Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy Phenol của một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



LÊ THÀNH CÔNG



PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PHENOL CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN TẠO MÀNG SINH HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học



LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC




Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh




THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các kết quả
trong luận văn là trung thực và là các kết quả thực tế do chúng tôi nghiên cứu, chƣa
từng đƣợc công bố trong các công trình khác. Các tài liệu tham khảo có nguồn gốc
rõ ràng và đƣợc trích dẫn đầy đủ.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2014
Học viên


Lê Thành Công





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ii
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm
Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các anh chị cán bộ Phòng
Công nghệ sinh học Môi trường – Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt là TS. Lê Thị
Nhi Công, ThS. Cung Thị Ngọc Mai, ThS. Vũ Thị Thanh, CN. Vũ Hải Hà đã

giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tôi trong quá trình hoàn thành luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Khoa Khoa học sự sống - Trường
Đại học Khoa học, đặc biệt là PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Trưởng Khoa
Khoa học sự sống đã tạo điều kiện, giới thiệu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu tại trường.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè và người
thân đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Với tất cả những tình cảm và lòng biết ơn chân thành sâu sắc, tôi xin cảm ơn
tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2014
Học Viên

Lê Thành Công

iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ix
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Cấu trúc, tính chất vật lý, hóa học của phenol 3
1.1.1. Cấu trúc phenol 3
1.1.2. Tính chất vật lý 3
1.1.3. Tính chất hóa học 3

1.2. Tổng quan về tình hình ô nhiễm phenol trên thế giới và Việt Nam 5
1.2.1. Trên thế giới 5
1.2.2. Ở Việt Nam 5
1.3. Ảnh hƣởng của phenol tới môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời 6
1.3.1. Ảnh hƣởng tới môi trƣờng 6
1.3.2. Ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời 7
1.4. Biện pháp xử lý ô nhiễm phenol 9
1.4.1. Biện pháp cơ học 9
1.4.2. Biện pháp vật lý 9
1.4.3. Biện pháp hóa học 10
1.4.4. Biện pháp sinh học 10
1.5. Giới thiệu chung về màng sinh học (biofilm) 16
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.5.1. Định nghĩa 16
1.5.2. Sự hình thành biofilm 18
1.5.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới sự hình thành biofilm 19
1.6. Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật 20
1.6.1. Phân loại vi sinh vật theo phƣơng pháp truyền thống 20
1.6.2. Phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử 20
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị sử dụng 22
2.1.1. Nguyên liệu 22
2.1.2. Hoá chất, môi trƣờng 22
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ 23
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 24
2.2.1. Thu thập mẫu 24
2.2.2. Làm giàu tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng chứa phenol 24
2.2.3. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng

phenol 25
2.2.4. Đánh giá và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học 26
2.2.5. Phân loại và định tên một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học 27
2.2.6. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng
sinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành 30
2.2.7. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của màng sinh học đa chủng tạo
thành ở điều kiện tối ƣu 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Thu thập mẫu và phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol 33
v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3.1.1. Thu thập mẫu 33
3.1.2. Phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol 33
3.1.3. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt 36
3.1.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu 37
3.2. Phân loại và định tên 3 chủng tạo biofilm tốt 38
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số 38
3.2.2. Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR 39
3.3. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng sinh
học 41
3.3.1. Ảnh hƣởng của pH 41
3.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 42
3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 43
3.3.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitor 44
3.4. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của biofilm đa chủng tạo thành ở điều
kiện tối ƣu 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
PHỤ LỤC 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ phenol 6
Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của phenol đến sức khoẻ của con ngƣời và động vật 8
Bảng 1.3. Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ sinh học phenol 12
Bảng 2.1. Các môi trƣờng nuôi cấy 22
Bảng 2.2. Các thành phần của phản ứng PCR 28
Bảng 3.1. Hình thái, đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của 3 chủng vi khuẩn 37



vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của phenol 3
Hình 1.2. Con đƣờng mở vòng ở vị trí ortho bởi 13
Hình 1.3. Con đƣờng phân hủy sinh học kỵ khí phenol bởi Pseudomonas sp. 14
Hình 1.4. Cấu trúc của biofilm qua ảnh hiển vi quét 18
Hình 1.5. Sự hình thành biofilm 19
Hình 2.1. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR 29
Hình 3.1. Mẫu nƣớc (A) và mẫu bùn (B) thu thập đƣợc từ bể chứa nƣớc thải kho xăng dầu
Đức Giang, Gia Lâm, Hà Nội 33
Hình 3.2. Mẫu làm giàu vsv trên môi trƣờng khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol
34
Hình 3.3. Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng khoáng Gost thạch 35

Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn 36
Hình 3.5. Khả năng tạo biofilm của 8 chủng vi khuẩn 36
Hình 3.6. Khả năng tạo màng của 8 chủng vi khuẩn 37
Hình 3.7. Hình ảnh điện di DNA tổng số 3 chủng vi khuẩn 39
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn 39
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 40
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn 42
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn 43
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi
khuẩn 44
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitor lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi
khuẩn 45
Hình 3.14. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của màngsinh học do các chủng vi khuẩn
tạo thành ở các nồng độ phenol khác nhau 46
viii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Hình 3.15. Hiệu suất phân hủy 150 ppm phenol của màng sinh học đa chủng của mẫu đối
chứng và mẫu thí nghiệm sau 7 ngày xử lý 47




ix
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
DNA : Deoxyribonucleic acid
EPS : Extracellular Polymeric Substances (hợp chất ngoại bào)
h : hour (giờ)

kDa : KiloDalton
LB : Luria-Bertani
LD50 : Lethal Dose, 50% (liều lƣợng gây chết một nửa)
mg, g : milligram, gram
OD : Optical Density (mật độ quang học)
GAC : Granular Activated Carbon (than hoạt tính dạng hạt)
PAC : Powder Activated Carbon (than hoạt tính dạng bột)
PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
ppm : parts per million (đơn vị một phần triệu, mg/l)
RNA : Ribonucleic acid
vsv : Vi sinh vật
nm, µm, cm, mm : Nanometer, micrometer, centimeter, milimeter
µl, ml, l : Microliter, milliliter, liter
HKTS : Hiếu khí tổng số
PAH : Polycyclic Aromantic Hydrocarbons


1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỞ ĐẦU
Công nghiệp dầu mỏ là ngành công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao và
quan trọng cũng nhƣ là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá với sự phát triển của tất
cả các quốc gia trên thế giới. Tuy nhiên, ngoài nguồn lợi về kinh tế và tầm quan
trọng trong các kế hoạch chiến lƣợc của mỗi quốc gia, ngành công nghiệp này lại
tiềm ẩn những mối nguy hại đến con ngƣời và hệ sinh thái. Đó là các mối nguy hại
đến từ các sự cố tràn dầu, từ cặn thải trong các kho chứa cũng nhƣ lƣợng xăng dầu
sử dụng cho các loại động cơ luôn chứa các hợp chất hữu cơ mạch vòng nhƣ
benzene, phenol, các hợp chất hydrocarbon thơm đa vòng (PAH), với hàm lƣợng
lớn, có ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng xung quanh và con ngƣời. Trong các hợp chất

ô nhiễm đó, phenol là một hợp chất hữu cơ khó phân hủy, độc hại, ảnh hƣởng
nghiêm trọng tới môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Chính vì vậy, việc loại bỏ
nguồn ô nhiễm phenol ra khỏi môi trƣờng là việc làm cấp thiết.
Hiện nay, việc xử lý các hợp chất hữu cơ độc hại nói chung và phenol nói
riêng theo phƣơng pháp phân huỷ sinh học đang là một hƣớng đi mới đầy triển vọng
và thu hút đƣợc sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và trong nƣớc.
Bản chất của phƣơng ph
. Một trong các phƣơng
pháp phân huỷ sinh học đƣợc ứng dụng hiện nay là công nghệ màng sinh học
(biofilm) do các vi sinh vật tạo ra. Bản chất của biofilm là một tập hợp các vi sinh
vật gắn trên một bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt phân cắt giữa các chất lỏng tạo
thành lớp màng polysaccharide ngoại bào bao phủ để bảo vệ các tế bào vi sinh vật
trong đó. Biofilm giúp các vi sinh vật có khả năng liên kết chặt chẽ với nhau, tạo
thành một cấu trúc bền vững khó bị phá hủy bởi các tác nhân bên ngoài nhƣ sự thay
đổi pH, nhiệt độ, nồng độ muối hay tốc độ dòng chảy. Chính vì mật độ các vi sinh
vật trong biofilm cao, nên nó hỗ trợ các quá trình trao đổi chất để từ đó phân hủy
các chất ô nhiễm tốt hơn. Do vậy, để góp phần xử lý các nguồn ô nhiễm phenol,
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả
năng phân huỷ phenol của một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học”.
Mục tiêu của đề tài:
Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn vừa có khả năng phân huỷ
phenol cao, vừa tạo màng sinh học tốt từ các mẫu nghiên cứu lấy từ kho xăng dầu
Đức Giang- Gia Lâm- Hà Nội. Đánh giá khả năng phân huỷ và tạo màng sinh học
của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên.
Nội dung của đề tài:
1. Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ phenol.
2. Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học.

3. Phân loại và định tên một số chủng vừa có khả năng tạo biofilm tốt, vừa
có khả năng phân hủy phenol cao.
4. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng phân huỷ
phenol của các chủng nghiên cứu.
5. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của màng sinh học đa chủng tạo
thành ở điều kiện tối ƣu.
3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cấu trúc, tính chất vật lý, hóa học của phenol
1.1.1. Cấu trúc phenol
Phenol còn đƣợc gọi là hydroxyl benzene, acid carbolic hoặc acid phenic, có
công thức hóa học C
6
H
5
OH, là một hợp chất thơm đơn giản nhất đƣợc Runge phát
hiện lần đầu tiên vào năm 1834 [48]. Phenol là một loại hợp chất hữu cơ mà trong
phân tử có chứa nhóm hydroxyl (−OH) liên kết trực tiếp vào nhân benzene (nhân
thơm). Phenol có khối lƣợng riêng (d=1,072 g/ml) và có tính acid yếu với K
a
= 1.10
-
10
(pK
a
= 10) [4].

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của phenol

Phenol có một nhóm –OH liên kết với vòng benzene. Đặc biệt hơn, trong
phân tử phenol có hiệu ứng liên hợp mạnh do có oxygen của nhóm –OH cũng ảnh
hƣởng đến tính chất vật lý và tính chất hoá học của phenol [4].
1.1.2. Tính chất vật lý
Phenol là chất rắn, tinh thể không màu, có mùi đặc trƣng, nóng chảy ở 43
o
C,
nhiệt độ sôi 182
o
C, để lâu ngoài không khí, phenol bị oxi hoá một phần, tạo nên hợp
chất có màu hồng và bị chảy rữa do hấp thụ hơi nƣớc. Phenol ít tan trong nƣớc lạnh,
tan trong môt số hợp chất hữu cơ (nhƣ ethanol, este, chloroform), tan vô hạn ở
66
o
C. Phenol rất độc, gây bỏng nặng khi rơi vào da [4].
1.1.3. Tính chất hóa học
 Tính acid
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Do hiệu ứng cộng hƣởng xảy ra trong phân tử nên phenol có tính acid. Vì
vậy, phenol có thể tác dụng với base mạnh để tạo thành muối và nƣớc.
C
6
H
5
OH + NaOH C
6
H
5

ONa + H
2
O
(Natriphenolat)
Tuy nhiên, tính acid của phenol rất yếu, K
a
=10
-9,75
nên không làm đổi màu
quỳ tím. Vì vậy, muối phenolat bị acid carbonic tác dụng lại tạo thành phenol.
C
6
H
5
ONa + CO
2
+ H
2
O C
6
H
5
OH + NaHCO
3
Phản ứng này dùng để tái tạo phenol trong công nghiệp.
 Tính chất nhƣ rƣợu
Phenol có thể tác dụng đƣợc với Na nhƣ rƣợu, nhƣng có điểm khác, đó là
muối phenolat tạo thành không bị nƣớc phân huỷ.
C
2

H
5
ONa + H
2
O C
2
H
5
OH + NaOH
C
6
H
5
Na + H
2
O Không phản ứng
Phenol cũng tạo este nhƣ rƣợu, nhƣng nếu rƣợu có thể tác dụng trực tiếp với
acid thì phenol chỉ có thể tác dụng với clorua acid hoặc anhidric acid mới tạo đƣợc
este.
C
6
H
5
OH + CH
3
COCI CH
3
COOC
6
H

5
+ HCl
C
6
H
5
OH + (CH
3
COO)
2
CH
3
COOC
6
H
5
+ CH
3
COOH

Điều này đƣợc giải thích nhƣ sau:
- Mật độ điện tích âm của O trong nhóm –OH vì có liên hợp trong phân tử
nên giảm hơn so với O trong nhóm –OH của rƣợu, dẫn đến phenol khó tấn công vào
phân tử acid tạo este hơn.
- Phenol là hợp chất vòng thơm, nên gây hiệu ứng không gian cản trở.
 Tính chất của nhân thơm
5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Phenol phản ứng với brom tạo kết tủa vàng. Phản ứng với HNO

3
tạo kết tủa
trắng [4].
Chính vì những đặc tính vật lý và hoá học nhƣ vậy mà phenol đƣợc ứng dụng
nhiều trong các ngành công nghiệp nhƣ:
- Công nghiệp chất dẻo: Điều chế nhựa phenol formaldehyde.
- Công nghiệp tơ hoá học: Tổng hợp ra tơ polyamide.
- Nông dƣợc: Điều chế ra thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ dại và kích thích tố
thực vật.
- Điều chế một số sản phẩm nhuộm, thuốc nổ (acid picric).
- Dùng trực tiếp làm chất sát trùng, tẩy uế, diệt nấm mốc…
1.2. Tổng quan về tình hình ô nhiễm phenol trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Có nhiều nghiên cứu cho thấy sự có mặt của phenol trong các mẫu nƣớc lấy
tại sông hồ với nồng độ cao. Ở cộng hoà Serbia, nồng độ phenol gần Kraljevo là 0,7
µg/l, Raska là 7,2 µg/l. Ở Sông Hoàng Hà Trung Quốc, nồng độ này là 4µg/l. Nồng
độ phenol trong nƣớc bề mặt tại Hà Lan là 2,6-6,5 µg/l. Nƣớc sông ô nhiễm, nƣớc
thải từ các nhà máy chế biến xăng dầu có nồng độ phenol trên 40mg/l. Ở Hoa Kỳ,
trong nƣớc sinh hoạt cũng thấy sự có mặt của phenol trong nƣớc sinh hoạt với nồng
độ 1µg/l [9]. Trong nƣớc tự nhiên, nồng độ phenol trong khoảng 0,01-2 µg/l. Nồng
độ phenol trong không khí thấp hơn, khoảng 1ng/m
3
. Nồng độ phenol ở gần các nhà
máy chế biến gỗ là rất cao, có thể đạt đến giá trị 9,7 đến 10,7 µg/m
3
[7].
1.2.2. Ở Việt Nam
Ở nƣớc ta, nguồn cơ bản phát sinh ô nhiễm phenol chính là chất thải từ các
cơ sở sản xuất có sử dụng phenol nhƣ nguyên liệu hay dung môi của quá trình sản
xuất. Các nhà máy sản xuất dƣợc phẩm có các mặt hàng thuốc giảm đau nhƣ

aspirin, acid salicylic, … trong nƣớc thải vệ sinh thiết bị, dụng cụ sẽ thải ra phenol.
Tại các cơ sở sản xuất hạt điều, trong nƣớc thải ngâm ủ hạt và vệ sinh nhà xƣởng có
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

chứa nhiều dẫn xuất của phenol. Phenol đƣợc sử dụng trong thành phần của thuốc
diệt cỏ, thuốc diệt nấm mốc. Do đó, trong quá trình tồn trữ, bảo quản và sử dụng sẽ
có tình trạng thất thoát ra ngoài môi trƣờng. Phenol cũng có mặt trong chất thải của
các phòng thí nghiệm sinh học do hỗn hợp phenol và chloroform thƣờng dùng để
tẩy DNA (Deoxyribonucleic acid) trong ngành sinh học phân tử và lƣợng dƣ phenol
trong quá trình sử dụng sẽ phát tán vào môi trƣờng gây ra tình trạng ô nhiễm. Đặc
biệt là tình trạng ô nhiễm phenol trong canh tác nông nghiệp do ngƣời nông dân
thiếu ý thức, vứt bừa bãi các chai lọ đựng thuốc diệt cỏ có chứa phenol ra đồng
ruộng.
Trong thực phẩm, phenol có mặt với nồng độ trung bình 5 µg/kg ở mật ong
và cà phê. Trong các thực phẩm chế biến, nồng độ phenol cũng ở mức báo động
nhƣ trong xúc xích nồng độ là 1 µg/kg, trong lớp vỏ ngoài của thịt hun khói nồng độ
là 37-70 mg/kg [46].
1.3. Ảnh hƣởng của phenol tới môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời
1.3.1. Ảnh hưởng tới môi trường
Trên góc độ môi trƣờng, phenol và các dẫn xuất của nó đƣợc xếp vào loại
chất gây ô nhiễm độc hại. Đây là nhóm chất tƣơng đối bền, có khả năng tích luỹ
trong cơ thể sinh vật và có khả năng gây nhiễm độc cấp tính, mãn tính cho ngƣời và
động vật. Khi xâm nhập vào cơ thể, phenol gây ra nhiều tổn thƣơng cho các cơ
quan, đặc biệt là hệ thần kinh và hệ thống tim mạch. Chính vì vậy, phenol có tác
động rất lớn đến môi trƣờng. Tình trạng ô nhiễm phenol trong không khí, nƣớc thải
và trong đất có thể gây ảnh hƣởng đến hệ sinh thái và ở hàm lƣợng cao có thể tiêu
diệt toàn bộ hệ sinh thái.
Giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ phenol và dẫn xuất của nó trong
nguồn nƣớc mặt và nƣớc ngầm đƣợc thể hiện ở bảng 1.1.

Bảng 1.1. Bảng giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ phenol
Đối tƣợng
Hàm lượng phenol tổng số (mg/l)
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Nƣớc bề
mặt
Nƣớc sinh hoạt
0,001
Nƣớc dùng cho nông nghiệp
và nuôi trồng thủy sản
0,002
Nƣớc ngầm
0,001
Nƣớc thải
Đổ vào các khu vực dùng
làm nguồn nƣớc cấp cho
sinh hoạt
≤ 1,0
Dùng làm nguồn nƣớc tƣới
tiêu, bơi lội, nuôi trồng thủy
sản
≤ 2,0
Không đƣợc phép đổ ra môi
trƣờng
≥ 5,0
1.3.2. Ảnh hưởng tới sức khỏe con người
Phenol sau khi xâm nhập vào tế bào, trải qua sự biến đổi tích cực, chủ yếu là
sự tham gia của enzyme oxy hoá ở Cytochrome P

450
. Đôi khi quá trình biến đổi
cũng làm gia tăng độc tính của các hợp chất riêng rẽ bằng cách hình thành các chất
chuyển hoá điện tử và gây tổn hại tới DNA hoặc các enzyme của cơ thể. Do vậy,
phenol rất độc hại và gây rối loạn nhiều chức năng sinh hoá của con ngƣời khi bị
nhiễm. Đối với con ngƣời, khi tiếp xúc với phenol trong không khí có thể bị kích
ứng đƣờng hô hấp, đau đầu, cay mắt [8]. Nếu tiếp xúc trực tiếp với phenol ở nồng
độ cao có thể gây bỏng da, tim đập loạn nhịp và có thể dẫn đến tử vong. Phenol
cũng gây tác động mạnh theo đƣờng tiêu hóa. Khi ăn, uống phải một lƣợng phenol
có thể gây kích ứng, bỏng phía bên trong cơ thể và gây tử vong ở hàm lƣợng cao.
Tình trạng bị kích ứng và ảnh hƣởng cũng xảy ra tƣơng tự đối với các loài động vật
khi tiếp xúc với phenol.
Ngoài ra, phenol còn là một chất gây kích ứng mắt, màng nhầy và da, gây co
giật, suy gan thận và một số cơ quan khác. Ở động vật, những tác động chủ yếu của
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ngộ độc cấp tính có tác dụng lên hệ thần kinh trung ƣơng tuỷ sống, gây co giật và
gây rối loạn nghiêm trọng. Sau khi hấp thụ một lƣợng chất độc, đầu tiên nhịp tim
tăng lên, sau đó chậm và không đều, ban đầu huyết áp tăng nhẹ và sau đó giảm rõ
rệt, gây tiết nƣớc bọt, khó thở và giảm nhiệt độ cơ thể. Giá trị LD
50
(nồng độ gây
chết 50% số cơ thể ngƣời hay động vật khi cơ thể đó đƣợc đƣa vào một lƣợng nhất
định chất độc) khi uống là 317 mg/kg đối với động vật gặm nhấm và 270 mg/kg đối
với chuột. Ở thỏ, giá trị LD
50
khi tiếp xúc qua da là 850 mg/kg. Giá trị EC
50
(nồng

độ gây hại 50% quần thể trong điều kiện thực nghiệm quan sát rõ ràng) đối với giáp
xác và cá vào khoảng 3-7 mg/l. Sự tồn tại kéo dài của phenol trong miệng và dƣới
da động vật có thể gây hại đến phổi, gan, thận, tim và đƣờng sinh dục. Liều thấp
nhất có thể gây tử vong bằng đƣờng tiêu hóa là khoảng 4,8 g và trong thời gian
không quá 19 phút. Những triệu chứng do hít lâu hơi phenol trong khoảng 30-60
ppm có thể gây tổn thƣơng phổi, giảm cân, nhức đầu, chóng mặt, tê liệt chân tay và
nặng hơn là tê liệt toàn thân … [8].
Những ảnh hƣởng của phenol lên sức khoẻ của ngƣời và động vật đƣợc thể
hiện ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của phenol đến sức khoẻ của con ngƣời và động vật
Nồng độ trong nƣớc
(ppm)
Thời gian nguy hiểm
(ngày)
Ảnh hƣởng
Những ảnh hưởng đến con người
5000
1
Tử vong
100

Mức độ rủi ro thấp
Những ảnh hưởng đến động vật
20.000
1
Cơ bắp run, tử vong
24.000
9
Giảm trọng lƣợng cơ thể
thai nhi

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

28.000
9
Dị tật bẩm sinh
1.4. Biện pháp xử lý ô nhiễm phenol
Tính chất độc hại của phenol trở thành một vấn đề cấp bách cần đƣợc quan
tâm. Hiện nay, đã có nhiều biện pháp hoá học, vật lý, sử dụng các vật liệu hấp phụ
và các vật liệu lọc để xử lý phenol.
1.4.1. Biện pháp cơ học
Các phƣơng pháp nhƣ quang hóa, cho bay hơi hay đào, chôn lấp đất ô nhiễm
đƣợc sử dụng để phân hủy phenol trong một số trƣờng hợp nhất định. Tuy nhiên,
các phƣơng pháp này cho hiệu quả xử lý không cao và vẫn để lại một lƣợng tồn dƣ
trong môi trƣờng.
1.4.2. Biện pháp vật lý
Các phƣơng pháp nhƣsử dụng tia UV hay than hoạt tính để xử lý nguồn ô
nhiễm phenol cũng cho hiệu quả nhất định, đặc biệt là sử dụng than hoạt tính. Than
hoạt tính là chất hấp phụ phổ biến, đã đƣợc áp dụng từ lâu trong các xử lý nƣớc để
loại bỏ các chất hữu cơ tự nhiên (NOMs), các chất ô nhiễm vô cơ, các chất tổng hợp
khó phân huỷ… Than hoạt tính lọc nƣớc nhờ 2 cơ chế chính: (1) lọc cơ học, giữ lại
các hạt cặn trong các lỗ rỗng nhỏ; (2) hấp phụ các tạp chất hoà tan trong nƣớc bằng
cơ chế hấp phụ bề mặt hoặc trao đổi ion.
Than hoạt tính xử lý nƣớc gồm 2 dạng chính: than hoạt tính dạng bột Powder
actived carbon - PAC và than hoạt tính dạng hạt Granular actived carbon - GAC.
Than hoạt tính dạng bột (PAC) đƣợc đƣa vào nƣớc trong quá trình keo tụ - lắng.
Hạn chế của phƣơng pháp này là đối với nguồn nƣớc bị ô nhiễm hữu cơ cao, lƣợng
PAC cần cho vào nƣớc lớn, tốn kém,và nếu sử dụng thƣờng xuyên sẽ tạo lƣợng cặn
lớn. Do vậy, phƣơng pháp này chỉ áp dụng trong trƣờng hợp khẩn cấp, khi lƣợng
hữu cơ ô nhiễm trong nguồn nƣớc tăng đột biến, nhƣ là quá trình xử lý sơ bộ.

Than hoạt tính dạng hạt (GAC) đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại vật liệu
lọc. Có thể sử dụng GAC trong bể lọc riêng biệt, đặt sau bể lọc cát thông thƣờng, để
loại bỏ các chất hữu cơ còn lại trong nƣớc sau bể lọc cát. Thời gian sử dụng của cột
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

lọc GAC phụ thuộc vào loại và lƣợng chất ô nhiễm trong nƣớc. Thông thƣờng, để
xử lý các sản phẩm phụ của clo thì 6-12 tháng, để xử lý thuốc trừ sâu, các chất hữu
cơ tổng hợp từ 1-2 năm và để xử lý mùi và vị từ 2-5 năm.
1.4.3. Biện pháp hóa học
* Xử lý bằng các tác nhân oxy hóa mạnh
Sử dụng các tác nhân oxy hóa mạnh nhƣ H
2
O
2
, ozone, chlorine, hệ Fenton để
oxy hóa phenol trong nƣớc thải tạo thành những hợp chất hữu cơ ít ô nhiễm hoặc
chuyển hóa để thành CO
2
và H
2
O. Việc ứng dụng xúc tác quang cũng đã bƣớc đầu
đƣợc nghiên cứu để xử lý phenol, tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu thực hiện trong
phòng thí nghiệm, trên một số dạng của hợp chất xúc tác quang và chƣa đƣợc triển
khai áp dụng trong thực tế.
Các phƣơng pháp kể trên mặc dù có hiệu quả trong việc loại bỏ phenol, tuy
nhiên, không triệt để vì sau khi qua các vật liệu lọc vẫn còn tồn dƣ của phenol và
mất khá nhiều thời gian xử lý.
1.4.4. Biện pháp sinh học
. Phân hủy

sinh học phenol nói riêng và các chất độc khác nói chung đã đƣợc các nhà khoa học
trên thế giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt đƣợc
khá nhiều thành tựu. Phân hủy sinh học đảm bảo an toàn cho môi trƣờng hơn tất cả
các phƣơng pháp khác và cũng đem lại hiệu quả kinh tế xã hội cao nhất.
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Phƣơng pháp phân hủy sinh học đƣợc áp dụng nhiều vì không tạo các sản
phẩm thứ cấp, thân thiện với môi trƣờng và giá thành rẻ hơn so với các phƣơng
pháp truyền thống. Đối với phenol, phân hủy sinh học đƣợc thực hiện chủ yếu làm
phá vỡ cấu trúc phân tử của chúng bằng cách sử dụng các enzyme mở vòng do các
chủng tại chính khu vực ô nhiễm sinh ra.
Xử lý chất ô nhiễm theo phƣơng pháp phân huỷ sinh học có thể tiến hành
theo hai hƣớng chính: tăng cƣờng sinh học và kích thích sinh học.
Tăng cƣờng sinh học: là phƣơng pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa
đã đƣợc làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh
vật đƣợc cải tiến về mặt di truyền bổ sung vào các môi trƣờng bị ô nhiễm. Tuy
nhiên, vẫn còn những khó khăn trong việc bổ sung vi sinh vật vào môi trƣờng bị ô
nhiễm do chi phí lớn, hiệu quả phân huỷ nhiều khi không cao do nhiều nguyên nhân
(sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trƣờng, sự thiếu hụt nguồn dinh
dƣỡng, các chất đa lƣợng và vi lƣợng cần thiết cho hoạt động phân huỷ của vi sinh
vật) [20].
Kích thích sinh học: là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao đổi
chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng chất độc hại thông qua
việc điều chỉnh các yếu tố môi trƣờng nhƣ nhiệt đô, độ ẩm, pH, nồng độ oxy, chất
dinh dƣỡng, các cơ chất và chất xúc tác…[20].
Kích thích sinh học hiện đang là khuynh hƣớng đƣợc sử dụng rộng rãi trong
xử lý ô nhiễm môi trƣờng bằng phƣơng pháp phân hủy sinh học [22]. Từ nguồn ô
nhiễm, ngƣời ta có thể phân lập ra một số chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng
phenol. Sau đó nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chúng để tìm ra các

điều kiện tối ƣu cho sự phát triển của chúng trên nguồn cơ chất phenol để từ đó kích
thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng phân huỷ phenol
ở vùng ô nhiễm. Để tăng cƣờng quá trình phân huỷ sinh học cần phải bổ sung
nguồn dinh dƣỡng nhƣ carbon, nitor, phosphore theo tỷ lệ nhất định là 100 : 5 : 1.
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Ngoài ra, các yếu tố môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH … cũng cần phải đƣợc điều chỉnh
thích hợp cho quá trình phân huỷ ở mức độ ổn định và đạt hiệu quả cao nhất [22].
Đôi khi ngƣời ta cũng kết hợp cả hai biện pháp trên để có đƣợc hiệu quả tốt
nhất. Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật sau khi đƣợc làm giàu trên
nguồn cơ chất, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ƣu (nhiệt độ, pH, độ ẩm, nguồn dinh
dƣỡng) cho tập đoàn vi sinh vật có khả năng phân hủy phenol hoạt động [22]. Mặt
khác, tùy vào đặc thù môi trƣờng, nồng độ phenol ô nhiễm mà chúng ta phải kết
hợp với các phƣơng pháp vật lý, hóa học để nâng cao quá trình phân hủy sinh học
phenol.
* Vai trò của vi sinh vật trong xử lý nước ô nhiễm phenol
Quá trình chuyển hóa đƣợc thực hiện bởi hoạt động của các enzyme do các
chủng vi sinh vật khác nhau tiết ra. Mỗi loại enzyme chỉ đặc trƣng cho mỗi loại
phản ứng, do đó để xử lý phenol đƣợc triệt để, phải kết hợp nhiều chủng vi sinh vật
khác nhau. Nhiều loài vi khuẩn và nấm men có khả năng khoáng hoá phenol dƣới
điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí [21].

Bảng 1.3. Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ sinh học phenol
Vi khuẩn
Nấm
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter johnsonii
Acinetobacter sp.
Alcaligens sp.

Bacillus brevis
Bacillus sp.
Bacillus stesrothermophillus
Pseudomonas flurorescens
Pseudomonas pictorium
Chalara paradoxa
Fusarium sp.
Phanerocheate chrysosporium
Rhizoctonia praticola
Candida tropicalis
Cryptococcus terreus
Rhodotorula creatinivora
Rhodosporidium
toruloidesTrichosporon cutaneum
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Pseudomonas putida
Pseudomonas sp.
Ralstonia eutropha

 Phân huỷ hiếu khí phenol
Trong điều kiện hiếu khí, sự phân huỷ bắt đầu bởi quá trình oxy hoá các
vòng thơm đƣợc thực hiện bởi mono oxygenase phenol hydroxylase ở vị trí ortho để
chuyển nhóm hydroxyl (-OH) thành dạng catechol. Đây là sản phẩm trung gian
chính từ sự chuyển hoá phenol bằng các chủng vi sinh vật khác nhau. Tuỳ thuộc vào
chủng vi sinh vật, catechol có thể bị cắt ở vị trí ortho dẫn đến sự hình thành succinyl
Co-A hoặc ở vị trí meta dẫn đến sự hình thành pyruvate và acetaldehyde.
Katayama-Hirayama và cộng sự (1991) và Paller và cộng sự (1995) đã mô tả
sự phân hủy sinh học bởi Rhodotorula rubravà Acinetobacter calcoaceticustƣơng

ứng thông qua con đƣờng mở vòng ở vị trí ortho (Hình 1.2) [20], [29].

Hình 1.2. Con đƣờng mở vòng ở vị trí ortho bởi
Rhodotorula rubura và Acinetobacter calcoaceticus
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

A: Phenol, B: Catechol, C: 2-hydroxymuconic semialdehyde, D: 2-hydroxymuconate, E: 2-oxo-4-enoadipate,
F: 2-oxo-penta-4-enoate, G: Pyruvate, H: Acetaldehyde, I: Acetyl Co A, E1: Monooxygenase phenol
hydroxylase, E2: Catechol-2,3-dioxygenase, E3: Hydrolase, E4: Dehydrogenase, E5: Isomerase, E6:
Decarboxylase, E7: Hydrotase, E8: Aldose.
 Phân hủy kỵ khí phenol
Các vi sinh vật phân hủy kỵ khí phenol trong điều kiện kỵ khí đã đƣợc
nghiên cứu với vi khuẩn khử nitor Thauera aromatic. Sự phân hủy kỵ khí bắt đầu từ
quá trình carboxyl hóa phenol, trải qua các bƣớc: (1) Quá trình phosphoryl hóa
phenol: một nhóm phosphate (từ một phosphoryl nào đó), đƣợc gắn vào phân tử
phenol dƣới xúc tác của phosphate phenyl synthase hay kinase (enzyme phosphoryl
hóa) tạo thành phosphate phenyl. (2) Carboxyl hóa phosphate phenyl dƣới xúc tác
của phenyl phosphate carboxylase hình thành 4-hydroxybenzoate [23], [24].
Các quá trình chuyển hóa hoặc phân hủy của 4-hydroxybenzoate tiếp tục
trong hai bƣớc để tạo benzoyl Co-enzyme A. Phân hủy kỵ khí phenol của chủng
Pseudomonas sp. đƣợc Lack và Fuchs (1994) mô tả trong hình 1.3.

Hình 1.3. Con đƣờng phân hủy sinh học kỵ khí phenol bởi Pseudomonas sp.
A: Phenol, B: Phenyl phosphate, C: 4-hydroxybenzoate, D: 4-hydroxylbenzoyl-CoA, E: Benzoyl-CoA, E1:
Phenyl phosphate sythase, E2: Phenyl phosphate carboxylase, E3: 4-hydroxybenzoate-CoA ligase, E4: 4-
hydroxybenzoyl-CoA.
Benzoyl-Co A dƣới xúc tác của Benzoyl-Co enzyme A tạo thành
cyclohexadience-1-carboxyl-CoA.Quá trình chuyển hóa này đƣợc tiếp tục để tạo
thành 3 phân tử acetyl Co A và một phân tử carbon dioxide [25].

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

* Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phân hủy phenol của vi sinh vật
Cũng nhƣ các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ khác, quá trình phân
hủy phenol cũng chịu tác động trực tiếp của nhiều yếu tố nhƣ cấu trúc hóa học và
độc tính của hợp chất, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, áp suất, pH v.v,
Cấu trúc hóa học và độc tính của các hợp chất ô nhiễm làm ngăn chặn hoặc
làm chậm các phản ứng chuyển hoá. Mức độ và cơ chế độc tính thì khác nhau với
từng chất độc, nồng độ chất độc và lƣợng vi sinh vật đƣợc đƣa vào. Tế bào vi sinh
vật ngừng hoạt động khi có ít nhất một trong những tác nhân ngăn cản quá trình
sinh lý của chúng diễn ra một cách bình thƣờng [35].
Mỗi sinh vật có nhiệt độ tối thiểu, tối ƣu và tối đa cho sự tăng trƣởng. Chủng
Pseudomonas putida ƣa lạnh đã đƣợc sử dụng để phân hủy phenol thành công ở
nhiệt độ thấp 10
o
C [21], trong khi một loại vi khuẩn ƣa nhiệt
Bacillusstearothermophiles cũng đã đƣợc sử dụng để phân hủy phenol ở nhiệt độ
cao hơn 50
o
C.
Nguồn nitor và nguồn carbon cũng ảnh hƣởng tới khả năng phân hủy phenol
của vi sinh vật. Vì đây là nguồn cung cấp chất dinh dƣỡng cho các hoạt động sống
của vi sinh vật diễn ra bình thƣờng. Tối ƣu hóa đƣợc các nguồn chất này sẽ làm
tăng hiệu quả xử lý phenol.
Ngoài các yếu tố môi trƣờng nói trên, sự phân hủy sinh học phenol còn phụ
thuộc vào tính chất vật lý, hóa học của các phenol, sự có mặt đồng thời hay riêng rẽ
của phenol và các dẫn xuất của chúng trong môi trƣờng. Ngoài ra nó còn phụ thuộc
vào bản thân các vi sinh vật, phƣơng thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua
màng tế bào. Thƣờng những phân tử có khả năng hòa tan trong nƣớc có thể đƣợc

vận chuyển qua màng tế bào và dễ dàng phân hủy sinh học tốt hơn [10].
Các yếu tố môi trƣờng tại nơi mà vi sinh vật đƣợc phân lập ảnh hƣởng rất lớn
đến sự phát triển của chúng. Do vậy, trong quá trình xử lý làm sạch môi trƣờng, vấn
đề này đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu quả của việc xử lý. Quá trình
phân hủy sinh học phenol cũng nhƣ các hợp chất hydrocacbon thơm đa nhân bởi