Ảnh hưởng sự giảm biểu hiện protein dkk3 trên con đường tín hiệu EGFR ở dòng tế bào tPH5CH, huh6 clone 5 và RD

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy
Dương và GS.BS. Masayuki Noguchi đã cho tôi cơ hội được tham gia thực hiện đề
tài.
Tôi xin chân thành cám ơn TS. Junko Kano đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô đã truyền thụ cho tôi những kiến thức
quý báu.
Cảm ơn các anh chị, các em trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử (ĐH khoa
học tự nhiên TpHCM) và các thành viên trong phòng thí nghiệm bệnh học chẩn
đốn (ĐH Tsukuba) đã giúp đỡ, động viên tơi những lúc khó khăn.

Nguyễn Thái Hồng Tâm
 


 
 

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục...................................................................................................................... i
Danh mục các ký hiệu và các chữ viết tắt ............................................................... iii
Danh mục các bảng ...................................................................................................v
Danh mục các hình .................................................................................................. vi

LỜI MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Họ protein Dickkopf và protein Dickkopf 3 ..................................................3

1.1.1. Dkks ...............................................................................................................3
1.1.2. Protein Dkk3 ..................................................................................................5
1.2.

Con đường tín hiệu Wnt .................................................................................7

1.3.

Con đường tín hiệu tế bào thơng qua thụ quan EGF ....................................9

1.4.

EGFR đối với ung thư và liệu pháp đích trong điều trị .............................. 12

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu ............................................................................................................ 15
2.1.1. Dòng tế bào .................................................................................................. 15
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................... 16
2.2. Phương pháp ................................................................................................... 16

i
 


 

 

2.2.1. Nuôi cấy tế bào............................................................................................. 16
2.2.2. Biến nạp siRNA vào tế bào nuôi cấy ........................................................... 17
2.2.3. Realtime RT-PCR sử dụng SYBRGreen ..................................................... 17
2.2.4. Western blot ................................................................................................. 18
2.2.5. RayBio®Phospho-EGFR (Tyr 1086) and Pan EGFR ELISA ..................... 21
2.2.6. Phân tích hình ảnh bằng phần mềm Imagine J ............................................ 21
2.2.7. Phân tích và xử lý số liệu ............................................................................. 22

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ, THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát hình thái tế bào .................................................................... 23
3.2. Kết quả khảo sát hoạt động tín hiệu của con đường EGFR ............................ 25
3.2.1. Tế bào tPH5CH ............................................................................................ 27
3.2.2. Tế bào HuH6 clone 5 ................................................................................... 28
3.2.3. Tế bào RD .................................................................................................... 29
3.3. Kết quả khảo sát hoạt động của EGFR ........................................................... 31
3.4. Thảo luận ......................................................................................................... 35

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN.................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

ii
 


 
 

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT

Akt (PKB)

: protein kinase B

APC

: tumor-suppressor protein

CKIα

: casein kinase Iα

Dkk

: họ protein Dickkopf

EGFR

: Epidermal Growth Factor Receptor

Erk 1/2

: Extracellular-signal regulated kinase ½

Fz

: thụ quan bề mặt Frizzled

GSK-3

: Glycogen synthase kinase-3

HuH6 clone 5

: dòng tế bào ung thư gan Hepatoblastoma

JNK

: c-Jun kinase

LEF

: lymphocyte enhancer factor (nhân tố phiên mã)

LRP

: lipoprotein receptor-related protein

MAPK

: Mitogen-activated protein kinase

NF-AT

: Nuclear factor of activated T-cells (nhân tố phiên mã)

PBS

: Phosphate buffer saline

PKC

: protein kinase C

PLC

: phospholipase C

RD

: dòng tế bào ung thư cơ xương (rhabdomyosarcoma).

SDS-PAGE

: Sodium dodecyl
electrophoresis

sFRP

: secreted Frizzled-related protein)

Stat3

: Signal Tranducers and Activators of Transcription 3

iii
 

sulfate

polyacrylamide

gel


 
 

TCF

: T-cell factor (nhân tố phiên mã)

tPH5CH

: dòng tế bào biểu mô gan đã được chuyển thành công
đoạn gen SV40 large T antigen.

Wif1

: Wnt inhibitor factor 1

β-actin

: một trong sáu đồng phân cấu trúc của protein actin.

βTrCP

: β-transducing repeat-containing protein

iv
 


 
 

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 – Sự biểu hiện bất thường của Dkks ở một số tế bào ung thư ........................... 6
Bảng 1.2 – Một số tác nhân đối kháng với hoạt động cuả EGF ..................................... 14
Bảng 2.1 – Danh sách kháng thể sử dụng trong Western Blot ....................................... 20
Bảng 3.1 – Kết quả tín hiệu đo p-EGFR và EGFR tổng bằng kỹ thuật ELISA.............. 33

v
 


 
 

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1 – Sơ đồ tác động của Dkk3 lên hai con đường truyền tín hiệu ở tế bào............ 3
Hình 1.2 – Mơ hình cấu trúc phân tử của những protein thuộc họ Dickkopf .................. 4
Hình 1.3 – Cơ chế tác động ức chế tín hiệu Wnt của một số Dkks .................................. 5
Hình 1.4 – Con đường tín hiệu Wnt ................................................................................. 7
Hình 1.5 – Sơ đồ vị trí hoạt động phosphoryl hóa của EGFR trong q trình truyền tín
hiệu trong tế bào ............................................................................................................... 9

Hình 1.6 – Sơ đồ hóa một số con đường hoạt động thơng qua sự hoạt hóa EGFR........ 10
Hình 2.1 – Một số dịng tế bào sử dụng ......................................................................... 15
Hình 3.1 – Hình thái tế bào khảo sát .............................................................................. 24
Hình 3.2 – Tác động của việc ức chế protein Dkk3 lên con đường tín hiệu thơng qua thụ
quan EGF trên tế bào tPH5CH ....................................................................................... 27
Hình 3.3 – Tác động của việc ức chế protein Dkk3 lên con đường tín hiệu thơng qua thụ
quan EGF trên tế bào HuH6 clone 5. ............................................................................. 28
Hình 3.4 – Tác động của việc ức chế protein Dkk3 lên con đường tín hiệu thơng qua thụ
quan EGF trên tế bào RD. .............................................................................................. 30
Hình 3.5 – Độ hoạt động tín hiệu của Erk1 và Erk2 ở quần thể tế bào RD. .................. 31
Hình 3.6 – Hoạt động phosphoryl hóa tại vị trí Tyr1086 của thụ quan EGF trên những
quần thể tế bào ................................................................................................................ 32
Hình 3.7 – Biểu hiện mRNA EGFR ở những quần thể tế bào ức chế biểu hiện Dkk3. 34
Hình 3.8 – Mối liên hệ giữa con đường tín hiệu Wnt và EGFR .................................... 35
vi
 


 

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

Dkk3 thuộc nhóm protein Dickkopf (Dkks) - có vai trị điều hịa hoạt động tín

hiệu của những protein Wnt. Tuy nhiên, vai trị điều hịa tín hiệu của Dkk3 lại chưa
được ghi nhận rõ ràng. Ảnh hưởng của Dkk3 lên con đường tín hiệu EGFR cũng
chưa được đề cập đến (Hình 1.1).
Wnt

EGFR

? 

Dkk3

β-catenin

?

Erks

Akt

Stat3

Hình 1.1 – Sơ đồ tác động của Dkk3 lên hai con đường truyền tín hiệu ở tế bào

1.1.

Họ protein Dickkopf và protein Dickkopf 3.

1.1.1. Dkks [21].
Dkks là một trong năm họ protein có vai trị đối kháng trong hoạt động điều hịa
con đường tín hiệu truyền tín hiệu Wnt được biết hiện nay. Ở động vật có xương

sống, họ protein Dkks là một nhóm gồm có bốn thành viên: Dkk-1, -2, -3 và -4.
Chúng đều là những glycoprotein tiết ngoại bào, có trình tự khoảng 255-350 amino
acid (aa). Cấu trúc phân tử của Dkks (Hình 1.2) chứa một vùng tín hiệu (vùng màu
đỏ) và hai vùng bảo tồn, giàu cysteine, mỗi vùng có đặc điểm riêng về khoảng cách
Cysteine và sự bảo tồn aa khác nhau – vùng DKK-N và “colipase fold”. Vùng
“colipase fold” là vùng bảo tồn nhất giữa các loài động vật có xương sống và khơng
xương sống, đồng thời cũng là vùng có hoạt tính ức chế tín hiệu Wnt. “Colipase
fold” là cấu hình đặc trưng của một nhóm các protein kích thước nhỏ; những protein
này có chức năng chuyên biệt trong tương tác protein-protein, như những protein
độc tố ở nhện, bò cạp và những protein ức chế protease. Cấu trúc vùng “colipase
fold” tồn tại những chuỗi β ngắn liên kết những cấu trúc “loop” và được ổn định bởi
3

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

những cầu nối disulfide tạo thành những cấu trúc “giống-ngón tay” (finger-like
structure) có thể đóng vai trị trong việc tương tác với những bề mặt. Vai trò hoạt
động của vùng DKK-N chưa được biết đến. Khoảng cách giữa hai vùng colipase
fold và DKK-N ở Dkk-1. -2, -4 khoảng 50-55aa; riêng ở Dkk-3, khoảng cách giữa 2
vùng này ngắn hơn, chỉ khoảng 12aa.

 
Hình 1.2 – Mơ hình cấu trúc phân tử của những protein thuộc họ Dickkopf.

Hầu hết những thành viên của Dkks đều có khả năng kìm hãm hoạt động truyền
tín hiệu của Wnt đặc biệt là theo con đường tín hiệu Wnt/β-catenin, ngoại trừ Dkk2.

Dkk2 cịn có khả năng thay thế Wnt truyền tín hiệu cho tế bào khơng thực hiện q
trình phân hủy β-catenin, chức năng này tùy thuộc vào trạng thái của tế bào (Hình
1.3.d). Wnt kích hoạt con đường truyền tín hiệu nội bào khi có sự gắn lên thụ quan
của nó là Frizzed (Fz). Hoạt động gắn kết này dẫn đến việc lôi kéo protein bề mặt tế
bào cạnh đó là LRP6 (Lipoprotein receptor-like protein) lại gần Fz kích hoạt con
đường truyền tín hiệu Wnt (Hình 1.3.a). Dkk1 và những thành viên Dkks có khả
năng liên kết phân tử với LRP6 dẫn đến việc khóa hoạt động truyền tín hiệu Wnt
bằng cách tạo khoảng cách không gian giữa Fz và LRP6 (Hình 1.3.b) hay làm nhập
bào LRP6 bằng cách tạo liên kết đồng thời giữa LRP6 với thụ quan Krm (Kremen)
(Hình 1.3.c).

4

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

 
Hình 1.3 – Cơ chế tác động ức chế tín hiệu Wnt của một số Dkks

1.1.2. Protein Dkk3
Dkk3 không tương tác liên kết với LRP dẫn đến hoạt động điều hịa con đường
tín hiệu Wnt. Chức năng và cơ chế hoạt động của Dkk3 chưa được biết đến.
Trong cấu trúc phân tử của Dkk3, bên cạnh những vùng “colipase fold” và
DKK-N giàu cystein, Dkk3 cịn có thêm vùng sgy (Hình 1.2). Sgy hiện diện trong
cấu trúc protein Dkkl1 (Dickkopf-like protein 1). Ở chuột, Dkkl1 chỉ biểu hiện mạnh
trong giai đoạn phát triển phôi (từ giai đoạn hai tế bào cho đến giai đoạn đầu của
phơi – blastocyst). Trong khi đó, ở tinh hồn chuột, Dkkl1 chỉ biểu hiện mạnh ở

mức mRNA. Chức năng của sgy vẫn còn chưa được biết đến một cách rõ ràng [18].
Gen mã hóa cho protein Dkk3 được cho là gen khởi nguồn cho những gen mã
hóa cho những protein thành viên của họ Dkks. Những kết quả nghiên cứu ở thủy
tức (Hydra) cho thấy dkk3 là gen xuất hiện duy nhất trong họ Dkks và Dkk3 đóng
vai trị như những tín hiệu phát triển then chốt ở lồi này [4].
Dkk3 biểu hiện mạnh chuyên biệt ở những tế bào, những vùng mơ riêng biệt có
khả năng tăng sinh, chuyển dạng và hoạt động chức năng mạnh, như: từ vùng tủy
đến phần vỏ của tuyến thượng thận có khả năng sản sinh những hormone thiết yếu
(Suwa T và cs, 2003); ở những túi nhỏ của tuyến tiền liệt (Kawano Y và cs, 2006)
hay ở những quần thể tế bào beta tuyến tụy có khả năng sản xuất Insulin (Herman M
và cs, 2007); thậm chí ở cả những mạch máu mới đang được hình thành ở ung thư
trực tràng (Zitt M và cs, 2008). Trong một nghiên cứu của Aslan H và cộng sự
(2006) cho thấy sự biểu hiện Dkk3 ức chế việc hình thành xương nhưng khơng hề

5

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

ảnh hưởng đến sự hình thành sụn càng chứng tỏ Dkk3 có liên quan đến sự hoạt động
chức năng sản xuất, chuyển hóa của tế bào (sản xuất chất, sản sinh tế bào…). Dkk3
biểu hiện khác nhau trong từng giai đoạn phát triển của phôi ruồi giấm và sự biểu
hiện này giảm dần và mất hẳn khi cá thể trưởng thành. Ở những cá thể trưởng thành
thì hoạt động tăng sinh, chuyển hóa giảm dần. Dkk3 còn được xác định chức năng
như là một yếu tố kìm hãm khối u khi mà trong hầu hết các tế bào ung thư Dkk3 bị
ức chế biểu hiện (Bảng 1.1) và sự giảm biểu hiện Dkk3 ở những tế bào ung thư này
thường là do sự methyl hóa cao promoter gen Dkk3. Tuy nhiên, sự ức chế biểu hiện

Dkk3 ở các tế bào ung thư là không tuyệt đối, về sau có nhiều cơng trình nghiên cứu
đã phát hiện có những ung thư biểu hiện mạnh Dkk3, như hepatoblastoma và
hepatocyte carcinoma…. Việc giảm biểu hiện Dkk3 ở những tế bào ung thư này đều
ảnh hưởng đến sức sống của những tế bào này. Wen Y và cs (2008) đã ghi nhận
giảm biểu hiện Dkk3 sẽ kích hoạt tín hiệu β-catenin/TCF-4 ở ung thư phổi; Jung IL
và cộng sự (2010) cho thấy “knockdown” gen Dkk3 gây cảm ứng apoptosis ở ung
thư phổi (lung adenocarcinoma) do Dkk3 đóng vai trò làm giảm lượng ROS nội bào
của những tế bào ung thư này…[1][10][12][14][16][23][28][31][32].
Bảng 1.1 – Sự biểu hiện bất thường của Dkks ở một số tế bào ung thư [21].

6

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

Trong khi những protein thành viên của họ Dkks có vai trị điều hịa tín hiệu
Wnt thì vai trị của Dkk3 trong con đường tín hiệu Wnt cũng khơng rõ ràng. Một
nghiên cứu sự biểu hiện Dkk3 ở tế bào ung thư xương ác tính Saos-2 thì Dkk3 tham
gia việc điều hịa con đường tín hiệu Wnt-beta-catenin và thơng qua đó ức chế sự
xâm lấn và khả năng di động của những tế bào ung thư này (Hoang HB và cs, 2004)
hay trong một nghiên cứu khác Nakamura RE và cs (2007) đã chứng minh Dkk3 là
nhân tố điều hịa dương của tín hiệu Wnt nghĩa là Dkk3 làm tăng tín hiệu
Wnt…[11][20].
1.2.

Con đường tín hiệu Wnt [26].

Hình 1.4 – Con đường tín hiệu Wnt 

Ở động vật đa bào, con đường truyền tín hiệu được kích hoạt bởi những phân tử
Wnt (Wnt signaling pathway) là con đường tín hiệu then chốt của tế bào, tham gia
trong các q trình phát triển, tạo phơi và cả những quá trình phát sinh bệnh (ung
7

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

thư, …). Wnt gắn lên thụ quan của chúng có thể kích hoạt ba con đường tín hiệu sau
(Hình 1.3):
-

(1) Con đường chính (canonical) dẫn đến việc không phân hủy β-catenin
trong tế bào, được biết đến như hoạt động chức năng chính của Wnt, Wnt/βcatenin. Trong con đường này, phức hợp protein gồm Axin, APC (tumorsuppressor protein) và GSK-3 (Glycogen synthase kinase-3) có vai trị bắt
giữ β-catenin trong tế bào. Tế bào khi khơng có tín hiệu Wnt, ở tế bào chất,
β-catenin tạo thành một tổ hợp protein với Axin, GSK3β, APC và CK1α
(casein kinase Iα); lôi kéo βTrCP đến gắn vào. βTrCP thực hiện ubiquitine
hóa β-catenin. β-catenin bị ubiquitine hóa sẽ bị phân cắt bởi hệ thống
proteasome trong tế bào. Trong khi, ở những tế bào có Wnt gắn lên thụ quan
Fz sẽ kích hoạt phân tử protein Dishevelled (Dsh) chuyển sang trạng thái
hoạt động. Dsh hoạt động có khả năng ức chế hoạt động của Auxin-APCGSK3, không cho phức hợp này tương tác gắn kết với β-catenin, không lôi
kéo βTrCP. β-catenin không bị phân hủy có khả năng di chuyển vào nhân
kết hợp với những tác nhân phiên mã như TCF/LEF (T-cell
factor/lymphocyte enhancer factor) cảm ứng sự biểu hiện một số gen mục
tiêu. Ở tế bào ung thư, một số gen bị đột biến liên quan đến việc tạo phức

hợp Axin-GSK3-APC-CK1α-βcatenin làm β-catenin khơng bị bắt giữ và
khơng bị ubiquitine hóa.

-

(2) Con đường hoạt hóa RhoA/Rho kinase (ROCK) và c-Jun kinase (JNK)
(non-canonical) dẫn đến việc sắp xếp bộ khung xương tế bào thuận lợi cho
sự phân bào và khả năng xâm lấn.

-

(3) Con đường “Wnt/Ca2+” dẫn tới việc phóng thích Ca2+ nội bào thơng qua
việc hoạt hóa phospholipase C (PLC) và protein kinase C (PKC). Lượng ion
Ca2+ nội bào tăng lên dẫn tới việc khử phosphoryl hóa của NF-AT (Nuclear
factor of activated T-cells, một nhân tố phiên mã). NF-AT di chuyển vào
nhân tác động đến sự biểu hiện gen.

8

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

1.3.

Con đường tín hiệu sống của tế bào thông qua thụ quan EGF (EGFR

signaling pathway) [7][27][9].

Hình 1.5 – Sơ đồ vị trí hoạt động phosphoryl hóa của EGFR trong q trình truyền tín hiệu
trong tế bào [27].

Thụ quan EGF (Epidermal Growth Factor Rceptor - EGFR) là một glycoprotein
xuyên màng và là thụ quan của các nhân tố tăng trưởng biểu bì. Cấu hình của EGFR
gồm: một vùng thụ quan nằm ngoài tế bào (extracellular receptor domain), một vùng
xuyên màng và một vùng nội bào (intacellular domain). Vùng cấu trúc nằm trong tế
bào chất này có chức năng tyrosine kinase (RTKs), có khả năng chuyển nhóm
phosphate từ phân tử năng lượng ATP sang vị trí amino acid Tyrosine của phân tử
protein mục tiêu. EGFR biểu hiện với số lượng từ 40 000 đến 100 000 thụ quan trên

9

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

một tế bào bình thường, với chức năng kích hoạt những con đường dẫn truyền tín
hiệu tham gia điều hịa sự tăng sinh, biệt hóa và sức sống của tế bào. Những ligand
của EGFR được biết đến cho đến nay gồm: nhân tố tăng trưởng biểu bì (EGFEpidermal growth factor), amphiregulin, nhân tố tăng trưởng chuyển đổi α (TGFα –
Transforming Growth factor α), nhân tố tăng trưởng giống EGF gắn heparin (HBEGF), amphiregulin, betacellulin và epiregulin. Khi có sự gắn lên của một trong
những ligand, EGFR dimer-hóa chính nó dẫn tới q trình tự phosphoryl hóa
(autophosphorylation) tại những vị trí tyrosine ở vùng cấu trúc nằm trong tế bào
chất. Những tyrosine được phosphoryl hóa này sau đó có khả năng lơi kéo những
phân tử “adaptor” (Grb2, Shc,…), hay những tyrosine kinase nội bào khác đến thực
hiện vai trị khuếch đại tín hiệu bằng cách sản sinh những phân tử tín hiệu thứ cấp và
chuyển chúng đến những con đường tín hiệu quan trọng trong tế bào. Tùy vào

những vị trí tyrosine trên EGFR được phsophoryl hóa sẽ quyết định việc truyền tín
hiệu tiếp theo trong tế bào thông qua con đường nào kế tiếp (Hình 1.5).

Hình 1.6 – Sơ đồ hóa một số con đường hoạt động thơng qua sự hoạt hóa EGFR [34]

10

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

Sau đây là một số con đường tín hiệu quan trọng trong tế bào thơng qua sự kích
hoạt của EGFR (Hình 1.6)
1.3.1. Con đường Ras/MAPK.
Sau khi EGFR được gắn phối tử và tự phosphoryl hóa tại vị trí tyrosine thuộc
vùng cấu trúc nằm trong tế bào chất, những protein như Grb2 (growth factor
receptor bound protein 2) có vùng cấu trúc gắn lên những vị trí phosphotyrosine của
EGFR, đồng thời với một vùng cấu trúc khác có khả năng gắn với SOS (nhân tố trao
đổi Guanine). Phức hợp EGRF-Grb2-SOS làm SOS có khả năng gắn GTP cho Ras.
Ras được hoạt hóa cảm ứng hoạt tính kinase của Raf kinase, một protein kinase có
khả năng phosphoryl hóa tại các vị trí serine/threonine, Raf kinase sẽ phosphoryl
hóa và kích hoạt MEK, một serine/threonine kinase khác. MEK sẽ thực hiện
phosphoryl hóa và kích hoạt protein kinase phân bào MAPK (hay còn gọi là Erk –
Extracellular-signal regulated kinase) dẫn đến sự phân bào của tế bào. MAPK có hai
đồng phân MAPK-p44 (Erk1) và MAPK-p42 (Erk2). Những tác nhân đích cuối
dòng của MAPK là p90rsk và phospholipase A2, những tác nhân này liên quan đến
sự tăng sinh và biệt hóa tế bào.
1.3.2. Con đường PI3K/Akt.

EGFR ở trạng thái hoạt động có khả năng hoạt hóa phosphatidyl inositol-3
kinase (PI3K). Kinase này tạo phosphatidyl inositol triphosphate (PIP3). PIP3 lôi
kéo và tương tác với Akt (hay còn gọi là protein kinase B – PKB) thông qua vùng
tương đồng pleckstrin (PH). Akt tham gia điều hịa tín hiệu của nhiều q trình sinh
học thiết yếu của tế bào. Aktcó khả năng kích hoạt sự biểu hiện của một số protein
cảm ứng apoptosis, như những protein bất hoạt những protein thành viên của họ
Bcl-2); ức chế sự biểu hiện của BIM thông qua tác động lên nhân tố phiên mã như
FOXO và p53. Akt phosphoryl hóa Mdm2, một E3 ubiquitin ligase; Mdm2 có tác
dụng thúc đẩy nhanh sự phân hủy p53; giảm hoạt động của caspase-9. Một trong
những chức năng được bảo tồn nhất của Akt là vai trị làm tăng sinh khối tế bào
thơng qua sự hoạt động của phức hợp mTOR-1 và được điều hịa bởi những tín hiệu

11

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

của nhân tố tăng trưởng và dinh dưỡng. Hoạt động của Akt kích thích tăng sinh tế
bào thông qua những tương tác với những tác nhân cuối dịng trong sự điều hịa chu
trình tế bào như hoạt động phosphoryl hóa những nhân tố ức chế hoạt động kinase
phụ thuộc vào chu trình tế bào (p21Cip1/WAF1 và p27Kip1) và ngăn cản tác động
ức chế chu trình tế bào của chúng.
1.3.3. Con đường Stat3.
EGFR hoạt hóa con đường này thông qua Src hay Jak. Hai phân tử này sẽ tương
tác và phosphoryl hóa Stat3, dẫn tới sự dimer hóa của Stat3. Stat3 di chuyển vào
nhân, tại đây Stat3 gắn trình tự gồm 9bp (TTCNNNGAA) lên vùng điều hòa của
những gen mục tiêu tham gia điều hòa phiên mã.

1.4.

EGFR đối với ung thư và liệu pháp đích trong điều trị (targeted therapy)
[7][6]

1.4.1. Ung thư liên quan đến hoạt động của EGFR
Những nghiên cứu vào những năm 1980 cho thấy những thay đổi trên con đường
tín hiệu EGFR liên quan đến sự chuyển dạng ác tính ở những khối u. Thêm vào đó,
EGFR của tế bào tương đồng với gen ung thư (oncogene) v-erb (virus tăng sinh
hồng cầu ở chim). Gen này mã hóa cho một thụ quan EGF bị thiếu vùng gắn EGF
nhưng vẫn có vùng xuyên màng và vùng tham gia kích thích sự tăng sinh tế bào.
Hoạt động bất thường của EGFR còn tham gia vào sự chuyển dạng ác tính của
những tế bào bị nhiễm virus. Sự biểu hiện vượt mức EGFR trở thành “dấu ấn” cho
sự chuyển dạng ác tính ở tế bào khối u. Sự chuyển dạng ác tính là hậu quả của sự rối
loạn điều hòa EGFR xuất hiện ở người bởi những cơ chế khác nhau, như: biểu hiện
vượt ngưỡng thụ quan EGF, những đột biến hoạt động, những biến đổi trong q
trình dimer hóa, sự hoạt hóa những nhân tố tăng trưởng tự tiết, giảm bớt hay tăng
cường sự nhập bào những thụ quan đã được hoạt hóa, sự thiếu tính chuyên biệt cùa
những phosphatases để khử những mảnh tyrosine của EGFR đã được phosphoryl
hóa, và giảm bớt sự tái sản xuất. Trong đó, sự biểu hiện vượt ngưỡng gen egfr không
12

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

do sự khuếch đại bản sao của gene, và sự hoạt hóa EGFR bởi TGF-α trong chu trình

tự tiết, là hai cơ chế chính thường xảy ra trong quá trình diễn tiến và phát triển ung
thư. Hơn nữa, EGFR bị đột biến ở một vài bệnh ung thư và đặc biệt phổ biến ở ung
thư nguyên bào thần kinh sợi (glioblastoma).
Tế bào được ghi nhận có sự biểu hiện EGFR mạnh: tế bào biểu bì (epithelial) và
trung bì (mesenchymal). Cấp độ biểu hiện EGFR ở khối u không quan trọng bằng độ
hoạt động của EGFR đối với những tác nhân có khả năng gây ung thư cũng như
những tác nhân đáp ứng trong trị liệu. Những nhân tố tác động đến trạng thái hoạt
hóa gồm sự đột biến, dimer hóa của thụ quan và sự tăng biểu hiện của những ligand.
Tuy nhiên, sự phức tạp của việc truyền tín hiệu phụ thuộc vào những tương tác của
bốn thụ quan và sự gắn kết của chúng với ligand.
1.4.2. Liệu pháp đích đối với EGFR trong điều trị ung thư
Liệu pháp đích (targeted thrapy) gần đây được coi là phương thức điều trị ung
thư quan trọng. Hầu hết những con đường tín hiệu được nghiên cứu ứng dụng trong
liệu pháp đích đều liên quan đến EGFR. Việc biểu hiện mạnh EGFR ở ung thư liên
quan mạnh mẽ đến những rủi ro cao trong sự tái phát/di căn, giảm sức sống, và
kháng lại những liệu pháp hóa-xạ trị của ung thư. Kháng thể đơn dòng kháng EGFR
hay nhân tố ức chế Tyrosine kinase hiện nay đều được sử dụng lâm sàng trong điều
trị ung thư. Với việc gia tăng lợi ích của những tác nhân này và giá trị của nhiều tác
nhân mới trong tương lai, kiến thức về liệu pháp kháng EGFR thích hợp với giai
đoạn hiện tại của liệu pháp điều trị ung thư và với những hướng nghiên cứu mới
trong lĩnh vực ung thư học (oncology).
Sự hoạt hóa của EGFR dẫn đến sự tăng sinh, kháng apoptosis, và sự bám trải của
tế bào. EGFR được biểu hiện vượt ngưỡng ở nhiều khối u rắn và sự biểu hiện mạnh
này liên quan đến giai đoạn phát triển và sự dự đoán tiến triển xấu của ung thư. Vài
năm gần đây, sự gia tăng số lượng thử nghiệm lâm sàng trong việc kiểm soát những
khối ung thư rắn ác tính (như ung thư vú, ruột kết, tuyến tụy, đầu và cổ, thận, dạ dày
và phổi) càng có giá trị cho thấy hiệu quả lâm sàng của những kháng thể đơn dòng
kháng EGFR và những tác nhân phân tử nhỏ (dạng uống) ức chế Tyrosine kinase
13

 


Chương 1 – Tổng quan tài liệu
 

(TKIs – Tyrosine Kinase Inhibitors). Những thuốc đánh vào hoạt động của EGFR ở
những khối u rắn ác tính được phát triển từ những năm 1980. Trong những năm gần
đây là sự phát triển những kháng thể đơn dòng kháng EGFR và những phân tử nhỏ
ức chế tyrosine kinase của EGFR (Bảng 1.2).
Bảng 1.2 – Một số tác nhân đối kháng với hoạt động cuả EGFR [6]

STT

Tác nhân kháng EGFR

Cơ chế tác động

1

Erlotinib

TKI của phức hợp HER1/EGFR

2

Gefitinib

TKI của EGFR

3

Cetuximab

Kháng thể đơn dòng IgG1 gắn lên EGFR và
khóa hoạt động phosphoryl hóa của thụ quan
Là kháng thể IgG2 gắn vào vùng ngoại bào của
4

Panitumumab

EGFR do đó ức chế sự hoạt động và
phosphoryl hóa của vùng kinase nội bào.
Tác nhân ức chế nhiều loại kinase, như

5

Sorefenib

Raff/MAPK-ERK kinase, VEGFR-2, VEGFR3 và PDGFR-β.
TKI của HER2/neu và EGFR, khóa những vị trí

6

Lapatinib

tự phosphoryl hóa trên thụ quan.

14

 


 

CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

 
 


Chương 2 – Vật liệu, phương pháp

1. Vật liệu
1.1.

A

Dòng tế bào

B

C

Hình 2.1 – Một số dịng tế bào sử dụng
A: tế bào tPH5CH; B – tế bào HuH6 clone 5; C – tế bào RD

1.1.1. Dòng tPH5CH (normal human hepatocyte): là những tế bào biểu mô
gan người không tái tạo (nonneoplastic hepatocytes) đã được Masayuki

Noguchi và nhóm nghiên cứu (National Cancer Center Research
Institute, Tokyo, Japan – 1995) thiết lập từ gan người giải phẫu và đã
được chuyển vào thành công đoạn lớn gen kháng nguyên T của virus
SV40 (SV40 large T antigen) không làm đột biến gen p53 như những
ung thư gan thường có. Có thể nói đây là dịng tế bào gan bình thường ở
người có khả năng tăng sinh trong in vitro nhưng khơng hình thành khối
u khi được ni cấy khảm trên chuột “nude”, rất hữu ích làm mơ hình
nghiên cứu đối chiếu với những mơ hình ung thư gan ác tính ở người
(human hepatocarcinogenesis) [22].
1.1.2. Dịng HuH6-clone 5 (hepatoblastoma-JCRB0401): là dòng tế bào ung
thư gan được phân lập từ trẻ em. Có hình thái tế bào giống tế bào biểu
mô. Hepatoblastoma là những tế bào ung thư gan giống với những tế bào
có khả năng tái sinh gan trong suốt sự phát triển phôi và bào thai, những
tê bào này vẫn phụ thuộc vào những nhân tố tăng trưởng. 50%
Hepatoblastoma mang đột biến liên quan đến gen β-catenin [24].

15

 


Chương 2 – Vật liệu, phương pháp 
 

1.1.3. Dòng RD (rhabdomyosarcoma): là dòng tế bào ung thư cơ xương
người được phân lập từ khối u cơ xương chậu ác tính của một bé gái 7
tuổi vào năm 1968 (Mc Allister và cộng sự, 1969).
Đặc điểm tế bào:
-

Có hình thái tế bào dạng que.

1.2.

Có nguồn gốc phát triển từ trung bì (messenchymal origin) của phôi.
Đột biến liên quan đến gen ras, gen Rb-1 (retinoblastoma).

Hóa chất

1.2.1. Mơi trường ni cấy tế bào D’MEM F12 (Dulbecco’s modified
Eagle’s medium F12) được bổ sung nhân tố tăng trưởng EGF
(100ng/ml), insulin (10µg/ml), glucagon (4µg/ml), linoleic acid
(5µg/ml),

hydrocortisone

(10-6M),

selenium

(10-7M),

transferrin

(5µg/ml), FBS 10%.
1.2.2. Môi trường OPTI-MEM I không huyết thanh (Sigma)
1.2.3. Dung dịch PBS (-) 1X
1.2.4. Dung dịch Trypsin 2,5%/EDTA 0,5M
2. Phương pháp
2.1.

Nuôi cấy tế bào

- Tế bào được cấy chuyền khi đã đạt độ phủ 70-80% diện tích bình ni cấy: loại
bỏ môi trường cũ, và rửa sạch môi trường bằng dung dịch PBS (-) 1X.
- Tách tế bào bằng cách ủ tế bào với dung dịch Trypsin/EDTA 0.25% và quan sát
tế bào dưới kính hiển vi (khoảng 3 phút).
- Khi tế bào bắt đầu co tròn, loại bỏ nhanh Trypsin/EDTA, vỗ nhẹ hai thành
bình. Thêm 1 ml mơi trường ni cấy. Dùng pipette huyền phù nhẹ tế bào. Chuyển
dịch tế bào vào bình ni cấy. Bổ sung mơi trường ni cấy vào bình.
- Ủ trong tủ ấm 5% CO2, 370C.

16

 


Chương 2 – Vật liệu, phương pháp 
 

2.2.

Nhiễm siRNA vào tế bào ni cấy

Sử dụng quy trình chuyển siRNA của Invitrogen cho dòng tế bào SK-N-SH
(“Transfecting Stealth RNAi or siRNA into SK-N-SH cells using Lipofectamine
RNAiMAX) đã được tính tốn cho quy mô nuôi tế bào trên đĩa 10mm.
Chuẩn bị môi trường chuyền siRNA:
+ Cho thử nghiệm chuyển Dkk3 siRNA (si*): pha lỗng Dkk3 siRNA
(Invitrogen/5’AUAGCUGGGAGGUAAGUUUGCCAGG3’

và

5’CCUGGCAAACUUACCUCCCAGCUAU3’) trong 2ml mơi trường Opti-MEM I

(khơng có huyết thanh) để đạt hàm lượng cuối cùng là 120pmol.
+ Cho thử nghiệm âm (chứng) (-*): pha loãng Universal negative siRNA
(Invitrogen) trong 2ml mơi trường Opti-MEM I (khơng có huyết thanh) để đạt hàm
lượng cuối cùng là 120pmol.
+ Bổ sung 20µl Lipofectamine RNAiMAX và trộn đều nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ
phịng khoảng 10-20phút (có thể ủ tối đa 45 phút)
Tế bào chuẩn bị cho quá trình nhiễm siRNA được nuôi trước trong môi trường
không bổ sung kháng sinh sau 24 giờ đạt mật độ 30-50% độ phủ. Chuyển 2ml dịch
(si*)/(-*) vào đĩa nuôi cấy. Di chuyển nhẹ nhàng đĩa để trộn đều.
Ủ tế bào đã chuyển siRNA ở tủ 37oC, 5%CO2 sau 24 giờ; tế bào chuyển siRNA
được thay môi trường nuôi cấy và tiếp tục ủ trong khoảng thời gian khảo sát là
24giờ, 48giờ và 72giờ.

2.3.

Realtime RT-PCR sử dụng SYBRGreen

Đây là phương pháp định lượng RNA dựa trên kỹ thuật phiên mã ngược (reverse
transcription) phối hợp với kỹ thuật PCR có sử dụng các chất phát huỳnh quang
SYBRGreen. Các phân tử SYBRGreen không phát huỳnh quang ở dạng tự do trong
môi trường, chỉ phát huỳnh quang khi gắn chèn vào mạch đôi DNA. Cường độ

17

 

Chương 2 – Vật liệu, phương pháp 
 

huỳnh quang đo được tương ứng với số lượng bản sao DNA được nhân bản tại thời
điểm đo.
Quy trình như sau :
- Tách chiết RNA tổng số của các lô quần thể tế bào với mật độ tế bào đạt tế bào
5-6.106 tế bào/ml giống nhau giữa các lô bằng RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen).
- Kiểm tra chất lượng RNA tổng số sau khi tách bằng đo mật độ quang và điện di
trên gel
- Thực hiện phản ứng chuyển RNA thành cDNA theo bộ kit cDNA (Applied
Biosystems)
- Tiến hành phản ứng RT-PCR (sử dụng Power SYBR® Green PCR Master
Mix-Applied Biosystems)
* 18S rRNA (chứng nội/ TAKARA BIO.INC)
* egfr (TAKARA BIO.INC/Primer set ID: HA087479))
- Tính mức độ tăng biểu hiện tương đối của gene là tỉ lệ tương đối giữa egfr và
18SRNA. Giá trị tính được cho phép định lượng tương đối mRNA của gene đặc hiệu
giữa mẫu có và khơng có xử lý thuốc.
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.4.

Western blot

Phương pháp này được sử dụng để xác định sự biểu hiện của những protein sau:
Dkk3, β-actin, P-Erk1/2, Erk1/2, P-Akt, Akt, P-Stat3 và Stat3 trong ba loại quần thể
tế bào là tPH5CH, HuH6 clone 5 và RD. Nguyên tắc của phương pháp này là dịch ly

giải protein có được từ các quần thể tế bào được biến tính và phân tách kích thước
trên gel polyacrilamide; sau đó, những protein này được chuyển lên màng lai và cuối
cùng được phát hiện bởi các kháng thể chuyên biệt.
Quy trình:
18