xác định con đường tín hiệu protein kinase hoạt hóa phân bào (mapk) trong ung thư biểu mô tuyến giáp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI


PHAN THỊ MINH PHƯƠNG




XÁC ĐỊNH CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU PROTEIN
KINASE HOẠT HÓA PHÂN BÀO (MAPK)
TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN GIÁP


LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC


Chuyên ngành: Miễn
Dịch

Mã số:
62.72.04.20



HÀ NỘI –
2010

MỤC LỤC
Trang phụ bìa

Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng, biểu đồ
Danh mục các hình vẽ, ảnh
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Tổng quan về ung thư biểu mô tuyến giáp 4
1.2. Các con đường tín hiệu và quá trình phát sinh, phát triển ung thư 8
1.3. Protein tương tác với Heparansulfate (Heparan Sulfate Interacting
Protein: HIP) và vai trò của HIP trong ung thư 23
1.4. Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (Epidermal Growth Factor
Receptor: EGFR) và vai trò của EGFR trong ung thư 31
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
2.1. Đối tượng nghiên cứu 35
2.2. Phương pháp nghiên cứu 36
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 51
2.4. Quản lý thông tin, phân tích dữ liệu 52
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53
3.1. Kết quả tách chiết và độ tinh sạch RNA 53
3.2. Kết quả nghiên cứu sự tham gia của HIP trong ung thư biểu mô
tuyến giáp 54
3.3. Kết quả nghiên cứu sự tham gia của EGFR trong ung thư biểu
mô tuyến giáp 67
3.4. Tương quan giữa HIP và EGFR trong mô ung thư biểu mô tuyến giáp 74
3.5. Kết quả sự hiện diện của các Protein ERK1 và ERK2 trên tế bào
ung thư biểu mô nuôi cấy 75
Chương 4. BÀN LUẬN 79
4.1. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 79
4.2. Vai trò của Heparansulfate Interacting Protein (HIP) trong ung

thư biểu mô tuyến giáp 80
4.3. Vai trò của EGFR trong ung thư biểu mô tuyến giáp 92
4.4. Tương quan giữa HIP và EGFR trong mô ung thư biểu mô tuyến giáp 104
4.5. Sự biểu lộ của các Protein ERK1 và ERK2 trên tế bào ung thư biểu
mô nuôi cấy 106
KẾT LUẬN 110
KIẾN NGHỊ 111
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

Bảng 3.1. Độ tinh sạch và nồng độ của RNA tách chiết trên mẫu
nghiên cứu 54
Bảng 3.2. Mức độ sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và mô UTBM
tuyến giáp 56
Bảng 3.3. Mức độ sao chép của HIP và kích thước u 60
Bảng 3.4. Mức độ sao chép của HIP và tình trạng di căn hạch 60
Bảng 3.5: So sánh mức độ sao chép của HIP theo giai đoạn ung thư 61
Bảng 3.6. Kết quả tách chiết protein và nồng độ protein 62
Bảng 3.7. Kết quả Western blot mức độ biểu lộ HIP 65
Bảng 3.8. Mức độ sao chép của EGFR ở mô bướu giáp keo và mô
UTBM tuyến giáp 69
Bảng 3.9. Mức độ sao chép của EGFR và kích thước u 71
Bảng 3.10. So sánh mức độ sao chép của EGFR và tình trạng di căn hạch 72
Bảng 3.11. So sánh mức độ sao chép của EGFR theo giai đoạn ung thư 73
Biểu đồ 3.1: So sánh sự sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và mô

ung thư tuyến giáp 57
Biểu đồ 3.2. So sánh mức độ sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và
mô ung thư biểu mô tuyến giáp bằng RT-PCR định lượng 59
Biểu đồ 3.3. Mức độ biểu lộ HIP ở mô bướu giáp và mô ung thư theo
loại mô học 65
Biểu đồ 3.4. Tương quan giữa mức độ sao chép và mức độ biểu lộ của
HIP 66
Biểu đồ 3.5. So sánh sự sao chép của EGFR ở mô bướu giáp keo và mô
ung thư tuyến giáp 70
Biểu đồ 3.6. Tương quan giữa HIP và EGFR trên mô ung thư biểu mô
tuyến giáp nghiên cứu 74
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ẢNH

Hình 1.1. Tuyến giáp và cấu trúc nang giáp 4
Hình 1.2. Con đường tín hiệu MAPK 13
Hình 1.3. Cấu trúc mô phỏng các vùng chức năng của HIP 25
Hình 1.4. Hoạt hóa EGFR bởi EGF 31
Hình 1.5. Con đường tín hiệu MAPK hoạt hoá bởi EGF 33
Hình 2.1. Quy trình tách chiết RNA từ mô tươi 38
Hình 2.2. Hình ảnh minh họa phương pháp Western blot 47
Hình 2.3. Sơ đồ phương pháp hoá mô miễn dịch với phức hợp Avidin-Biotin 49
Ảnh 3.1. Hình ảnh điện di kiểm tra RNA tách chiết từ mô tuyến giáp
trên gel agarose 0,8%, điện thế 100V trong 10 phút 53
Ảnh 3.2. Kết quả phản ứng RT-PCR của gen HIP và GAPDH trên mô
bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp. 55
Ảnh 3.3. Kết quả phản ứng RT-PCR của gen HIP và GAPDH trên mô
bướu giáp keo và mô ung thư 55
Ảnh 3.4. Kết quả RT-PCR định lượng đánh giá mức độ sao chép HIP ở
mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp sử dụng kỹ thuật
điện di mao quản 58

Ảnh 3.5. Kết quả sao chép mRNA của HIP theo giai đoạn ung thư 61
Ảnh 3.6. Hình ảnh nhuộm Coomasie blue sau điện di SDS-PAGE
protein tổng số tách chiết từ mô ung thư và bướu giáp keo 63
Ảnh 3.7. Kết quả Western blot đánh giá mức độ biểu lộ HIP ở mô ung thư
và bướu giáp keo lành tính 64
Ảnh 3.8. Kết quả Western blot đánh giá mức độ biểu lộ HIP ở mô ung
thư và mô bướu giáp keo lành tính 64
Ảnh 3.9. Kết quả phản ứng RT - PCR của gen EGFR và GAPDH trên
mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp 67
Ảnh 3.10. Kết quả phản ứng RT - PCR của gen EGFR và GAPDH trên
mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp 68
Ảnh 3.11. Kết quả phản ứng RT - PCR của gen EGFR và GAPDH trên
mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp 68
Ảnh 3.12. Tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy trong môi trường FBS sau 24h. 75
Ảnh 3.13. Tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy trong môi trường FBS 76
Ảnh 3.14. Nhuộm Coomasie blue sau điện di SDS-PAGE protein tổng
số tách chiết từ tế bào nuôi cấy. 77
Ảnh 3.15. Kết quả Western blot xác định sự biểu lộ hai protein ERK1 và
ERK2 ở dòng tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy 77
Ảnh 4.1. Hình ảnh các loại mô học của khối u tuyến giáp……………… 99
Các chữ viết tắt




bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
(yu t phỏt trin nguyờn bo si kim tớnh)
bp
base pair (đơn vị đo s lng các acid nucleic)
CDK

Cyclin- dependent kinase (kinase ph thuc cyclin)
cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid
(ADN bổ sung)
DNA Deoxyribonucleic Acid
EGF Epidermal growth factor (yếu tố phát triển biểu mô)
EGFR Epidermal growth factor Receptor
(thụ thể của yếu tố phát triển biểu mô)
ERK Extracellular signal regulated kinase
(Kinase đợc điều hòa bởi tín hiệu ngoại bào)
FBS Fetal Bovine Serum ( huyết thanh phôi bò)
GAPDH Glyceraldehyd phosphate dehydrogenase
GF
Growth Factor (yu t phỏt trin)
GFR
Growth Factor Receptor (th th yu t phỏt trin )
HIP
Heparansulfate Interacting Protein
(protein tng tỏc vi Heparansulfate)
HMDM
Hoỏ min dch mụ
HP/HS
Heparin v Heparansulfate
kD
Kilo Dalton (đơn vị đo trọng lợng protein)
MAPK Mitogen Activated Protein kinase
(Protein kinase ho¹t hãa ph©n bµo)
MEK Mitogen Activated Protein kinase kinase
(Kinase cña protein kinase ho¹t hãa ph©n bµo)
mRNA
Message Ribonucleic Acid (ARN thông tin)

RNA
Ribonucleic Acid
PCR
Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi)
PI3K
Phosphoinositide 3-Kinase
PTC Papillary Thyroid Carcinoma
(ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú)
RAF Protein RAF
RAS Protein RAS
RTK Receptor Tyrosin kinase
RT-PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi với enzyme sao chép ngược)
TF
Transcription factor (yếu tố sao chép)
TGF Transforming Growth factor
(yÕu tè ph¸t triÓn chuyển dạng)
UTBM Ung thư biểu mô
WNT Protein WNT


1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh ung thư ngày càng có xu hướng gia tăng trong những thập niên
gần đây. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, hàng năm trên toàn cầu
có khoảng trên 10 triệu người mắc bệnh ung thư và khoảng trên 6 triệu
người chết do căn bệnh này. Ở nước ta, theo ghi nhận sơ bộ ở Hà Nội,
thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh thành khác, ước tính mỗi năm có

khoảng 150.000 trường hợp mới mắc và khoảng 75.000 người chết vì ung
thư. Tuy nhiên, căn bệnh ung thư vẫn có thể chữa khỏi nếu được phát hiện
sớm và điều trị kịp thời; người mắc bệnh ung thư có thể kéo dài thời gian
sống, nâng cao chất lượng cuộc sống nếu có được phương pháp điều trị phù
hợp và tận gốc [5].
Chính vì thế, việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh sinh ung thư để từ
đó tìm ra phương pháp điều trị can thiệp là mối quan tâm hàng đầu của các
nhà Y-Sinh học hiện nay. Trong khuynh hướng nghiên cứu về cơ chế bệnh
sinh ung thư nói chung và ung thư tuyến giáp nói riêng, các nhà khoa học
đi theo hai hướng tiếp cận chính: i) nghiên cứu về di truyền phân tử tế bào
nhằm tìm ra các gen gây ung thư hay các thương tổn của hệ di truyền tế
bào do các tác nhân tại chỗ hay các tác nhân bên ngoài; ii) nghiên cứu về
protein trong đó các protein màng là mục tiêu chính. Các protein màng
đóng vai trò quan trọng trong việc tiếp nhận, dẫn truyền tín hiệu tế bào-tế
bào hay khoảng gian bào-tế bào. Các kênh tín hiệu này có chức năng quan
trọng trong quá trình trưởng thành, phát triển, biệt hóa và di truyền của tế
bào. Cho đến nay rất nhiều protein thuộc loại này tương ứng với nhiều
kênh dẫn truyền tín hiệu khác nhau đã được phát hiện, trong đó có: thụ thể
2
của yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) và protein tương tác với heparan
sulfate (HIP). Sự thể hiện của các protein này phản ánh chặt chẽ tình trạng
hoạt động của tế bào.
Các thụ thể trên bề mặt màng tế bào có vai trò tiếp nhận các tín hiệu điều
hoà tăng sinh, biệt hóa tế bào từ các yếu tố có trong khoảng gian bào như
EGF, trophin, cytokin, hormon… Tùy theo bản chất tín hiệu đến tế bào mà
chúng có thể được dẫn truyền theo nhiều kênh dẫn truyền khác nhau như:
Hedgehog; Wnt; PI3K; MAPK (mitogen activated protein kinase) Nhiều
nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, thông tin tín hiệu được tiếp nhận qua thụ
thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) và protein tương tác với heparan sulfate
(HIP) được truyền qua con đường tín hiệu của MAPK mà dạng nguyên mẫu

của nó là các protein ERK1 và ERK2 [27], [144]. Tín hiệu này sau đó được
chuyển vào nhân tế bào, qua một loạt các phản ứng dây chuyền để tác động
lên quá trình sao chép DNA và qua đó tham gia điều hoà sự tăng sinh và biệt
hóa tế bào. Nhiều đột biến của các yếu tố tín hiệu dọc theo con đường MAPK
đã được phát hiện trong ung thư biểu mô tuyến giáp. Vì vậy ung thư biểu mô
tuyến giáp là mô hình phù hợp cho việc thiết kế nghiên cứu này.
Hoạt động của các con đường tín hiệu
chịu sự điều hòa chặt chẽ bởi các
yếu tố ở khoảng gian bào trong đó có các sản phẩm của quá trình đáp ứng
miễn dịch như cytokin, interleukin, các peptid, yếu tố phát triển Chính vì
vậy, việc nghiên cứu cơ chế phân tử của quá trình dẫn truyền tín hiệu trong
ung thư nói chung và ung thư tuyến giáp nói riêng còn phải được đặt trong
một cái nhìn tổng thể về sự điều hòa, đáp ứng miễn dịch tại chỗ hoặc toàn
thân của cơ thể chủ [10]. Đồng thời nghiên cứu con đường dẫn truyền tín hiệu
trong ung thư sẽ kích hoạt khả năng chọn lựa liệu pháp điều trị mới- liệu pháp
3
ngăn cản con đường dẫn truyền tín hiệu- giúp kiểm soát ung thư trong tầm
với của y học. Vì vậy đề tài: “Xác định con đường tín hiệu protein kinase
hoạt hóa
phân bào (MAPK) trong ung thư biểu mô tuyến giáp” được tiến
hành với các mục tiêu sau:
1. Xác định sự sao chép và biểu lộ của protein tương tác với heparan
sulfate (HIP) và thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) ở mô ung thư
biểu mô tuyến giáp.
2. Xác định mối tương quan của HIP và EGFR ở mô ung thư biểu
mô tuyến giáp.
3. Xác định sự biểu lộ của protein ERK1 và ERK2 ở tế bào ung thư biểu
mô nuôi cấy.

4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN GIÁP
1.1.1. Cấu trúc tuyến giáp











Tuyến giáp
Nhìn
nghiêng
Thùy bên
Nhìn thẳng
Eo
Tế bào
nang

Nang
giáp

Chất keo
Thùy bên

Tuyến giáp
Tuyến cận giáp trên
Tuyến cận
giáp dưới
T
ế
Hình 1.1. Tuyến giáp và cấu trúc nang giáp [51]

Tuyến giáp gồm những đơn vị cấu tạo được gọi là nang tuyến giáp. Nang
tuyến giáp có đường kính khoảng 100-300 µm, chứa đầy các chất keo trong
lòng nang. Lòng nang được lót bởi một lớp tế bào hình khối đa diện hoặc hình
trụ là tế bào nang (tiết ra tiền hormon tuyến giáp) xen kẽ với tế bào C (tiết ra
hormon calcitonin tham gia điều hòa chuyển hóa calci). Tế bào C chiếm
khoảng 1% tổng số lượng tế bào nang, là những tế bào lớn, hình cầu, sáng
màu. Hai loại tế bào nang và tế bào C đều có thể ác tính hóa để trở thành ung
thư tuyến giáp với các thể loại tế bào học khác nhau [105].
5
1.1.2. Dịch tễ học ung thư biểu mô tuyến giáp
Ung thư biểu mô tuyến giáp là sự ác tính của lớp tế bào biểu mô chế tiết
thành các nang tuyến. Với một tỷ lệ gia tăng trên khắp thế giới, ung thư biểu
mô tuyến giáp đứng hàng thứ bảy trong số các loại ung thư phổ biến ở phụ nữ
trong năm 2007 và là loại ung thư phổ biến nhất trong hệ thống nội tiết [45],
[59].
Ung thư tuyến giáp chiếm tỷ lệ 1% trong tổng số các loại ung thư. Tỷ lệ
này cao ở những nước có bệnh bướu cổ đơn thuần. Điều này chứng tỏ ung thư
tuyến giáp có liên quan tới các u lành tuyến giáp. Một vài dân tộc trên thế giới
đã được xác định rõ là có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn. Ở Hoa Kỳ, hàng năm ước
tính có khoảng 22.000 trường hợp ung thư tuyến giáp mới mắc [27], [44]. Ở
Việt Nam, tỷ lệ ung thư tuyến giáp ở những địa phương có bệnh bướu giáp
đơn thuần cao hơn những vùng khác. Tỷ lệ bệnh này gia tăng ở những người

xạ trị vùng đầu cổ lúc trẻ. Xạ trị sau tuổi 21có nguy cơ gây ra ung thư tuyến
giáp ít hơn. Khoảng 20% bệnh xảy ra ở những bệnh nhân có phình giáp hạt
(đơn hay đa hạt) và khoảng 3% ở các bệnh nhân có u nang tuyến giáp. Bệnh
thường gặp ở mọi lứa tuổi song có hai đỉnh: một đỉnh thấp ở giai đoạn 7-20
tuổi và một đỉnh cao ở lứa tuổi 40-60, nữ cao hơn nam từ 2-3 lần và ở nam thì
bệnh ít ác tính hơn [2], [13].
1.1.3. Phân loại ung thư biểu mô tuyến giáp
Người ta chia ung thư biểu mô tuyến giáp thành hai loại: thể biệt hóa và
thể không biệt hóa. Hai thể này khác nhau về tiến triển lâm sàng cũng như
tiên lượng. Thể biệt hóa thường gặp ở người trẻ, tiến triển chậm trong nhiều
năm, nếu chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời sẽ cho kết quả tốt. Ngược lại, thể
không biệt hóa lại thường gặp ở người trên 60 tuổi, tiến triển nhanh và hiếm
có bệnh nhân sống quá 5 năm. Xếp theo thể loại mô bệnh học, ung thư tuyến
giáp có nhiều thể khác nhau: thể nhú (Papillary carcinoma), thể nang
(Follicular carcinoma), tế bào Hurthle, thể tủy (Medullary carcinoma) và thể
6
không biệt hóa (Anaplastic carcinoma). Trong đó thể nhú hay gặp nhất, chiếm
khoảng 80% tổng số ung thư tuyến giáp, thể nang chiếm 12% và thể tuỷ
khoảng 6%. Các thể ung thư khác như sarcom nguyên phát, u lympho ác tính
hay ung thư tuyến giáp thứ phát do di căn từ nơi khác đến thì hiếm gặp. Tỷ lệ
sống sau 5 năm của ung thư giáp thể nhú là 80-90%, thể nang là 50-70% và
thể tủy là 30-40%. Trong khi đó tỷ lệ này ở thể không biệt hóa chỉ dưới 5% và
đa số các bệnh nhân thuộc thể này chết trong vòng một năm [33], [68], [142].

Tế bào C
Ung thư thể nhú
Phì đại lành tính
Ung thư thể tủy
Ung thư thể nang
Ung thư thể không
biệt hóa
- Không có tính chất gia đình
- Có tính chất gia đình
Tế bào nang



Sơ đồ: Quá trình hình thành và tiến triển của ung thư tuyến giáp [105]

1.1.4. Các phương pháp phát hiện ung thư tuyến giáp
Trong một số trường hợp ung thư tuyến giáp có các triệu chứng như:
khàn giọng, đau cổ và tuyến giáp to. Ung thư tuyến giáp thường ở dạng những
nhân cứng, do bệnh nhân tự phát hiện ra hoặc do người thân hay bạn bè phát
hiện. Điều quan trọng là phải chẩn đoán phân biệt giữa nhân giáp lành và
nhân ung thư. Các xét nghiệm cận lâm sàng định kỳ như xét nghiệm hóa sinh,
siêu âm, xạ đồ giúp cung cấp các thông tin để theo dõi sự tiến triển của khối
nhân giáp cứng.
7
Xét nghiệm hormon tuyến giáp thường ít có giá trị và không giúp cho
việc chẩn đoán phân biệt giữa phì đại tuyến giáp lành tính và ung thư giáp.
Tuy nhiên khi có triệu chứng cường giáp hoặc suy giáp thì thiên về u giáp
lành tính. Nồng độ thyroglobulin có giá trị một khi chẩn đoán ung thư giáp đã
được khẳng định và không có giá trị trong việc chẩn đoán phân biệt giữa u

giáp lành tính và ung thư. Siêu âm giúp xác định thể tích tuyến giáp, số lượng
và kích thước của các nhân và giúp định hướng cho kỹ thuật chọc hút bằng
kim nhỏ hoặc sinh thiết. Một số hình ảnh siêu âm điển hình có thể giúp thầy
thuốc lâm sàng nghĩ đến nhân giáp lành tính hoặc nhân ung thư. Tuy nhiên
chỉ một kỹ thuật siêu âm không cho phép chẩn đoán phân biệt hai thể loại
bệnh lý trên. Xạ đồ tuyến giáp giúp phân biệt nhân lạnh, nóng hay nhân ấm
thông qua việc xác định độ tập trung iod trên film. Khoảng 85% nhân giáp là
nhân lạnh, 10% là nhân ấm và chỉ 5% thuộc nhân nóng. Cần phải lưu ý rằng
trong số trên thì 85% nhân lạnh, 90% nhân ấm và 95% nhân nóng đều là lành
tính. Mặc dù xạ đồ tuyến giáp có thể định hướng người thầy thuốc nghĩ đến
nhân giáp lành tính hay ung thư, song chỉ một kỹ thuật này không thể đưa ra
một chẩn đoán xác định cho bệnh nhân.
Cho đến nay, chỉ có một xét nghiệm duy nhất giúp chẩn đoán phân biệt
nhân giáp ung thư và nhân giáp lành là chẩn đoán tế bào học nhờ sinh thiết.
Nhân giáp thường dễ dàng chọc hút bởi kỹ thuật sử dụng kim nhỏ (fine needle
aspiration biopsy: FNA). Có thể nói kỹ thuật sử dụng kim nhỏ là công cụ chẩn
đoán hữu hiệu trong việc đánh giá tình trạng lâm sàng của các nhân tuyến
giáp. Tuy nhiên khoảng chừng 15-30% kết quả của phương pháp cho trả lời là
“nghi ngờ” hay “chưa xác định” [109]. Các trường hợp “chẩn đoán nghi ngờ”
thường là: ung thư thể nhú, các dạng khác nhau của ung thư thể tủy, loạn sản
tế bào Hurthle, hoặc các trường hợp tế bào học không điển hình khác. Chính
vì vậy việc xác định từng trường hợp nhân giáp lành tính hay ác tính luôn là
8
vấn đề thử thách đối với các nhà tế bào học. Hơn nữa, để phát hiện được tế
bào ung thư, thường chỉ khi khối u đã thành hình rõ; vào thời điểm đó hiệu
quả của sự can thiệp đều hạn chế. Vì thế, trong những năm trở lại đây nhiều
nhà nghiên cứu đã nghĩ đến xu hướng sử dụng kỹ thuật chẩn đoán sinh học
phân tử nhằm phát hiện những biến đổi về gen sớm nhất trước khi có sự biến
đổi về hình thái tế bào. Do đó, việc tìm hiểu các biến đổi gen trong quá trình
phát sinh ung thư là cần thiết giúp tìm ra các dấu ấn ung thư mới góp phần

chẩn đoán sớm bệnh ung thư.
Bằng kỹ thuật microarray sử dụng mô tuyến giáp lành tính đối chiếu với
các dòng tế bào/mô ung thư tuyến giáp người ta đã phát hiện được khoảng
700 gen bị hoạt hóa và 220 gen bị ức chế ở các dòng tế bào ung thư giáp so
với mô lành tính ở nhiều mức độ khác nhau. Trong số đó, nhiều gen đã được
biết đến và nghiên cứu khá kỹ lưỡng như: RET, BRAF, Ras, p53, UbcH10
(Cyclin-selective ubiquitin carrier protein) và CBX7 (Chromobox homolog 7).
Các nhà khoa học sử dụng kỹ thuật PCR định lượng (real time PCR) để định
lượng quá trình sao chép các gen này ở trong các thể mô ung thư tuyến giáp
khác nhau nhằm mục đích phát triển các dấu ấn ung thư mới phục vụ cho
chẩn đoán. Kết quả cho thấy mức độ hoạt hóa/ức chế các gen này phụ thuộc
vào mức độ ác tính của từng thể loại tế bào học. Trong đó thể ung thư tuyến
giáp không biệt hóa (anaplastic thyroid carcinoma) bao giờ cũng thể hiện rõ
nét nhất [67], [105], [145].
1.2. CÁC CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT SINH,
PHÁT TRIỂN UNG THƯ
Sự phát triển, biệt hóa và sống còn của các tế bào bình thường được điều
hoà bởi một số lượng giới hạn các con đường tín hiệu mà trong đó phần nào
liên kết với nhau. Các con đường tín hiệu truyền và kết hợp các tín hiệu từ
ngoại bào như: các yếu tố phát triển, hormon, các liên kết tế bào-tế bào, tế
bào-khoảng gian bào thông qua các thụ thể trên màng tế bào đi vào bên trong
9
tế bào, rồi tiếp tục qua các protein dẫn truyền trong bào tương để đi vào nhân
tế bào. Ở đây, chúng hoạt hóa các gen sao chép dẫn đến sự tăng sinh và biệt
hóa tế bào. Các loại protein tín hiệu, các protein màng, protein bào tương và
protein nhân đều là sản phẩm của c-oncogen (proto-oncogen) trong điều kiện
bình thường. Khi có sự mất điều hoà hoạt động của chúng, các c-oncogen đột
biến trở thành oncogen có thể làm xuất hiện ung thư và trong những tình
huống này con đường tín hiệu sẽ trở thành “con đường tín hiệu sinh ung thư”.
Sự hoạt động không phù hợp hoặc là sự bất hoạt của các con đường tín

hiệu là yếu tố quyết định đối với sự tiến triển ung thư ở người. Nhiều gen sinh
ung thư và nhiều gen ức chế ung thư cũng hoạt động trong khuôn khổ “con
đường tín hiệu sinh ung thư” này [104], [108].
Các con đường tín hiệu có thể được khái quát như sau:
- Các tín hiệu ngoại bào (GF, cytokin, hormon…)
- Các tín hiệu ở màng tế bào (thụ thể màng tế bào)
- Các tín hiệu ở bào tương (RAS, RAF, ERK của con đường MAPK;
PDK và AKT của con đường PI3K; con đường WNT…)
- Các tín hiệu trong nhân tế bào (Jun, Myc…)
Trong khuôn khổ của đề tài này, con đường tín hiệu protein kinase hoạt
hóa phân bào (MAPK) được nhấn mạnh.
1.2.1. Con đường tín hiệu MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase)
1.2.1.1. Các thành viên của con đường tín hiệu MAPK
MAPK là một gia đình lớn của các protein kinase serine/threonine liên
quan với nhiều hoạt động của tế bào như là tăng sinh, biệt hóa, chết tế bào.
Các protein tín hiệu ở bào tương qua con đường MAPK gồm có RAF, MEK
và protein ERK. Ở tế bào bình thường, nó tiếp nhận các tín hiệu từ sự hoạt
hóa các thụ thể tyrosin kinase (Receptor Tyrosine Kinase: RTKs) bởi yếu tố
phát triển (Growth Factor: GF), rồi đi vào nhân tế bào hoạt hóa sự biểu lộ của
gen. Ngoài ra, MAPK cũng có thể được hoạt hóa bởi các kích thích nội bào và
10
ngoại bào khác. Ở tế bào ung thư, tín hiệu MAPK thường được gia tăng. Vì
vậy con đường MAPK qua ERK được xem là “dòng thác phân bào cổ điển”
[80], [118], [148].
Các protein ERK (Extracellular signal Regulated Kinase) là dạng
nguyên mẫu của MAPK. Ở tế bào động vât có vú có hai loại ERK1 và ERK2
là đặc trưng của MAPK, có trọng lượng phân tử 44kD (ERK1) và 42kD
(ERK2). Một số protein kinase khác ít liên quan hơn là ERK3, ERK5, ERK6.
Con đường tín hiệu p44/42MAPK (ERK1/2) được hoạt hóa bởi đáp ứng của
các kích thích ngoại bào bao gồm: các yếu tố phân bào, yếu tố phát triển,

cytokin và là đích quan trọng trong chẩn đoán và điều trị ung thư. Sau khi
nhận kích thích, một dòng thác protein kinse hiệu ứng được khởi đầu, gồm có
một MAPKinase kinase kinase (MAP3K), một MAPKinase kinase (MAP2K)
và một MAPK. Nhiều MAP3K đã được xác định, bao gồm các thành viên của
gia đình RAF. MEK1 và MEK2 là MAP2K nguyên phát trong con đường
này. MEK1 và MEK2 hoạt hóa p44 (ERK1) và p42 (ERK2) thông qua việc
phosphoryl hóa các acid amin Thr202/Tyr204 và Thr185/Tyr187. Một số đích
cuối dòng thác của p44/42 cũng đã được xác định là p90RKS và Elk1.
ERK1/2 bị ức chế bởi MAPK phosphates.
1.2.1.2. Quá trình hoạt động của con đường tín hiệu MAPK
Con đường dẫn truyền tín hiệu RAF-MEK-ERK là dòng thác protein
kinase được hoạt hóa bởi RAS. Con đường này điều hoà sự phát triển, tăng
sinh và biệt hóa tế bào đáp ứng với những kích thích từ các yếu tố phát triển,
kháng thể, cytokin và hormon… [118]. Qua con đường này RAS được cho là để
thúc đẩy sự thay đổi về khung và hình dạng tế bào, sự kết dính và di chuyển tế
bào. Điều đó được thể hiện phổ biến ở các tế bào với RAS sinh ung thư [34],
[81], [148]. Sự biến đổi RAS trong ung thư là do chức năng điều hoà nút của
nó ở một số con đường liên quan với các đặc tính thiết yếu của các tế bào ung
11
thư. Trong số các tác dụng khác nhau này, sự hoạt hóa con đường ERK
MAPK là quyết định nhất đối với sự kích thích tăng sinh tế bào ung thư cùng
với sự biến đổi của RAS. Một trong các lý luận của nguyên lý này chính là sự
biến đổi loại trừ lẫn nhau của gen RAS và BRAF trong một số ung thư, nổi
bật là trong u hắc tố [31].
Trong hoạt tính chuyển dạng của các gen sinh ung thư nguồn gốc virus
(v-oncogen) thì RAS và RAF là chìa khóa cho khám phá này của Rapp và
cộng sự [116] và chính RAF là yếu tố hiệu ứng đầu tiên được xác định của
dòng tín hiệu được hoạt hóa từ RAS [24], [80].
Hoạt hóa RAF được khởi đầu bởi sự kết hợp RAS-GTP với vùng gắn
RAS (RBD: RAS binding domain) nằm trong khu vực điều hoà N tận của

kinase. Sự thay đổi thích ứng và sự kết tập lên màng tế bào làm khởi động
những biến đổi phosphoryl hóa RAF, điều đó kết hợp với việc kích thích
hoạt tính serine/threonine kinase của RAF gây phosphoryl hóa liên tục và
gây hoạt hóa MEK và ERK [71], [91]. Ba protein RAF có chức năng ở
người là A-RAF, B-RAF và C-RAF hoạt động phụ thuộc vào sự phosphoryl
hóa của đoạn mang hoạt tính [24], [143]. Mối thông tin liên lạc giữa RAF,
MEK và ERK cần có protein kết nối, đó là một đồng dạng của RAF không
có hoạt tính kinase [91].
MAPK tạo tín hiệu qua bào tương vào nhân và ở nhân nó kích thích các
yếu tố điều khiển các tế bào ở trạng thái nghỉ trở thành tế bào ở trạng thái
phân chia. Trong nhân tế bào, hai phân tử rất quan trọng để điều khiển sự phát
triển tế bào qua các giai đoạn phân chia tế bào là các cyclin và các enzym
hoạt hóa phụ thuộc cyclin (cdks: cyclin dependent kinases). Nếu không có các
cyclin thì các cdks không hoạt động được. Tuy nhiên, cần phải có các cdks thì
các cyclin mới làm cho các tế bào từ trạng thái nghỉ trở nên hoạt động và vì
thế hoạt hóa quá trình phân chia tế bào. Một trong những cyclin rất quan trọng
12
này là cyclin D. Nó đóng vai trò quan trọng đặc biệt trong tiến trình phân chia
tế bào [8], [10], [79]. Sự kết tập của cyclin D hình thành bước cuối cùng trong
con đường liên kết hoạt hóa thụ thể yếu tố phát triển biểu mô và phân chia tế
bào. Khi MAPK đi vào trong nhân tế bào, nó gây kết tập cyclin D và tác động
lên "chất kìm hãm sinh học" và khi sự kìm hãm sinh học bị bất hoạt thì tế bào
buộc phải vận chuyển sang trạng thái phân chia hoạt động [78].
1.2.1.3. Vai trò con đường tín hiệu MAPK trong ung thư
Sự hoạt hóa liên tục con đường tín hiệu RAS-MEK-ERK là phổ biến đối
với nhiều loại ung thư. Xấp xỉ 15% ung thư ở người có sự biến đổi hoạt động
của RAS [80] và biến đổi BRAF gần đây được xác định qua sàng lọc trên phạm
vi rộng các gen đột biến trong ung thư ở người [43]. Đột biến thân của B-RAF
liên quan với 60% các khối u hắc tố ác tính [39] và xảy ra với tần suất từ vừa
đến cao ở các ung thư biểu mô đại trực tràng [114], ung thư biểu mô buồng

trứng [130], ung thư phổi và ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú [29]. Điều đó
gợi ý rằng việc hoạt hóa biến đổi gen sinh ung thư BRAF như là yếu tố khởi
động chủ chốt của các khối u ác tính. Sự biến đổi BRAF và RAS được giới hạn
một cách có ý nghĩa với các loại u tương tự và thông thường là theo cách loại
trừ lẫn nhau. Điều này cho phép các tác giả nghĩ rằng các gen này cùng trên
một con đường tín hiệu sinh ung thư với nhau; đồng thời cũng gợi ý rằng RAS
tác động gây hoạt hóa BRAF ở các loại hình ung thư này [103], [142].
Sự hoạt hóa con đường JNK MAPK (JNK: Jun kinase N tận- một con
đường thành viên khác trong con đường tín hiệu MAPK) bởi RAS là một khía
cạnh khác trong chức năng đa chiều của các protein này. Sự tăng cường hoạt
hóa của protein RAS ở tế bào bình thường có thể gây ngừng phát triển, chết
theo chương trình hoặc suy yếu sự sao chép tế bào. Ở một số loại tế bào, sự
hoạt hóa RAS cũng có thể gây biệt hóa tế bào. Chính vì thế, ngoài tác dụng
tăng sinh tế bào, các protein RAS ở trạng thái hoạt hóa còn kích thích các đáp
ứng khác, thậm chí cả việc chấm dứt tác dụng của chúng.Trong một vài trường
13
hợp, nó còn tạo ra phản ứng bảo đảm an toàn chống lại sự tăng sinh quá mức.
Tuỳ theo tình huống mà con đường JNK MAPK có thể hoạt động theo cách thức
này [92], [121].
Như vậy khi các thụ thể yếu tố phát triển trên màng tế bào được hoạt hóa
thì các protein RAS sẽ hoạt hóa hầu như liên tục, chúng làm trung gian cho
nhiều hiệu ứng của hoạt động sinh lý hoặc là hoạt động sinh ung thư của các
thụ thể tyrosin kinase (RTK), đặc biệt là hoạt động của con đường MAPK
theo chiều của protein RAS. Thực vậy, protein RAS làm trung gian không
những cho các tín hiệu qua thụ thể tyrosine kinase mà còn liên quan đến việc
đáp ứng của tế bào với các cytokin và hormon. Ngược lại, thụ thể tyrosin
kinase và các yếu tố khác điều chỉnh hoạt động của MAPK và các con đường
ung thư khác nữa không chỉ thông qua RAS mà còn qua nhiều cơ chế khác
nhau [34], [104], [134].

Yếu tố phát triển
Màng tế bào
Gen sinh u như JUN, FOS
Thụ thể yếu tố phát triển
Sao chép gen











Hình 1.2. Con đường tín hiệu MAPK [148]
14
1.2.2. Các con đường tín hiệu khác
1.2.2. 1.Con đường tín hiệu PI3K (Phosphoinositide3-Kinase)
Con đường tín hiệu PI3K thực hiện nhiệm vụ kiểm soát sự chuyển hóa tế
bào, đặc biệt là vận chuyển và sử dụng glucose, nó kiểm soát sự điều hoà phát
triển tế bào, đặc biệt là sinh tổng hợp protein và ngăn chặn sự chết tế bào theo
chương trình. Con đường này được kích hoạt bởi protein RAS và các thụ thể
tyrosine kinase hoạt hóa. Con đường tín hiệu PI3K được xem như là con
đường tín hiệu ung thư vì thành phần ức chế chủ yếu của nó, PTEN, là một
chất ức chế khối u cổ điển [140], [148].
Con đường PI3K thực sự đi qua protein kinase PDK1 và AKT. Việc hoạt
hóa kết hợp PDK1 và AKT dẫn đến gia tăng tổng hợp protein. Hiệu quả này
quan trọng trong hoạt động đồng hóa của insulin và yếu tố phát triển giống

insulin (IGFs: Insulin-like growth factors) ở nhiều tế bào, nó cũng là điều kiện
tiên quyết đối với việc tăng sinh tế bào và vì vậy là trung tâm của phát triển
khối u [35], [140].
Sự phát triển tế bào bình thường liên quan với việc hoạt hóa đồng thời
con đường MAPK và PI3K. Cùng với nhau, 2 con đường này gây ra mọi thay
đổi như là: tăng chuyển hóa, thúc đẩy tổng hợp protein, sắp xếp lại khung tế
bào, ức chế các tín hiệu tiền chết theo chương trình và dĩ nhiên là cả sự kích
thích phát triển chu kỳ tế bào từ G1/G0 vào pha S [148]. Tiếp sau sự di
chuyển của chúng vào nhân tế bào như một hiệu quả của hoạt hóa MAPK,
hoạt hóa protein kinase ERK gây phosphoryl hóa một loạt các yếu tố hoạt hóa
sao chép liên quan dến sự phát triển chu kỳ tế bào. Hiệu ứng quan trọng của
những sự kiện này là sự kích thích sao chép cyclin D. Sự kết tập cyclin D điều
khiển quá trình phát triển chu kỳ tế bào trong phần lớn thời kỳ G1 [79]. Vì
vậy, sự hoạt hóa đồng thời của cyclin D là điểm quan trọng của việc hiệp lực
giữa con đường MAPK và PI3K. Và sự điều hoà Myc là điểm xa hơn nữa của
việc hiệp lực giữa hai con đường trên [148].
15
1.2.2.2. Con đường tín hiệu WNT
Có hơn 20 yếu tố thuộc vào gia đình yếu tố phát triển WNT ở người.
Chúng là các protein có trọng lượng phân tử khoảng 40kDa với >30% giống
nhau. Các protein được tiết ra sau khi được glycosyl hóa và liên kết đồng hóa
trị với phần nửa ái mỡ của màng tế bào. Do đó, các yếu tố này liên kết tốt với
dịch ngoại bào và cắm lên màng tế bào làm hạn chế sự khuếch tán của chúng.
Vì vậy, chúng được giới hạn hoạt động như các yếu tố cận tiết và tự tiết.
Trong suốt quá trình phát triển, các protein WNT có xu thế làm phát
triển và tạo hình thái cho nhiều tổ chức khác nhau, đặc biệt là cấu trúc biểu
mô hình ống và ống nhỏ ở thận và ruột. Dĩ nhiên, yếu tố và con đường
WNT tương tác với những con đường tín hiệu khác, ví dụ. tương tác với
con đường tín hiệu phụ thuộc Hedgehog trong phát triển của các chi [131].
Các yếu tố WNT riêng lẽ duy trì mối liên quan với sự bình ổn của tổ chức

trưởng thành và đặc biệt là để kiểm soát các khoang tế bào gốc, ví dụ ở
đường tiêu hóa [90].
Hoạt động liên tục của con đường WNT chủ yếu là trong phát triển ung
thư đại tràng. Nó cũng quan trọng trong các ung thư khác, ví dụ ung thư biểu
mô tế bào gan. Sự mất điều hoà của con đường WNT là do mất chức năng của
các chất điều hoà âm tính (như là APC) hoặc bởi sự đột biến sinh ung thư
hoạt hóa β-Catenin. Vì vậy, APC và CTNNB1 (mã hóa cho β-Catenin) được
xem như là chất ức chế khối u và chất sinh ung thư [107], [136].
1.2.2.3. Con đường tín hiệu Sonic Hedgehog (SHH)
Cũng như con đường WNT, con đường tín hiệu SHH góp phần hằng
định tổ chức ở người trưởng thành, ngoài ra chúng còn liên quan đến việc duy
trì quần thể tế bào gốc. Có 3 protein Hedgehog ở người, đó là sonic Hedgehog
(SHH), Desert Hedgehog (DHH) và Indian Hedgehog (IHH). Chúng tác động
theo hình thức cận tiết. Sự khuếch tán của chúng bị giới hạn bởi việc thay đổi
16
tính ái mỡ và trong trường hợp này là gắn ái lực với cholesterol. Hedgehog
được nghiên cứu rõ nhất là về vai trò của chúng trong sự phát triển các chi,
tuy nhiên chúng có vai trò quyết định đối với sự phát triển của nhiều cơ quan
khác, như là não và tuyến tiền liệt.
Yếu tố Hedgehog quan trọng nhất trong các mô trưởng thành là SHH.
Yếu tố Hedgehog gắn với thụ thể cơ trơn như là SMO1, khởi động con đường
tín hiệu nội bào và cuối cùng dẫn đến sự hoạt hóa của yếu tố sao chép GLI.
Đã có nhiều bằng chứng về sự giao thoa giữa con đường SHH và WNT bên
trong tế bào [104], [131].
Theo Brandon Wainwright và cộng sự [28] khi phân tích sự biến đổi gen
ở những bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào đáy của da, hội chứng Gorlin, đã
xác định gen patched như là một chất ức chế khối u. Patched là một thụ thể
của gia đình phối tử hedgehog và con đường này bị phá vỡ khi có sự thay đổi
của các loại khối u bao gồm não, đường tiêu hóa, tuỵ và phổi. Khi nghiên cứu
để xác định vai trò của con đường phát triển của da, Brandon Wainwright đã

chứng minh một hoạt động không mong đợi của hedgehog trong điều hoà
thành phần tế bào gốc của biểu mô. Tác giả cũng đã khảo sát được sự điều
hoà tế bào gốc hệ thần kinh bị chi phối bởi con đường patched/ hedgehog này.
Việc hiểu biết mối tương tác giữa con đường hedgehog và những con đường
khác như là Wnt và Notch trong hệ thống này sẽ cho phép xác định đặc tính tế
bào gốc và vai trò của nó trong nền tảng tế bào của khối u [77].
1.2.2.4. Con đường tín hiệu NOTCH
Con đường NOTCH được tìm thấy đầu tiên ở ruồi giấm và ngày càng
được nghiên cứu nhiều hơn về chức năng của nó trong việc phát triển các mẫu
sinh vật. Ngày nay, NOTCH được khẳng định là một con đường tín hiệu sinh
ung thư ở người và được xem như là một tác nhân trong bệnh lý thần kinh
Alzheimer. Đáng chú ý là cả việc ức chế và tăng hoạt động của con đường
17
NOTCH đều có thể khởi động sự tiến triển ung thư. Sự nhập nhằng này hoàn
toàn chưa từng xảy ra đối với con đường tín hiệu sinh ung thư khác. Điều mâu
thuẩn này liên quan đến sự nhạy cảm rõ ràng với liều lượng của nó mà sự
nhạy cảm đó xuất phát từ chức năng sinh học của NOTCH [97], [112].
Cũng giống như các con đường tín hiệu WNT và SHH, con đường tín
hiệu NOTCH kiểm soát khoang tế bào gốc và tế bào tiền thân. Một cách chính
xác hơn, chức năng đặc trưng của nó là điều hoà việc quyết định số phận các
tế bào nhị phân. Điều này bao gồm việc quyết định hoặc là một tế bào duy trì
một tổ chức tiền thân hoặc là đi đến biệt hóa tận cùng, như là lớp tế bào đáy
của biểu bì [112], [148].
Ở những tế bào ung thư, protein NOTCH có chức năng như là gen sinh
ung thư. Tín hiệu NOTCH hoạt động liên tục làm xuất hiện phần lớn các tiền
lympho bào không phù hợp theo hướng biệt hóa thành tế bào T; vì vậy chúng
trở nên ác tính bởi các biến đổi xa hơn nữa. Tương tự, sự tăng cường hoạt
động của NOTCH hợp tác với protein ung thư của virus như là kháng nguyên
T SV40 trong u trung biểu mô và HPV E6 và E7 trong ung thư cơ quan sinh
dục. Trong những trường hợp này, hiệu quả ức chế của tín hiệu NOTCH lên

chu kỳ tế bào bị loại bỏ bởi protein ung thư của virus trong khi chức năng duy
trì tế bào tiền thân của nó vẫn hoạt động và góp phần làm mở rộng khối u
[112], [148].
Như vậy, một số con đường tín hiệu trong điều kiện sinh lý bình thường
là hệ thống điều hoà quá trình tăng sinh và biệt hóa của các tế bào trong cơ
thể. Tuy nhiên, khi các con đường này hoạt hóa quá mức hoặc bị bất hoạt sẽ
gây nên một số biến đổi về đặc tính của tế bào theo hướng ác tính như là tăng
sinh không kiểm soát được, ngăn chặn sự biệt hóa, giảm sự chết theo chương
trình, thay đổi cấu trúc mô