Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá cây dứa dại (pandanus tectorius parkins ex j p du roi) mọc hoang ở xã lộc bình – huyện phú lộc – tỉnh thừa thiên huế

LỜI CẢM ƠN
Luận văn thạc sĩ này được hoàn thành tại Bộ môn Hóa học Hữu cơ,
Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Để tích lũy vốn kiến thức
quý báu, để hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ này đó là ơn nghĩa sâu nặng của
thầy cô, gia đình và bạn bè.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS.
Phạm Hữu Điển đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô trong tổ Bộ môn hóa hữu
cơ cũng như các thầy cô trong khoa Hóa học – Đại học sư phạm Hà Nội đã
giúp đỡ và cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu, cũng như tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã rất nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bè bạn đã động viên,
tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Hà Nội, ngày 6 tháng 6 năm 2014
Học viên K22
1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, CÁC KÍ HIỆU
1. Các phương pháp sắc kí
TLC : Thin- Layer Chromatography - Sắc kí bản mỏng
CC : Column Chromatography - Sắc kí cột
2. Các phương pháp phổ
IR : Infrared - Phổ hồng ngoại
MS : Mass Spectrometry - Phổ khối lượng
1
H NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance - Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân
13
C NMR : Carbon- 13 Nuclear Magnetic Resonance - Phổ cộng hưởng

từ C- 13
HMBC : Heteronuclear - Multiple Bond Coherence
HSQC : Heteronuclear - Spectrometry Quantum Coherence
DEPT : Distiotionless Enhancenmen by Polarisation Transfer
3. Các kí hiệu khác
Me : - CH
3
Ac : - COCH
3
dd : Dung dịch
dm : Dung môi
H : n- hexan
E : Etyl axetat
M : Metanol
2
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG SỐ, SƠ ĐỒ
Trang
Danh mục các hình
Danh mục các bảng số
Sơ đồ
3
MỤC LỤC
4
MỞ ĐẦU
Vấn đề dinh dưỡng và sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu của mọi
người, đặc biệt là trong thời gian gần đây khi mà các căn bệnh nguy hiểm như
AIDS, ung thư, viêm gan B, tiểu đường đang có chiều hướng gia tăng. Đây
chính là vấn đề cấp bách đặt ra không chỉ cho các cán bộ ngành y dược không
ngừng nghiên cứu tìm kiếm các phương thuốc mới để phòng ngừa, điều trị
hiệu quả các loại bệnh tật. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, gió

mùa, mưa thuận,
g
i
ó
hoà nên hệ thực vật rất phong phú và đa dạng với
nhiều loài thực vật là những loại dược liệu quí, trong đó có Dứa dại. Từ lâu
Dứa dại đã được nhân dân sử dụng làm thuốc chữa đau đầu, mất ngủ, giải độc
rượu, tiêu đàm, viêm gan, tiểu đường, viêm thận, phù thũng, cảm sốt, viêm
đường tiết niệu, thương tổn do chấn thương. Hơn nữa, lá dứa dại có vị ngọt,
tính mát, có tác dụng giải nhiệt, chữa các chứng bệnh như cảm, sốt, giã đắp
vào chỗ đinh râu. Một số nghiên cứu khoa học gần đây đã chỉ ra rằng: một số
hợp chất thiên nhiên phân lập từ Dứa dại có khả năng ức chế sự phát triển của
một số tế bào ung thư, có tác dụng hạ đường huyết. Một số loài Dứa dại như
loài Pandanus odorus, P.amaryllifolius, Pandanus odoratissium, lá dứa thơm
P.amaryllifolius; từ lá, quả của cây dứa dại Pandanus tectorius Parkins. ex J.
P. du Roi đã được quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học.
Trong khuôn khổ luận văn thạc sĩ hóa học này, chúng tôi chọn đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá cây dứa dại
(Pandanus tectorius Parkins. ex J. P. du Roi) mọc hoang ở xã Lộc Bình –
huyện Phú Lộc – tỉnh Thừa Thiên Huế” nhằm góp phần tìm hiểu giá trị khoa
học, nâng cao giá trị sử dụng nguồn cây thuốc “bình dân” này một cách hiệu
quả và bền vững hơn.
5
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA DẠI
1.1.1. Khái quát về họ Dứa dại (Pandanaceae) và chi Pandanus
a. Họ Dứa dại Pandanaceae
Họ Dứa dại (hay còn gọi là Dứa gai) Pandanaceae là một họ thực vật có

hoa, có nguồn gốc ở khu vực nhiệt đới phân bố ở một số nước Châu Á và khu
vực Thái Bình Dương bao gồm 800 loài và có 4 chi:
- Chi Freycinetia Gaudich: Khoảng 180 loài.
- Chi Martellidendron (Pic. Serm.) Callm. & Chassot, còn được coi là
phân chi của chi Pandanus.
- Chi Pandanus Parkinson: Khoảng 700 loài dứa dại (dứa gai, cây cơm
nếp, dứa thơm )
- Chi Sararanga Hemsl: khoảng trên 10 loài.
Trong đó chi Pandanus (dứa dại) là quan trọng nhất. Stone B.C. [33] đã
thống kê được một số loài thuộc hai chi Freycinetia và Pandanus phân bố ở
một số nước châu Á và khu vực Thái Bình Dương như sau:
- Phillippines: có 8 loài thuộc chi Freycinetia và trên 50 loài thuộc chi
Pandanus.
- Thái Lan: có 3 loài thuộc chi Freycinetia và 2 loài thuộc chi
Pandanus.
- New Guinea: có 60 loài thuộc chi Freycinetia và 70 loài thuộc chi
Pandanus.
- New Zealand: chỉ có 1 loài thuộc chi Freycinetia.
- Borneo: có hai loài thuộc chi Freycinetia, 50 loài thuộc chi Pandanus.
- Madagascar: trên 100 loài thuộc chi Pandanus.
6
b. Chi Pandanus
Một số loài thuộc chi Pandanus thường gặp là: Pandanus tectorius
Parkins. ex J. P. du Roi, Pandanus odoratissim, Pandanus amyrillium,
Pandanus herbaceus, P.toei, P.unguiculatus [34]. Loài Pandanus tectorius
Parkins. ex J. P. du Roi, còn gọi là dứa gỗ, dứa gai phân bố rộng rãi trên các
bờ biển của Ấn Độ, Xri Lanca, Mianma, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt
Nam, Trung Quốc, Nam quần đảo Ryu Kyu, Malaixia, Micronesia,
Phillippines [2,10,36,38]. Theo kinh nghiệm dân gian của nhân dân các nước
ven biển và hải đảo thuộc Thái Bình Dương (Marshalls, Yap, Hawaii, Tonga,

Tahiti ) phần trên mặt đất của loài dứa dại này được sử dụng để chữa viêm
họng, bị ngộ độc thức ăn, chữa đái dắt, đái buốt [1,10]. Ở Ấn Độ, lá được
dùng để điều trị bệnh phong, giang mai, ghẻ và bệnh bạch bì. Tinh dầu lá
dùng trị bệnh đau đầu, thấp khớp, hạt và cùi quả làm thức ăn, chồi non làm
rau ăn. Ở Thái Lan, rễ cây được dùng để hạ nhiệt, long đờm, lợi tiểu; cụm hoa
dùng làm thuốc trợ tim.
Hình 1.1. Ảnh cây và quả dứa dại Pandanus tectorius Parkin. ex J.P. du Roi
(chụp tại tỉnh Thừa Thiên – Huế, tháng 8/2013).
7
1.1.2. Một số đặc điểm thực vật học của loài Dứa dại (Pandanus tectorius
Parkins. ex J. P. du Roi)
Tên khoa học: Pandanus tectorius Parkin. ex J.P. du Roi.
Họ Dứa dai: Pandanaceae.
a. Mô tả: Cây nhỏ, phân nhánh ở ngọn cao từ 2- 4m, có nhiều rễ phụ
thòng xuống đất. Lá dài từ 1- 2m, trên gân chính và mép lá có nhiều gai nhọn.
Bông mo đực ở ngọn cây, thõng xuống với những mo trắng rời nhau. Hoa rất
thơm, bông mo cái đơn độc, gồm rất nhiều lá noãn. Cụm quả có khối hình
trứng dài từ 16- 22cm, có cuống màu da cam, gồm những quả hạch có góc, xẻ
thành nhiều ô, ra quả vào mùa hè [1].
b. Nơi sống và thu hái
Nơi sống: Loài Pandanus tectorius Parkins. ex J.P.du Roi còn được gọi
là Dứa gỗ, Dứa gai phân bố rộng rãi trên các bờ biển của Ân Độ, Xri Lanca,
Mianma, Thái Lan, Campuchia, Trung Quốc, Nam quần đảo RyuKyu,
Malaisya, Philippines…[2,10,36,38]. Ở Việt Nam, Dứa dại thường phân bố
trên các bãi ẩm, có cát, trong các rú bụi ven biển dọc các bờ ngòi nước mặn,
rừng ngập mặn, cũng phân bố trên đất liền, dọc theo các con sông ở khắp
nước ta, từ Hoà Bình, Quảng Ninh, Hà Nam, đến Quảng Nam- Đà Nẵng,
Khánh Hoà, Bình Thuận. Dứa dại mọc thành từng bụi lớn.
Thu hái: Phần lá thu hái quanh năm, đem về phơi hay sấy khô dùng
dần. Rễ thu hái quanh năm; thu các rễ chưa bám đất tốt hơn là rễ ở dưới đất,

đem về thái mỏng, phơi hay sấy khô dùng dần. Thu hái quả vào mùa đông
dùng tươi hay phơi khô.
1.1.3. Công dụng của cây Dứa dại
Cây Dứa dại từ lâu đã được xem như một loại thảo dược quý, có nhiều
tác dụng trong chữa bệnh và có nhiều tác dụng cho sức khoẻ con người. Một
số tác dụng dược lý của cây Dứa dại như tác dụng chống viêm, kháng khuẩn,
8
kháng nhiều dòng tế bào ung thu (Caov- 3, Skov- 3, PC3, Hella cells), tác
dụng hạ đường huyết, chữa cảm, hạ sốt, chữa sạn thận, sỏi thận, sỏi bàng
quang…
Theo sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của GS Đỗ Tất
Lợi, Dứa dại nằm trong nhóm những cây có tác dụng thông tiểu, thông mật
trong đó tác dụng thông tiểu là chính. Ngoài ra Dứa dại còn để chữa nhiều
chứng bệnh như sán khí, tiểu tiện bất lợi, đái đường, trúng nắng, mắt mờ, mắt
hoa, viêm gan, xơ gan giai đoạn đầu…[1,10]. Như vậy, cây Dứa dại được xem
như là một loài thảo dược phòng trị nhiều bệnh nan y được GS Đỗ Tất Lợi và
các nhà khoa học đánh giá cao. Để hiểu kĩ hơn về cây dứa dại này, dưới đây
xin giới thiệu từng bộ phận của cây dứa dại được dùng làm thuốc trong đông
y và trong dân gian như sau:
a. Qủa dứa dại: Theo đông y quả dứa có vị ngọt, tính bình, quả có tác
dụng chữa bệnh gan nhưng chỉ chữa được một số loại viêm gan, một vài thể
nhất định chứ không phải là tất cả các thể viêm gan mà dùng loại thuốc nam
nay. Hơn nữa, nó cũng chỉ có tác dụng một số loại viêm gan cấp mới bị hay
một số thể viêm gan mãn [12]. Ngày nay trên thị trường đã có sản phẩm trà
dứa dại được chế biến theo công nghệ hiện đại.
b. Hoa dứa dại: Theo đông y hoa có vị ngọt, tính lạnh. Dùng hoa sắc
uống có tác dụng chữa cảm mạo, sán khí, chữa đái đục, đái buốt, đái nhỏ giọt,
tiểu tiện không thông, nhọt mọc sau gáy.
c. Đọt dứa dại: Có vị ngọt, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt, lương
huyết, chỉ huyết, sinh cơ, tán độc; dùng chữa sỏi, mụn nhọt, tiểu tiện vàng đỏ,

giã nát đắp chỗ đầu đinh, lòi rom, bó gãy xương. Một số bài thuốc đối với đọt
non dứa dại:
- Dùng đọt non dứa dại và đậu tương giã nát đắp vào chỗ bị thương sẽ
chữa viêm loét, đặc biệt là chữa viêm loét cẳng chân.
9
- Dùng 2 lạng đọt non, 1 lạng xích tiểu, 3 con đăng tâm thảo, 15 búp tre
đem sắc uống sẽ giúp thanh tâm giải nhiệt, chữa bồn chồn, tay chân vật vã
không yên.
- Đem 15- 20g đọt non sắc uống sẽ chữa đái rắt, đái buốt, đái ra máu.
- Chữa sỏi thận: Đọt non dứa dại 20g, cỏ bợ 30g, ngải cứu 20g, đường
phèn 10g tất cả rửa sạch, thái nhỏ, giã nát, gạn nước uống.
- Chữa tiểu rắt, tiểu buốt có máu: đọt non 20g, mầm rễ cỏ gừng 20g,
sắc uống.
- Chữa kinh phong ở trẻ em: Đọt non dứa dại 12g, lá chua me, lá xương
rồng, búp mít mật, cỏ nhọ nhồi mỗi thử 8g, hạt nhân đào 5 cái. Tất cả giã nhỏ,
hoà với một chén nước đun sôi để nguội, gạn lấy nước trong thêm ít đường,
uống cách 2 giờ một lần cứ mỗi tuổi uống 1 thìa nhỏ.
- Dùng để đắp ngoài: Đọt non dứa dại, lá đinh hương (lượng bằng
nhau) đắp chữa đinh râu rất tốt.
d. Rễ dứa dại: Rễ dứa dại tươi giã nát, đem đắp vết thương có tác dụng
lành vết thương, chống viêm nhiễm. Theo đông y, rễ dứa dại có vị ngọt nhạt,
tính mát. Có tác dụng làm ra mồ hôi, lợi thuỷ, hạ sốt. Dùng chữa các bệnh
như cảm mạo, sốt dịch, viêm gan, viêm đường tiết liệu, phù thũng, thương tổn
do bị ngã, bị đánh chấn thương [1,2,7,8,10]. Một số bài thuốc với rễ dứa dại:
- Chữa phù thũng, xơ gan cổ trướng: Theo kinh nghiệm dân gian, dùng
rễ dứa dại 30- 40g, phối hợp với rễ cỏ xước 20- 30g, cỏ lưỡi mèo 20- 30g sắc
nước uống trong ngày.
- Chữa ngã, đánh chấn thương: Theo kinh nghiệm dân gian, dùng rễ
dứa dại, giã nát đắp vào chỗ bị thương rồi băng cố định lại.
- Chữa đau đầu mất ngủ: Rễ dứa dại 20 – 30g, sao thơm, sắc lấy nước,

chia 2 lần uống trong ngày.
10
- Chữa sỏi thận, tiết niệu: Rễ dứa dại hoặc dứa quả dại 12 – 20g, hạt quả
chuối hột 10 – 12g, rễ cỏ tranh 10 – 12g, bông mã đề 8 – 10g, kim tiền thảo (lá
đồng tiền hay gọi lá mắt trâu) 15 – 20g, rễ cây lau 10 – 12g, củ cỏ ống 10 –
12g, sắc lấy nước uống làm 2 – 3 lần trong ngày vào trước bữa ăn.
- Trị viêm thận phù thũng: Rễ dứa dại 30 – 60g, thịt lợn nạc 150 – 200g, nấu
thành canh ăn ngày một lần, một tuần cần ăn 3 – 4 lần. Kết hợp hằng ngày
dùng rau dừa nước khô 30 – 60g, rau má 12 – 16g, bông mã đề 10 – 12g, bồ
công anh 12 – 16g, sắc với nước uống trước bữa ăn ngày 2 lần, mỗi lần 150 ml.
- Trị viêm gan, xơ gan cổ trướng: Rễ dứa dại hoặc quả dứa dại 20 –
30g, lá quao nước 20 – 30g, lá cây ô rô 12 – 20g, sắc lấy nước thuốc uống
ngày 2 lần, mỗi lần khoảng 150 ml vào trước bữa ăn.
e. Củ dứa dại: Với người cao tuổi thận khí kém, lại mắc bệnh mãn tính
như: ho, táo bón, làm việc trong tư thế đứng nhiều. Người bệnh mệt mỏi, đau
lưng, mỏi gối, váng đầu ù tai, tiểu tiện nhiều lần, đại tiện bí…Phương pháp
chữa là bổ thận, bổ máu, nhuận tràng. Dùng bài: bạch đồng nữ 20g, mai mực
16g, đỗ đen 30g, vừng đen 15g.Tất cả các vị đều sao vàng. Sắc uống ngày 1
thang chia 2 lần, sau khi ăn khoảng 2 giờ, uống nóng [1, 7, 8].
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
DỨA DẠI
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học chi Pandanus
Dứa dại là một loại dược liệu quý, trong Đông y đánh giá rất cao, vì thế
các nhà khoa học ở Việt Nam và các nước trên thế giới đang tích cực tìm tòi
và nghiên cứu. Tuy vậy, các công trình khoa học nghiên cứu về thành phần
hoá học của các loài thuộc chi Pandanus không nhiều, đặc biệt là về loài Dứa
dại Pandanus tectorius Parkins. ex J.P.du Roi.
11
a. Nghiên cứu của thế giới
Các nhà khoa học của của Trung Quốc, Pháp, Thái Lan, Indonexia,

Austraylia…đã tập chung nghiên cứu thành phần hóa học của một số loài như:
Pandanus latifolius, P.veitchii, P.amaryllifolius.Roxb, P.odoratissimus… Hầu
hết các công trình nghiên cứu đều chỉ ra rằng: thành phần chính hóa học chính
của chi Pandanus là các ancaloit, tecpenoit, sterol, các axit hữu cơ và các
lignan. Trong hoa và lá chứa nhiều tinh dầu mà thành phần chủ yếu là các ete
của β- phenyletyl ancol, các benzyl benzoat, salisylat, acetate, các tecpenoit
như: geraniol, linalool, linalyl axetat, guaiacol…Kết quả nghiên cứu của rễ,
thân, lá của cây dứa thơm Pandanus amaryllifolius cho thấy: thành phần hoá
học chính là 2- acetyl- 1- pyroline ancaloit (2AP) chất tạo mùi thơm cho dứa.
Các nhà khoa học đã phân lập được trên 20 ancaloit từ lá, rễ cây dứa thơm, một
số hợp chất phenolic, flavonoid từ quả của Pandanus tectorius. Từ lá, rễ, thân
cây dứa thơm Pandanus amaryllifolius các nhà khoa học đã phân tích phần tinh
dầu, cặn chiết dung môi hữu cơ tách được các chất đó là các pandamarilactone-
A, B, C, D; các norpandamarilactonine- A, B, C; các pandamanine,
pandamarilactone- 31, pandamarilctone- 32…[15,16,26,27,32,34].
NH O
O
HH
N
H
O
O
O
O
Norpandamarilactonine A (1) 6E- Pandanamine (2)
6Z- Pandanamine (3)
12
N
N
N

O
H
H
N
O
N
O
O
O
4 5
6
Hình 1.2. Một số ancaloit từ dứa thơm Pandanus amaryllifolius
4. Khung cơ bản 2AP 5. (+)- Pandamarine 6. Pandamarinlactam
Từ tinh dầu lá Dứa dại của Pandanus odoratissimus các tác giả [24] đã
tách ra được ethyl formate và 3- methyl- 1- butanal đã được tìm thấy và từ
tinh dầu của hoa tách ra được rượu phenylethyl, methyl ether, axetat. Bên
cạnh đó, các tác giả còn tách từ quả của loài Dứa dại Pandanus tectorius các
hợp chất este sau: 3- metyl- 3- buten- 1- yl axetat, 3- metyl- 3- buten- 1yl
xinnamat, 3- metyl- 2- buten- 1yl axetat, 3- metyl- 2- buten- 1- yl xinnamat.
Năm 1965, các nhà khoa học CH Pháp đã chiết tách từ P.veitchii được hợp
chất axit 2(S), 4(S)- γ–hiđroxi- γ –metylglutamic[23].
Năm 1998, các nhà khoa học từ Trường đại học Chung- hsinh Đài
Trung (Đài Loan), đã phân lập được 15 hợp chất từ rễ cây dứa dại Pandanus
odoratissiumus, trong đó có 3 hợp chất phenolic, 1 hợp chất benzofuran mới,
6 lignans, 4 steroid, vanillin [36].
Theo tài liệu [23] hàm lượng carotenoit chứa một lượng đáng kể trong
quả của Dứa dại. Khi quả chuyển màu da cam là thời điểm hàm lượng
carotenoit trong quả là cao nhất.
13
b. Ở Việt Nam

Lần đầu tiên thành phần hoá học của cây Dứa dại đã được PGS.TS Lê
Thị Anh Đào nghiên cứu. Tác giả đã sơ bộ nghiên cứu thành phần hoá học của
tinh dầu hương nếp lấy từ cây dứa thơm Pandanus amaryllia.Roxd- Việt Nam.
Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng phương pháp chiết tách và đã khẳng
định được chất có mùi hương nếp là 2- axetyl- 1- pyroline, bước đầu tác giả đã
tách biệt được 3- metyl- 2(5H)- furanone và 2- axetyl- 1- pyroline [5].
Đầu năm 2008, Lại Thị Kim Dung và các cộng sự [4] đã phân lập được
flavonoit tổng. Đào Hùng Cường (ĐHSP Đà Nẵng) và các cộng sự [3] đã phân
lập được metyl este của axit 9- octadec-12-enoic, 9-isopropylidenbixiclo
[3.3.1] nonan-2-on và một ancoloit có tên là pandamarilactonine A từ lá dứa
thơm P. amryllifolius, thu hái tại xã Đại Quang, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng
Nam.
1.2.2. Nghiên cứu về Dứa dại Pandanus tectorius Parkins. ex J.P.du Roi
a. Trên thế giới
Năm 2011, các nhà khoa học Trung Quốc [40] đã nghiên cứu về quả
Dứa dại Pandanus tectorius Pankins.ex J.P.du Roi.Kết quả đã phân lập và xác
định được cấu trúc của 15 hợp chất: trong đó có 10 hợp chất phenolic và 5
hợp chất flavonoit.
14

HO
OCH
2
CH
3
O
HO
CHO
OCH
3

H
3
CO
etyl coumarate (4)
sinapaldehyde (5)
HO
CH
2
OH
OCH
3
dihydroconiferyl alcohol (7)
HO
CH
2
OH
OCH
3
HO
CH
2
OH
OCH
3
coniferyl alcohol (8)
O
3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-
metoxyphenyl)propan-1-on(9)
OH
CHO

salicylaldehyde (10)
O
OCH
3
H
3
CO
H
3
CO
H
3
CO O
OCH
3
tangeretin (11)
O
OH
H
3
CO
HO O
sakuranetin(12)
O
HO
HO O
O
OH
HO
HO O

OH
3
CO
HO O
chrysin (13)
naringenin (14)
OH
5,8-dihydroxy-7-metoxy-flavon(15)
HO
CHO
OCH
3
trans-3,4- dihydroxycinnamaldehyde(6)
OCH
3
HO
OCH
2
CH
3
O
CHO
OH
vanilin (1)
HO
trans- ethyl caffeate (2)
HO
HO
O
OCH

2
CH
3
cis- cthylcaffeate (3)
21
7 8
9
10
11
12
14
13
15
16
17
18
19
20
Hình 1.3: Một số hợp chất phenolic và flavonoit phân lập từ quả Dứa dại
Pandanus tectorius Parkins. ex J.P.du Roi.
Bên cạnh đó các tác giả [31] còn phân lập được một hợp chất cirsileol
cũng từ lá Dứa dại Pandanus tectorius Parkins.ex J.P.du Roi:
OH
3
CO
CO
OH
OCH
3
O

OH
H
3
15
Cirsileol (22)
Năm 2008, theo tài liệu [35] từ phân đoạn chiết clorofom của lá Dứa
dại Pandanus tectorius Parkins.ex J.P.du.Roi, các tác giả đã phân lập được
một tritecpen mới có khung tirucallan: 24, 24- đimethyl- 5β- tirucalla- 9(11),
25- đien- 3β- on (23), squalene (24) và hỗn hợp của 2 phytol: stigmasterol
(25) và β- sitosterol (26).
b. Ở Việt Nam
Năm 2011 Nguyễn Văn Đậu và các cộng sự [13] đã phân lập được β-
sitosterol (26) từ lá cây dứa dại Pandanus tectorius Parkins. ex J.P.du Roi.
Năm 2013, học viên cao học K21 Trần Thị Huyên [9] đã nghiên cứu về thành
phần hoá học và hoạt tính sinh học của rễ cây Dứa dại Pandanus tectorius mọc
hoang ở xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, Thừa Thiên Huế. Tác giả đã phân lập và
xác định được cấu trúc của 4 hợp chất là β- sitosterol (26), stigmast - 5, 22-
đien- 3β-ol (25), δ- lacton 2- (1, 2- đihiđroxyletyl)- 4, 5- metylenđioxibenzoic
(27) và 5- (2- Hiđroxi- 4- metoxiphenyl)- 3- hiđroxitetrahiđroxifuran (28).
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
1.3.1. Ở Việt Nam
Nguyễn Thị Minh Thanh cùng các cộng sự [11] đã nghiên cứu tác dụng
hạ đường huyết của quả dứa dại (Pandanus odoratissimus L.). Các tác giả đã
nghiên cứu khả năng hạ đường huyết trên chuột thí nghiệm với 4kg mẫu quả
dứa dại thu hái ở bãi biển tỉnh Thừa Thiên Huế dưới dạng chế phẩm cao toàn
phần (CT) và chế phẩm flavonoit tổng số (FT). Kết quả, về ảnh hưởng của các
chế phẩm CT và FT, thì tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết quả dứa dại
có thể do tác dụng của các flavonoid. So sánh với các loại dược liệu khác đã
được nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết trên chuột thí nghiệm như quả
và thân mướp đắng, thổ phục linh, quả chuối hột, dây thìa canh… thì tác dụng

hạ đường huyết của dịch chiết quả dứa dại là tương đối tốt.
16
Gần đây, kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng KB cho
thấy cao chiết n- hexan và cao chiết etyl axetat từ rễ cây dứa dại Pandanus
tectorius Parkins. ex J. P. du Roi có khả năng gây độc tế bào ung thư KB mức
trung bình với giá trị IC
50
tương ứng là 7, 4 μg/ml và 22 μg/ml [9].
1.3.2. Trên thế giới
Năm 2009 Londonkar R. và A. Kamble [24] đã nghiên cứu khả năng
chống oxi hóa của cao chiết metanol từ rễ cây Pandanus odoratissium. Ở Trung
Quốc, hai tác giả Ting- Ting Jong và Shoung- Whang Chau khi chiết tách phần
rễ của Dứa dại P. odoratissimus đã phân lập được các hợp chất phenolic, bốn
loại hợp chất lignan cộng với một dẫn xuất benzofuran mới. Trong số đó,
pinoresinol và 3, 4- bis(4- hyđroxy- 3- metoxybenzyl) tetrahyđrofuran thể hiện
hoạt tính chống oxy hóa khá tốt [36]. Axit 4- hyđroxibenzoic phân lập từ cao
chiết nước của rễ cây dứa dại Pandanus odorus có tác dụng hạ đường huyết trên
chuột gây đái tháo đường thực nghiệm [28]. Theo tài liêu [25], hợp chất 24, 24-
đimetyl- 5β- tirucalla- 9(11), 25- đien- 3- on (23) có khả năng ức chế sự phát
triển của tế bào ung thư chủng Mycobacterium tuberculosis H
37
Rv (MIC =
64 μg/mL) theo phương pháp thử nghiệm vi phiến MABA.
Hợp chất Cirsileol (22) phân lập từ lá cây dứa dại Pandanus tectorius
Parkins.ex J. P. du Roi có hoạt tính kháng nhiều dòng tế bào ung thư khác
nhau như: Caov- 3, Skov- 3, PC3 và Hela cells [31].
Theo tài liệu [34], các tác giả ở Trung Quốc đã nghiên cứu được một
loại protein mới là Pandanin (29) chiết xuất từ lá Dứa dại P. amaryllifolius.
Roxb có hoạt tính kháng virut chủng HSV- 1 và virút cúm chủng H1N1 với
các giá trị EC50 tương ứng là 2, 94 và 15, 63 µM.

17
CHƯƠNG 2
THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là lá cây Dứa dại được thu hái tại xã Lộc Bình,
huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 6/2012. Tên khoa học của
mẫu cây được ThS. Nguyễn Thế Anh, Viện hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN
Việt Nam giúp xác định là Pandanus tectorius Parkins. ex J. P. du Roi. Sau
khi thu hái, lá được cắt nhỏ, phơi và sấy khô, sau đó nghiền thành bột.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
1. Xác định tên khoa học của cây Dứa dại.
2. Khảo sát định tính các lớp chất có trong lá Dứa dại.
3. Chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp phần trong lá Dứa dại.
4. Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của cao tổng và tinh chất.
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
1. Phương pháp thu hái và xử lí mẫu.
2. Phương pháp ngâm chiết để thu lấy dịch chiết.
3. Phương pháp sắc kí cột và sắc kí bản mỏng để chiết tách các lớp chất.
4. Phương pháp TLC và CC.
5. Xác định cấu trúc của các cấu tử phân lập được bằng một số phương
pháp vật lý hiện đại như đo nhiệt độ nóng chảy, phổ IR,
1
H NMR,
13
C NMR,
DEPT, HSQC, HMBC, MS, EI- MS.
6. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học: thử kháng độc tế bào
ung thư dòng KB và thử hoạt tính kháng sinh.
18

2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
2.2.1. Thiết bị
1. Thiết bị chiết siêu âm Ultrasonic cleaner (Hàn Quốc), tại Bộ môn
Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội.
2. Đèn tử ngoại ba bước sóng (254nm, 302nm và 365nm).
3. Máy đông cô chân không Labconco, tại Bộ môn Hóa học hữu cơ,
khoa Hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội.
4. Thiết bị máy TLC điều chế của Bộ môn Hóa học hữu cơ, khoa Hóa
học, Trường ĐHSP Hà Nội.
5. Thiết bị đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500MHz của
Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
6. Thiết bị đo phổ hồng ngoại Shimadzu 8101M FTIR của Viện hóa
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
7. Các thiết bị thử hoạt tính sinh học: Tủ ấm CO
2
(INNOVA CO- 170);
tủ cấy sinh học an toàn cấp II; máy li tâm (Universal 320R); kính hiển vi
ngược (Zeizz); tủ lạnh sâu - 25
0
C, - 80
0
C; buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kì);
máy quang phổ (Genios Tecan); bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng
cụ thí nghiệm thông thường khác của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH và CN
Việt Nam.
2.2.2. Hóa chất
- Dung môi: Metanol, n- hexan, clorofom, etylaxetat, butanol, DMSO.
Dung môi dùng để ngâm chiết đều dùng loại tinh khiết, khi dùng cho sắc kí
cột hay sắc kí bản mỏng điều chế đều cần dung môi tinh khiết.
- Thuốc hiện hình: vanilin trong H

2
SO
4
10% và sấy ở trên bếp điện để
phát hiện các chất.
19
2.2.3. Dụng cụ
- Sắc ký cột, chất hấp thụ silicagel (hãng Merck- 60), kích thước hạt
40- 60, với hệ dung môi rửa giải là n- hexan: etylaxetat tăng dần độ phân cực.
- Sắc ký bản mỏng: sử dụng bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel F-
254 (hãng Merck).
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách
a. Thu hái: Phần lá cây dứa dại Pandanus tectorius Parkins. ex J. P. du
Roi được thu tại xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên- Huế vào
tháng 6/2012.
b. Xử lí mẫu: Lá dứa dại được đem sấy nhanh ở 110
o
C trong vòng 2
phút để diệt mầm nấm men rồi đem sấy khô ở 60- 70
o
C (có thể phơi dưới ánh
nắng mặt trời), sau đó thái nhỏ và đi đem nghiền thành dạng bột.
Lấy 5,0 kg mẫu khô nghiền nhỏ của lá Dứa dại đem cho vào bình ngâm
chiết liên tục bằng hỗn hợp metanol: nước theo tỉ lệ 9:1 khoảng 3 tuần. Lọc để
thu lấy dung dịch có màu xanh đậm. Phần bã còn lại đem ngâm lại trong
metanol: nước. Tiến hành tương tự như thế 7 lần. Thu lấy tất cả các dung dịch
lọc được đem cất cô quay chân không để cất đuổi dung môi thu được cao
tổng. Để phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ cao tổng thu được ở trên chúng
tôi sử dụng qui trình chiết bằng phễu chiết thực hiện ở điều kiện nhiệt độ

phòng. Đó là qui trình chiết phân đoạn bằng các dung môi n- hexan, etyl
axetat và butanol. Qui trình chiết như sau:
+ Lấy cao tổng hòa trong n- hexan, dùng phễu chiết để chiết lấy dịch n-
hexan. Phần bã còn lại tiếp tục chiết với n- hexan tương tự như thế thêm 4 lần.
Dịch chiết n- hexan qua 5 lần chiết được gom lại. Phần bã còn lại gọi là bã 1.
+ Tiếp tục chiết bã 1 bằng etyl axetat. Làm 5 lần sau đó gom dịch chiết
etyl axetat vào. Phần bã còn lại sau khi chiết etyl axetat gọi là bã 2.
20
+ Phần bã 2 đem chiết 5 lần bằng n- butanol. Làm 5 lần sau đó gom dịch
chiết n- butanol.Các dịch chiết thu được thì dịch chiết của n- hexan, dịch chiết
của etyl axetat và butanol có màu xanh đen. Sau khi cất đuổi dung môi thu được
các cặn chiết tương ứng: cặn n- hexan, cặn etyl axetat, cặn n- butanol.
Các quá trình trên được mô tả bằng sơ đồ thực nghiệm dưới đây:
Mẫu lá dứa dại khô (5kg)
Ngâm trong metanol trong 3 tuần
Bã
Cặn n- hexan (LH)
Cặn etyl (LE)
Cặn n- butanol (LB)
Cao tổng (320gam)
Dịch chiết Dịch
Sấy khô ở 60- 70
o
c
Lọc
n- BuOH
EtOAc
21

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết từ cặn tổng lá Dứa dại

22
Chiết trong các dung môi
Chiết bằng các dung môi khác nhau
n- Hexan
Dưới đây là khối lượng các cặn chiết thu được và thành phần % các cặn
chiết so với mẫu khô.
Bảng 2.2: Hàm lượng % các cặn chiết so với mẫu khô
STT Tên cặn chiết
Số gam
thu được (g)
% So
với mẫu khô
1 Cao tổng 320, 0 6, 4
2 Căn n- hexan (LH) 54, 16 1, 08
3 Cặn etyl axetat (LE) 63, 39 1, 26
4 Cặn n- butanol (LB) 44, 86 0, 89
Các phân đoạn dịch chiết trên đây, sau khi lọc và cất kiệt dung môi
dưới áp suất giảm, thì thu được 3 loại cặn chiết từ lá Dứa dại với kí hiệu như
trên, trong đó thành phần phần trăm của cặn EtOAc là nhiều nhất sau đó đến
cặn n- hexan và ít nhất là cặn n- butanol.
Kết quả thử hoạt tính sinh học 3 cặn chiết (n- hexan, etyl axetat,
butanol) cho thấy cao chiết từ n- hexan và etyl axetat có hoạt tính kháng tế
bào ung thư dòng KB khá tốt (xem mục 3.1), vì vậy dưới đây chúng tôi sẽ tập
trung nghiên cứu chiết tách các hợp chất từ hai cao chiết này.
2.3.2. Phân lập và tinh chế các cặn chiết
a. Phân lập các chất từ cặn n- hexan
*Lấy 54, 16 gam cao chiết n- hexan thu được ở trên tiến hành chạy sắc
kí cột (cột có kích cỡ d=3, 0 cm, l= 80 cm), chất hấp phụ là silicagel của hãng
Merck, kích thước hạt 40- 60 μm.
Cột sắc kí được rửa giải bằng hệ dung môi n- hexan: etyl axetat (H:E)

với tỉ lệ tăng dần độ phân cực tăng dần từ 100:0 đến 0:100, được 6 phân đoạn,
kí hiệu LH1- LH6. Kiểm tra trình tự các chất ra khỏi cột sắc kí bằng phương
pháp sắc kí bản mỏng (dùng bản mỏng, đế nhôm, tráng sẵn silica gel của hãng
Meck; thuốc hiện hình là vanilin trong dung dịch H
2
SO
4
10%), sau đó thu
23
gom các phân đoạn có R
f
giống nhau, cất cô quay chân không để đuổi hết
dung môi. Cặn thu được tiếp tục đem chạy sắc kí cột lặp lại.
Ở phân đoạn H:E=4:1, có 2 chất kết tinh màu trắng. Lọc, rửa, kết tinh
lại nhiều lần 2 kết tinh đó chúng tôi thì thu được 20mg chất rắn màu trắng,
dạng bột kí hiệu là LH1.Tiến hành kiểm tra trên bản mỏng không thấy phát
quang trên đèn điện tử ở các bước sóng, nhưng khi hiện hình và đốt lên thấy
xuất hiện một chấm tròn màu tím đen có R
f
= 0, 45. Tương tự, sau khi xử lý
tinh thể thứ hai, chúng tôi thu nhận được chất rắn màu trắng, dạng bột, có
khối lượng 15mg và giá trị R
f
=0, 55, kí hiệu LH2.
b. Phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat
*Lấy 63, 39 gam cao chiết etyl axetat đem chạy cột sắc kí silica gel, hệ
dung môi rưả giải n- hexan: etyl axetat tỉ lệ từ 4:1 đến 0: 100, được 11 phân
đoạn, kí hiệu LE1- LE11. Ở phân đoạn H:E=1:1 thấy xuất hiện kết tinh, tiến
hành rửa kết tinh lại trong etyl axetat lạnh nhiều lần, chúng tôi thu được một
chất rắn màu vàng nhạt, khối lượng 2mg, kí hiệu là LE5.Tiếp tục tiến hành

tách chất trên cột thô cặn etyl axetat, với phân đoạn hệ dung môi rửa giải
H:E=0:100 thấy xuất hiện kết tinh vô định hình màu vàng rơm. Tiến hành rửa
kết tinh lại nhiều lần trong etyl axetat lạnh thì thu được chất rắn màu vàng
rơm, vô định hình (20mg), kí hiệu là LE2.
2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
a. Phương pháp thử nghiệm khả năng gây độc tế bào ung thư dòng KB
Phương pháp này áp dụng cho cao chiết phân đoạn và một số chất tinh
sạch từ Dứa dại. Dòng tế bào ung thư KB được nuôi cấy trong các môi trường
nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các
thành phần cần thiết khác ở điều kiện (5% CO
2
; 37
O
C; độ ẩm 98%; vô trùng
tuyệt đối). Sau thời gian cấy chuyển, tế bào phát triển ở pha loãng sẽ được sử
dụng để thử độc tính.
24
Thử độc tính tế bào: 200 ml dung dịch tế bào ở pha loãng nồng độ 3.10
4
tế bào/ ml vào mỗi giếng(đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM. Mẫu thử
được pha loãng sao cho đạt được nồng độ cuối cùng là 128µg /ml; 32µg/ml;
8µg /ml; 2µg /ml; 0, 5µg /ml. ủ ở 37
0
C trong CO
2
trong 3 ngày.Giếng điều
khiển(đối chứng dương) chỉ gồm 200 dung dịch tế bào 3.10
4
tế bào/ml.
Ellipticine(Sigma) được dùng làm chất tham khảo (đối chứng âm).

Sau 3 ngày nuôi cấy, ủ tiếp với MTT 0, 2 mg/ml ở 37
0
C trong 4 giờ;
loại bỏ môi trường, thêm 100 DMSO lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540nm
trên máy spectrophotometter Genios TECAN. Mức độ kìm hãm sự phát triển
của tế bào được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy
phổ TECAN theo công thức sau:
IC(%) =
OD
mẫu thử
- OD
control(+)
x 100
OD
control(-)
- OD
control(+)
Giá trị IC
50
được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự
phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
b. Phương pháp thử nghiệm khả năng kháng nấm, kháng khuẩn
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người được
cung cấp bởi ATCC bao gồm: Bacillus subtilis(ATCC 6633), Staphylococcus
aureus (ATCC 13709), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 15442), Candida albicans (ATCC 10231), Lactobacillus
fermentum (Lp B14), Enterococcus faecium (B650). Môi trường nuôi cấy:MHB
(Mueler- Hilton- Broth), MHA(Mueler- Hilton- Agar); TSB (Tryptic Soy
Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SAB, SA cho nấm.
Hoạt tính vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên pha loãng đa

nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm nhằm
đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá
trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) và IC
50
(nồng độ ức
chế 50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
25