Seminar STAPHYLOCOCCUS AUREUS và những điều cần biết về chúng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


SEMINAR
STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ
NHỮNG ĐIỀU CẦN BIẾT
VỀ CHÚNG
GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
NHÓM SVTH: 1. NGUYỄN THỊ AN
2. NGUYỄN THỊ KIM HOÀNG
3. PHẠM THỊ THÙY DƯƠNG
4. VÕ THỊ HUỲNH MAI
5. LÊ THỊ THU TRÚC
TP.HCM: 3/2011
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
MỤC LỤC:
Lời mở đầu: 2
Chương I: Tổng quan về tác nhân gây ngộ độc
1.1. Lịch sử phát hiện
1.2. Phân loại
1.2.1. Phân loại Staphylococcus theo khoa học
1.2.2. Phân loại theo coagulase
1.2.2.1. Tụ cầu có men coagulase
1.2.2.2. Tụ cầu không có men coagulase
1.2.3. Phân loại Staphylococcus bằng kháng nguyên
1.2.4. Phân loại Staphylococcus bằng phage
1.3. Đặc điểm
1.3.1. Đặc điểm chung
1.3.2. Đặc điểm sinh hóa

1.4. Yếu tố độc lực
1.4.1. Các yếu tố độc lực bên ngoài
1.4.2. Các loại độc tố
1.4.3. Hệ gen tụ cầu vàng
1.4.4. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B
1.5. Cơ chế gây bệnh
1.5.1. Cơ chế gây độc của SEB
1.5.2. Cơ chế gây bệnh
1.6. Bệnh và các triệu chứng bệnh
1.6.1. Ngộ độc thực phẩm-dạ dày-ruột
1.6.2. Viêm phổi
1.6.3. Hội chứng shock do độc tố
1.6.4. Nhiễm trùng da và mô tế bào, áp-xe, viêm não, viêm tủy xương
NHÓM 2_ 08DSH4
2
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
1.7. Các biện pháp phòng và xử lý bệnh
1.7.1. Phòng bệnh
1.7.2. Xử lý bệnh
Chương II: Các phương pháp xác định
2.1. Phương pháp truyền thống
2.1.1. Nguyên tắc
2.1.2. Môi trường và thuốc thử
2.1.3. Phương pháp
2.1.3.1. Phân tích định tính Staphylococcus aureus
2.1.3.2. Định lượng Staphylococcus aureus
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
2.1.3.3. Định lượng bằng phương pháp MPN
2.1.3.4. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm
2.2. Phương pháp hiện đại

2.2.1. Phương pháp ELISA
2.2.1.1. Qui trình ELISA trực tiếp dùng để
xác định Staphylococcus Aureus
2.2.1.2. Xác định loài Staphylococcus và những độc tố Staphylococcal bằng ELISA có
trong kem lạnh và tiêu thụ pho mát trong
tỉnh Burdur, Turkey
2.2.2. Phương pháp PCR
2.2.3. Phương pháp RPLA (Reverse Passive Latex Agglutiation)
2.2.4. Phương pháp lai phân tử
2.2.5. Dùng Bacteriophage để làm Kit thử nhanh MRSA
Chương III: Kết luận và đề nghị
Tài liệu tham khảo:
NHÓM 2_ 08DSH4
3
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
LỜI MỞ ĐẦU
Với tình hình an toàn vệ sinh đang diễn ra hết sức phức tạp. Song song đó, vấn đề về
sức khỏe cũng là một vấn đề mang tính thời sự nóng hổi. Chính vì thế mà không ít người
đã đặt câu hỏi: “Liệu trong thời đại thị trường cạnh tranh khóc liệt như hiện nay thì các
doanh nghiệp có thực sự chú trọng đến sức khỏe người tiêu dùng không hay lợi nhuận sẽ
được đặt lên hàng đầu?”
Các vụ ngộ độc thực phẩm thì có rất nhiều nguyên nhân như do: hóa chất, bản chất
thực phẩm chứa sẵn một số chất độc,… Nhưng quan trọng hơn hết vẫn là từ vi sinh vật,
trong đó có Staphylococus aureus-một trong những nguyên nhân chính. Điều đáng lưu ý
và quan tâm ở đây là chủng này có khả năng tiết ra một số độc tố bền với nhiệt và khó bị
phân hủy ở nhiệt độ cao. Hơn nữa, chúng lại có khả năng kháng methiciline, penicilline
khi gặp điều kiện thuận lợi còn có thể lây lan và gây nên nhưng căn bệnh nguy hiểm.
Vì thế mà nhóm chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Staphylococcus aureus và
những điều cần biết về chúng”.
Nhằm mục đích tìm hiểu nguồn gốc phát sinh, những tác hại mà Staphylococus aureus

gây ra cũng như các biện pháp phòng ngừa và chữa trị Đặc biệt là tìm hiểu các phương
pháp phân tích để nhận biết và phát hiện chúng, đây đồng thời có thể xem là một biện
pháp hữu hiệu để kiểm tra độ an toàn của thực phẩm.
NHÓM 2_ 08DSH4
4
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY ĐỘC.
1.1. Lịch sử phát hiện:
- Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người
Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội
nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo
cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm
tụ cầu khuẩn (Staphylococcus ), trình bày tương
đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các
bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.
Staphy
lococcus dưới kính hiển vi.
- Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân
lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu
của lịch sử ngành vi sinh vật (VSV) học.
- Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự
hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh
của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi
1.2. Phân loại:
1.2.1. Phân loại Staphylococcus theo khoa học:
- Giới : Eubacteria .
- Ngành : Firmicutes .
- Lớp : Bacilli .
- Bộ : Bacillales .
- Họ : Staphylococcaceae .

- Giống : Staphylococcus .
- Loài : aureus.
NHÓM 2_ 08DSH4
5
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Tên khoa học : Staphylococcus aureus.
1.2.2. Phân loại Staphylococcus theo men Coagulase:
Trên phương diện gây bệnh thì tụ cầu khuẩn được chia làm hai nhóm chính: có men
Coalugase và không có men Coagulase.
1.2.2.1. Tụ cầu có men Coagulase:
Nhờ men coagulase này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các
khuẩn lạc màu vàng. Do vậy vi khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng. Các vi khuẩn quan
trọng của nhóm này là:
+ Staphylococcus aureus.
+Staphylococcua intermedius.
1.2.2.2. Tụ cầu không có men Coagulase:
- Do không có men coagulase nên trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc có màu
trắng ngà. Trên lâm sàng thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu trắng. Các vi khuẩn nhóm
này có thể kể:
+ Staphylococcus epidermidis.
+ Staphylococcus saprophyticus.
+ Staphylococcus haemolyticus.
+ Staphylococcus capitis.
+ Staphylococcus simulans.
+ Staphylococcus hominis.
+ Staphylococcus warneri.
- Cùng 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không hiện diện ở người.
1.2.3. Phân loại Staphylococcus bằng kháng nguyên:
NHÓM 2_ 08DSH4
6

PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của
vách tế bào vi khuẩn. Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn.
Các kháng nguyên trên bề mặt tế bào được quan tâm.
- Acid teichoic : là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng tác dụng
hoạt hóa bổ thể. Đây là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid này gắn
polysaccharid vách tụ cầu vàng. Đây là kháng nguyên O.
- Protein A : là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu chuẩn
để xác định tụ cầu vàng. 100% các chủng tụ cầu vàng có protein này.
- Vỏ polysaccharid: một số ít chủng S. aureus có vỏ và có thể quan sát được bằng
phương pháp nhuộm vỏ.
- Lớp vỏ bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên và có thể chứng minh được bằng
phương pháp huyết thanh học. Vỏ của tụ cầu cũng có tác dụng chống thực bào bởi vỏ đã
che phủ peptidoglycan của vách, làm cho bổ thể này không có chỗ bám để hoạt hóa theo
con đường tắt.
1.2.4. Phân loại Staphylococcus bằng phage:
- Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các nhóm
I, II, III, IV. Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S. aureus.
- Nhóm 1 : 29, 52, 52A, 79,80.
- Nhóm 2: 3A, 3B, 3C, 55,77.
- Nhóm 3: 6, 7, 42E, 47,53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85.
- Nhóm 4: 42D.
1.3. Đặc điểm:
1.3.1. Đặc điểm chung:
- Stahylococcus aureus phân bố rộng rãi trong tự nhiên có nhiều trong các thực phẩm
như: thịt, trứng, sữa và trên da, tóc, lông của người và động vật.
- Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh, được xếp vào nhóm vi
khuẩn cơ hội, vì có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi
để xâm nhập.
NHÓM 2_ 08DSH4

7
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các cầu
khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và thường
không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân
bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng
đôi hoặc đám nhỏ.
- Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí, bụi,
thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người.
- Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò
trong y học:
+ Staphylococcus aureus ( S. aureus): Tụ cầu vàng, được xem là tụ cầu gây bệnh.
+ Staphylococcus epidermidis ( Tụ cầu da).
+ Staphylococcus saprophyticus.
1.3.2. Đặc điểm sinh hoá:
- Phát triển tốt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết
thanh. Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu.
- Phản ứng indol, NH
3
, thủy phân gelatine, đông huyết tương.
- Trên môi trường thạch khuẩn lạc có hình tròn trơn bóng, đục mờ.
- Trên môi trường lỏng tế bào ở dạng cặn, vòng nhãn mờ trong ống nghiệm ở bề mặt
môi trường.
- Tính chất nuôi cấy:
+ Vi khuẩn phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở
nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S.
aureus là 18 – 40
0
C, pH=7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25
0

C, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở
canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc,
khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu
trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S. aureus có thể sinh trưởng được trên môi
trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao.
NHÓM 2_ 08DSH4
8
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
+ Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ
phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15
0
C, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở
35-37
0
C.
+ Những chủng khác nhau làm tan máu ở những mức độ khác nhau, ở thạch máu,
typ tan máu β thường được quan sát xung quanh khuẩn lạc.
S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết
tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. Sự hiện
diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát
nhiệt độ kém của quá trình chế biến nên thhường có mặt trong nhóm thực phẩm đã được
qua chế biến và nấu chín.
- Tính chất sinh hoá và đề kháng:
+ Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác,
chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu
vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác.
+ S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành
nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose,
sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều
mẫn cảm với novobiocine.

+ Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase ( beta –
lactamase). Men này phá huỷ vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như
penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng.
+ Ngoài ra, cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như vi khuẩn
Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum và Bacillus cereus cũng thường
được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn.
- Cấu trúc kháng nguyên:
+ Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở
vách tế bào.
NHÓM 2_ 08DSH4
9
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
+ Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề
mặt. Người ta có thể căn cứ vào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy
nhiên phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chuẩn đoán vi khuẩn.
- Độc tố - Enzym:
+ Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn
rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S.
aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm
+ Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường
có nhiệt độ trên 15
o
C hơn cả vi khuẩn. Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S. aureus là
một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37
0
C và có thể tồn
tại nhiệt ở 100 °C trong vòng 30 – 700 phút.
+ Các enzyme ngoại bào:
 Protease phân giải protein của tế bào chủ.
 Lipase phân giải lipid.

 Deoxyribonuclease ( DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo
(FAME).
1.4. Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus:
1.4.1. Các yếu tố độc lực bên ngoài:
- Laminin và fibronectin tạo thành mạng lưới dày đặc trên bề mặt biểu mô và nội mạc
của tế bào kí chủ.
- Fibrin được tạo từ tiền chất thúc đẩy quá trình đông máu và tổn thương mô.
- Adhesion tương tác với collagen giúp vi khuẩn bám lên tế bào mô bị hư hỏng, được
tìm thấy ở các chủng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp.
- Vỏ polysaccharide: một số chủng S. aureus có thể tạo vỏ polysaccharide . Vỏ này
cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào.
- Thành vi khuẩn có techoic acid (TE), lypoteichoic acid (LTA), peptidoglycan
(PGN), protein A. Gần đây một số nghiên cứu cho thấy màng S. aureus có thành phần
diacullipoprotein (DLP) cũng đóng vai trò quan trọng để kích hoạt các miễn dịch tại chỗ
NHÓM 2_ 08DSH4
10
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
và hệ thống. S. aureus còn có các protein giúp cho việc gắn vào da dễ dàng. Đó là các
Clumping protein, Pindin protein.
- Sự kháng kháng sinh của S. aureus là một đặc điểm rất đáng chú ý. Đa số S. aureus
kháng lại peniciline G kháng lại do vi khuẩn này sản xuất được men peniciline A nhờ gen
của R.plasmid. Một số còn lại kháng lại được methycilin gọi là methycilin resistance S.
aureus (MRSA), do nó tạo ra được các protein gắn vào các vị trí tác động của kháng sinh.
Hiện nay, một số rất ít S. aureus còn đề kháng được với Cephulosporin các thế hệ. Kháng
sinh còn dùng trong các trường hợp này là vancomycin.
1.4.2. Các loại độc tố:
- Hemolysis: gồm 4 loại (alpha, beta, gamma, delta), mang bản chất protein gây tan
máu beta, tác động khác nhau lên các hồng cầu khác nhau. Có khả năng sinh kháng, gây
hoại tử da tại chổ và giết chết súc vật thí nghiệm.
+ Alpha-hemolysis: làm hư hỏng màng tế bào mạnh nhất, có khả năng ức chế thẩm

thấu của màng, liên kết với các tế bào nhạy cảm như tiểu cầu, bạch cầu có khả năng phân
hủy hồng cầu tổn thương hồng cầu. Alpha-hemolysin tiết ra sẽ gắn vào màng của tế bào
nhạy cảm, sự gắn kết đó tạo thành một màng đầy nước tạo điều kiện thấm nước không
kiểm soát được các ion và các phân tử hữu cơ nhỏ. Khi các phân tử quan trọng đi qua như
ATP, ion thì không thể đảo ngược thẩm thấu dẫn đến phá vỡ thành tế bào gây ra cái chết
cho tế bào chủ.
+ Beta-hemolysis: là một trong những exotoxins được sản xuất bởi hầu hết các
chủng S.aureus, là protein có khả năng gây thoái hóa sphingomyelin gây ngộ độc cho
nhiều tế bào kể cả hồng cầu người.
+ Delta-hemolysis: là một peptide rất nhỏ sản xuất bởi hầu hết các chủng S.aureus,
là một protein hoạt động bề mặt và có thể dễ dàng chèn thêm chính nó vào cấu trúc màng
kỵ nước và các kênh ion.
+ Gamma-hemolysis: nhạy cảm với các loại hồng cầu của thỏ, cừu, người, chuột,
bò, ngựa. Gây ra hoại tử nhẹ ở da thỏ, chuột, có thể gây chết thỏ.
- Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc TSST ( toxic shack syndrome toxin): thường
gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông băng dày, bẩn hoặc những người nhiễm trùng vết
NHÓM 2_ 08DSH4
11
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
thương. Khó phân biệt độc tố này với enterotoxin F. TSST kích thích giải phóng TNF
(Tumor neerosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin I,II. Cơ chế gây sốc của nó
giống như độc tố ruột.
- Độc tố exfoliatin hay epidermolitic: Là các men phá hủy thượng bì. Men này gây tổn
thương da tạo các bọng nước, Gây hội chứng phồng rộp và chốc lở da ở trẻ em. 85% các
chủng S.aureus thuộc loại phage nhóm II tạo độc tố này. Nó gồm 2 loại A và B, đều là
polypeptide, loại A bền với nhiệt độ 100
0
C/20 phút, còn loại B thì không. Kháng thể đặc
hiệu có tác dụng trung hòa độc tố này.
- Alpha toxin: bản chất là protein gây tan các bạch cầu đa nhân và tiểu cầu, từ đó gây

ra ổ áp xe, hoại tử da và tan máu. Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó
không có tác dụng chống nhiễm khuẩn.
- Độc tố bạch cầu (Leucocidin): là nhân tố giết chết bạch cầu của nhiều loại động vật,
bản chất là protein, không chịu nhiệt. Tụ cầu gây bệnh có thể bị thực bào như tụ cầu
không gây bệnh nhưng lại có khả năng phát triển bên trong bạch cầu. Gồm hai mảnh F và
S có thể tách rời nhau, trọng lượng phân tử là 32000, 38000 Dalton. Nếu hai mảnh này
tách rời nhau thì chúng sẽ mất khả năng gây độc. Chúng gây ra nhiễm trùng da và hoại tử.
- Ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic): độc tố này tương tự như độc tố sinh mủ của liên
cầu. Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyte, đồng thời nó
làm tăng nhạy cảm với nội độc tố như gây shock, hoại tử gan và cơ tim. Gồm 3 loại ký
hiệu A, B, C. Ba loại này khác nhau về trọng lượng phân tử và về tính đặc hiệu kháng
nguyên, giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào.
- Dung huyết tố (hemolycin staphylolycin): phá hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế
bào hạt cũng như đại thực bào.
- Fribrinolysin (enzyme Staphylokinase): Nhiều chủng của S.aureus thể hiện một hoạt
hóa plasminogen gọi là staphylokinase. Nó làm phá hủy fibrin. Là một enzyme đặc trưng
cho các chủng gây bệnh ở người trong các cục máu và gây vỡ các cục máu này tạo nên
tắc mạch. Cơ chế này giống với Steptokinase, được sử dụng trong y học để điều trị bệnh
nhân bị huyết khối động mạch vành.
NHÓM 2_ 08DSH4
12
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Coagulase: làm đông huyết tương người và thỏ, chống đông với citrate natri và
oxalate natri. Coagulase làm dính tơ huyết vào bề mặt vi khuẩn và do đó cản trở sự thực
bào. Men này gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa quá trình sinh fibrin từ
tiền chất fibrinogen. Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm và một enzyme vách vi khuẩn
giúp S. aureus tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó.
- Hyaluronidase: men này có khả phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có
thể phát tán trong tổ chức. Thủy phân axit hyaluronic của mô liên kết.
- Beta- lactamase: men này phá hủy vòng beta lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng

sinh như penicilline G, Ampicilline và Uredopenicilline làm cho các kháng sinh này mất
tác dụng.
- Độc tố ruột (enterotoxin): Trong đó có SEB (Staphylococcal enterotoxin B ). Do một
số chủng tụ cầu vàng tạo thành, đặc biệt lúc phát triển ở nồng độ CO
2
lớn (30%) và môi
trường đặc vừa. Đây là những loại protein tương đối chịu nhiệt không bị phân hủy bởi sự
đun nấu. Nó đề kháng với sự đun sôi trong 30 phút cũng như tác động của enzyme ở ruột.
Các độc tố ruột này gây nhiễm khuẩn thức ăn và viêm ruột cấp. Bao gồm 6 loại được ký
hiệu từ A-F. Về mặt miễn dịch 6 loại này được phân biệt rõ ràng mặc dù chúng có kháng
nguyên chéo về cơ chế gây bệnh, kích thích tạo ra một lượng lớn interleukin I và II.
1.4.3. Hệ gen tụ cầu vàng S.aureus:
Hiện nay người ta đã thành công trong việc giải trình tự gen của tụ cầu vàng được kí
hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mn50, RF122. Steven và
cộng sự đã thành công trong việc giải trình tự gen dài 2809422 bp của chủng S.aureus
COL. Kết quả giải trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số CP000046.1 cho hệ
gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid. Trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít nhất
các cặp G-C, điều này gây ra mối nguy hại về việc chuyển gen từ chủng tụ cầu vàng sang
các tác nhân gây bệnh Gram dương khác. Các chủng S.aureus được phân lập từ các chủng
thực phẩm tỷ lệ enterotoxigenic được ước tính khoảng 25%. Tại Pháp trong số 61 chủng
phân lập từ phomat và sữa tươi có 15,9 % chủng là giống enterotoxigenic. Trong 332
chủng S.aureus phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa gen SEG, SEH, SEI,
SEJ.
NHÓM 2_ 08DSH4
13
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
1.4.4. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B:
- Được sản xuất phần lớn bởi các chủng S.aureus. Các độc tố này là những protein
tương đối bền với nhiệt, không bị phá hủy khi đun nấu, có trọng lượng phân tử 28000-
30000 Da gồm 6 loại được kí hiệu A, B, C, D, E, F. Năm 2008 tìm ra được hai loại độc tố

mới là SES và SET cũng nằm trong nhóm độc tố ruột do S.aureus sinh ra.
- Cấu trúc phân tử của Staphylococcal enterotoxin B (SEB):
SEB là một trong các ngoại độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S.aureus. Thông thường
không bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ vận chuyển ion và
nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin.
+ SEB được hình thành khi S.aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như: nhiệt
độ môi trường gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu.
+ Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S.aureus nên
SEB được nghiên cứu khá chi tiết. Trình tự a.a của SEB được xác định từ năm 1970.
Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S.aureus thường được tìm thấy trong
môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự
tính hiệu gồm 27 a.a ở đầu N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB ra
ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định.
SEB dạng hoạt động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 a.a rong một chuổi
polypeptide đơn có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa. Ở dạng hoạt động protein
SEB có cấu gồm: 7 cấu trúc xoắn anpha và 14 phiến gấp nếp beta và một cầu nối disuifide
nối cystein ở vị trí 120 và 140. SEB có khả năng chống lại sự tác động của protease trysin
và chymotrysin và papain có trong ruột.
- Năm 1986, Christopher và cộng sự đã xác định thành công trình tự SEB của chủng
S.aureus S6. Trình tự của một gen hoàn thiện được tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí
nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm 798 nucleotide và kết thúc tại codon
TGA tại vị trí nucleotide 1042.
1.5. Cơ chế gây bệnh:
1.5.1. Cơ chế gây độc của SEB:
NHÓM 2_ 08DSH4
14
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- SEB là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ các độc tố
liên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích sao đó kích
thích gia tăng số lượng lớn các lympho T. SEB được xem là một siêu kháng nguyên của

vi khuẩn vì có thể tạo thành một cầu nối giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng
nguyên và vùng Vbeta của các thụ thể tế bào T như: CD4, CD7. Từ đó kích thích hoạt hóa
các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vbeta mà không cần thiết phải có một quá trình chế
biến và trình diện thông thường.
- Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của cytokine và interleukin (IL-2), các
yếu tố hoại tử khối u beta (TNF-beta) và các interferon. Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh
nhân có các triệu chứng như: chán ăn, buồn nôn, tiêu chảy… Các triệu chứng này xuất
hiện là do các cytokine trong các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt.
- SEB dễ hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định, chịu được các tác
động cơ học vừa phải, chịu được nhiệt độ sôi.
1.5.2. Cơ chế gây bệnh:
- Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật
chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề mặt này bao
gồm:
+ Da, niêm mạc: Khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu.
+ Các tổ chức sâu hơn: Tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ
chức nội mô.
- S.aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide.
- Tác nhân gây bệnh như S.aureus mới có khả năng khởi động các quá trình sinh hóa
đặc hiệu như: tăng sinh, bài tiết đôc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu tế bào vật
chủ.
NHÓM 2_ 08DSH4
15
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- S.aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase,
hemolysin, leukocidin… phá hủy các thành phần tế bào vật chủ.
- Hầu hết các chủng S. aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt
(protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiên
tượng gắn độc này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn
dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa, chúng là các receptor cho các đại

thực bào. Qúa trình gắn trên giúp S. aureus tránh không bị đại thực bào. Ngoài ra, phần
lớn các chủng S. aureus một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này vi khuẩn tạo được một
lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy
niêm mạc.
- Ước tính khoảng 0,1µg S.aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người.
1.6. Bệnh và các triệu chứng bệnh:
- S.aureus có mặt ở khắp nơi trong thiên nhiên như: không khí, nước, da, họng, mũi,
tóc hay lông của các loài động vật máu nóng…và chỉ gây độc khi hình thành độc tố ruột
(Enterotoxin). Những trường hợp nhiễm độc đầu tiên do ăn bánh kẹo gây ra bởi tụ cầu
vàng đã được nói đến từ những năm 1901-1914. Ở Việt Nam cũng như trên khắp thế giới,
ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên.
- Khả năng gây độc chỉ xảy ra khi ăn thức ăn cùng độc tố của vi khuẩn. Còn nếu chỉ ăn
vi khuẩn thì không gây ra ngộ độc. Điều đó chứng tỏ, ngộ độc là do độc tố của vi khuẩn
được sản xuất ra trong môi trường thức ăn với sự hoạt động của vi khuẩn, độc tố ruột là
một loại độc tố mạnh.
- S.aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: mụn nhọt, chốc lở, viêm da,
viêm phổi, viêm não, viêm tủy sương, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng
ngoài tim, viêm màng não, áp-xe trong cơ, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương,
nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẩu.
1.6.1. Ngộ độc thực phẩm-viêm dạ dày, ruột:
- Ngộ độc thực phẩm là một căn bệnh của ruột, ngộ độc thực phẩm có thể do ăn uống
phải độc tố ruột của S.aureus cư trú trong đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Nguyên
nhân là do ăn thức ăn bị nhiễm độc tố (105 vi khuẩn/g thức ăn) hoặc do vi khuẩn tăng
NHÓM 2_ 08DSH4
16
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
sinh trong đường ruột (có đến 2-30% số người mang vi khuẩn này trong ruột. S.aureus có
thể nhiễm từ môi trường hoặc từ người chế biến sẽ sinh sôi rất nhanh trong thức ăn có
hàm lượng dinh dưỡng thích hợp (thường gặp nhất là các loại thực phẩm giàu protein
như: thịt bò muối, đùi lợn muối, xúc xích, kem, sốt, pho mát) và sinh ra độc tố đường

ruột, gây ngộ độc. Khả năng trúng độc của cơ thể phụ thuộc vào loại độc tố, số lượng độc
tố, khả năng đề kháng của cơ thể.
- Triệu chứng: các triệu chứng thường xảy ra 2-4 h sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc.
Triệu chứng ban đầu là sự tiết nước bọt, buồn nôn, nôn mửa và đi ngoài dữ dội, phân có
lẫn nước, đau bụng, co rút vùng bụng, tiêu chảy. Triệu chứng thứ cấp là đổ nhiều mồ hôi,
ớn lạnh, đau đầu, mất nước.
1.6.2. Viêm phổi:
- S.aureus thể xâm nhập vào nhu mô phổi qua hai đường: hít vào đường hô hấp trên
hoặc lây lan qua đường máu. Thường sau khi mắc bệnh cúm hoặc ở người suy giảm miễn
dịch, tụ cầu vàng theo dịch tiết đường hô hấp trên bị hít vào phổi. Tuy đây là bệnh ít gặp
nhưng đó lại là bệnh nhiễm khuẩn nghiêm trọng. Vi khuẩn tạo vỏ bọc dễ xâm nhập vào
máu gây nhiễm khuẩn huyết. Viêm phổi thường gồm nhiều ổ, tâm ổ viêm là phế quản
hoặc tiểu phế quản viêm hoại tử, xuất huyết. Các ổ viêm này vỡ ra tạo ra các ổ áp-xe. Ở
những ca nặng, thành phế nang thường bị phá hủy, không khí vào phế nang bị phá hủy
nhưng không thoát ra được, tạo ra các túi khí thành mỏng. Các yếu tố gây nguy cơ mắc
bệnh là điều kiện sống kém, sử dụng kháng sinh bừa bãi, bệnh nhân nằm viện lâu ngày
làm giảm sức đề kháng của cơ thể tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn dễ dàng xâm nhập
vào đường hô hấp, đồng thời làm giảm chức năng miễn dịch của cơ thể.
NHÓM 2_ 08DSH4
17
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Triệu chứng: phổ biến là sốt cao, mạch nhanh, thở nhanh, ho, ít gặp ho ra máu. Có
thể suy hô hấp, sốc nhiễm khuẩn, nhiễm độc hệ thống, khó thở, hoại tử và hình thành ổ
áp-xe. Hai biến chứng hay gặp nhất là tràn dịch màng phổi và mủ màng phổi.
1.6.3. Hội chứng shock do độc tố:
- Là căn bệnh gây ra bởi độc tố TSST-1 được tiết ra bởi vi khuẩn S.aureus phát triển
trong điều kiện có ít hoặc không có oxy. Bệnh thường gặp ở những phụ nữ trong kỳ kinh
nguyệt có dùng băng thấm hút mạnh, các bông này có khả năng gắn các magnesium do đó
làm giảm lượng ion này trong âm đạo. Khoảng 20% phụ nữ có mang tụ cầu ở đường âm
đạo. Do lượng ion magnesium giảm xuống, vi khuẩn này tăng cường sản xuất các ngoại

độc tố gây sốc.
- Hội chứng Thukydides là thể đặc biệt của hội chứng sốc nhiễm độc. Hội chứng này
có thể gặp ở thanh thiếu niên cả hai giới, thường gặp do bội nhiễm tụ cầu sau khi bị cúm.
Tỷ lệ tử vong của hội chứng này khá cao trên 50%. Biểu hiện lâm sàng về mặt hô hấp và
tiêu hóa rất giống với bệnh dịch hạch do Thurykodides mô tả ở Athen và năm 430 trước
công nguyên.
- Triệu chứng: đột ngột sốt cao, cảm giác mệt mỏi, tiêu chảy toàn nước, nhức đầu, đau
cơ, nổi bang ngoài da, có một vài dấu hiệu của sốc, nôn mửa, hạ huyết áp. Có thể có phát
ban như bị cháy nắng, lột da, vết đỏ đặc hiệu ngoài từng đám hay lan toàn thân nhanh, có
thể có biểu hiện xung huyết, kết mạc, họng đỏ, phù ngoại biên. Thay đổi các chỉ số cận
lâm sàng như: urê máu tăng, albumin máu giảm, calcim máu hạ, hạ phosphate máu, tăng
creatin phosphakinase, giảm tiểu cầu. Gây ra các rối loạn chức năng thận và cơ tim, quá
tải dịch, suy hô hấp ở người lớn. Sau khoảng 1 tuần bệnh nhân bị tróc da vùng thân mình
và tứ chi. Di chứng muộn gồm hoại thư ngoại biên, mất móng có thể phục hồi yếu cơ suy
nhược, kéo dài và rối loạn tâm thần kinh. Nếu bệnh nặng có thể tử vong ở tỷ lệ khá cao.
1.6.4. Nhiễm trùng da và mô tế bào, áp-xe, viêm não, viêm tủy xương:
- S.aureus từ lâu đã được công nhận là một trong những vi khuẩn quan trọng nhất gây
bệnh ở người. Nó là nguyên nhân hàng đầu của nhiễm trùng da và mô mềm, nó cũng có
thể gây nhiễm trùng nghiêm trọng như nhiễm trùng xương khớp, viêm thần kinh…
NHÓM 2_ 08DSH4
18
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Nhiễm trùng da và mô tế bào, áp-xe: những bệnh nhiễm trùng da và các phần phụ
chủ yếu là các chân lông và tuyến mồ hôi tạo thành bệnh cảnh áp-xe kinh điển của tụ cầu
vàng. Nó tạo fibrin bao bọc ổ áp xe. Các ổ nhiễm trùng này có thể chỉ nhỏ như đầu đinh
nếu viêm nang lông và kích thước như quả táo như áp-xe cơ. Mủ của ổ áp-xe do tụ cầu
vàng thường có màu vàng, đặc và không hôi.
+ Triệu chứng: trên da hình thành những khu vực thường là màu đỏ, đau và xưng
lên, chứa đầy mủ, xung quanh khu vực bị áp xe có thể cảm thấy ấm khi chạm vào.
+ Đối với mô tế bào thì sự nhiễm trùng là ở các lớp cơ bản dưới da, cũng bị sưng

đỏ và đau, nổi mụn nhọt và lây nhiễm.
+ Vi khuẩn có thể xâm nhập vào từ những vết cắt, vết cạo hoặc những thương tích
nhỏ, có thể xảy ra bất cứ nơi nào trên cơ thể nhưng thường xảy ra trên hai tay và hai chân.
- Viêm não, viêm tủy xương:
+ Nhiễm trùng các cơ quan bên trong cơ thể có thể do đường nội sinh: từ một ổ
nhiễm ngoại vi, vi khuẩn theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác. Chúng đi
vào cơ thể qua các vết rách trên da sau chấn thương hoặc trong quá trình phẩu thuật.
+ Triệu chứng: não sau viêm nội tâm mạc, chóng mặt, viêm màng não mủ, tràn mủ
dưới màng cứng, viêm tắc tĩnh mạch, viêm xoang, viêm xoang chũm, yếu tay, chân, thay
đổi thị giác. Gây sốt tỷ viêm mãn, viêm khớp nhiễm trùng, thường gặp ở khớp gối, hông
và khớp cùng chậu, gây viêm mũi cơ.
1.7. Phòng và xử lý bệnh:
1.7.1. Phòng bệnh:
- Ở những vùng có điều kiện vệ sinh cá nhân kém, nơi đông dân cư, đặc biệt là thiếu
nước sạch trong sinh hoạt, thời tiết nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh
mạnh.
- Phòng bệnh tụ cầu khuẩn cũng như các bệnh nhiễm khuẩn khác thì yếu tố vệ sinh cá
nhân là điều quan trọng, rửa tay sạch trước khi ăn và sau khi đi vệ sinh là yêu cầu cơ bản
để phòng bệnh, ăn uống hợp vệ sinh, nấu kỹ trước khi dùng, giữ gìn sạch sẽ những vết
trầy xước trên da. Những bệnh nhân tai biến mạch máu não nằm liệt giường có thể dẫn
NHÓM 2_ 08DSH4
19
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
đến xuất hiện những vết loét cần phải chăm sóc hổ trợ vận động như xoa bóp mạch máu
lưu thông, còn đối với bệnh nhân đái tháo đường cần giữ gìn bàn chân trách bị phòng loét.
- Các biện pháp như mang mũ hoặc khăn trùm đầu, mang khẩu trang và rửa tay
thường xuyên là biện pháp phòng chóng lây truyền hữu hiệu trong bệnh viện.
- Những người làm việc trong các bếp ăn tập thể hoặc trong các xưởng chế biến thực
phẩm cũng cần thực hiện các biện pháp phòng hộ trên.
- Đối với thực phẩm thì nên bảo quản cẩn thận, không để lẫn đồ ăn sống lẫn với đồ ăn

chín. Nếu nghi ngờ thực phẩm đã bị nhiễm khuẩn thì nên loại bỏ.
- Khám sức khỏe định kỳ cho công nhân làm việc trực tiếp với thực phẩm, chú ý khám
tai, mũi, họng.
- Không để những người bị viêm xoang, viêm mũi họng, có mụn mủ ở tay tham gia
chế biến thực phẩm.
- Dùng kẹp khi phục vụ thức ăn.
- Tăng cường uống vitamin, năng cao sức khỏe, rửa tay bằng nước nóng và xà phòng,
hạ pH thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển.
1.7.2. Xử lý bệnh:
- Đối với những tổn thương khu trú trên da thì không cần phải đều trị kháng sinh trừ
khi nhiễm khuẩn lan rộng hoặc có biến chứng. Tại chổ mưng mủ cần làm sạch da tại chổ
bằng dung dịch sát khuẩn, dùng kháng sinh trực tiếp bôi ngoài da. Các loại áp-xe cần rạch
mủ và kết hợp dùng kháng sinh đường uống hoặc tiêm. Những loại nhiễm khuẩn xương,
não thì cần dùng các loại kháng sinh đặc hiệu và khi điều trị thì phải theo dõi chặt chẽ
nhất là đối với những người cao tuổi người bị xơ vữa động mạch hay đáy tháo đường.
- Cần sử dụng những loại kháng sinh phù hợp cho từng bệnh nhân. Thường dùng
gamma globuline để điều trị bệnh. Mặc dù S.aureus có thể sản xuất được men
penicillinase phá hủy vòng beta-lactamase làm bất hoạt các loại kháng sinh như
penicilline G, Ampicilline Nhưng hiện nay trong điều trị nhiễm trùng S.aureus người ta
vẫn sử dụng peniclline và cephalosporine kháng với beta-lactamase.
- Nafcilline và Oxacilline là hai loại peniclline được dùng bằng đường tiêm. Nếu
nhiễm trùng nặng thì nên sử dụng cephalosporine thế hệ thứ nhất như cephazoline.
NHÓM 2_ 08DSH4
20
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Nếu bệnh nhân không dung nạp với kháng sinh nhóm beta-lactamase thì nên thay
bằng vancomycine và clidamycine bằng đường tiêm. Dicloxaciline và cephalexine là
kháng sinh dạng uống.
- Dùng gamma-globuline chống tụ cầu.
CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH.

2.1. Các phương pháp truyền thống:
2.1.1. Nguyên tắc:
S.aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng huyết
tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.
2.1.2. Môi trường và thuốc thử:
- Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được dùng để định
tính S.aureus hay cũng có thể dùng trong định lượng bằng phương pháp Most Probable
Number (MPN).
- Môi trường thạch Mannitol muối – Mannitol Salt Agar (M35): Nếu không sử dụng
môi trường thạch Baird – Parker, ta có thể sử dụng môi trường thạch Mannitol muối.
Thành phần chính của môi trường này gồm có peptone, chất chiết từ thịt bò, Mannitol,
NaCl và Phenol đỏ. Nồng độ muối trong môi trường khá cao (7,5%) sẽ ức chế sự sinh
trưởng của nhiều loài vi sinh vật.
- Mannitol là nguồn Carbonhydrate duy nhất để vi khuẩn lên men. Trên môi trường
thạch Mannitol muối, S. aureus cho khuẩn lạc màu vàng, còn S. epidermidis (không lên
men Mannitol) sẽ cho khuẩn lạc màu đỏ.
- Môi trường thạch máu: máu được sử dụng là máu cừu hay máu bê non dưới 5 tháng
tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chống đông citrate. Môi
trường cần được pha trước 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm.
- Môi trường thạch Braid Parker Agar (BPA): là môi trường chọn lọc thường sử dụng
để phát hiện S.aureus. Môi trường có chứa pepton và chất chiết thịt bò là những thành
NHÓM 2_ 08DSH4
21
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
phần dinh dưỡng cơ bản. Glycine và sodium pyruvate có chức năng kích thích sự sinh
trưởng của vi khuẩn. Lithium chloride và potassium tellurite được sử dụng để ức chế vi
khuẩn Gram âm và làm chậm sự sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương khác. Lòng đỏ
trứng được cho vào môi trường để phát hiện khả năng sinh tổng hợp lycithinase của
S.aureus.
- Lưu ý: lòng đỏ trứng và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi

đã khử trùng và làm nguội đến khoảng 60
o
C. Tụ cầu sinh tổng hợp coagulase trên môi
trường này sẽ có màu đen. Sự sinh tổng hợp lecithinase của vi khuẩn sẽ tạo nên vòng sáng
xung quanh các khuẩn lạc.
- Môi trường dịch thể tim óc-Braid heart infusion broth (M36): thành phần cơ bản của
môi trường gồm óc bê, tim bò, peptone, glucose và muối NaCl. Đây là môi trường giàu
dinh dưỡng được sử dụng để thúc đẩy sự sinh trưởng của nhóm vi sinh vật có nhu cầu về
dinh dưỡng.
- Huyết thanh thỏ có bổ sung ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA): được sử dụng
để kiểm tra hoạt tính coagulase của vi khuẩn. Huyết thanh thường được cung cấp ở dạng
đông khô. EDTA có chức năng như một tác nhân chống đông tụ. Quá trình hoàn nguyên
huyết thanh được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
2.1.3. Phương pháp:
2.1.3.1. Phân tích định tính S.aureus:
- Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MBS, trộn đều và ủ ở
nhiệt độ 37
o
C trong 24 giờ.
- Dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu từ ống dương tính (môi trường chuyển từ đỏ
sang vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Perker, ủ ở 37
o
C trong
24 giờ.
- Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường phân lập tròn, lồi, có tâm đen,
trong suốt, đường kính 1-1.5mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc.
- Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ 37
o
C 24 giờ.
- Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0.3ml huyết tương và ủ ở 37

o
C trong 24 giờ
để thử phản ứng đông kết.
NHÓM 2_ 08DSH4
22
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được
kết luận là có S.aureus khi thử nghiệm coagulase này dương tính (nghĩa là có sự xuất hiện
của khối đông trong khi ống đối chứng thì không có).
2.1.3.2. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:
a./ Đồng nhất mẫu pha loãng:
Cân chính xác 10 ± 0.1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng,
đồng nhất bằng máy dập mẫu 30s. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo
mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird
Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa.
b./ Phân lập trên môi trường chọn lọc:
- Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker.
Dùng que cấy tam giác thủy tinh ( thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường
cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha
loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1
0
C trong
24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu.
- Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính
0,5 – 1 mm, lồi , đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh.
- Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48
giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng,
lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn
lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần
đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc.

- Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục,
lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm. Hầu hết S. Aureus có vùng
tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này.
c./ Khẳng định:
- Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi
trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 1
0
C trong 24 giờ.
NHÓM 2_ 08DSH4
23
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
- Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã
rã đông, ủ ở 37 ± 1
0
C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời
gian 2,4,6,8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc
trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết
quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều
được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng
nhất như ống không cấy.
d./ Cách tính kết quả:
- Mật độ S.Aureus trong mẫu được tính như sau :
Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(N
t
H
t
+ N
a
H
a

)/( F
1
+F
2
)
- Trong đó:
+ F: là độ pha loãng
+ N
t
: tổng số khuẩn lạc đặc trưng
+ N
a
: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng
+ H
t
: tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với
khuẩn lạc đặc trưng
+ H
a
: tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so
với số khuẩn lạc không đặc trưng.
2.1.3.3. Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN:
- Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong mẫu có mật độ S.aureus
thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với 3 độ pha loãng thập phân liên
tiếp (ví dụ: 10
-1
,10
-2
,10

-3
,…). Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có
thể sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 3 lần lặp
lại ở mỗi độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 5 lần lặp lại ở
mỗi độ pha loãng).
- Môi trường được sử dụng là canh MSB hay Tryptose Soy Broth chứa 10% muối
NaCl. Cấy 1ml dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống 10ml môi trường, ủ ở 37
o
C
trong 48 giờ. Chọn các ống (+), có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành
NHÓM 2_ 08DSH4
24
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM
phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Baird Parker, ủ 37
o
C trong 48 giờ. Chọn
các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker để thực hiện thử nghiệm khẳng định
S.aureus tương tự trường hợp phương pháp đếm khuẩn lạc. Các đĩa cho kết quả khẳng
định S.aureus (+) được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ thống các dãy ống nghiệm
ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+) ứng với mỗi độ pha loãng. Tra bảng MPN để suy ra
mật độ S.aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml).
Quy trình định lượng S.aureus.


)
NHÓM 2_ 08DSH4
25
Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ
thập phân 10
-1

,10
-2
,10
-3
…
Chuyển 1ml dung dịch 10
-1
,10
-2
,10
-3
…
vào ống 10ml canh MSB ,mỗi nồng độ 3
ống lặp lại, ủ ở 37
o
C, 48 giờ.
Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha
loãng.
Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 37
o
C,
48 giờ.
Chọn khuẩn lạc đặc trưng.
Cấy vào TSA, ủ 37±1
o
C, 24 giờ.
Thử nghiệm ngưng kết
coagulase.
Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi
độ pha loãng

Trãi lên đĩa thạch BPA, ủ ở 37
o
C, 24-48 giờ, trải trên đĩa
thạch máu, ủ 37
o
C, 24 giờ.
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng Đếm số khuẩn lạc không đặc
trưng.
Lấy 5 khuẩn lạc khôngđặc trưng
cấy vào TSA, ủ ở 37±1
o
C, 24
giờ
Thử nghiệm ngưng kết coagulase.
Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng
cấy vào TSA, ủ ở 37±1
o
C,
24 giờ.
Mật độ S.aureus(CFU/g hoặc CFU/ml)
Tỷ lệ khuẩn lạc đặc trưng,
coagulase (+)
Tỷ lệ khuẩn lạc không đặc
trưng, coagulase (+)