Giới thiệu các kỹ thuật chẩn đoán di truyền

GIỚI THIỆU CÁC KỸ THUẬT
CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN
DÀN BÀI
I. Tổng quan các kỹ thuật chẩn đoán di truyền
II. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào làm NST đồ
TÓM TẮT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
MỤC TIÊU
Học xong phần này sinh viên sẽ có khả năng:
- Trình bày được nguyên tắc lựa chọn các kỹ thuật chẩn đoán di truyền;
- Nêu được định nghĩa NST đồ và các giới hạn của NST đồ;
- Liệt kê được các chỉ định làm nhiễm sắc thể đồ;
- Kể tên các loại mô / tế bào chọn nuôi cấy để làm nhiễm sắc thể đồ trong
chẩn đoán trước sinh và phân tích lý do;
- Kể tên các loại mô / tế bào chọn nuôi cấy để làm nhiễm sắc thể đồ trong
chẩn đoán sau sinh và phân tích lý do;
- Mô tả lượng mẫu cần lấy và điều kiện vận chuyển từng loại mô / tế bào;
- Kể tên 3 giai đoạn chính của nuôi cấy tế bào và các công việc chính của từng
giai đoạn.
I. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN
i. Đại cương
Bệnh nhân có thể được tiếp cận bằng nhiều phương pháp nhằm đánh giá, thu thập
thông tin cần thiết để thiết lập chẩn đoán. Thời điểm tiếp cận cũng đa dạng: tiền làm
tổ, trước sinh, sơ sinh, trẻ em các độ tuổi, người trưởng thành.
ii. Lâm sàng và các xét nghiệm cơ bản là điểm khởi đầu để tiếp cận một
bệnh nhân nghi ngờ có bệnh lý di truyền:
- Khám lâm sàng, ghi nhận bệnh sử là cơ sở phân loại ban đầu;
- Phân tích cây gia hệ có thể giúp xác định cách di truyền của bệnh lý, những cá
thể có nguy cơ cao;
- Những xét nghiệm căn bản như chụp X quang, CT scan, MRI, các chỉ số sinh
hóa giúp xác định rõ cơ quan bị ảnh hưởng, mức độ Trong một số trường

hợp, các kết quả này có thể giúp khẳng định hoặc loại trừ một chẩn đoán.
Các xét nghiệm di truyền giúp xác định chẩn đoán; trong một số trường hợp giúp thiết
lập chẩn đoán (khi khám lâm sàng và phân tích cây gia hệ không mang lại đủ thông tin
cần thiết để thiết lập chẩn đoán).
Độ chính xác của chẩn đoán là tiên quyết để xác định hướng xử trí thích hợp và tiên
lượng chính xác.
Cũng có trường hợp các xét nghiệm di truyền được thực hiện trên những bệnh nhân
không biểu hiện bệnh lý trên lâm sàng. Ví dụ: cha và mẹ bệnh nhân, cá thể trong gia
đình có bệnh di truyền yêu cầu được xét nghiệm
iii. Các kỹ thuật di truyền tế bào
a. NST đồ
Nguyên lý
Ở kỳ giữa của nguyên phân, các NST đã co xoắn cực đại, màng nhân đã biến mất. Khi
xử lý tế bào trong một dung dịch nhược trương, tế bào sẽ căng phồng lên. Nếu cố định
tế bào trong tình trạng này trên tiêu bản, các NST sẽ nằm rải rác không (hoặc rất ít)
chồng chéo lên nhau, tạo điều kiện thuận lợi cho việc đếm NST và quan sát hình thái
từng NST riêng biệt.
Phương pháp
Theo nguyên lý trên, việc thực hiện NST đồ gồm các bước:
- Chọn tế bào nguyên phân, hoặc kích thích tế bào đi vào nguyên phân trong điều
kiện nuôi cấy;
- Gây sốc nhược trương;
- Cố định tế bào lên tiêu bản;
- Xử lý và nhuộm tế bào để quan sát NST với cấu trúc băng;
- Quan sát, chụp hình, đếm, sắp xếp và phân tích.
Thông tin từ kết quả
Nhiễm sắc thể đồ cho phép chúng ta khảo sát tổng quát toàn bộ bộ NST, phát hiện các
bất thường số lượng NST, các bất thường cấu trúc như chuyển đoạn, đảo đoạn, NST
đều, các mất đoạn và nhân đoạn lớn (thông thường trên 2 Mb).
Hạn chế

- Không thể đem lại thông tin về các bất thường cấu trúc nhỏ hơn 2 Mb, các bất
thường về mythyl hóa (trường hợp dấu ấn di truyền), các bệnh lý gien
- Thời gian thực hiện xét nghiệm dài.
- Có thể thất bại trong nuôi cấy.
- Có khả năng nhiễm tế bào mẹ gây sai lệch chẩn đoán.
Đây là xét nghiệm di truyền cơ bản và quan trọng, sẽ được trình bày chi tiết trong phần
II.
b. Lai huỳnh quang tại chỗ: FISH (Fluorescence
in situ hybridization)
Nguyên lý
Dựa trên sự bắt cặp giữa các base bổ sung, một đoạn DNA có thể được tổng hợp và
đánh dấu huỳnh quang (gọi làđoạn mồi), trước khi cho tiếp xúc với NST cần khảo sát.
Trong những điều kiện thích hợp, đoạn mồi sẽ bắt cặp với vùng tương ứng trên NST
cần khảo sát (gọi là phản ứng lai).
Tín hiệu huỳnh quang sẽ được quan sát nhằm xác định tình trạng:
- bình thường (có 2 tín hiệu huỳnh quang, tương ứng với vùng cần khảo sát trên 2
NST ;
- mất đoạn: mất 1 hay 2 tín hiệu, hoặc có trường hợp chỉ giảm cường độ tín hiệu
(khi mất đoạn nhỏ hơn kích thước đoạn mồi). Trường hợp monosomy, cũng
quan sát thấy mất một tín hiệu;
- nhân đoạn: có tín hiệu thứ 3, thứ 4 Trường hợp trisomy cũng quan sát thấy 3
tín hiệu;
- chuyển đoạn: tín hiệu được phát hiện trên một NST khác.
Vùng cần khảo sát được xác định dựa vào:
- những triệu chứng lâm sàng hướng chẩn đoán đến một bệnh lý mà bất thường
trên NST đãđược mô tả rõ;
- bất thường cấu trúc (mất đoạn, nhân đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn, NST đều)
được quan sát thấy trên NST đồ nhưng cần được khẳng định lại.
Phương pháp
Theo nguyên lý trên, việc thực hiện kỹ thuật FISH gồm các bước:

- Tổng hợp đoạn mồi tương ứng với vùng cần khảo sát;
- Đánh dấu huỳnh quang đoạn mồi (có thể đánh dấu bằng nhiều màu huỳnh
quang trong trường hợp lai cùng lúc nhiều loại mồi khác nhau);
- Thực hiện phản ứng lai;
- Rửa đi các đoạn mồi thừa không gắn vào vùng cần khảo sát, cố định tiêu bản,
quan sát, chụp hình, phân tích.
Thông tin từ kết quả
Khi đã có được hình chụp các cụm NST kỳ giữa lai với đoạn mồi, công việc còn lại
chỉ là đếm số lượng các tín hiệu nhằm xác định các chẩn đoán mất đoạn, nhân đoạn,
trisomy, monosomy. Vị trí tương đối của các tín hiệu có màu huỳnh quang khác nhau
(ví dụ: đoạn mồi đặc hiệu màu đỏ, đoạn mồi cho các telomere màu xanh) có thể khẳng
định các chẩn đoán chuyển đoạn, đảo đoạn.
Hạn chế
Chỉđem lại thông tin liên quan đến vùng cần khảo sát.
Chỉ có thể phát hiện các mất đoạn, nhân đoạn lớn hơn 10 Kb.
c. Nhuộm toàn bộ NST (Chromosome painting)
Nguyên lý
Cùng nguyên lý với kỹ thuật FISH, nhưng sử dụng nhiều đoạn mồi lai trên suốt chiều
dài của một NST.
Phương pháp
Tương tự nhưkỹ thuật FISH.
Thông tin từ kết quả
Với toàn bộ NST phát huỳnh quang, các chuyển đoạn được quan sát rõ ràng, cũng như
các trường hợp một đoạn NST chènvào giữa NST khác.
Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích trong các trường hợp chuyển đoạn không rõđiểm gãy
(do đó không chọn được đoạn mồi đặc hiệu như trong kỹ thuật FISH).
Hạn chế
Giá thành khá cao và thông tin thu được hạn chế (không phát hiện được đảo đoạn, mất
đoạn )
d. NST đồ quang phổ (spectral karyotype)

Nguyên lý
Cùng nguyên lý với kỹ thuật FISH và kỹ thuật Nhuộm toàn bộ NST, nhưng sử dụng
các bộ mồi nhuộm khác màu huỳnh quang cho mỗi NST khác nhau.
Phương pháp
Tương tự như kỹ thuật FISH.
Thông tin từ kết quả
Phát hiện chuyển đoạn, chèn đoạn tương tự như kỹ thuật Nhuộm toàn bộ NST.
Đặc biệt kỹ thuật NST đồ quang phổgiúp nhận ra nhanh chóng nguồn gốc của NST
marker, giúp khảo sát các trường hợp bất thường cấu trúc NST phức tạp, liên quan đến
nhiều cặp NST khác nhau (ví dụ: trong các bệnh máu ác tính).
Hạn chế
Giá thành rất cao.
iv. Các kỹ thuật di truyền phân tử
a. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction)
Nguyên lý
Xuất phát từ cơ chế tự sao của DNA trong tự nhiên.
Khi các điều kiện cần thiết được xây dựng lại trong môi trường thí nghiệm, DNA của
bệnh nhân có thể được phóng đại nhiều lần để phục vụ cho chẩn đoán và cho các nhu
cầu nghiên cứu khác.
Các điều kiện cần thiết bao gồm:
- Sự tách rời của hai mạch DNA gốc;
- Đoạn mồi;
- Sự tổng hợp mạch DNA mới bởi enzyme.
Phương pháp
- Chuẩn bị các đoạn mồi (primer) tương ứng với vùng DNA cần được phóng đại;
- Tách rời hai mạch DNA gốc bởi nhiệt (denaturation) (95 - 98°C);
- Hạ nhiệt độ vừa đủ nhằm cho phép các đoạn mồi gắn được vào đoạn có trình tự
đặc hiệu tương ứng trên mạch gốc (50 - 65°C);
- Tổng hợp mạch DNA mới bởi enzyme polymerase bền nhiệt,
- Lập lại chu trình nhiều lần.

Vì quá trình tách 2 mạch DNA gốc được thực hiện bởi nhiệt, enzyme sử dụng phải bền
với nhiệt độ cao. Taq polymerase, một enzyme phân lập từ loại vi khuẩn Thermus
aquaticus, có thể trải qua nhiệt độ 98°C trong 25 - 35 chu kỳ mà vẫn giữ khả năng hoạt
động.
Sản phẩm PCR sau đó sẽ được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di (định tính: có sản phẩm
phóng đại hoặc không). Sản phẩm có thể được tinh sạch trước khi sử dụng cho các kỹ
thuật khác.
Cũng dựa trên nguyên lý và kỹ thuật căn bản trên, có thể bổ sung một số bước kỹ thuật
nhằm định lượng sản phẩm PCR (sử dụng các đoạn mồi đánh dấu huỳnh quang, so
sánh với một chứng nội tại). Kỹ thuật này gọi là PCR định lượng (quantitative PCR).
Kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán.
Thông tin từ kết quả
Thông tin định tính: Có hay không có sự phóng đại đoạn DNA đích.
Thông tin định lượng: So sánh giữa lượng sản phẩm của đoạn DNA đích và của đoạn
DNA chứng (là đoạn DNA bình thường, hiện diện 2 phiên bản trong bộ NST). Ta có
các trường hợp:
- Sản phẩm của DNA đích = sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận đoạn
DNA đích hiện diện 2 phiên bản trong bộ NST: bình thường.
- Sản phẩm của DNA đích = 1/2 sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận đoạn
DNA đích hiện diện 1 phiên bản trong bộ NST: mất đoạn, hoặc monosomy
chiếc NST tương ứng.
- Sản phẩm của DNA đích = 3/2 sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận đoạn
DNA đích hiện diện 3 phiên bản trong bộ NST: nhân đoạn, hoặc trisomy chiếc
NST tương ứng.
Hạn chế
Đoạn mồi PCR cần được tổng hợp đặc hiệu, nên chỉ thực hiện được phản ứng PCR
cho những đoạn DNA đích đã được biết rõ trình tự.
Độ dài các đoạn DNA có thể được phóng đại bằng phản ứng PCR có giới hạn (hiệu
quả nhất là khoảng vài trăm pb đến vài Kb, dài nhất khoảng 20 Kb). Do đó, đây là kỹ
thuật khảo sát rất đặc hiệu và phổ khảo sát hẹp.

b. Cắt giới hạn, điện di DNA, kỹ thuật Southern-
Blot
Các enzyme cắt giới hạn có khả năng nhận biết một trình tự đặc biệt trên phân tử DNA
mạch kép, và cắt đúng vị trí này. Việc sử dụng phối hợp nhiều loại enzyme cắt giới
hạn có thể giúp cắt rời đoạn DNA cần khảo sát (ví dụ đoạn DNA tương ứng với một
gien, một locus xác định).
Điện di DNA là kỹ thuật phân tách các đoạn DNA theo chiều dài, khi cho hỗn hợp
DNA di chuyển trong một chất nền dưới tác động của điện trường. Các đoạn DNA có
kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo thành những băng riêng
biệt trong chất nền.
Những kỹ thuật như Southern-Blot kết hợp sử dụng enzyme cắt giới hạn, điện di DNA,
phản ứng lai để khảo sát số lượng phiên bản của một gien, một locus xác định, hoặc
khảo sát chiều dài một đoạn DNA xác định (ví dụ, promotor của gien FRAX1 trong
hội chứng NST X dễ gãy).
c. CGH array: Kỹ thuật lai NST so sánh
Kỹ thuật này giúp nhanh chóng phát hiện các thay đổi số lượng phiên bản (mất đoạn,
nhân đoạn) trên toàn bộ bộ NST.
Nguyên lý
Khi cho DNA cần khảo sát nhuộm một màu huỳnh quang (ví dụ: xanh lá cây), lai với
DNA chứng (người bình thường) nhuộm một màu huỳnh quang khác (ví dụ màu đỏ),
ta sẽ thu được tín hiệu màu trung gian.
Đối với một đoạn DNA xác định:
- tín hiệu xanh = tín hiệu đỏ  Đoạn DNA đích tồn tại 2 phiên bản trên người
cần khảo sát: bình thường;
- tín hiệu ngả màu đỏ, vượt quá một ngưỡng quy định  Đoạn DNA đích tồn tại
1 phiên bản trên người cần khảo sát: mất đoạn, hoặc monosomy;
- tín hiệu ngả màu xanh, vượt quá một ngưỡng quy định  Đoạn DNA đích tồn
tại 3 phiên bản trên người cần khảo sát: nhân đoạn, hoặc trisomy;
Phương pháp
- Chuẩn bị tiêu bản chứa nhiều đoạn mồi được cố định sẵn trên tiêu bản. Các

đoạn mồi này tương ứng với những đoạn DNA cần khảo sát. Ví dụ: Tiêu bản
gồm tất cả những đoạn mồi tương ứng với những bất thường mất đoạn nhỏ đã
được biết ở người. Hoặc: Tiêu bản toàn bộ bộ gien người, với các đoạn mồi trải
đều khắp các NST, khoảng cách giữa hai đoạn mồi có thể chỉ khoảng vài chục,
vài trăm Kb.
- Cắt nhỏ DNA của người cần khảo sát và người chứng, đánh dấu huỳnh quang;
- Cho DNA người chứng và DNA người cần khảo sát cùng lai trên tiêu bản có
sẵn các đoạn mồi;
- Rửa lam, scan lam, quan sát và phân tích cường độ huỳnh quang đối với mỗi
đoạn mồi.
Thông tin từ kết quả
Nếu ta nhận được kết quả bất thường tương ứng với một đoạn mồi: tín hiệu bệnh nhân
> chứng hay tín hiệu bệnh nhân < chứng, thông tin rút ra là có sự tăng hay giảm số
lượng phiên bản của bệnh nhân so với chứng.
Kỹ thuật CGH array toàn bộ gien cho phép chúng ta phát hiện nhanh chóng các mất
đoạn và nhân đoạn trên toàn bộ bộ gien, đến kích thước rất nhỏ (vài chục - vài trăm
Kb)
Hạn chế
Với các trường hợp bất thường cấu trúc không kéo theo sự tăng giảm số lượng phiên
bản gien (ví dụ: đảo đoạn, chuyển đoạn), CGH array sẽ không thể phát hiện.
d. Giải trình tự DNA
Nguyên lý
Phương pháp Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-
determination method) là một phương pháp xác định trình tự DNA được Frederick
Sanger phát triển vào năm 1975.
Nguyên tắc cơ bản:
- dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp
DNA. Sự tổng hợp bị dừng lại khi gặp một dideoxynucleotide;
- khi trong ống phản ứng trộn lẫn 4 loại nucleotide bình thường A, T, G, C và
một loại dideoxynucleotide tương ứng với A, phản ứng sẽ bị dừng lại ở các vị

trí có A;
- tương tự cho 3 loại nucleotide khác;
- Kết quả tổng hợp của cả 4 ống phản ứng sẽ được điện di trên chất nền
acrylamide song song với nhau (Hình 1), từ đó trình tự của mạch DNA sẽ được
đọc lần lượt từng nucleotide.
Hình 1: Giải trình tự theo phương pháp Dideoxy: hình ảnh điện di 4 ống phản ứng
Phương pháp này đã được cải tiến rất nhiều. Với phương pháp nhuộm huỳnh quang 4
loại dideoxynucleotide A, T, G, C theo 4 màu khác nhau, phản ứng có thể được thực
hiện chung trong một ống và sau đó được điện di mao quản. Trình tự DNA sẽ được
đọc theo màu huỳnh quang tương ứng.
Hình 2: Giải trình tự theo phương pháp Dideoxy với 4 loại dideoxynucleotide nhuộm
huỳnh quang: kết quả điện di mao quản.
Thông tin từ kết quả
Trình tự của DNA được xác định chính xác đến từng nucleotide.
Hạn chế
Mỗi phản ứng chỉ đọc được một đoạn trình tự ngắn (500 - 650 pb).
e. Phân tích dấu ấn di truyền
Nguyên lý
Đoạn DNA mang dấu ấn di truyền có đặc điểm là allelle nhận từ cha và allelle nhận từ
mẹ khác nhau về trạng thái methyl hóa.
Khi được xử lý với bisulfite, nucleotide C sẽ phản ứng như sau:
- trên allelle không bị methyl hóa, C sẽ bị chuyển thành U
- trên allelle bị methyl hóa, C không thay đổi.
Sau xử lý với bisulfite, đoạn DNA nói trên sẽ được phóng đại bằng PCR với đoạn mồi
đặc hiệu:
Nếu trình tự đoạn DNA nói trên không thay đổi (allelle bị methyl hóa), phản ứng PCR
mới xảy ra;
Nếu trình tự đoạn PCR đã thay đổi (allelle bình thường), phản ứng PCR không phóng
đại được đoạn này.
Thông tin từ kết quả

Định lượng sản phẩm PCR sẽ cho biết trong mẫu có:
- 2 allelle methyl hoá (bất thường)
- 1 allelle methyl hóa (bình thường)
- Không có allelle nào bị methyl hóa (bất thường)
Từ đó xác định trên bệnh nhân có bất thường về tình trạng dấu ấn di truyền hay không.
v. Lựa chọn kỹ thuật chẩn đoán di truyền
Bệnh lý nghi ngờ sau khám
LS và phân tích cây gia hệ
Kỹ thuật chẩn
đoán lựa chọn
đầu tiên
Ưu điểm Hạn chế
Bệnh NST: bất thường số
lượng
NST đồ Khảo sát được
cùng lúc các bất
thường cấu trúc
NST
Thời gian trả kết
quả lâu hơn các
phương pháp khác
FISH Thời gian trả kết
quả nhanh
Chỉ khảo sát các
loại trisomy,
monosomy thường
gặp (phụ thuộc
đoạn mồi sử dụng)
QF-PCR Thời gian trả kết
quả nhanh

Chỉ khảo sát các
loại trisomy,
monosomy thường
gặp (phụ thuộc
đoạn mồi sử dụng)
CGH array Thời gian trả kết
quả nhanh
Giá thành cao
Bệnh
NST: Bất
thường
cấu trúc
Mất đoạn
Nhân đoạn
Đảo đoạn
Chuyển đoạn
NST đồ Khảo sát được
toàn bộ các loại
bất thường cấu
trúc NST
Giới hạn quan sát
mất đoạn, nhân
đoạn: trên 2 Mb
CGH array Phát hiện được
các mất đoạn,
thêm đoạn rất nhỏ
(vài chục - vài
trăm Kb)
Không phát hiện
được các trường

hợp đảo đoạn,
chuyển đoạn
FISH đặc hiệu Khảo sát được
các trường hợp
mất đoạn, nhân
đoạn, chuyển
đoạn, đảo đoạn.
Khẳng định chẩn
đoán quan sát
thấy trên NST đồ
Chỉ khảo sát bất
thường cấu trúc đã
định hướng trước
bằng NST đồ (chọn
đoạn mồi sử dụng)
FISH tất cả
telomere
Khảo sát được
các trường hợp
chuyển đoạn.
Khẳng định chẩn
đoán chuyển đoạn
quan sát thấy trên
NST đồ
Không khảo sát
được các bất
thường cấu trúc
khác
NST đồ quang Khảo sát được Giá thành cao
phổ các trường hợp

chuyển đoạn,
nguồn gốc NST
marker
Mất đoạn nhỏ
(microdeletion)
FISH Khảo sát được
các mất đoạn nhỏ
không quan sát
được trên NST đồ
Chỉ khảo sát bất
thường đã định
hướng qua lâm
sàng (chọn đoạn
mồi)
QF-PCR Khảo sát được
các mất đoạn nhỏ
không quan sát
được trên NST đồ
Chỉ khảo sát bất
thường đã định
hướng qua lâm
sàng (chọn đoạn
mồi)
CGH array Khảo sát được
các mất đoạn nhỏ
không quan sát
được trên NST
đồ. Có thể khảo
sát toàn bộ bộ
NST

Giá thành cao
Bệnh đơn
gien
Đột biến điểm Giải trình tự
toàn bộ gien
Khảo sát được tất
cả các đột biến
trên gien đã biết
và chưa biết
Giá thành cao và
thời gian dài (khi
gien có nhiều exon)
Giải vi trình tự
đặc hiệu allelle
Nhanh và giá
thành thấp hơn
giải trình tự toàn
bộ gien
Chỉ khảo sát các
đột biến đã biết
Phóng đại đơn vị
lặp không ổn
định
Southern-Blot Xác định allelle
bình thường,
allelle tiền đột
biến, allelle đột
biến
Độ chính xác tương
đối

PCR với đoạn
mồi huỳnh
quang, điện di
mao quản
Xác định chính
xác số lần lặp
Giá thành cao
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO LÀM NST ĐỒ
Các loại mô có nhiều tế bào phân chia tự phát là mô tủy, mô hạch lympho, các u đặc,
và gai nhau. Thực hiện NST đồ trên các loại mô này có thể không cần trải qua quá
trình nuôi cấy.
Đối với các mẫu mô khác không đủ số tế bào phân chia để phân tích như tế bào thai
nhi trong dịch ối, tế bào lympho trong máu ngoại vi, mẫu sinh thiết các mô đặc… thì
cần nuôi cấy mẫu trong một thời gian thích hợp tương ứng với từng loại mô. Các tế
bào lympho trong máu ngoại vi thường cần được cho thêm chất kích thích phân chia
trong môi trường nuôi cấy.
1. Chỉ định làm NST đồ
a. Chẩn đoán trước sinh
Nhiễm sắc thể đồ giúp chẩn đoán các bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể
có thể gặp ở thai nhi, cho các trường hợp:
- Mẹ lớn tuổi (trên 40 tuổi);
- Tiền căn gia đình có bệnh lý nhiễm sắc thể;
- Tiền căn sinh con trước đó bị dị tật bẩm sinh nghi do di truyền;
- Các bất thường thai nhi quan sát thấy trên siêu âm…
Chẩn đoán sau sinh
- Các bệnh đa dị tật bẩm sinh, trẻ sơ sinh kém trương lực, chậm phát triển tâm
thần vận động, rối loạn phát triển cơ quan sinh dục…;
- Các bệnh lý di truyền do bất thường nhiễm sắc thể đã được miêu tả và chẩn
đoán được trên lâm sàng.
Người lớn, và chỉ định khác

- Bệnh lý sinh sản như vô sinh, sảy thai liên tiếp, tiền căn thai chết lưu…;
- Xét nghiệm thường quy trước khi thực hiện các thủ thuật hỗ trợ sinh sản;
- Vô kinh, mãn kinh sớm;
- Nghiên cứu các loại bệnh lý ác tính.
ii. Nguyên tắc chọn mẫu
Khi chọn mẫu gửi nuôi cấy mô để làm nhiễm sắc thể đồ, chúng ta cần lưu ý các
nguyên tắc chọn ưu tiên sau:
- Loại mô có tế bào đang phân chia mạnh;
- Loại mô, tế bào dễ nuôi cấy;
- Kỹ thuật sinh thiết dễ dàng, ít xâm lấn.
Trong chẩn đoán trước sinh, mẫu dùng trong nuôi cấy là tế bào thai nhi trong dịch ối,
gai nhau, máu cuống rốn thai nhi…
Làm nhiễm sắc thể đồ thai nhi từ tế bào trong dịch ối và gai nhau là hai kỹ thuật
thường được sử dụng nhất.
Với mẫu nuôi cấy là tế bào ối, nhiễm sắc thể đồ thường “đẹp” hơn, dịch ối còn lại có
thể được sử dụng cho nhiều xét nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên, thủ thuật chọc ối làm
tăng nguy cơ sẩy thai dù rất nhỏ, đặc biệt nếu chọc ối sớm (nguy cơ sảy thai tự nhiên
khoảng 1/200, sau chọc ối tăng gấp 1,5 lần), do đó không nên thực hiện nhiều lần trừ
trường hợp tuyệt đối cần thiết. Dù mẫu nhận được có thể không đạt chuẩn, kỹ thuật
viên cũng nên cố gắng tận dụng hết sức trước khi đề nghị chọc ối lại. Kể từ tuần thứ 10
của thai kỳ có thể chọc ối, nhưng hiện nay thủ thuật này thường được sử dụng sau tuần
thứ 15.
Làm nhiễm sắc thể đồ từ mẫu sinh thiết gai nhau có nguy cơ sẩy thai ít hơn. Khuyết
điểm của kỹ thuật thứ hai này là người lấy mẫu cần có nhiều kinh nghiệm sinh thiết
gai nhau để tránh sinh thiết nhầm mô mẹ, dễ sai lệch chẩn đoán. Sinh thiết gai nhau
được thực hiện lý tưởng nhất kể từ tuần thứ 11 của thai kỳ.
Trong chẩn đoán sau sinh và chẩn đoán cho người lớn, mẫu được sử dụng thường là tế
bào lympho trong máu ngoại vi, vì loại mẫu này dễ lấy và lấy số lượng nhiều, khi đưa
vào nuôi cấy có thể bảo quản lại một phần; trong trường hợp nuôi cấy thất bại có thể
tiếp tục nuôi cấy lại lần hai.

Trong các trường hợp ung thư, mẫu đưa vào nuôi cấy là mô sinh thiết từ khối u, tủy
xương…
iii. Kỹ thuật lấy mẫu
Sau đây là một số điểm cần lưu ý trong quá trình lấy mẫu đối với các loại mô thường
được sử dụng nhất để nuôi cấy làm nhiễm sắc thể đồ.
a. Lấy mẫu máu ngoại vi (tế bào lympho)
Máu ngoại vi cần được lấy trong kim tiêm hoặc ống chân không vô trùng có chứa
sodium heparin để chống đông. Thể tích mẫu cần lấy khoảng 5 – 10 ml đối với người
lớn, lượng mẫu này đủ để đưa vào nuôi cấy và dự trữ phòng ngừa nuôi cấy lần đầu thất
bại. Đối với trẻ em, cần lấy khoảng khoảng 2 – 5 ml, do thể tích tuần hoàn nhỏ hơn và
tế bào lympho trẻ em có khả năng phân chia tốt hơn.
Lý tưởng nhất là mẫu máu được đưa vào nuôi cấy trong vòng 24 giờ sau khi lấy.
Trường hợp vận chuyển mẫu đi xa, cần tránh nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao trên
đường vận chuyển. Mẫu được giữ ở nhiệt độ phòng hoặc giữ lạnh nhưng không thấp
dưới 4°C. Với các mẫu nhỏ có nguy cơ bị khô đi, có thể cho thêm một ít môi trường
nuôi cấy trước khi vận chuyển.
Nếu các điều kiện trên không được đảm bảo (mẫu bị khô, mẫu vận chuyển trong đá
lạnh, mẫu quá cũ) nên lấy mẫu lại nếu có thể được.
Lấy mẫu ối (tế bào thai nhi)
Cần lấy mẫu khoảng 10 – 15 ml dịch ối trong điều kiện vô trùng và đựng trong chai
cấy vô trùng. Đối với thai dưới 15 tuần tuổi, thể tích mẫu lấy thường được tính: n tuần
= n ml dịch ối. Vài ml dịch ối đầu tiên thường có nhiều tế bào của mẹ, không nên cho
vào chai nuôi cấy.
Mẫu được giữ ở nhiệt độ phòng trong quá trình vận chuyển, tránh các nhiệt độ quá
thấp hoặc quá cao, tránh kéo dài thời gian vận chuyển.
Lấy mẫu tế bào tủy xương
Các lưu ý trong lấy mẫu tủy xương cũng tương tự như lấy mẫu máu ngoại vi, nhưng
mẫu tủy xương cần được đưa vào nuôi cấy nhanh chóng (trong vòng 24h). Thể tích
mẫu cần lấy khoảng 1 – 3 ml.
Lấy mẫu tế bào mô đặc

Các mô đặc có thể sử dụng là da, gai nhau, các bộ phận của trẻ chết ngay sau sinh, mô
thai chết lưu, mẫu sinh thiết các loại u…
Cần lấy mẫu khoảng 10 – 20 mg gai nhau. Ngoài gai nhau, các loại mô đặc khác khi
lấy mẫu vốn không trong điều kiện vô trùng, nên nhiễm khuẩn là một nguy cơ rất lớn
trong quá trình nuôi cấy các loại mô này.
Các phần của trẻ chết ngay sau sinh, mô thai chết lưu… là các loại mô không thể sinh
thiết lại trong trường hợp nuôi cấy thất bại, và tỷ lệ tế bào còn sống trong mô sinh thiết
không nhiều… gây rất nhiều khó khăn cho kỹ thuật.
Đối với mẫu mô nhỏ, có thể đựng trong chai nuôi cấy vô trùng có chứa môi trường
nuôi cấy để vận chuyển đến phòng thí nghiệm. Không vận chuyển mẫu trong formalin.
Nếu không có môi trường nuôi cấy, có thể tạm vận chuyển mẫu trong nước muối sinh
lý vô trùng. Mẫu lớn có thể được vận chuyển nguyên khối không cần môi trường, vận
chuyển lạnh (trong đá, 0 – 4°C) để làm chậm quá trình phân hủy mô và làm chậm sự
phát triển của các loại vi khuẩn.
iv. Tổng quan nuôi cấy mô/tế bào làm NST đồ
Kỹ thuật nuôi cấy có phần thay đổi tùy loại mô hoặc tế bào sử dụng, nhưng vẫn có
những điểm chung được trình bày trong Hình 3.
Hình 3: Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô và tế bào làm nhiễm sắc thể đồ
Bắt đầu nuôi cấy
- Tế bào sống
- Điều kiện vô trùng
- Môi trường nuôi cấy
phù hợp
- + chất kích thích tế
bào phân chia
- Chất kháng khuẩn
Duy trì nuôi cấy
- Điều kiện vô trùng
- Nhiệt độ tối ưu
- pH tối ưu

- Độ ẩm tối ưu
- Thời gian chăm sóc
tối ưu
Thu hoạch tế bào
- Ngưng quá trình
phân chia
- Gây trương nở tế
bào bằng sốc nhược
trương
- Cố định tế bào
- Nhuộm băng
v. Bắt đầu nuôi cấy
a. Môi trường nuôi cấy
Các mẫu mô sau khi được nhận sẽ được bắt đầu nuôi cấy trong môi trường lỏng thích
hợp.
Môi trường nuôi cấy là dung dịch muối được bổ sung nhiều chất “phụ gia” như đường,
muối, chất đệm pH… Đỏ phenol được sử dụng làm chỉ thị màu trong nhiều loại môi
trường; trong quá trình nuôi cấy, nếu môi trường trở nên quá axit, chỉ thị màu đổi
vàng; chỉ thị màu chuyển thành hồng tím báo hiệu môi trường quá kiềm; hai trường
hợp này báo hiệu cần thay môi trường mới. Một số dạng mô / tế bào có môi trường đặc
biệt cho riêng nó. Các dạng môi trường như RPMI 1640, MEM thích hợp nuôi cấy cho
nhiều loại mô khác nhau.
Các môi trường được thương mại hóa thường không đầy đủ, cần được bổ sung thêm
trước khi sử dụng:
- L-glutamin, axit amin cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào;
- Huyết thanh, thường sử dụng huyết thanh bê, 10 – 30% thể tích môi trường;
- Kháng sinh (penicillin/streptomycin, kanamycin, gentamicin), kháng nấm
(nystatin, amphotericin B). Thuốc kháng nấm làm chậm sự phát triển tế bào
nuôi cấy, chỉ sử dụng khi nghi nhiễm nấm;
- Chất kích thích phân chia tế bào. Phytohemagglutinin (PHA) chiết xuất từ đậu

đỏ thường được sử dụng để kích thích tế bào lympho T phân chia;
- Chất kích thích tăng trưởng, giúp tế bào nuôi cấy đạt độ tăng trưởng lý tưởng.
Dụng cụ nuôi cấy
Tùy theo loại mô nuôi cấy và kinh nghiệm của người thực hiện, dụng cụ nuôi cấy có
thể được lựa chọn khác nhau.
Tế bào ối và các tế bào từ mô đặc (các tế bào “bám dính”) cần được bám trên một bề
mặt để phát triển . Các tế bào này có thể được nuôi cấy trong chai nuôi cấy, hoặc nuôi
cấy in situ (sử dụng dĩa Petri, slide chambers…) (Hình 4).
Máu và tủy xương (các tế bào “không bám dính”) có thể được nuôi cấy dưới dạng
huyền phù, trong các ống ly tâm hoặc chai nuôi cấy.
Để duy trì các điều kiện tối ưu cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của các tế bào,
các mẫu nuôi cấy cần được đặt trong các tủ cấy ổn nhiệt (37°C), duy trì nồng độ CO
2
và độ ẩm cần thiết.
Hình 4 : Dụng cụ nuôi cấy
(Nguồn : />Toàn bộ quá trình nuôi cấy cần được thực hiện vô trùng. Phòng thí nghiệm được cách
ly, trang bị hệ thống lọc khí. Người thực hiện có phục trang vô trùng. Các thao tác
được thực hiện dưới máy hút vô trùng (Hình 5).
Chuẩn bị mẫu
Máu ngoại vi và tủy xương có thể được cho trực tiếp vào dung dịch và nuôi cấy. Tế
bào lympho trong máu cũng có thể được tách ra trước khi đưa vào nuôi cấy bằng
phương pháp ly tâm.
Các tế bào trong dịch ối (tế bào da, ống tiết niệu, ống tiêu hóa của thai nhi, màng ối)
được tách ra bằng phương pháp ly tâm. Dịch ối còn lại sau khi tách tế bào có thể được
sử dụng để làm các xét nghiệm tìm α-fetoprotein (AFP) và acetylcholinesterase
(AChE) để tầm soát các dị tật hở của thai nhi (ví dụ tật đốt sống chẻ đôi).
Các mẫu sinh thiết mô đặc cần được cắt nhỏ bằng dao vô trùng, sau đó xử lý bằng
enzyme như collagenase hay trypsin để tách rời các tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho
tế bào phân chia, tăng trưởng trong quá trình nuôi cấy.
vi. Duy trì nuôi cấy

Các tế bào nuôi cấy được duy trì ở điều kiện nhiệt độ, pH, độ ẩm tối ưu cho sự tăng
trưởng, phát triển.
- Nhiệt độ: tủ cấy giữ nhiệt độ ổn định ở 37°C (nhiệt độ cơ thể);
- pH tối ưu 7,2 – 7,4 (pH sinh lý) được duy trì bằng nồng độ CO
2
5% trong tủ
cấy. Các chai nuôi cấy hoặc vật dụng nuôi cấy khác được đậy lỏng lẻo, cho
phép sự trao đổi khí với không khí trong tủ cấy. Tuy nhiên, hệ thống nuôi cấy
mở này dễ bị nhiễm. Một phương pháp thay thế là sử dụng hệ thống đóng và
nuôi cấy không cần CO
2
, với điều kiện trong môi trường nuôi cấy phải có đệm
pH;
Hình 5: Máy hút vô trùng (laminar hood).
Nguồn : />- Độ ẩm 97% được duy trì trong tủ cấy để tránh sự bay hơi, cô đặc môi trường có
thể làm chết tế bào.
Với các điều kiện như trên được đảm bảo, thời gian để các tế bào trong nuôi cấy tăng
trưởng và phát triển đủ mức cho phân tích nhiễm sắc thể thay đổi tùy loại tế bào. Nuôi
cấy máu ngoại vi thường cần 72 giờ (ngắn nhất là 48 giờ đối với mẫu từ trẻ sơ sinh),
tủy xương cần 24 – 48 giờ. Nuôi cấy tế bào ối và tế bào từ các mô đặc thường cần thời
gian dài hơn, từ 6 – 10 ngày (tế bào ối nuôi cấy in situ) đến 2 tuần (tế bào ối và mô đặc
nuôi trong chai cấy), và cần theo dõi, đánh giá thường xuyên để thay môi trường và
điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy nếu cần thiết.
vii. Thu hoạch tế bào
- Ngưng quá trình phân chia: Colchicine có tác dụng cố định tơ vô sắc, ngăn cản
các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa phân chia về hai cực. Khi cho colcemid vào môi
trường nuôi cấy và ủ, ngày càng nhiều tế bào nguyên phân bị chặn đứng lại ở
kỳ giữa;
- Gây trương nở tế bào bằng sốc nhược trương. Môi trường nuôi cấy được rút bỏ,
thay bằng một dung dịch nhược trương (ví dụ kali clorua 0,075M, natri citrat

0.8%). Các tế bào sẽ trương nở, các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa sẽ dễ dàng tách rời
không chồng chéo lên nhau, tạo thuận lợi cho việc quan sát;
- Cố định tế bào: sau quá trình sốc nhược trương, các tế bào trương phồng sẽ
được xử lý bằng dung dịch cố định (3 phần metanol: 1 phần axit axetic). Các tế
bào sau khi được cố định có thể được tiếp tục sử dụng ngay hoặc giữ lạnh (-
20°C) nhiều năm;
- Chuẩn bị lam và nhuộm băng: các tế bào nuôi cấy dạng huyền phù sẽ được hòa
trộn trong dung dịch cố định và nhỏ giọt lên lam, để khô. Các tế bào nuôi cấy in
situ (như tế bào ối trên chamber slides) đã bám sẵn trên lam không cần phải
chuẩn bị. Quá trình nhuộm băng được thực hiện bằng xử lý trypsin (băng G)
hoặc xử lý nhiệt (băng R) trước khi nhuộm Giemsa, là hai phương pháp nhuộm
băng thường dùng nhất để thực hiện nhiễm sắc thể đồ (Xem Hình 6, Hình 7).
Hình 6: Nhiễm sắc thể nhuộm băng G
(Nguồn: />Hình 7: Nhiễm sắc thể nhuộm băng R
(Nguồn: CHU Bordeaux)
viii. Thời gian trả kết quả, khả năng thất bại và cách khắc phục
Với các phần mềm hỗ trợ làm nhiễm sắc thể đồ hiện đại, thời gian tìm và chụp hình
các các cụm kỳ giữa, phân loại, sắp xếp và chẩn đoán bất thường cấu trúc nhiễm sắc
thể được thu ngắn đáng kể (1 - 2 ngày). Thời gian cần thiết để thực hiện và trả kết quả
nhiễm sắc thể đồ chủ yếu phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy mô / tế bào.
Loại mô sử dụng và kinh nghiệm của người thực hiện sẽ ảnh hưởng đến tỉ lệ thành -
bại của quá trình nuôi cấy. Mỗi phòng thí nghiệm cần theo dõi tỉ lệ thành công - thất
bại của mình để phát hiện ngay những dao động bất thường nhằm tìm và xử trí nguyên
nhân.
Để giảm khả năng thất bại trong nuôi cấy và không thể trả kết quả cho bệnh nhân, mẫu
sinh thiết từ mỗi bệnh nhân nên được chia nhỏ và nuôi cấy thành nhiều mẫu khác nhau
và thu hoạch tại các thời điểm khác nhau.
TÓM TẮT
Các kỹ thuật di truyền tế bào cho phép khảo sát các bất thường ở cấp độ nhiễm sắc thể,
cho phép khảo sát tổng quát nhưng độ phân giải không cao. Các kỹ thuật di truyền

phân tử cho phép khảo sát các bất thường kích thước nhỏ, thậm chí đến từng
Nucleotide, nhưng cần được định hướng tốt thông qua khám lâm sàng hoặc các xét
nghiệm di truyền tế bào.
Nhiễm sắc thể đồ là xét nghiệm di truyền giúp chẩn đoán trước sinh các bất thường về
cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể có thể gặp ở thai nhi. Sau sinh, nhiễm sắc thể đồ có
thể hữu ích để chẩn đoán các trường hợp dị tật bẩm sinh, trẻ sơ sinh kém trương lực,
rối loạn phát triển tâm thần vận động và giới tính. Ở người lớn, nhiễm sắc thể đồ cần
làm trước các trường hợp bệnh lý sinh sản, là xét nghiệm thường quy trước khi thực
hiện hỗ trợ sinh sản. Ngoài ra, nhiễm sắc thể đồ còn giúp nghiên cứu các loại u ác tính.
Quá trình nuôi cấy mô và tế bào cho phép thu được lượng tế bào ở kỳ giữa cần thiết để
thực hiện nhiễm sắc thể đồ. Tùy yêu cầu chẩn đoán và tuổi bệnh nhân, một loại mô
thích hợp sẽ được chọn nuôi cấy. Các điều kiện lấy mẫu và vận chuyển mẫu cần được
tôn trọng để tạo thuận lợi cho quá trình nuôi cấy.
Nuôi cấy tế bào gồm các giai đoạn bắt đầu nuôi cấy, duy trì nuôi cấy và thu hoạch tế
bào. Đây là một quá trình dài, phức tạp, cần được thực hiện nghiêm ngặt theo mọi điều
kiện đã được chuẩn hóa để giảm khả năng nuôi cấy thất bại đến mức thấp nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Nussbaum et al.: Thompson & Thompson's Genetics in Medicine. Saunders; 7th
edition (2007).
Jr., George Sack: USMLE Road Map Genetics. McGraw-Hill Medical; 1st edition
(2008) Gersen Steven L. (Editor), Keagle Martha B. (Editor): The Principles of
Clinical Cytogenetics. Section 2: Examining and Analyzing Chromosomes, pages 62 –
130. Humana Press; 2 edition (October 8, 2004).