đồ án tốt nghiệp công nghệ protein enzyme và kỹ thuật gen

Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, trước hết em xin bầy tỏ lòng
biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, TS. Lê
Quang Hòa người đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn em trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu để hoàn thành bản luận văn này. Em cũng xin bày tỏ lòng
biết ơn đến đã toàn bộ cán bộ Viện CNSH và CNTP trường ĐHBK HN đã giúp
đỡ và hướng dẫn em tận tình trong quá trình nghiên cứu tại phòng thí
nghiệm :”công nghệ Protein enzyme và kỹ thuật gen“.
Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những
người thân đã đọng viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành bản luận
văn này.

Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Trương Thị Thu Hiền
Trang 1
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt: Nghĩa tương ứng:

VSV Vi sinh vật
UHT(Ultra heat treatment) Xử lý tiệt trùng sữa
PCR(Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp
dNTP Deoxynucleotide-triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylendiamin etetraacetic acid
TE TRIS-EDTA
CFU( colony forming units) Đơn vị hình thành khuẩn lạc

Trang 2

Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ
Bảng 1. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa
Bảng 2. Kết quả ly tâm với E.Coli
Bảng 3. Kết quả ly tâm với Bacillus
Bảng 4. Kết quả lựa chọn môi trường tăng sinh
Bảng 5. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với E.coli.
Bảng 6. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với Bacillus.
Hình 1 Hình thái Escherichia coli
Hình 2. Hình thái Bacillus cereus.
Hình 3. Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR
Hình 4. Đồ thị chuẩn hóa của phản ứng Real-time PCR
Hình 5. Quy trình phát hiện Bacillus và E.coli trên sữa tiệt trùng không
đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/1ml
Hình 6. Quy trình phát hiện Bacillus trên sữa tiệt trùng không đường ở
mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml
Hình 7. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế
bào của Bacillus
Hình 8. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế
bào của E.coli
Hình 9. Kết quả lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu sinh khối tế bào
vi sinh vật.

Trang 3
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
MỞ ĐẦU
Sản lượng sữa và nhu cầu tiêu thụ sữa trên thị trường Việt Nam đang tăng
một cách đáng kể, trong 10 năm qua mức độ tiêu thụ là 15 lần. Ước tính đến
năm 2010, nhu cầu về các sản phẩm sữa ở nước ta sẽ gia tăng khoảng 10-15%
mỗi năm để đạt mức khoảng 10kg/đầu người /năm. Vốn là một thực phẩm bổ

dưỡng, sữa cũng là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật gây bệnh. Do vậy,
công tác kiểm tra, và đảm bảo vệ sinh cho sản phẩm sữa là mối quan tâm hàng
đầu của các nhà sản xuất sữa và người tiêu dùng. Tuy nhiên với các phương
pháp phân tích hiện nay, một số hiện tượng nhiễm tạp vi sinh vật gây bệnh
thường được phát hiện muộn, kết quả là các biện pháp xử lý kỹ thuật ít có hiệu
quả và ảnh hưởng nhiều đến quá trình sản xuất
Việc xác định các vi sinh vật có khả năng nhiễm tạp trong các sản phẩm
sữa bằng các phương pháp truyền thống thường ít chính xác, độ nhạy không cao
và thời gian dài. Các kết quả phân tích hầu như không có tính ngăn ngừa chỉ là
căn cứ để giải quyết hậu quả của sự nhiễm tạp. Sự chậm trễ của phương pháp
này sẽ làm tổn thất lớn cho các nhà máy khi có sự cố nhiễm VSV
Đề tài ”Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Bacillus cereus và
Escherichia coli, trong sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật Real Time
PCR” được lựa chọn cũng nhằm góp phần giảm bớt những hạn chế trên của
việc phát hiện những vi sinh vật nhiễm tạp.
Để đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của đề tài gồm các phần sau:
• Lựa chon thời gian ly tâm thu sinh khối tế bào vi sinh vật
• Lựa chọn một môi trường tăng sinh cho vi sinh vật.
• Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp cho vi sinh vật
• Ứng dụng kỹ thuật Real time PCR để phát hiện nhanh các vi sinh vật
B.cereus và E.Coli
Trang 4
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
PHẦN I: TỔNG QUAN
I. Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt nam:
Ngành công nghiệp Sữa Việt Nam là một ngành công nghiệp có nhiều
triển vọng vì hiện giờ các nhà sản xuất trong nước mới chỉ đáp ứng được 11%
nhu cầu tiêu thụ. Nhu cầu sữa trên thị trường cũng tăng không ngừng, năm 1990
tính bình quân trên đầu người mới chỉ ở mức 0,47kg/năm, đến năm 2000 con số
nằy đã tăng đến 6,5 kg/năm và đến năm 2005 đạt tới 9kg/ năm. Cùng với sự gia

tăng về nhu cầu tiêu thụ thì sản lượng sản xuất sữa đã tăng lên đáng kể. Theo số
liệu thống kê năm 2000, sản lượng sữa trong nước đạt 54.000 tấn, năm 2003
tăng hơn gấp hai lần(112000 tấn) và đến năm 2004 con số này đã tăng lên thành
xấp xỉ 198000 tấn.
Sản lượng sữa được dự báo còn tăng nhanh hơn nữa trong giai đoạn tới.
mặc dù có sựu tăng trưởng tốt và sản lượng tiêu thụ và sản xuất nhưng ngành
sữa Việt Nam vẫn còn rất nhiều vấn đề cần giải quyết trong bản thân các nhà
máy cũng như cơ chế quản lý sao cho đảm bảo chất lượng sản phẩm và quyền
lợi người tiêu dùng.
Hiện nay, đã có nhiều chương trình chăn nuôi bò sữa ở các vùng miền tuy
nhiên vẫn chưa đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể vì những nguyên nhân như
mức đầu tư chưa lớn, kỹ thuật chưa đủ đáp ứng và quản lý chưa hiệu quả.Chính
vì nguyên nhân trên mà ngành chăn nuôi bò sữa còn vấp phải vòng luẩn quẩn đó
là nguồn thu từ bán sữa tươi chưa đủ để đầu tư cơ sở vật chất kỹ thuật tốt.
II. Các vi sinh vật nhiễm tạp trong quá trình chế biến sữa
1. Các nhóm vi sinh vật thường gặp
Trang 5
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Trong sữa luôn chứa một lượng vi sinh vật nhất định ngay cả khi sữa
được thu hoạch trong điều kiện vệ sinh tốt. Hệ vi sinh vật trong sữa cũng rất đa
dạng bao gồm nấm men, mấn mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. Trong các đối tượng
trên thì vi khuẩn được quan tâm hơn cả vì trong sữa chúng thường phát triển
vượt trội hơn. Vi khuẩn trong sữa hay gặp nhất đó là nhóm vi khuẩn lactic như
Streptococcus lactic, S.diaxetylactic, S. Paracitrovous, Lactobacillus
bulgaricum, L.acidophilum, L. Lactic, L.helveticum. [4] Nhóm vi khuẩn này
dóng vai trò quan trọng trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa như sữa
chua, phomát. Tuy nhiên nếu chúng có xuất hiện trong các sản phẩm sữa tươi
tiệt trùng hoặc sữa tươi thanh trùng thì sẽ là tác nhân làm hỏng sản phẩm dưới
dạng tạo kết tụ protein.
Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia các vi sinh vật thường nhiễm

trong sữa thành các nhóm chính sau:
1.1 Vi sinh vật chịu lạnh (Psychrotrophs)
Là những vi sinh vật có khả năng phát triển được ở nhiệt độ dưới 7
o
C.
Trong công nghệ sản xuất sữa nhóm vi sinh vật chịu lạnh hay gặp trong mẫu sữa
hỏng là nhóm trực khuẩn Gram (-), thường được xác định thuộc loài
Pseudomonas. hầu hết những vi sinh vật chịu lạnh này sẽ nhanh chóng làm
hỏng sữa khi được bảo quản ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 10
o
C. Tuy nhiên nó lại
bị tiêu diệt dễ dàng trong các quá trinh gia nhiệt vì vậy ở sản phẩm đã qua gia
nhiệt thì thường hay bị tái nhiễm sau gia nhiệt do điều kiện vệ sinh không đảm
bảo.
1.2 Vi sinh vật ưa ấm (Meso philic)
Trang 6
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Những vi khuẩn ưa ấm quan trọng nhất là Streptococci, Lactobacilli và
Coliforms, những vi khuẩn này sản sinh axit, sinh khí và làm mất mùi sữa. Tuy
nhiên chúng lại dễ dàng bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt Pasteur.
1.3 Vi sinh vật chịu nhiệt (Thermoduric)
Là nhóm có thể không bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt pasteur hoặc
các xử lý nhiệt khác. Tuy nhiên nhóm này không phát triển ở nhiệt độ gia nhiệt
Pasteur. Giống chịu nhiệt hay gặp nhất là Mcrobacterium, Corynebacterrium,
Micrococos, Streptococcus và Bacillus
1.4 Nhóm ưa nhiệt (Thermophilic)
Là nhóm vi khuẩn phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ xử lý Pasteur. Loài ưa
nhiệt thường thấy nhất trong 2 nhóm Bacillus và Clostridium.
1.5 Nhóm ưa nhiệt có thể phát triển trong điều kiện lạnh (Thermoduric
Psychrotrophs) là một số ít các vi sinh vật chịu nhiệt hoặc tạo bào tử chịu nhiệt

nên vẫn có thể sống sót sau khi gia nhiệt nhưng chúng cũng có khả năng phát
triển được trong điều kiện lạnh. Nhóm này thường phát triển chậm sau đó gây
hỏng sản phẩm trong quá trình lưu thông sản phẩm. thường hay gặp nhất trong
nhóm này là Bacillus.[16]
2.Tổng quan về Bacillus và E.coli
E.coli và Bacillus là hai vi sinh vật gây bệnh thường gặp và phát triển tốt
trong môi trường sữa, ngoài ra Bacillus còn là vi sinh vật dễ ràng sinh bào tử và
bào tử rất dễ nảy mầm vì thế gây khó khăn trong quá trình bảo quản.
2.1 Escherichia coli
Trang 7
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
E.coli là vi sinh vật hiếu khí tuỳ ý hiện diện trong đường ruột của người
và các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng
vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có 4 dòng
có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enteropathogenic E.coli
(EPEC), Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) và
Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) hay E.coli O157:H7.[2]
Hình 1 Hình thái Escherichia coli
Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm hay phân
chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây người ta
còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện trong những vùng nước ấm,
không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E.coli
dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong
quá trình sản xuất, chế biến. Các dòng E.coli gây bệnh gây ra các triệu chứng
Trang 8
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
rối lọan đường tiêu hoá. Các triệu chứng lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng,
có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khả
năng đáp ứng của từng người.
2.2 Bacillus cereus

Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tuỳ tiện,
tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ 5-50
o
C, tối ưu ở 35-40
o
C, pH dao động
từ 4,5-9,3, dễ tạo bào tử và bào tửu nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn này hiện
diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (Sữa, thịt, rau quả, các loại sản phẩm
khô )[2]
Trang 9
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Hình 2 Hình thái Bacillus cereus
Vi khuẩn này sinh ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu
chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus khi
thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ
trước khi sử dụng.
Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ 10
6
tế bào/g đủ gây ngộ độc. Triệu
chứng ngộ độc gây ra bởi B.cereus chủ yếu là đau bụng, tiêu chảy, không sốt,
bắt đầu 4 đến 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12-24 giờ.
Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực
phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ
III. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa
Giới hạn tối đa về vi sinh vật cho phép có mặt trong các sản phẩm sữa
khác nhau là khác nhau. Trong cùng một sản phẩm nhưng ở mỗi quốc gia khác
nhau thì giới hạn này cũng khác nhau
Tiêu chuẩn Việt Nam
Hiện nay Việt Nam đang áp dụng tiêu chuẩn về giới hạn vi sinh vật trong
các sản phẩm sữa theo quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31 tháng 08

năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế (Bảng 1)[8]
Nhóm sữa
a. Sữa khô, sữa bột
TSVKHK 5.10
4
Coliforms 10
E.coli 0
Trang 10
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
S.Aureus 0
Salmonella* 0
b. Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur. TSVKHK 5.10
4
Coliforms 10
E.coli 3
Salmonella* 0
c. Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp U.H.T. TSVKHK 10
Coliforms 0
E.coli 0
S.Aureus 0
Salmonella* 0
d. Sản phẩm chế biến của sữa : bơ, sữa chua, pho-
mat, ( - dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước
khi sử dụng ).
TSVKHK 10
4
Coliforms 10
E.coli 0
S.Aureus 0
Salmonella* 0

Bảng 1 Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa
IV. Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm
Để kiểm soát vi sinh vật thì có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào
thời gian cho kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là
phương pháp truyền thống và phương pháp phân tích nhanh.
1. Các phương pháp truyền thống
Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật
trên các môi trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các
loài vi sinh vật khác nhau.
Trang 11
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải
đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một
số hạn chế như độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích
thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa.
2. Các phương pháp phân tích nhanh
Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chia
phương pháp này thành hai nhóm nhỏ: nhóm dựa trên nguyên tắc của sự kết hợp
đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể (phương pháp miễn dịch) và nhóm dựa
trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit
2.1. Phương pháp miễn dịch
Nhóm các phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc
hiệu với kháng nguyên bề mặt của tế bào vi sinh vật. Dựa trên nguyên tắc
này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành phương pháp phát hiện nhanh
vi sinh vật.
• Kĩ thuật ELISA, khi trong mẫu xuất hiện vi sinh vật mục tiêu sẽ
xảy ra phản ứng kháng nguyên kháng thể và phản ứng này sẽ được
phát hiện nhờ một kháng thể cộng hợp gắn enzym thứ hai làm biến
màu cơ chất. Ngưỡng phát hiện của kĩ thuật này giao động từ 10
4

-
10
6
cfu/ml, do vậy trong phân tích phát hiện vi sinh vật thường
phải qua giai đoạn tăng sinh. Tuy nhiên, giờ đây người ta đã có thể
sử dụng bi từ có gắn kháng thể đặc hiệu để thu nhận trực tiếp vi
sinh vật mục tiêu với một sốlượng lớn mà không cần giai đoạn tăng
sinh.
Trang 12
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
• Kĩ thuật latex agglutination (LA), sử dụng các hạt cao su có mầu có
đính kháng thể đặc hiệu để định tính nhanh các chủng vi khuẩn đã
được phân lập. Khi có mặt kháng nguyên tương ứng, quá trình kết
tụ (agglutination) sẽ diễn ra và có thể quan sát trực tiếp bắng mắt
thường (tạo ra hạt hoặc dải có màu). Kĩ thuật này có thể sử dụng để
xác định nhanh vi sinh vật nhiễm tạp trong môi trường thuần sau
khi phân lập từ thực phẩm.
2.2. Kĩ thuật lai phân tử( DNA- hybridization):
Kỹ thuật này có thể sử dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có tính
chính xác và độ nhạy cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự có mặt của
nhiều loài vi sinh vật một lúc với thời gian nhanh. Tuy nhiên kỹ thuật cũng
phức tạp và phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật liệu phóng xạ.
2.3. Kỹ thuật PCR
Về lý thuyết kỹ thuật này có thể nhân một đoạn ADN đích lên hàng triệu
bản chỉ trong khoảng hơn một giờ vì vậy giảm được rất nhiều hoặc không
cần thời gian tăng sinh cũng có thể xác định được sự có mặt của vi sinh vật
đích. Tuy nhiên sự có mặt của các chất ức chế trong thực phẩm hoặc trong
môi trường tăng sinh cũng có thể ức chế sự bắt cặp của mồi và làm giảm
khả năng khuyếch đại đoạn ADN đích Kỹ thuật này cho phép phát hiện
được nhiều loài vi sinh vật với thời gian tương đối nhanh và độ nhạy khá

cao. Phương pháp này có thể áp dụng trong các nhà máy trong công tác
phòng ngừa và phát hiện.
2.4. Kỹ thuật Microarray, Macroarray:
Kỹ thuật này thực chất là dựa trên kỹ thuật lai phân tử, trên các phiến
kính hoặc các màng cellulose có gắn hang chục nghìn mẫu do AND theo một
trình tự xác định. Nhờ vào phản ứng lai, bắt cặp của AND có trình tự tương
Trang 13
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
đồng mà sự có mặt của một đoan gen của một vi sinh vật đích nào đó có thể
được phát hiện và số copy có thể xác định chính xác. Với kỹ thuật này có thể
xác định được nhiều gen đích ( vi sinh vật) trong cùng một thời điểm với
mức độ chính xác cao và thời gian nhanh và chính xác
3. Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR
Nguyên tắc
Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên
nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và theo dõi trực
tiếp qúa trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt qua sử dụng
kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa vào độ phát huỳnh quang ta có thể định lượng
các đoạn DAN hình thành
Do mồi có tính phát quang cho nên có thể đánh dấu chúng với các chất
nhuộm khác nhau, nhờ thế để có thể nhân các đoạn khác nhau trong cùng một
phản ứng PCR. Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là phải tổng hợp các
mẫu dò khác nhau cho các trình tự nhận biết khác nhau.[10]
Các phương pháp định lượng bằng Real time PCR
• Phương pháp sử dụng chất nhuộm mầu SYBR Green:
Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi
được gắn với sợi DNA kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi
bản sao tạo ra càng nhiều thì tín hiệu phát ra của chất mầu sẽ tăng lên
theo tỉ lệ thuận. Ưu điểm của phương pháp này là SYBR sẽ đính vào bất
cứ chuỗi DNA kép nào có mặt.

• Phương pháp đầu dò thuỷ phân TaqMan:
Trang 14
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Kỹ thuật này sử dụng các đầu dò có thể phát huỳnh quang, các mẫu
dò là một oligonucleotit trong đó một đầu được gắn với chất nhuộm mầu
có phát huỳnh quang, đầu kia được gắn với chất nhuộm có vai trò làm tắt
sự phát huỳnh quang. Khi có mặt đoạn DNA cần nhân, mẫu dò sẽ gắn vào
DNA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng 5’. Ở trạng thái này không
có hiện tượng phát huỳnh quang.
Khi bắt đầu tiến hành quy trình PCR với sự hoạt động của enzyme
taq-polymerase mồi được kéo dài cho tới khi gặp mẫu dò thì mẫu dò sẽ bị
phân giải bởi hoạt tính 5’ nuclease của taq-DNA polymerase.Sự phân giải
mẫu dò sẽ làm giải phóng chất nhuộm mầu có khả ăng phát huỳnh quang
khỏi ảnh hưởng kìm hãm của chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh
quang. Sự phát huỳnh quang này có thể nhận biết được.
• Phương pháp đầu dò lai
Trong kỹ thuật này một đầu dò được gắn với một chất cho huỳnh
quang ở đầu 3’ và một đầu dò thứ hai gắn với một chất nhuộm huỳnh
quang. Khi hai đầu dò này tiến lại gần nhau, cách nhau khoảng 1-5
nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ kích thích
chất nhận huỳnh quang và kết quả là phát ra tín hiệu huỳnh quang.
Trang 15
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Hình 3 Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR
Ưu điểm
Kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm của PCR như sau:
-Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR
-Có thể định lượng chính xác sản phẩm PCR, trong khi sử dụng PCR thông
thường việc phân biệt dựa trên độ lớn của vạch thu được sau điện di
-Độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, thời gian tiến hành phản ứng ngắn

-Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA cùng lúc trong cùng một ống nghiệm
nên giảm khả năng nhiễm mẫu
Trang 16
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. Vật liệu và thiết bị
1. Chủng vi sinh vật
STT Chủng chuẩn Nguồn gốc
1 Bacillus cereus ATCC 10876
2 Escherichia coli ATCC 25923
2. Mẫu sữa thí nghiệm
-Mẫu sữa tươi tiệt trùng không có vi sinh vật của Vinamilk.
3. Hoá chất
-Hóa chất dùng tách chiết DNA tổng số và hóa chất real time PCR được cung
cấp bởi Amersham Pharmacia Biotech.
-Các hóa chất phân tích DNA do Invitrogen và Applied Biosystem cung cấp
-Hóa chất môi trương nuôi cấy do Merck và Difco cung cấp
4.Môi trường
Các môi trường sử dụng trong đề tài gồm có
• Môi trường Violet Red Bile Agar (VRBA): Dùng để nuôi E.coli
• Môi trường Mannitol-Egg Yolk-polymyxin(MYP) agar (g/l):Dùng để
nuôi Bacillus
• Môi trường LB(g/l) dùng trong tăng sinh vi khuẩn
• Trypticase soy broth yeast extract (TSBYE)
Trang 17
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
• Letheen Broth
• Fluid Thioglycollate Medium
• Nutrient Broth
• Terrific Broth

II. Phương pháp nghiên cứu
1. Xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ
tế bào của E.coli và Bacillus
Để có thể thu được mẫu sữa với các mật độ vi sinh vật nhất định cần phải
tiến hành nhiễm chủ động vi sinh vật mong muốn vào mẫu sữa tiệt trùng không
có vi sinh vật ở mật độ mong muốn phù hợp với yêu cầu thí nghiệm. Như vậy
cần phải xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật
độ tế bào của E.coli và Bacillus, nhằm xác định được mật độ vi sinh vật của một
dung dịch chứa vi sinh vật thông qua mật độ quang.
1.1. Nguyên tắc:
Khi phát triển trong môi trường lỏng mật độ tế bào thay đổi theo thời
gian. Khả năng hấp thụ ánh sáng của canh trường phụ thuộc vào mật độ tế bào
trong dịch nuôi cấy. Ta sẽ tiến hành xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa
giá trị mật độ quang và mật độ tế bào
1.2. Cách tiến hành:
-Cho 100µl chủng chuẩn vào trong 10ml môi trường tăng sinh TSBYE, nuôi lắc
với vận tốc lác 200 vòng/phút ở 37
o
C
Trang 18
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
-Sau các khoảng thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ tăng
sinh, đem mẫu đi đo giá trị mật độ quang so với môi trường TSBYE ở bước
sóng 600nm
- Pha loãng dung dịch tại các thời điểm tăng sinh, trải 100µl dung dịch đó trên
môi trường đặc hiệu.
-Đếm khuẩn lạc và xác định mật độ tế bào (N/ml) của các dung dịch đó tại các
thời điểm khác nhau.
-Tính các giá trị Log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ
đục. Vẽ đường biễu diễn của Log (N/ml) theo OD

600nm
. Xác định khoảng tuyến
tính giữa log (N/ml) và OD.
2. Lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu cặn tế bào trong quá trình ly
tâm
Với mật độ vi sinh vật ban đầu rất thấp của mẫu thí nghiệm, ta cần tiến
hành ly tâm để cô đặc mẫu và thu lại sinh khối tế bào. Tuy nhiên, với mật độ
thấp như thế, nếu mang ly tâm 50 ml mẫu chỉ có thể thu được tối đa 4 CFU, như
vậy xây dựng một chế độ ly tâm phù hợp là một việc rất quan trọng.
2.1.Nguyên tắc
Ở cùng một vận tốc ly tâm, thời gian ly tâm càng lớn thì tế bào sống thu
được trong cặn tế bào càng tăng, đồng thời tỷ lệ tế bào chết trong quá trình ly
tâm cũng tăng lên. Nên nếu lựa chọn thời gian tăng sinh quá cao sẽ làm tỷ lệ vi
sinh vật chết trong quá trình ly tâm tăng lên, tuy nhiên nếu thời gian ly tâm thấp
sẽ không thu hết cặn tế bào sống từ mẫu sữa thí nghiệm. Vì vậy, phần này nhằm
nghiên cứu thời gian tăng sinh phù hợp nhất cho cả hai vi sinh vật lựa chọn
nhằm thu được tỷ lệ cao nhất tế bào vi sinh vật sống từ mẫu thí nghiệm có mật
Trang 19
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
độ vi sinh vật ban đầu rất thấp 1CFU/25ml.Ta sẽ tiến hành xác định chế độ ly
tâm thích hợp (cố định lực ly tâm, thay đổi thời gian ly tâm) để thu tế bào trước
bước tăng sinh.
2.2. Cách tiến hành:
Với một thời gian ly tâm nhất định, tiến hành các bước sau:

• Tăng sinh 100µl chủng chuẩn trong 10ml môi trường TSBYE nuôi lắc ở
vận tốc lắc 200rpm trong 3-4h ở 37
o
C.
• Đo OD, dựa vào đường cong sinh trưởng của hai vi sinh vật đã xây dựng

được để xác định độ pha loãng cần thiết để có thể tiến hành nhiễm chủ
động.
• Nhiễm chủ động với nồng độ 300 CFU/ml vào 50ml sữa trong ống falcon
50ml ( Với nồng độ này khi trải 100µl trên đĩa thạch đặc hiệu thì sẽ dễ
dàng đếm số khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật)
+ Thực hiện đồng thời trong 6 ống falcon. Để đảm bảo nồng độ vi sinh
vật trong cả 6 ống falcon là như nhau hay quá trình nhiễm chủ động
được chính xác ta tiến hành nhiễm chủ động 10
5
CFU vào 300 ml sữa
(tương ứng với 300CFU/50ml), chia đều vào 6 ống falcon 50ml (lắc
đều trước mỗi lần rót từ bình Scort vào ống falcon).
• Ly tâm 3 ống ở các chế độ ly tâm 6000 rpm, trong 3 phút, 6 phút, 9
phút, 12 phút. 3 ống còn lại được dùng làm kiểm chứng.
+ Đổ dịch nổi sang ống falcon sạch. Chuyển các ống falcon vào giữ
lạnh trong thùng đá để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật.
+ Hoà tan phần kết tủa sau ly tâm trong 10ml đệm.
• Xác định mật độ tế bào trong dịch kiểm chứng, dịch hoà tan kết tủa và
trong dịch nổi sau ly tâm:
Trang 20
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
+đối với dịch nổi: trải 100µl dịch nổi trên đĩa Petri có chứa môi trường
đặc hiệu.
+ dịch kiểm chứng và dịch hoà tan kết tủa sau ly tâm: trải 100µl dịch và
dịch pha loãng 10 lần(pha loãng bằng đệm photphat,pH=7.25,đã thanh
trùng) lên đĩa Petri chứa môi trường đặc hiệu.
Nuôi ở 37
o
C trong 24h sau đó đếm khuẩn lạc.
2.3. Đánh giá kết quả

Sau khi xác định được mật độ tế bào trong dịch kiểm chứng, dịch hoà tan kết
tủa và trong dịch nổi sau ly tâm. Ta tiến hành xác định tỷ lệ tế bào sống còn lại
trong dịch nổi và tỷ lệ tế bào sống thu được trong phần kết tủa sau ly tâm. Từ đó
đánh giá hiệu quả ly tâm ở các thời gian ly tâm khác nhau.
Lựa chọn khoảng thời gian ly tâm thích hợp nhất để thu được tỷ lệ tế bào
sống trong cặn tế bào sau khi ly tâm là lớn nhất.
3. Lựa chọn môi trường tăng sinh thích hợp cho cả 2 vi sinh vật.
Các môi trường dùng trong thí nghiệm:
TSBYE
Letheen Broth
Fluid Thioglycollate Medium
Nutrient Broth
Terrific Broth
Milk ( sữa tươi tiệt trùng vinamilk)
Với các môi trường trên, tiến hành các bước thí nghiệm như sau:
• Tăng sinh 100µl chủng chuẩn trong 10ml TSBYE trong 3-4h nuôi lắc
với vân tốc lắc 200rpm. ở nhiệt độ 37
o
C
Trang 21
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
• Đo OD và dựa vào đường cong sinh trưởng đã xây dựng để xác định mật
độ tế bào và độ pha loãng thích hợp.
• Nhiễm mẫu chủ động các mẫu sữa tiệt trùng không có vi sinh vật các vi
sinh vật B.cereu E.Coli sao cho mật độ vi sinh vật đạt 10CFU/ml (Thực
hiện đồng thời trong 6 ống : nhiễm khoảng 3.10
3
CFU vào 300ml sữa rồi
chia đều vào 6 ống( lắc đều trước khi rót))
• Ly tâm ở chế độ ly tâm thích hợp đã xác định ở trên.(giữ lạnh mẫu nếu

cần thiết). Đổ dịch nổi.
• Cho vào mỗi ống 10 ml một loại môi trường ở trên. Lắc đều cho tan kết
tủa mang nuôi ở 37
o
C, lắc 200rpm, trong 4h.
• Trải 100µl dịch pha loãng trên đĩa Petri có môi trường đặc hiệu. Mỗi
nồng độ trải trên 3 đĩa. Nuôi ở 37
o
C trong 24h
Đánh giá kết quả:
-Đếm số lượng khuẩn lạc từ các đĩa peptri. So sánh và đánh giá hiệu quả tăng
sinh giữa các môi trường đã chọn.
-Lựa chọn ra một môi trường tăng sinh thích hợp nhất cho tất cả các vi sinh vật
lựa chọn.
4. Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp:
4.1. Mục đích:
Xác định được thời gian tăng sinh tối thiểu để thu được mật độ vi sinh vật
đủ để thực hiện phản ứng Real time PCR từ mật độ vi sinh vật ban đầu là
1CFU/25ml
4.2. Cách tiến hành:
• Tăng sinh 100µl chủng chuẩn trong 10ml TSBYE trong 3-4h nuôi lắc với
vân tốc lắc 200rpm. ở nhiệt độ 37
o
C
Trang 22
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
• Đo OD và dựa vào đường cong sinh trưởng đã xây dựng để xác định mật độ
tế bào và độ pha loãng thích hợp.
• Nhiễm mẫu chủ động các mẫu sữa tiệt trùng không có vi sinh vật các vi sinh
vật B.cereu, E.Coli sao cho mật độ vi sinh vật đạt 1CFU/25ml (Thực hiện

đồng thời trong 3 ống ở 3 nồng độ 1 CFU/25ml, 1/3 CFU/25ml và
3CFU/25ml để đảm bảo chắc chắc thu đưựoc giá trị 1 CFU/25ml). Trải trên
dĩa peptri để kiểm tra lại nồng độ vi sinh vật đã nhiễm vào.
• Ly tâm ở chế độ ly tâm thích hợp đã xác định ở trên.(giữ lạnh mẫu nếu cần
thiết). Đổ dịch nổi.
• Cho vào mỗi ống 10 ml một loại môi trường ở trên. Lắc đều cho tan kết tủa
mang nuôi ở 37
o
C, lắc 200rpm, trong 3 giờ ,4giờ, 5 giờ.
• Trải 100µl dịch pha loãng trên đĩa Petri có môi trường đặc hiệu. Mỗi nồng
độ trải trên 3 đĩa. Nuôi ở 37
o
C trong 24h
4.3 Đánh giá kết quả
-Đếm số lượng khuẩn lạc từ các đĩa peptri. Xác định ống có nồng độ nhiễm
đúng 1 CFU/25ml
-Xác định mật độ vi sinh vật thu được sau khi tăng sinh 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ
-Dựa vào độ nhạy của phản ứng Real time PCR để xác định khoảng thời gian
tăng sinh tối thiểu để có thể phát hiện sự nhiễm tạp của vi sinh vật
5. Tách chiết DNA tổng số
5.1. Nguyên tắc
Thành tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng nhiệt độ cao, sau đó ly tâm loại
xác tế bào.
5.2. Tiến hành
Trang 23
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
-Sau khi nuôi cấy các VSV lựa chọn trong môi trường, pha loãng dịch nuôi
cấy đến các nồng độ khác nhau, nhiễm chủ động vào 10 ml sữa.
-Chuyển 1ml dịch nuôi cấy trong sữa sang ống eppendorf, thêm 0,3ml
EDTA 0,25M ly tâm 13000vòng/phút trong 5 phút thu cặn tế bào

-Rửa cặn tế bào hai lần bằng nước cất, ly tâm 13000 vòng/phút, đổ dịch nổi
-Thêm 100µl nước khử ion.
-Tách chiết DNA ở 99
o
C trong 15 phút
-Xử lý dịch thu được để thu DNA tổng số ở phần dịch trong vào một
eppendorf mới
-Giữ ở -20
o
C cho phản ứng Real Time PCR
6. Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose.
6.1. Nguyên tắc:
Các axit nucleic (DNA, RNA) do chứa gốc phosphate trong phân tử nên ở pH
kiềm hay trung tính chúng sẽ là những poly anion tích điện rất âm Trong diện
trường chúng sẽ chuyển động về phía cực dương không phụ thuộc vào điện tích
của phân tử DNA, mà phụ thuộc vào kích thước phân tử DNA và tính chất của
gel agaroza. Sau điện di DNA có thể được phát hiện và phân tách bằng cách
nhuộm gel bởi ethium bromide. Ethium bromide là chất có khả năng liên kết
đặc hiệu với DNA và chất huỳnh quang khi bị kích thích bởi ánh sáng tử ngoại.
6.2. Tiến hành:
• Cho agaroza vào dung dịch 1X đệm TAE để được nồng độ 1%. Dùng lò
vi sóng đun đến khi agaroza nóng chảy.
• Để nguội bớt rồi đổ dịch vào khay để đông thạch.
Trang 24
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
• Pha loãng đệm 10X đệm TAE thành 1X TAE
• Trộn mẫu DNA cần điện di với đệm chấm mẫu.
• Tra mẫu vào giếng
• Cắm dây nối bình điện di vào nguồn một chiều ở 100 V cố định.
• Chờ thuốc nhuộm xanh trong mẫu chạy đến vạch cuối cùng.

• Nhuộm bản gel vào dung dịch ethium bromide 0.5µl/ml trong vòng 15
phút, nhấc khay thạch đựng mẫu và đổ agaroza lên giếng nilo soi lên máy
soi gel và quan sát
7. Kỹ thuật Real time PCR
7.1. Nguyên tắc:
Kỹ thuật Real Time PCR cho phép hiển thị và theo dõi trực tiếp quá trình
nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát
huỳnh quang. Dựa vào cường độ phát huỳnh quang mà có thể định lượng được
các đoạn DNA hình thành. Có 3 kỹ thuật được sử dụng cho real time PCR:
SYBR Green, TaqMan (phương pháp 5’ nuclease), đầu dò lai. Trong đó phương
pháp nhuộm màu SYBR Green là phương pháp đơn giản và kinh tế hơn cả cho
phép phát hiện và định lượng sản phẩm PCR trong phản ứng Real time. SYBR
Green gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA mạch kép. Do vậy, khi sản phẩm PCR
được tích lũy, cường độ phát huỳnh quang sẽ tăng lên .
- Ưu điểm của phương pháp SYBR Green: rẻ tiền, dễ sử dụng, nhạy.
- Nhược điểm: do SYBR Green liên kết với bất kỳ một DNA mạch kép
nào trong phản ứng, bao gồm cả primer- dimers và những sản phẩm không đặc
hiệu khác, dẫn tới kết quả cao hơn so với nồng độ đích.
Trang 25