luận văn tốt nghiệp ngành công nghệ sinh học: khảo sát khả năng tăng sinh khối của nấm men Rhodotorula

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ – TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài:
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TĂNG SINH KHỐI
CỦA NẤM MEN RHODOTORULA Spp
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH
GVHD : TÔ MINH CHÂU
KHÓA HỌC: 2006 – 2010
Thành phố Hồ Chí Minh tháng 12 năm 2010
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 1
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả thầy, cô khoa Công Nghệ Sinh
Học trường Đại học Mở-TP.HCM đã truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức quý
báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Đặc biệt là với lòng biết ơn sâu sắc
đến cô Tô Minh Châu và thầy Ngyễn Văn Hanh đã tận tình hướng dẫn , góp ý cũng
như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp
này với tất cả tinh thần trách nhiệm và lòng nhiệt tình của Cô và Thầy.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 2
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
Công nghệ sinh học là ngành khoa học còn trẻ so với các ngành khoa học
khác.Trong những năm gần đây công nghệ sinh học là một trong những ngành
khoa học có bước đột phá khá lớn, nó đã và đang phát triển rất mạnh mẽ và là
một trong những ngành mũi nhọn hiện nay. Các thành tựu của công nghệ sinh

học đã có những ứng dụng thiết thực và có hiệu quả trong các lónh lực y học,
chân nuôi thú y, nuôi trồng thủy sản, công nghiệp thực phẩm…Đối tượng mà
ngành công nghệ sinh học đang hướng đến đó chính là vi sinh vật, mà vi sinh
vật là nguồn vô tận lại có lợi ích rất lớn đối với con người.Từ xa xưa con người
đã biết đến hoạt tính của vi sinh vật, ngày nay việc ứng dụng nó càng tinh vi
và hoàn thiện hơn. Công nghệ sinh học được chia thành nhiều ngành khác
nhau, trong đó công nghệ vi sinh là ngành khai thác tốt nhất khả năng kỳ diệu
của cơ thể vi sinh vật. Thực chất có thể coi vi sinh vật là các nhà máy cực kỳ
nhỏ và cực kỳ tinh vi. Nhiệm vụ của công nghệ vi sinh là tạo ra được điều kiện
thuận lợi cho các vi sinh vật hoạt động với hiệu suất cao nhất. Vì thế chúng ta
cần nghiên cứu tìm ra những vi sinh vật có ứng dụng thiết thực đến đời sống
con người cũng như khai thác có hiệu quả nhất. Và việc tìm kiếm, khai thác
nguồn lợi này sẽ mãi mãi không bao giờ là vô nghóa. Một trong số những vi
sinh vật mà các nhà khoa học đã tìm ra và có ứng dụng rộng rãi trong ngành
nuôi trồng thủy hải sản, chăn nuôi thú y, công nghiệp thực phẩm, đó chính là
nấm men. Một giống nấm men mà em muốn đề cập đến ở đây đó chính là
nấm men Rhodotorula.
Nấm men Rhodotorula đã được các nhà khoa học biết đến từ những năm 50.
Ngòai việc tạo ra một lượng lớn protein, vitamin, loại nấm men này còn cung
cấp một lượng lớn carotenoid là lọai sắt tố đỏ cam hòa tan được trong dầu.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 3
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Chúng được dùng làm chất phụ gia, bổ sung vào thức ăn vật nuôi, làm phẩm
màu dùng trong công nghiệp
Thực tiễn khoa học đã chứng minh được khả năng tuyệt vời của vi sinh vật
trong việc tổng hợp nên các chất cần thiết cho đời sống của con người từ phụ
phế liệu công nghiệp như: protid, axit amin, vitamin, Một trong số những vi
sinh vật có lợi đó có nấm men Rhodotorula, sinh khối của chúng chứa một
lượng lớn protein, vitamin, được dùng để bổ sung vào thức ăn cho người và gia

súc. Như việc bổ sung sinh khối nấm men Rhodotorula glutilis vào khẩu phần
thức ăn cho tôm sẽ vừa cung cấp khoáng , lipid vừa cung cấp carotenoid.
Cùng với sự phát triển của nền công nghiệp hiện đại, công nghệ sinh học
hiện đang là mối quan tâm hàng đầu của tất cả các nước đã và đang phát triển
trên Thế Giới hiện nay. Họ đã tập trung nghiên cứu để tìm và khai thác được
tối đa nguồn lợi từ vi sinh vật. Sử dụng vi sinh vật để sản xuất ra chế phẩm
sinh học, phân vi sinh, chất phụ gia, chiết suất protein, caroten, để thay thế
cho những nguồn trước đây và cũng chính điều này đã khơi dậy những ý tưởng
mới mẻ về những công trình nghiên cứu của rất nhiều người. Và để tìm hiểu
rõ hơn đồng thời bước đầu tiếp cận với công tác nghiên cứu em đã tiến hành
làm đề tài “Khảo sát điều kiện tăng sinh khối của nấm men Rhodotorula spp”
với mục đích tìm ra được môi trường tối ưu nhất để vừa có thể thu được một
lượng lớn sinh khối vừa ít tốn kém về mặt tài chính cũng như thời gian nhất.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 4
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
PHẦN II: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT.
1. Sơ lược đặc điểm của nấm men nói chung[2,4,6,9]
1.1. Hình thái kích thước của nấm men.
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào và thường sinh
sản vô tính theo lối nảy chồi. Nấm men không chứa diệp lục tố và phân bố
rộng rãi trong tự nhiên. Nhiều loài trong nhóm này có khả năng lên men rượu
được áp dụng trong sản xuất rượu, bia, làm bánh mì Tế bào nấm men giàu
protein, vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B và tiền vitamin D
2
-bổ sung dinh
dưỡng vào thức ăn gia súc và có thể dùng chế tạo một số thực phẩm cho
người Tuy nhiên cũng có một số nấm men gây bệnh cho người và gia súc như
Candida albican, Cryptoccous và gây hư hỏng thực phẩm như Mycoderma.
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật, tế bào nấm men

thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, hình thái nấm men thay đổi tùy thuộc
vào từng loài, tùy điều kiện nuôi cấy và trao đổi chấùt của ống giống, do đó
nấm men có hình thái đa dạng như hình trứng, hình bầu dục, hình tròn, hình
ống dài, hình thoi, hình chai, hình lưỡi liềm
Kích thước tế bào nấm men thay đổi tùy theo từng giống từng loài, nói
chung kích thước trung bình trong khỏang 3-5×5-10 µm.
1.2. Cấu tạo tế bào nấm men.
1.2.1. Vách tế bào
Khi còn non vách tế bào nấm men tương đối mỏng, tùy thuộc thời gian nuôi
dưỡng mà vách tế bào dày lên. Thành phần chủ yếu của vách tế bào là glucan
và mannan, thành phần còn lại là protein, một ít lipit, đôi khi còn là
polyphotphat, enzyme, sắc tố và một ít ion vô cơ, đặc biệt vách tế bào còn
chứa chất kitin.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 5
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
1.2.2. Màng nguyên sinh chất
Chất nguyên sinh thường có màu xám. Khi tế bào còn non hầu như không
nhận thấy càng về già ta càng thấy có sự thay đổi rõ rệt.
Tế bào còn non chất nguyên sinh thường đồng nhất hơn, càng về già tế bào
chất càng không đồng nhất vì xuất hiện nhiều không bào và hạt volotin vì thế
chất nguyên sinh thường có dạng lổn nhổn .Trong thành phần của chúng cũng
giống như các vi sinh vật khác chủ yếu được cấu tạo từ nước, protit, gluxit, lipit
và các muối khoáng, enzyme đồng thời các cơ quan con trong đó. Tế bào chất
luôn luôn chuyển động. Thường chuyển động theo một chiều xung quanh
thành tế bào.
Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của nấm men. Như nấm
men trong trạng thái hô hấp tế bào chất thường đồng nhất và không chứa
những chất lổn nhổn, trong khi đó ở trạng thái lên men thấy xuất hiện nhiều
chất làm mất tính đồng nhất của không bào.

Trong màng nguyên sinh chất có các cơ quan như sau:
a. Ti thể
Là những hình cầu, hình que, hình sợi, kích thước khỏang từ 0,2-0,5×0,4-1
µm. Ti thể gồm 2 lớp màng: màng trong và màng ngòai. Màng trong có hình
sóng hay hình răng lược để tăng diện tích tiếp xúc, giữa 2 màng có các hạt gọi
là hạt cơ bản, bên trong ti thể là chất dòch hữu cơ.
Chức năng của ti thể là trạm năng lượng của nấm men:
+ Nó tham gia thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng năng lượng ra
khỏi cơ chất, làm cho năng lượng được tích lũy dưới dạng ATP.
+ Giải phóng năng lượng khỏi ATP và chuyển dạng năng lượng đó thành
dạng năng lượng có ích cho họat động sống của tế bào.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 6
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
+ Tham gia vào việc tổng hợp nên một số hợp chất protein, lipit,
hydratcacbon, những hợp chất này tham gia vào cấu tạo màng tế bào.
+ Ngòai ra ti thể còn chứa nhiều lọai men khác nhau như: oxidaza,
xitocromxidaza, peoxidaza, photphataza
b. Riboxom
Số lượng riboxom thay đổi thụ thuộc vào từng loài, từng giai đọan phát triển
và từng điều kiện nuôi cấy. Có 2 loại riboxom: lọai riboxom 70S và lọai 80S.
c. Các vật thể ẩn nhập khác
Không bào chứa các enzyme thủy phân, polyphotphat, lipit, ion kim lọai,
các sản phẩm trao đổi chất và điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển
của tế bào nấm men.
Ngòai ra còn chứa một số hạt dự trữ khác nhau, hạt lipit dưới dạng các hạt
nhỏ, các hạt glucogen, một ít hạt tinh bột.
1.2.3. Nhân
Nhân tế bào nấm men là nhân thật, nhân có sự phân hóa, có kết cấu hoàn
chỉnh và ổn đònh, có khả năng biểu hiện của tế bào tiến hóa, đó là sự phân

chia tế bào theo hình thức gián phân.
1.3. Sinh sản của nấm men
Nấm men có các hình thức sinh sản sau:
Sinh sản bằng nảy chồi.
Sinh sản bằng nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến của nấm men. Khi
nấm men trưởng thành sẽ nảy ra một chồi nhỏ, chồi lớn dần lên, một phần
nhân của tế bào mẹ được chuyển sang chồi, sau đó tách ra thành một nhân
mới. Tế bào con được tạo thành có thể tách ra khỏi tế bào mẹ hoặc dính trên
tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh tế bào mới.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 7
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Sinh sản bằng phân cắt.
Một số nấm men có thể sinh sản bằng phân cắt giống vi khuẩn, tế bào dài
ra rồi sau đó sinh ra những vách ngăn đặc biệt và phân cắt thành nhiều tế bào.
Sinh sản bằng sự tạo bào tử túi.
Bào tử được sinh ra trong một túi nhỏ. Tế bào tạo bào tử được gọi là túi bào
tử hay nang bào tử. Bào tử túi được sinh ra theo các phương thức sau:
 Sư tạo bào tử vô tính: Nhân tế bào của tế sinh bào tử sẽ được phân
chia trực tiếp tạo 2, 4, 8 hay 16 nhân con. Các nhân con này sẽ được
bao bọc bởi lớp màng dày và sẽ trở thành bào tử trong nang. Nang vỡ
bào tử được giải phóng.
 Sự tạo bào tử hữu tính:Tế bào nấm men có thể sinh sản bằng túi hay
nang bào tử, trong mỗi túi có từ 2-4 hoặc 8 bào tử. Túi bào tử sinh ra
do sự tiếp hợp của 2 tế bào nấm men. Khi 2 tế bào khác giới đứng
gần nhau, ở mỗi đầu của 2 tế bào sẽ mọc ra mấu lồi và tiến sát vào
nhau, 2 tế bào sẽ tiếp hợp với nhau và hình thành một hợp tử, sau đó
sẽ có quá trình phối chất nguyên sinh và phối nhân. Nhân của hợp tử
phân chia thành 2 hoặc 4 hoặc 8 nhân mới và mỗi nhân con cùng với
một phần nguyên sinh chất tạo thành một túi bào tử.

Nang bào tử được hình thành do hai tế bào nấm men tiếp hợp với nhau.
 Tiếp hợp đẳng giao: Do 2 tế bào nấm men giống nhau tiếp hợp
với nhau mà tạo thành.
 Tiếp hợp dò giao: Do 2 tế bào nấm men có hình thái kích
thước không giống nhau tiếp hợp với nhau mà tạo thành.
Sự tạo bào tử bắn
Ngoài các hình thức sinh sản trên, nấm men còn có khả năng tạo thành bào
tử bắn. Loại bào tử này sau khi tạo thành sẽ bắn ra đối diện.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 8
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
1.4. Phân lọai nấm men[2,4]
Từ trước đến nay có rất nhiều khóa phân lọai nấm men của nhiều tác giả
khác nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân lọai nấm men đầu tiên. Đến
năm 1952, J.Lodder đã cùng với Kreger Van Rij tổng kết lại một cách khá
hoàn thiện vấn đề phân lọai nấm men. Về khóa phân loại đến loài có khóa
phân lọai của Lodder là khóa phân lọai thông dụng nhất trên Thế Giới hiện
nay. Theo khóa phân lọai của Lodder (1971) nấm men được chia làm 39
giống. Nấm men không phải là các nấm thuộc một nhóm phân lọai thống nhất.
Chúng thuộc ngành thực vật bật thấp Eumycophyta nằm trong 2 lớp
Ascomycetes và Fungi Imperfecty.
1.5. Ứng dụng các loài nấm men trong cuộc sống.
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, trong nước, trong
không khí, và nhất là trong môi trường có chứa đường, có pH thấp như trong
lương thực, thực phẩm, hoa quả, rau dưa, rỉ đường, trong đất ruộng mía, đất
vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ.
Sinh khối nấm men được ứng dụng trong nhiều lónh vực như trong nuôi
trồng thủy hải sản, chăn nuôi thú y, trong dược phẩm
Nhiều lọai nấm men được ứng dụng rộng rãi để nấu rượu, nấu bia, sản xuất
cồn, glixerin và điều chế một số hóa chất khác.

Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng giàu protein và chứa
nhiều lọai vitamin. Vì vậy nó được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp
sản xuất thức ăn bổ sung cho người, gia súc và thủy sản.
Nấm men còn được sử dụng để làm nở bột mì, gây hương vò nước chấm, sản
xuất một số dược phẩm.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 9
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
2. Nấm men Rhodotorula spp
2.1. Khái quát chung [5,10,12]
Năm 1921 A.Harden là người đầu tiên phân lập ra lọai nấm men
Rhodotorula mucilaginose. Nấm men này phân bố ở khắp nơi, trong đất, nước,
không khí, ao hồ, khí đốt, ở người và những động vật có vú khác Cho đến nay
người ta đã phân lập được rất nhiều loài trong giống Rhodotorula nhưng hiện
nay có 3 loài được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất lương thực, thực phẩm,
chăn nuôi thú y đó là Rhodotorula glutilis, Rh.minuta và Rh.mucilaginosa.
2.2. Đặc điểm hình thái sinh lý[2,3,5,10]
2.2.1. Phân lọai
Theo khóa phân loại của Lodder và Kreger-Van-Rij(1971)Rhodotorula
thuộc họ Sporobolomycetaceae. Cơ sở để xếp Rhodotorula vào một nhánh
riêng là sự có mặt của các hợp chất carotenoid trong tế bào nấm men và
không có khả năng đồng hóa inositol. Rhodotorula thuộc giới nấm, lớp nấm
bất toàn không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ty hay không có sợi khuẩn ty
giả.
2.2.2. Cấu tạo
Rhodotorula có cấu tạo đơn bào. Theo Marquardt(1962) thành tế bào nấm
men có 3 lớp. Lớp trong cùng và ngòai cùng mỏng bao vây, lớp giữa dày từ
130-1000A
0
thành tế bào là polysaccharide bền với sự phân hủy bởi dung dòch

KOH. Nguyên sinh chất đặc, trong đó có chứa nhân tế bào có vỏ đặc thù và
những lỗ xốp lưới nội mô, không bào và chất béo ở dạng sệt và được bao
quanh bởi một màng sẫm.
2.2.3. Hình dạng và kích thước.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 10
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Tế bào nấm men Rhodotorula có nhiều hình dạng khác nhau tùy loài và
điều kiện nuôi cấy. Dạng thường gặp là trứng, elip, hình dài hoặc hình gậy.
Khuẩn lạc Rhodotorula có màu hồng cam khi phát triển trên môi trường
thạch Sabouraund, Malt, thạch khoai tây. Nấm men Rhodotorula không có giai
đọan sinh sản hữu tính và không có khả năng gây bệnh. Khuẩn lạc nấm men
Rhodotorula phát triển nhanh , trơn nhẵn, lấp lánh hoặc mờ đôi khi sần sùi,
nhầy.
Kích thước tế bào Rhodotorula dao động trong khoảng 2-5 µm chiều rộng và
khoảng 5-10 µm chiều dài. Kích thước này cũng thay đổi tùy theo loài khác
nhau, ở thời gian và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
2.2.4. Sinh sản và sinh trưởng.
Rhodotorula sinh sản bằng lối nảy chồi, một số sinh sản bằng cách phân
đôi. Tốc độ sinh sản của Rhodotorula khá nhanh, thời gian để số tế bào tăng
gấp đôi là 4-6 giờ. Qúa trình sinh sản của Rhodotorula cũng giống các loài
nấm men khác gồm 4 giai đọan: giai đọan thích nghi, giai đọan phát triển, giai
đọan ổn đònh, giai đọan diệt vong. Qúa trình sinh trưởng và phát triển của nấm
men Rhodotorula chòu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH, lượng
giống ban đầu.
2.2.5. Đặc điểm sinh hóa[10]
Nấm men Rhodotorula có một số đặc tính sinh hóa sau:
- Không lên men yếm khí
- Không lên men carbolhydrates và sản xuất enzyme urease.
- Không đồng hóa inositol.

- Đồng hóa hoặc không đồng hóa đường raffinoza.
- Đồng hoá hoặc không đồng hoá đường lactoza
2.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng sự sinh trưởng và phát triển của nấm men [8]
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 11
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Nấm men Rhodotorula phát triển tốt trong điều kiện pH từ 3,5-6. Trong
phương pháp lên men chìm nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến việc nuôi cấy rất
lớn. Nấm men Rhodotorula phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 25-35
o
C .
*Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy .
a) Nguồn Cacbon: Đóng vai trò quan trọng trong việc tạo năng lượng cho cơ
thể đồng thời còn cung cấp hợp chất trung gian cho quá trình tổng hợp các chất
xây dựng tế bào. Nồng độ cacbon cao quá sẽ ức chế sự phát triển của nấm
men. Nguồn thức ăn cacbon chủ yếu của vi sinh vật là hydratcacbon. Trong số
hydratcacbon trước hết phải kể đến gluccoza. Gluccoza là nguồn cacbon vạn
năng đối với vi sinh vật.
b) Nguồn Nitơ: Cung cấp cho nấm men nguồn axit amin tổng hợp protein
cho tế bào.Tất cả các loại protein đều được cấu tạo từ axit amin.Các axit amin
tạo thành do quá trình trao đổi cacbon và nitơ. Khi nuôi cấy nấm men trong
môi trường có nồng độ Nitơ thấp lượng β– caroten sinh tổng hợp tăng.
c) Các chất khoáng: Nấm men rất cần khoáng, vi chất khoáng tham gia xúc
tác cho các phản ứng sinh hóa xảy ra trong cơ thể. Ngoài nguồn photpho nấm
men cần các loại khoáng khác như Mg
2+
, Ca
2+
, Na
+

, K
+
Vi sinh vật lấy
khoáng từ môi trường dinh dưỡng. Có trường hợp phải bổ sung vào môi trường
một số dạng muối hoặc có khi chúng có sẵn trong các nguyên liệu pha môi
trường(đường, bột, cao ngô, rỉ đường ) và trong nước khoáng.
d) Vitamin: Vitamin là các chất sinh trưởng chính, đóng vai trò quan trọng
trong thức ăn bổ sung cho vi sinh vật. Một số vi sinh vật cần vitamin trong môi
trường dinh dưỡng, một số khác thì có thể tựï tổng hợp. Những vitamin có ảnh
hưởng đến vi sinh vật là vitamin PP (axit nicotinic), vitamin B1, vitamin B2,
biotin, axit pantotenic…Ngoài ra vitamin còn cung cấp Co-enzyme cho các
phản ứng sinh hóa trong tế bào, thường vitamin được đưa vào môi trường nuôi
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 12
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
cấy trong thành phần của chất chiết nấm men thì không cần bổ sung vitamin.
Nếu tạo nguồn Nitơ khác nhau thì phải thêm lượng nhỏ chất chiết nấm men để
bổ sung vitamin cho môi trường.
*Ảnh hưởng của yếu tố hóa học: Trong các yếu tố hóa học có ảnh hưởng
đến hoạt động sống của vi sinh vật ngoài yếu tố thức ăn còn các yếu tố khác
như pH môi trường, các hợp chất diệt khuẩn
pH môi trường có ảnh hûng rất lớn đến hoạt động sống của vi sinh vật. Do
nó làm ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, pH thay đổi làm
điện tích màng tế bào chất thay đổi, dẫn đến làm thay đổi tính thẩm thấu của
màng. Cho nên sự hấp thụ các loại thức ăn cũng thay đổi, thêm vào đó pH làm
thay đổi hẳn chiều hướng của các phản ứng. Mỗi loài vi sinh vật có pH tối
thích và pH cực tiểu, cực đại riêng.
Ta không nên hạ thấp pH môi trường xuống vì làm như vậy nấm men sẽ
khó phát triển. Nếu pH cao quá vừa ức chế nấm men phát triển vừa tạo điều
kiện cho vi khuẩn nhiễm vào môi trường nuôi và phát triển, cạnh tranh chất

dinh dưỡng, làm giảm chất lượng nấm men.
*Ảnh hưởng của yếu tố vất lý: Tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy ,ta có
các yếu tố ảnh hưởng khác nhau. Đối với phương pháp lên men chìm thì nhiệt
độ là yếu tố cần chú ý nhất. Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống
của vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng hoạt động trong một giới
hạn nhất đònh. Các enzyme hô hấp, đặc biệt là các enzyme trong chu trình
Crebs là các enzyme rất mẫn cảm với nhiệt độ. Ngoài ra nhiệt độ cao còn làm
vô hoạt ARN thông tin và phá hủy tế bào.
Thiết bò nuôi nấm men cũng phải thích hợp, thuận lợi, làm tăng quá trình
trao đổi chất của vi sinh vật.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 13
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
*Ảnh hưởng của sự khuấy trộn:
Nấm men không chỉ sử dụng oxy hoà tan có sẵn trong môi trường lỏng,
lượng oxy hoà tan có sẵn trong nước rất ít. Chính vì vậy cần cung cấp lượng
oxy hoà tan vào môi trường bằng phương pháp khuấy trộn, sục khí từ các thiết
bò bên ngoài(sử dụng máy sục khí hoặc cánh khuấy trong thiết bò lên men)
Oxy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và
phát triển của nấm men, vì vậy việc cung cấp oxy cho quá trình tạo sinh khối
là rất cần thiết.
2.2.7. Giá trò dinh dưỡng của sinh khối nấm men Rhodotorula spp [1,11,12,13]
Sinh khối nấm men Rhodotorula có giá trò dinh dưỡng rất cao, chứa nhiều
protein, khoáng chất và các chất béo protein của nấm men gồm các acid
amin không thay thế như Lizine, Threonin, Tryptophan Các axit amin này
thường đạt tỷ lệ khá cao và có tính chất gần giống các loại thức ăn có nguồn
gốc động vật. Nấm men Rhodotorula còn cung cấp một lượng lớn Carotenoid,
lượng carotenoid này được ứng dụng trong nhiều lónh vực như ngành công
nghiệp, trong chăn nuôi thú y
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 14

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Gía trò dinh dưỡng một số nấm men trong giống Rhodotorula [1]
Nấm men Hiệu suất
sinh khối/l
(gam/chất
khô)
%đạm/chất
khô
Lượng protein
(theo Nitơ)
gam/100g chất
khô
Tổng số
carotenoid mg
% chất khô
Rh.glutilis Mn 9,2 3,4 21,3 8,31
Rh.glutilisK-1 7,6 2,7 16,85 4,23
Rh.glutilis 320 10,8 4,04 25,12 5,82
Rh.glutilis 322 5,0 3,46 21,6 1,19
Rh.mucilonosa 323 6,6 3,0 18,7 1
Rh.rubra 329 11,0 4,0 25 1,84
Rh.rubra M
o
7,8 3,4 21,25 2,07
Rhdotorula chưa
đònh loại
11 2,28 14,25 2,01
Sinh khối nấm men Rhodotorula thu được chúng ta sẽ có được một sản phẩm
giàu protein, enzyme, vitamin, các chất khoáng cộng thêm có cả các

carotenoid và các chất béo. Từ sinh khối này ta có thể tạo ra các sản phẩm
như:
Cốm bổ dưỡng giàu protein-carotenoid dùng cho trẻ em, người già người bệnh
Bột gia vò giàu protein-carotenoid bổ sung vào lương thực như :bánh mì, mì
gói.
Thức ăn dinh dưỡng bổ sung cho vật nuôi: carotenoid tổng hợp trong quá trình
lên men nằm trong các tế bào nấm men. Sau khi ly tâm rửa sạch, sấy khô ở
nhiệt độ thấp thì sinh khối nấm men có thể trực tiếp sử dụng cho vào thức ăn
gia súc.
Hiện nay các sản phẩm tổng hợp hoá học không được chấp nhận làm chất phụ
gia cho thực phẩm và thức ăn vật nuôi do hậu quả không đảm bảo an toàn cho
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 15
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
sức khỏe. Do đó khuynh hướng phát triển quá trình tạo các chất carotenoid từ
thiên nhiên để thay thế các hợp chất tổng hợp đang được tìm kiếm khẩn cấp.
Hợp chất carotenoid trong mô thực vật , động vật chỉ có với số lượng rất ít và
việc tách chiết gặp nhiều khó khăn, tốn kém. Để sản xuất công nghiệp các
hợp chất carotenoid theo các nhà nghiên cứu khoa học hiện nay, việc nuôi cấy
các tế bào vi sinh vật có khả năng tích lũy carotenoid được coi là quá trình tốt
nhất. Trong đó tế bào nấm men Rhodotorula là một trong số những tế bào vi
sinh vật chứa hàm lượng carotenoid rất lớn. Carotenoid dùng làm phụ gia cho
nhiều thực phẩm như chất tạo màu cho các loại thực phẩm và thức uống, tạo
màu cho thòt cá tôm cua…
2.2.8. Các ứng dụng của nấm men Rhodotorula trong cuộc sống [1,7,10,11]
Bổ sung sinh khối nấm men Rhodotorula glutilis 5% vào thức ăn nuôi gà
mái đẻ và bổ sung 5% vào thức ăn cho tôm sú
Bổ sung sinh khối nấm men Rhodotorula glutilis 2,5% vào thức ăn nuôi tôm
đã làm tăng trọng trên 7,5 % và tăng hàm lượng carotenoid trong vỏ.
Carotenoid có trong sinh khối nấm men Rhodotorula được làm phụ gia cho

nhiều lọai thực phẩm, như chất tạo màu các lọai thực phẩm và thức uống.
Đồng thời các carotenoid cũng làm chất phụ gia, tạo lòng đỏ trứng gia cầm,tạo
màu cho thòt cá, tôm cua. Các carotenoid còn có họat tính chóng oxy hóa,
phòng ngừa ung thư.
Hiện nay các sản phẩm tổng hợp hóa học ít được chấp nhận trong việc làm
chất phụ gia cho thực phẩm và thức ăn vật nuôi do hậu quả không đảm bảo an
tòan cho sức khỏe. Do đó ứng dụng sinh khối nấm men Rhodotorula vào việc
thay thế các hóa chất trước đây là ứng dụng rất cần thiết và cấp bách. Sinh
khối này hiện nay đang được ứng dụng làm nguồn bổ sung vào thức ăn gia súc,
gia cầm và trong nuôi trồng thủy hải sản.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 16
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
2.2.9. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thu nhận sinh khối[5]
 Phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được
nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX.
Sau đó phương pháp nuôi cấy chìm đã được thay thế vào những năm 50 của
thế kỷ trước. Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho
vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ không
phức tạp. Do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản
vừa không tốn kém.
Nguyên liệu thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám
mì, cám gạo, ngô mãnh, đậu nành và các lọai ngũ cốc khác. Trong các lọai
nguyên liệu trên cám gạo, cám mì thường được sử dụng nhiều. Hai lọai cám
này có đầy đủ khoáng chất để vi sinh vật phát triển. Mặt khác khi tạo môi
trường chúng có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính,
vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu. Trong nhiều
trường hợp để tạo khả năng thoáng khí người ta cho thêm trấu vào. Thực chất

của việc cho trấu vào là để tăng độ xốp của môi trường, để không khí có thể
lưu thông trong môi trường.
 Phương pháp nuôi cấy chìm .
Phương pháp này thường tốn ít diện tích. Qúa trình nuôi cấy thường được
thực hiện trong các thiết bò lên men. Phương pháp này thường đòi hỏi chi phí
lớn, thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và hệ thống thổi khí.Khó kiểm
soát và giải quyết hậu quả do sự nhiễm vi sinh vật lạ gây nên.
2.2.10.Phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật.[5]
Trong công nghệ sản xuất sinh khối vi sinh vật có 2 dạng:
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 17
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
a)Sinh khối gồm những tế bào sống.
Lọai sinh khối này bao gồm sinh khối vi sinh vật dùng sản xuất bánh mì và
sinh khối vi sinh vật dùng sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, phân bón vi sinh và
vaccine dùng cho người và động vật. Các lọai sinh khối này đòi hỏi phải đảm
bảo tế bào ở dạng sống và có hoạt tính sinh học cao. Do đó việc thu nhận sinh
khối phải đảm bảo các đặc tính đó không bò thay đổi.
b)Sinh khối bao gồm những tế bào chết.
Lọai sinh khối này được sử dụng vào hai mục đích: làm thực phẩm cho
người, gia súc và sản xuất vaccine chết. Sinh khối bao gồm các tế bào chết
không cần đến sự họat động của chúng, do đó việc thu nhận sinh khối của
chúng cũng đơn giản hơn.Ta có thể sử dụng các phương pháp sau để thu nhận
sinh khối: Phương pháp lọc, phương pháp ly tâm, phương pháp lắng.
PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 18
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
1.Nội dung: Tìm môi trường cũng như các điều kiện pH, nhiệt độ, hàm lượng
khóang, thích hợp nhất để nấm men Rhodotorula cho lượng sinh khối cao nhất

nhằm giảm được giá thành cho sản phẩm.
2. Vật liệu thí nghiệm.
2.1. Nguyên liệu làm môi trường và các hóa chất.
Nguyên liệu bao gồm: Nước gía đỗ, nước thơm, rỉ đường, (NH
4
)
2
SO
4
,
MgSO
4
.7H
2
O, gluccoza, chiết nấm men, peptone, KH
2
PO
4
, saccaroza.
2.2. Dụng cụ thí nghiệm.
Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: nồi hấp Autoclave, tủ ấm, tủ lạnh, kính hiển
vi, đóa petri, ống nghiệm, pipet, buồng đếm, thước đo
2.3. Đối tượng nghiên cứu:
Giống nấm men Rhodotorula spp
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Phương pháp thí nghiệm
3.1.1. Sơ đồ khối quá trình nghiên cứu
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 19
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu

Giống gốc
Kiểm tra giống (trên kính hiển vi)
Khảo sát một số tính chất sinh hóa của giống
Nhân giống cấp 1 trên 11 môi trường với 2 điều kiện lắc, tónh trong cùng
nhiệt độ phòng, khảo sát ở các mức thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ.
Chọn 3 môi trường có sinh khối cao trong 11 môi trường
Lặp lại thí nghiệm với 3 môi trường đã chọn
Chọn ra môi trường tối ưu nhất
Khảo sát ảnh hưởng của pH lên môi trường đã chọn lựa
Chọn pH thích hợp
Khảo sát ảnh hưởng của đường gluccoza, saccaroza lên sinh khối tế bào
Chọn loại đường tốt
Khảo sát nồng độ pepton và chiết nấm men ảnh hưởng đến sinh khối tế bào
Chọn nồng độ pepton và chiết nấm men thích hợp
Kết luận : Chọn môi trường có nguồn cacbon, nồng độ pepton, chiết nấm
men, pH cũng như thời gian và điều kiện nuôi cấy thích hợp.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 20
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Qua các bước khảo sát trên ta sẽ chọn được môi trường nhân giống cho
lượng sinh khối cao nhất làm môi trường nhân giống cho sản xuất.
Sơ đồ khối
Môi trường nhân giống cho sản xuất (cấp 1: 50 ml)
Môi trường cấp 2 (5 l)
(sử dụng môi trường cấp 1 đã chọn, nuôi ở nhiệt độ phòng, sục khí sau 72 giờ)

Cấy qua các môi trường sản xuất
(khảo sát 4 môi trường , nuôi qua 24 giờ ở nhiệt độ phòng)
Sấy khô
Chế phẩm sinh học chứa Rhodotorula spp

Bảo quản ở nhiệt độ phòng
Kiểm tra số lượng tế bào sau thời gian bảo quản: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày.
Cụ thể các bước được tiến hành như sau:
3.1.2. Khảo sát độ thuần của giống.
a. Giống gốc: Giống được công ty Giấu Vàng cung cấp.
b. Môi trường cơ bản.
Môi trường cơ bản để giữ và nhân giống là môi trường Sabouraud.
Thành phần môi trường bao gồm:
Peptone: 20 g Thạch: 20 g
Gluccoza: 40 g Nước : 1000 ml
pH : 5,6-6
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 21
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Giống gốc từ công ty, đem cấy chuyền sang môi trường thạch nghiêng
Sabouraund. Sau 3-5 ngày nuôi cấy trên thạch nghiêng ta tiếp tục cấy lên môi
trường thạch đóa Sabouraund. Trước khi cấy lên môi trường thạch đóa ta phải
pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Sau 24 giờ quan sát bề
mặt thạch xem có khuẩn lạc lạ hay không, nếu có đem nhuộm Gram và quan
sát dưới kính hiển vi xem có phải vi sinh vật lạ hay không.
3.1.3. Khảo sát khả năng lên men, đồng hoá một số lọai đường.
Sau khi kiểm tra độ thuần của giống ta tiếp tục khảo sát khả năng lên men,
đồng hoá một số loại đường.Với mục đích kiểm tra lại một số đặc tính sinh
hoá của giống để khẳëng đònh lại độ thuần của giống.
Môi trường lên men đường có thành phần như sau:
Peptone: 10 g/l
Đường(lên men): 10 g/l
Phenol red, ống Durham
Nước cất: 1000 ml
pH = 5,5-6

Môi trường đồng hoá có thành phần:
Đường(Inulin, raffinoza): 11 g/l
Nước cất: 1000 ml
pH = 7
Môi trường sau khi pha xong cho vào các ống nghiệm cùng với ống
durham, môi trương đồng hoá cũng làm tương tự nhưng không cho pepton và
ống durham. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121
0
C, 1 atm, trong 20 phút để nguội
rồi cấy giống nấm men vào, ủ ở nhiệt độ phòng 24-48 giờ rồi quan sát.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 22
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
3.1.4. Khảo sát khả năng tạo sinh khối của nấm men Rhodotorula ở các môi
trường nhân giống và ở các mức thời gian khác nhau, trong điều kiện lắc,
tónh ở nhiệt độ phòng.
Các môi trường khảo sát có thành phần như sau:
Môi trường1: Nước giá đỗ(200g/l)+Gluccoza(20g/l)+(NH
4
)
2
SO
4
(5g/l)+
MgSO
4
(1g/l)+ KH
2
PO
4

(1g/l)
Môi trường 2: Nước giá đỗ(200g/l)+Gluccoza(20g/l)+Yeast extract(5g/l)
Môi trường 3: Nước giá đỗ(200g/l)+Gluccoza(20g/l)+peptone(5g/l)
Môi trường4: Nước thơm(200g/l)+Gluccoza(20g/l) +(NH
4
)
2
SO
4
(5g/l)
+MgSO
4
(1g/l) + KH
2
PO
4
l(1g/l)
Môi trường 5: Nước thơm(200g/l)+ Gluccoza(20g/l)+Yeast extract(5g/l)
Môi trường 6: Nước thơm(200g/l)+ Gluccoza(20g/l)+ peptone(5g/l)
Môi trường RĐ 4
0
Be:
(NH
4
)
2
SO
4
: 5 g/l
KH

2
PO
4
: 2 g/l
MgSO
4
: 1 g/l
Rỉ đường 4
0
Be
pH=5,6-6
Môi trường RĐ 6
0
Be:
(NH
4
)
2
SO
4
: 5 g/l
KH
2
PO
4
: 2 g/l
MgSO
4
: 1 g/l
Rỉ đường 6

0
Be
pH=5,6-6
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 23
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Môi trường RĐ 8
0
Be:
(NH
4
)
2
SO
4
: 5 g/l
KH
2
PO
4
: 2 g/l
MgSO
4
: 1 g/l
Rỉ đường 8
0
Be
pH=5,6-6
Môi trường RĐ 10
0

Be:
(NH
4
)
2
SO
4
: 5 g/l
KH
2
PO
4
: 2 g/l
MgSO
4
: 1 g/l
Rỉ đường 10
0
Be
pH=5,6-6
Môi trường tổng hợp: Nước giá đỗ (200g/l) + Peptone (2g/l) + chiết nấm men
(3g/l) + KH
2
PO
4
(1g/l) + (NH
4
)
2
SO

4
(5g/l)
* Nhân giống nấm men trên môi trường dòch thể: Ống giống thuần được cấy
chuyền sang các môi trường nhân giống dòch thể.
Tiến hành nuôi cấy trên môi trường lỏng để nhân giống và thu sinh khối
nấm men. Những nghiên cứu ban đầu được tiến hành trên các môi trường
nhân giống đã nêu ở trên. Các môi trường được chuẩn bò sau đó được phân
phối vào các erlen hay chai nhỏ 100 ml chứa 50 ml môi trường. Đem hấp tiệt
trùng ở 121
0
C, 1amt trong 20 phút, để nguội. Ta cấy giống theo tỷ lệ 10%, cho
lần lượt 10ml nước muối sinh lý 9‰ vào trong các ống giống nấm men đã
được cấy chuyền nuôi cấy trước đó. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều tránh làm
bể thạch. Hòa đều rồi dùng pipet hút 5 ml cho vào các chai môi trường đã
chuẩn bò,mỗi ống giống cấy vào 2 chai môi trường. Tất cả thao tác phải được
thực hiện trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành nuôi ở chế độ tónh và lắc
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 24
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành đếm số lượng tế bào sau 24 giờ, 48giờ , 72 giờ ,
96 giờ.ø Khảo sát xem môi trường nào sẽ cho lượng sinh khối cao nhất, ở thời
điểm nào thu nhận sinh khối là tốt nhất.
Trong 11 môi trường khảo sát ta chọn ra 3 môi trường tốt nhất trong 11 môi
trường. Lặp lại thí nghiệm với 3 môi trường này để tìm ra môi trường tối ưu
cũng như chọn thời gian và chế độ nuôi thích hợp nhất.
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng tăng sinh khối của nấm men
Rhodotorula spp
Ngoài môi trường nghiên cứu cần chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng như C,
N, các loại muối khoáng, vitamin để nấm men phát triển. Bên cạnh đó pH
cũng là một yếu tố đặc biệt quan trọng đối với quá trình sinh trưởng của nấm

men. Do đó em đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng tăng
sinh khối của nấm men Rhodotorula với các giá trò pH thay đổi từ 3,5 đến 6.
Điều kiện lên men:
Thể tích dòch lên men 50 ml
Nhiệt độ phòng
Các mức thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
Nồng độ giống ban đầu 10
6
tế bào/ml
Tiến hành thí nghiệm:
Sau khi đã tìm được môi trường thích hợp nhất cho nấm men Rhodotorula phát
triển. Ta thử nghiệm khả năng tăng sinh khối của nấm men này ở các pH khác
nhau 3,5; 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6. Môi trường sau khi pha xong (môi trường tối ưu đã
chọn) được phân phối vào 6 chai có dung tích 100ml chứa 50ml môi trường
sau đó điều chỉnh về các mức pH nêu trên bằng dung dòch NaOH 0,1N, H
2
SO
4
0,1N. Đem hấp tiệt trùng ở 121
0
C, 1amt ,trong 20 phút, để nguội. Sau đó cho
lượng nấm men vào nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng. Đếm số lượng tế bào trên
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 25