KHẢO SÁT XỬ LÝ 1 NAPHTHOL BẰNG HUMIN VÀ BACILLUS SUBTILIS

ðẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU





KHẢO SÁT XỬ LÝ 1-NAPHTHOL BẰNG
HUMIN VÀ BACILLUS SUBTILIS



CHUYÊN NGÀNH: HÓA VÔ CƠ
MÃ SỐ: 60 44 25


LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Nguyễn ðức Lượng
2. TS. Hoàng ðông Nam

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC HÌNH ii
DANH MỤC BẢNG iv
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4
1.1 THAN BÙN VÀ HUMIN 4
1.1.1 Than bùn 4
1.1.2 Humin 6
1.1.3 Một số phƣơng pháp xử lý humin thô 8
1.1.3.1 Phƣơng pháp base (phƣơng pháp kiềm chảy) 8
1.1.3.2 Phƣơng pháp acid 8
1.1.3.3 Ứng dụng của humin 9
1.2 XỬ LÝ NƢỚC THẢI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC 10
1.2.1 Giới thiệu 10
1.2.2 Quá trình sinh hoá trong xử lý nƣớc thải 10
1.2.3 Sự sinh trƣởng của vi sinh vật 11
1.2.4 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 12
1.2.4.1 Kỹ thuật cố định tế bào trên chất mang rắn 13
1.2.4.2 Kỹ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel 14
1.2.4.3 Kỹ thuật kết bông tế bào 15
1.2.4.4 Yêu cầu đối với chất cố định 15
1.2.5 Giới thiệu về Bacillus subtilis 15
1.2.5.1 Đặc điểm hình thái 16
1.2.5.2 Đặc tính sinh trƣởng 16
1.2.5.3 Ứng dụng của Bacillus subtilis 17
1.3 TỔNG QUAN VỀ 1-NAPHTHOL 18
1.3.1 Giới thiệu về 1-naphthol 18

1.3.2 Tính chất vật lý 18
1.3.3 Tính chất hóa học 19
1.3.4 Độc tính 19
1.3.5 Nguồn phát sinh 1-naphthol 20
1.4 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ XỬ LÝ 1-NAPHTHOL 20
1.5 PHƢƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ PHÂN TÍCH 22
1.5.1 Phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 22
1.5.1.1 Phân loại sắc ký 22
1.5.1.2 Hệ thống thiết bị HPLC 24
1.5.1.3 Ứng dụng của phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng
cao 24
1.5.2 Phƣơng pháp phân tích quang phổ hấp thu UV-VIS (phổ kích thích
electron) 26
1.5.2.1 Nguyên tắc 26
1.5.2.2 Máy đo phổ hấp thu UV-VIS và nguyên lý hoạt động 26
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 28
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 28
2.1.1 Giống vi sinh vật 28
2.1.2 Nguyên liệu 28
2.1.3 Hoá chất 28
2.1.4 Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy vi sinh 28
2.1.4.1 Môi trƣờng nhân giống (MT1) [1] 28
2.1.4.2 Môi trƣờng xử lý (MT2) [1] 29
2.1.4.3 Môi trƣờng cấy chuyền và trải đĩa 29
2.2 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM 30
2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập humin và khảo sát mẫu humin 31
2.2.1.1 Phân lập humin 31
2.2.1.2 Phổ IR của humin 32
2.2.1.3 Cấu trúc bề mặt của humin 32
2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát phổ hấp thu UV-VIS của 1-naphthol 32

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sắc ký đồ HPLC của dung dịch 1-naphthol và
các yếu tố ảnh hƣởng 32
2.2.3.1 Thí nghiệm 3a: Khảo sát sắc ký đồ HPLC của dung dịch
1-naphthol 33
2.2.3.2 Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hƣởng của các loại nƣớc lọc dùng
để pha loãng dung dịch 1-naphthol dùng trong phân tích định
lƣợng HPLC 33
2.2.3.3 Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sắc ký đồ
HPLC của 1-naphthol 33
2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của
chủng Bacillus subtilis 34
2.2.4.1 Cấy giống và bảo quản giống 34
2.2.4.2 Giai đoạn nhân giống 34
2.2.4.3 Khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của chủng
Bacillus subtilis 34
2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol của các phƣơng
pháp khác nhau 35
2.2.5.1 Tạo chế phẩm vi sinh cố định trên humin 35
2.2.5.2 So sánh khả năng xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên
humin với các phƣơng pháp khác 36
2.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng xử lý
1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin 37
2.2.6.1 Thí nghiệm 6a: Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng humin sử
dụng trong giai đoạn tạo chế phẩm vi sinh cố định đến khả
năng xử lý 1-naphthol 37
2.2.6.2 Thí nghiệm 6b: Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến
khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên
humin 38
2.2.6.3 Thí nghiệm 6c: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ 1-naphthol
ban đầu đến khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh

cố định trên humin 39
2.2.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát khả năng thích nghi của vi sinh cố định trên
humin đối với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao 39
2.2.8 Thí nghiệm 8: Khảo sát khả năng tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định
trên humin 40
2.2.9 Thí nghiệm 9: Khảo sát khả năng tái sử dụng humin để tạo chế phẩm cố
định mới 40
2.3 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 41
2.3.1 Xác định mật độ tế bào 41
2.3.2 Phân tích định lƣợng 1-naphthol 41
2.3.3 Tính toán hiệu suất xử lý 1-naphthol 41
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42
3.1 PHÂN LẬP HUMIN VÀ KHẢO SÁT MẪU HUMIN 42
3.1.1 Phân lập humin 42
3.1.2 Phổ IR của humin 42
3.1.3 Cấu trúc bề mặt của humin 43
3.2 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 2: PHỔ UV-VIS CỦA 1-NAPHTHOL 43
3.3 KHẢO SÁT SẮC KÝ ĐỒ HPLC CỦA 1-NAPHTHOL VÀ CÁC YẾU TỐ
ẢNH HƢỞNG 44
3.3.1 Kết quả thí nghiệm 3a: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 1-naphthol và
đƣờng chuẩn của dung dịch 1-naphthol 44
3.3.2 Kết quả thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hƣởng của các loại nƣớc lọc lên
sắc ký đồ của 1-naphthol 46
3.3.3 Kết quả thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sắc ký đồ của
dung dịch 1-naphthol 48
3.4 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 4: KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TĂNG SINH KHỐI
THEO THỜI GIAN CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS 49
3.5 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 5: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG XỬ LÝ
1-NAPHTHOL BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP KHÁC NHAU 52
3.6 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG XỬ LÝ

1-NAPHTHOL BẰNG CHẾ PHẨM VI SINH CỐ ĐỊNH TRÊN HUMIN 54
3.6.1 Kết quả thí nghiệm 6a: Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng humin trong
quá trình tạo chế phẩm vi sinh cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol
54
3.6.2 Kết quả thí nghiệm 6b: Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả
năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin 57
3.6.3 Kết quả thí nghiệm 6c: Ảnh hƣởng của nồng độ 1-naphthol ban đầu đến
khả năng xử lý của chế phẩm vi sinh cố định trên humin 60
3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 7: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THÍCH NGHI
CỦA CHẾ PHẨM VI SINH CỐ ĐỊNH TRÊN HUMIN ĐỐI VỚI
1-NAPHTHOL 64
3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG CHẾ
PHẨM VI SINH CỐ ĐỊNH TRÊN HUMIN 66
3.9 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG
HUMIN ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM CỐ ĐỊNH MỚI 68
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70
4.1 KẾT LUẬN 70
4.2 KIẾN NGHỊ 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73
PHỤ LỤC 77
i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
HPLC (High Performance Liquid Chromatography): phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao.
B. sub : vi khuẩn Bacillus subtilis.
ii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ tách các hợp chất humic từ than bùn. 5

Hình 1.2. Cấu trúc của acid fulvic 5
Hình 1.3. Cấu trúc của acid humic 5
Hình 1.4. Kết quả chụp phổ XRD của humin. 6
Hình 1.5. Kết quả chụp phổ IR của humin. 7
Hình 1.6. Các nhóm chức trong humin. 8
Hình 1.7. Đƣờng cong sinh trƣởng của vi sinh vật. 12
Hình 1.8. Các phƣơng pháp cố định tế bào 13
Hình 1.9. Hình thái của Bacillus subtilis. 16
Hình 1.10. Đƣờng cong sinh trƣởng của Bacillus subtilis 17
Hình 1.11. Hệ thống thiết bị phân tích HPLC 24
Hình 1.12. Cấu tạo máy đo phổ hấp thu UV-VIS 26
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu chung. 30
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập humin 31
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát sắc ký đồ HPLC của 1-naphthol và các yếu tố ảnh hƣởng.
32
Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của Bacillus
subtilis. 35
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol bằng các
phƣơng pháp khác nhau. 36
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng humin trong
quá trình tạo chế phẩm cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol. 38
Hình 3.1. Kết quả phổ IR của humin. 42
Hình 3.2. Hình SEM của humin. 43
Hình 3.3. Phổ hấp thu UV-VIS của dung dịch 1-naphthol. 44
Hình 3.4. Đƣờng chuẩn dung dịch 1-naphthol. 45
Hình 3.5. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau. 46
iii

Hình 3.6abc: Ảnh hƣởng của các loại nƣớc lọc đến sắc ký đồ của 1-naphthol. 47
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của pH đến sắc ký đồ của 1-naphthol. 49

Hình 3.8. Đƣờng chuẩn giữa OD và mật độ tế bào vi sinh. 50
Hình 3.9. Đƣờng cong sinh trƣởng của Bacillus subtilis. 51
Hình 3.10. Xử lý 1-naphthol bằng các phƣơng pháp khác nhau. 53
Hình 3.11. Hiệu suất xử lý 1-naphthol bằng các phƣơng pháp khác nhau. 53
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng humin đến khả năng xử lý 1-naphthol. 56
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng humin đến hiệu suất xử lý 1-naphthol. 56
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng xử lý 1-naphthol. 59
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH đến hiệu suất xử lý 1-naphthol. 59
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch 1-naphthol ban đầu. 62
Hình 3.17. Hiệu suất xử lý 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau. 63
Hình 3.18. Khả năng thích nghi với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao. 65
Hình 3.19. Hiệu suất xử lý 1-naphthol nồng độ cao của chế phẩm vi sinh cố định
trƣớc và sau giai đoạn thích nghi. 65
Hình 3.20. Khả năng tái sử dụng của chế phẩm vi sinh cố định trên humin. 67
Hình 3.21. Khả năng tái sử dụng humin. 69
Hình 3.22. Hiệu suất xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin
mới và trên humin tái sử dụng. 69
iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Độ độc của 1-naphthol với các loài sinh vật 20
Bảng 3.1. Đƣờng chuẩn của dung dịch 1-naphthol. 45
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của các loại nƣớc lọc đến sắc ký đồ của 1-naphthol. 47
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của pH đến sắc ký đồ của dung dịch 1-naphthol. 49
Bảng 3.4. Mật độ tế bào và giá trị OD tƣơng ứng của Bacillus subtilis. 50
Bảng 3.5. Giá trị đƣờng cong sinh trƣởng của Bacillus subtilis theo thời gian. 51
Bảng 3.6. Hàm lƣợng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak)
sau khi xử lý bằng các phƣơng pháp khác nhau. 52
Bảng 3.7. Hiệu suất (H%) xử lý 1-naphthol bằng các phƣơng pháp khác nhau. 52
Bảng 3.8. Hàm lƣợng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak)

khi sử dụng các hàm lƣợng humin khác nhau. 55
Bảng 3.9. Hiệu suất (H%) xử lý 1-naphthol khi sử dụng các hàm lƣợng humin khác
nhau. 55
Bảng 3.10. Hàm lƣợng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak)
khi xử lý ở các pH khác nhau. 58
Bảng 3.11. Hiệu suất (H %) xử lý ở các pH khác nhau. 58
Bảng 3.12. Xử lý 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau. 61
Bảng 3.13. Khả năng thích nghi của chế phẩm vi sinh cố định đối với dung dịch
1-naphthol nồng độ cao. 64
Bảng 3.14. Khả năng tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin. 67
Bảng 3.15. Khả năng tái sử dụng humin. 68
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
1

MỞ ĐẦU
Do xu thế phát triển của xã hội, các nhà máy, khu công nghiệp, vùng kinh tế
ra đời, các đô thị mới đƣợc mở rộng… đòi hỏi cần rất nhiều nƣớc sạch. Trên thực
tế, thế giới chỉ có khoảng 30 triệu km
3
nƣớc ngọt, nguồn dự trữ này không đổi trong
khi nhu cầu sử dụng nƣớc luôn tăng; nhu cầu nƣớc hàng năm của thế giới hiện nay
vào khoảng 3500 – 3900 tỉ km
3
nƣớc sạch, một nửa trong số đó trở thành nƣớc thải.
1 m
3
nƣớc thải có thể làm nhiễm bẩn mạnh 10 m
3
nƣớc sạch nƣớc [3]. Do đó nguồn
nƣớc mất dần khả năng tự làm sạch, nhanh chóng bị cạn kiệt, gây ra nạn thiếu nƣớc.

Nƣớc thải nếu chƣa qua xử lý, thải trực tiếp ra môi trƣờng, sẽ ảnh hƣởng rất
lớn đến chất lƣợng nƣớc nói chung và gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời khi sử
dụng. Chính vì vậy, xử lý nƣớc thải đạt tiêu chuẩn qui định là vấn đề rất cấp thiết.
Trong những năm gần đây đã có một mối quan tâm ngày càng tăng về nƣớc
thải công nghiệp có chứa các hợp chất polyphenol, là những chất hết sức độc hại đối
với môi trƣờng và đối với sức khoẻ con ngƣời. 1-naphthol là một dạng polyphenol
đƣợc sử dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp tổng hợp chất hữu cơ, sản xuất
chất màu azo, thuốc trừ giun sán, thuốc trừ sâu, trong công nghệ thuộc da và sản
xuất giấy. Đặc biệt, 1-naphthol đƣợc xác định là sản phẩm chính của quá trình phân
huỷ thuốc trừ sâu carbaryl trong điều kiện tự nhiên [2]. Chỉ với liều nhỏ 1-naphthol,
có thể gây ảnh hƣởng xấu tới gan, thận và chức năng của tuyến giáp [17], làm giảm
nồng độ testoterone ở nam giới [22]. Về lâu dài, 1-naphthol có thể tích tụ ở các mô
và gây ra các khối u ở đại trực tràng [16]. 1-naphthol cũng gây độc cho giun, tảo và
các loài cá [5]. Do độc tính của nó, nƣớc thải công nghiệp có chứa 1-naphthol nhất
thiết phải đƣợc xử lý trƣớc khi thải ra môi trƣờng.
Đã có nhiều nghiên cứu về phƣơng pháp loại bỏ 1-naphthol. Các phƣơng
pháp chính để loại bỏ 1-naphthol từ môi trƣờng bao gồm: quá trình sử dụng bức xạ
năng lƣợng cao, quá trình xúc tác quang trên các vật liệu bán dẫn, quá trình oxi hoá
học, quá trình quang oxi hoá sử dụng ozon hoặc phản ứng Fenton, quá trình hấp phụ
lên các vật liệu xốp, quá trình phân huỷ sinh học bởi vi sinh vật [1], [2], [5], [14],
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
2

[20], [23], [24], [25], [29], [35]. Các phƣơng pháp sử dụng quá trình oxi hoá hoá
học tỏ ra có hiệu quả khi phân huỷ dung dịch 1-naphthol nồng độ thấp, nhƣng đối
với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao, việc sử dụng các phƣơng pháp này rất tốn
kém. Các phƣơng pháp sử dụng quá trình quang oxi hoá thƣờng bị hạn chế về sự
phân bố ánh sáng theo độ sâu của dung dịch [30]. Quá trình hấp phụ 1-naphthol lên
humin đã tận dụng đƣợc nguồn bã thải than bùn của các nhà máy phân bón humic.
Tuy nhiên, hạn chế của phƣơng pháp này ở chỗ dung lƣợng hấp phụ thấp (dung

lƣợng hấp phụ 15.15 mg/g humin đối với dung dịch 1-naphthol 100 ppm ở pH 0.91
trong 60 phút) [2].
Một phƣơng pháp có ƣu điểm vƣợt trội về hiệu quả kinh tế và hiệu quả loại
bỏ 1-naphthol chính là sử dụng quá trình phân huỷ sinh học bằng vi sinh vật. Ví dụ,
sau 74 giờ xử lý bằng Bacillus subtilis, hiệu quả loại bỏ 1-naphthol trong dung dịch
có nồng độ 80 ppm đạt hơn 80% [1]. Ƣu điểm của việc sử dụng quá trình phân huỷ
sinh học 1-naphthol bằng vi sinh chính là phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn rất đơn
giản, dễ dàng, kinh tế và bằng cách tăng khối lƣợng sinh khối kết hợp với tối ƣu hoá
điều kiện nuôi cấy, có thể xử lý khối lƣợng lớn nƣớc thải có chứa 1-naphthol cũng
nhƣ các hợp chất hữu cơ khác. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là việc sử dụng vi
sinh tự do dễ bị rửa trôi khỏi các hệ thống xử lý nƣớc thải [4], [26].
Để tận dụng các ƣu điểm vƣợt trội của phƣơng pháp phân huỷ sinh học và
khắc phục nhƣợc điểm dễ bị rửa trôi của phƣơng pháp, chúng tôi đã tiến hành xử lý
1-naphthol bằng vi sinh vật cố định. Ƣu điểm của việc sử dụng vi sinh cố định
chính là có thể xử lý tập trung, tránh đƣợc hiện tƣợng bị rửa trôi khỏi hệ thống xử
lý, có khả năng tái sử dụng, do đó mang lại hiệu quả kinh tế và hiệu quả xử lý tốt
[33].
Khi lựa chọn giá thể cố định cho vi sinh vật, với mong muốn tận dụng
nguồn bã thải than bùn của các nhà máy phân bón humic (hiện nguồn bã thải này
cũng đang là yếu tố gây ô nhiễm môi trƣờng), cũng nhƣ dựa trên các yêu cầu đối
với vật liệu cố định (rẻ tiền, bền vững về mặt cơ lý hoá, bền vững dƣới sự tấn công
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
3

của vi khuẩn, có cấu trúc lỗ xốp hoặc bề mặt hấp phụ lớn…) [27], chúng tôi lựa
chọn humin làm vật liệu cố định vi sinh trong quá trình xử lý 1-naphthol.
Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Khảo sát vai trò
của humin trong xử lý 1-naphthol bằng vi sinh” nhằm tìm khả năng kết hợp humin
và vi sinh vật để xử lý 1-naphthol với những nội dung nghiên cứu nhƣ sau:
1) Phân lập humin từ bã thải than bùn của nhà máy phân bón Humix

(Bình Dƣơng).
2) Theo dõi sự gia tăng sinh khối theo thời gian của chủng Bacillus
subtilis.
3) Cố định Bacillus subtilis lên giá thể humin.
4) Khảo sát phổ hấp thu UV-VIS của 1-naphthol.
5) Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sắc ký đồ HPLC của dung dịch
1-naphthol (pH của môi trƣờng và các loại nƣớc lọc dùng để pha loãng dung dịch
1-naphthol).
6) So sánh khả năng xử lý 1-naphthol bằng Bacillus subtilis cố định trên
humin, Bacillus subtilis tự do, humin tự do; nhằm đánh giá tiềm năng xử lý
1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin.
7) Tối ƣu hoá các điều kiện xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên
humin.
8) Khảo sát khả năng thích nghi của vi sinh cố định trên humin đối với
dung dịch 1-naphthol nồng độ cao.
9) Khảo sát số lần tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin.
10) Khảo sát khả năng tái sử dụng humin để tạo chế phẩm cố định mới.
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 THAN BÙN VÀ HUMIN
1.1.1 Than bùn
Than bùn là sản phẩm phân huỷ thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện khí
hậu ẩm ƣớt và thiếu oxy. Quá trình này có thể kéo dài hàng trăm, hàng ngàn năm.
Thành phần của than bùn bao gồm các hợp chất hữu cơ và chất mùn [2].
 Các hợp chất hữu cơ trong than bùn:
- Các chất hữu cơ hoà tan trong nƣớc (chủ yếu là polysaccharide, đƣờng
đơn, tanin).
- Các hợp chất hoà tan trong ester và rƣợu (gồm acid béo, sáp, resin…).

- Cellulose, hemicellulose.
- Lignin và dẫn xuất của nó.
- Hợp chất nitơ.
Cũng có thể phân loại các chất hữu cơ trong than bùn là chất không phải
mùn và chất mùn.
 Chất mùn (hợp chất humic) [15],[27]:
Các hợp chất humic là sản phẩm phân huỷ các chất hữu cơ. Thành phần
nguyên tố chủ yếu của các chất humic bao gồm carbon, oxy, hydro, nitơ, lƣu huỳnh,
và một số nguyên tố vi lƣợng khác.
Dựa vào độ hoà tan, ngƣời ta chia chất mùn thành 3 nhóm: acid fulvic, acid
humic, humin.
Acid fulvic tan đƣợc trong nƣớc, trong acid và trong kiềm. Acid humic
không tan trong nƣớc, không tan trong rƣợu, nhƣng tan đƣợc trong dung dịch kiềm
và kết tủa trong môi trƣờng acid pH nhỏ hơn 2. Humin không tan trong bất kì pH
nào [2].

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
5


Hình 1.1. Sơ đồ tách các hợp chất humic từ than bùn [2].
Các hợp chất này đều là các chất điện ly có phân tử lƣợng rất cao, từ vài
trăm (acid fulvic) đến vài vạn (acid humic, humin). Chúng gồm nhiều phân tử liên
kết với nhau tạo thành cấu trúc phức tạp chứa nhân thơm, một số nhóm oxy hoạt
động và có thể có những nhóm giống nhƣ protein và carbuahydro.
Model structure of fulvic acid (Buffle)

Hình 1.2. Cấu trúc của acid fulvic [38].

Hình 1.3. Cấu trúc của acid humic [59].
Không tan:
Humin
Phần tan
Than bùn
pH ≥ 13
Không tan:
Acid Humic
Phần tan:
Acid Fulvic
pH ≤ 1.5
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
6

1.1.2 Humin
Humin chỉ chiếm một tỉ lệ nhỏ trong than bùn (6,84%), gồm các chất cao
phân tử xuất hiện do quá trình già hóa của acid humic và acid fulvic. Đây là thành
phần bền nhất của than bùn, đƣợc tách ra bằng cách hòa tan than bùn trong dung
dịch NaOH có pH khoảng 13. Ở pH này, acid humic và acid fulvic đã tan hết, chỉ
còn lại humin không tan.
Humin có màu từ nâu đến đen tùy vào mức độ già hóa các acid [15].
Humin cũng là thành phần có khối lƣợng phân tử cao nhất trong than bùn
và có cấu trúc phức tạp.
Các hợp chất hữu cơ có trong humin cũng dựa trên cơ sở những hợp chất
hữu cơ có trong than bùn, bao gồm các hợp chất béo có mạch carbon dài (chiếm
khoảng 50%), cellulose và hemicellulose (khoảng 30-35%), các hợp chất aromatic
và polyaromatic (khoảng 15%), các hợp chất amid và carboxylic (khoảng 3%) [2].


Hình 1.4. Kết quả chụp phổ XRD của humin [2].

Kết quả chụp phổ XRD đã khẳng định trong humin, ngoài các hợp chất hữu
cơ còn có mặt các khoáng vô cơ nhƣ quartz – SiO
2
, aluminosilicat…
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
7


Hình 1.5. Kết quả chụp phổ IR của humin [2].
Kết quả chụp phổ IR của humin cho thấy có các dao động của nhóm chức
và liên kết sau:
- Nhóm –OH liên kết hydro: khoảng 3400 cm
-1
.
- Nhóm C=O của nhóm carboxyl –COOH: khoảng 1710 cm
-1
.
- Nhóm –C≡N: khoảng 2362-2200 cm
-1
.
- Liên kết C-OH: khoảng 1150-1040 cm
-1
.
- Liên kết C=C mạch vòng: khoảng 1580-1650 cm
-1
.
- Liên kết –C-H mạch vòng: khoảng 2920cm
-1
và 2840 cm
-1

.
- Liên kết N-H: khoảng 800cm
-1
.
Theo Buffle, humin có thể tạo phức với ion kim loại từ các nhóm cacboxyl
và phenolic hydroxyl.
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
8

C
O
O
M
O
C
O
C
O
O
M
O
C
O
M
O
+
Phenolic hydroxyl 2 nhóm cacboxyl 1 nhóm cacboxyl

Hình 1.6. Các nhóm chức trong humin [2].
1.1.3 Một số phƣơng pháp xử lý humin thô

1.1.3.1 Phƣơng pháp base (phƣơng pháp kiềm chảy)
SiO
2
là một oxide acid và Al
2
O
3
là một oxide lƣỡng tính, chúng đều tác
dụng tốt với kiềm đặc biệt ở nhiệt độ cao.
SiO
2
+ 2NaOH  Na
2
SiO
3
+ H
2
O
Al
2
O
3
+ 2NaOH  2NaAlO
2
+ H
2
O
Cho base tác dụng với mẫu humin ở nhiệt độ cao sẽ làm phá vỡ cấu trúc của
mẫu. SiO
2

, Al
2
O
3
có trong humin chuyển thành các muối tan, từ đó loại bỏ chúng
qua quá trình lọc rửa.
Base đƣợc sử dụng để kiềm chảy có thể là KOH, NaOH,

Na
2
CO
3
, Nhiệt
độ kiềm chảy từ 450-500
o
C đối với kiềm mạnh và 900-1000
o
C đối với kiềm yếu.
Thời gian gia nhiệt từ 30-60 phút.
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là không độc hại, thời gian phản ứng nhanh.
Nhƣng lại gặp khó khăn trong quá trình lọc rửa, quá trình nung phức tạp vì phải
đảm bảo humin không bị cháy trong quá trình nung. Đặc biệt khi nung ở nhiệt độ
cao, có thể làm cho humin mất đi khả năng hấp phụ [7].
1.1.3.2 Phƣơng pháp acid
 Phương pháp sử dụng hỗn hợp HF và HCl
Đối với phƣơng pháp này ngƣời ta loại bỏ SiO
2
, Al
2
O

3
và các hợp chất khác
trong humin bằng hỗn hợp HF, HCl.
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
9

SiO
2
tác dụng đƣợc với HF tạo thành SiF
4
dễ bay hơi khi nung nóng hoặc
tạo thành các phức tan trong nƣớc có thể loại bỏ trong quá trình lọc rửa [7].
SiO
2
+ 4HF  SiF
4
+ 2H
2
O
SiF
4
+ 2HF  H
2
SiF
6

Al
2
O
3

có thể tác dụng đồng thời với HF, HCl:
Al
2
O
3
+ 3HCl  AlCl
3
+ 3H
2
O
Al
3+
+3F
-
 AlF
3
(hoặc AlF
6
3-
)
Phƣơng pháp này đơn giản, loại bỏ đƣợc một lƣợng lớn các hợp chất vô cơ.
Tuy nhiên các phản ứng trên xảy ra chậm và HF là acid rất độc.
 Phương pháp rửa bằng acid HCl
Than bùn trong quá trình hình thành, tồn tại và trong quá trình khai thác,
tồn chứa ở bãi thải đã hấp phụ một lƣợng lớn kim loại nặng. Điều này làm giảm
đáng kể khả năng hấp phụ của humin. Phƣơng pháp rửa thực hiện quá trình loại bỏ
các kim loại nặng trong humin bằng việc trao đổi ion H
+
với acid mạnh nhƣ HCl,
nhằm phục hồi các nhóm chức -COOH trên bề mặt humin - tác nhân chính của quá

trình hấp phụ [7].
Phƣơng pháp này thực hiện đơn giản, thời gian ngắn, chi phí thấp. Tuy vậy,
trong humin vẫn tồn tại một lƣợng lớn SiO
2
, Al
2
O
3
.
1.1.3.3 Ứng dụng của humin
Than bùn sau khi chiết acid humic để làm phân bón (bằng cách trao đổi ion
K
+
, NH
4
+
với H
+
), phần bã là humin, một phần dùng làm chất độn thêm vào phân
bón để tăng hàm lƣợng mùn trong phân bón, một phần dùng làm than đốt.
So với acid fulvic và acid humic, phản ứng của humin với ion kim loại thấp
hơn do các nhóm chức bề mặt của humin đã bị chiếm bởi các khoáng vô cơ
(quartz-SiO
2
, khoáng sét, ferrihydrite-FeOOH, gibbsite-Al(OH)
3
) thông qua cầu nối
cation. Tuy vậy, với số lƣợng lớn các nhóm chức trên bề mặt, cũng nhƣ khả năng
không bị hoà tan với bất kì pH nào, humin đƣợc xem là vật liệu hấp phụ tốt. Dựa
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU

10

trên tính chất này, ngƣời ta sử dụng humin để hấp phụ các ion kim loại nặng và các
chất độc hữu cơ trong nƣớc thải.
Mặt khác humin rất bền vững dƣới các tác nhân sinh học. Do đó humin
cũng đƣợc nghiên cứu và sử dụng để làm giá thể cho vi sinh xử lý nƣớc thải, nhằm
làm tăng hiệu quả sử dụng các chế phẩm vi sinh, cũng nhƣ làm giảm giá thành của
các công trình xử lý nƣớc thải.
1.2 XỬ LÝ NƢỚC THẢI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC
1.2.1 Giới thiệu
Xử lý nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học dựa trên cơ sở hoạt động của vi
sinh vật để phân hủy các hợp chất hữu cơ và một số chất khoáng làm nguồn dinh
dƣỡng và tạo năng lƣợng. Trong quá trình dinh dƣỡng, vi sinh vật nhận các chất
dinh dƣỡng để xây dựng tế bào, sinh trƣởng và sinh sản (tăng sinh khối). Kết quả là
chất bẩn hữu cơ đƣợc khoáng hóa và trở thành các chất vô cơ, các chất đơn giản,
CO
2
, H
2
O,…
Tùy vào môi trƣờng sinh trƣởng và sinh sản của vi sinh vật mà ngƣời ta
chia thành môi trƣờng sinh hóa hiếu khí, kỵ khí, hoặc thiếu khí. Đặc tính quan trọng
nhất của môi trƣờng sinh hóa là nơi tiếp nhận cuối cùng của các e
-
khi chúng oxy
hóa các hợp chất hữu cơ để hấp thụ năng lƣợng. Có 3 loại chất nhận e
-
chủ yếu là
O
2

, hợp chất hữu cơ, hợp chất vô cơ [6], [1].
Trong môi trƣờng hiếu khí, chất nhận e
-
là O
2
hòa tan. Điện thế của môi
trƣờng lệch về dƣơng.
Trong môi trƣờng kỵ khí, chất nhận e
-
là hợp chất hữu cơ, CO
2
, SO
4
2-
. Điện
thế của môi trƣờng lệch về âm.
Trong môi trƣờng thiếu khí, chất nhận e
-
chủ yếu là NO
2
-
, NO
3
-
(do thiếu
O
2
). Điện thế của môi trƣờng lệch về dƣơng.
1.2.2 Quá trình sinh hoá trong xử lý nƣớc thải
Gồm 3 giai đoạn:

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
11

- Giai đoạn 1: Hợp chất hữu cơ tiếp xúc với bề mặt của tế bào vi sinh vật
(bằng cách hấp phụ, hay keo tụ sinh học), sau đó xảy ra quá trình dị
hóa – là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ có khối lƣợng phân tử
lớn và cấu trúc mạch dài, thành các hợp chất có khối lƣợng phân tử nhỏ
và mạch ngắn.
- Giai đoạn 2: Các sản phẩm ở giai đoạn 1 sẽ khuếch tán và hấp thụ qua
màng vào trong tế bào của vi sinh vật.
- Giai đoạn 3: Các chất này chuyển vào trong tế bào, tại đây xảy ra quá
trình đồng hoá để sinh ra năng lƣợng và tổng hợp vật liệu mới cho tế bào
vi sinh vật. Quá trình này gồm hàng loạt các phản ứng hóa sinh, chủ yếu
là các phản ứng oxi hóa khử.
1.2.3 Sự sinh trƣởng của vi sinh vật
Sự sinh trƣởng của vi sinh vật bao gồm quá trình sinh sản (tăng số lƣợng và
kích thƣớc tế bào) và tăng sinh khối. Tất cả những biến đổi về hình thái, sinh lí diễn
ra trong tế bào nhƣ trên, gọi là sự phát triển. Vi sinh vật sinh sản chủ yếu bằng cách
phân đôi tế bào. Thời gian phân cắt này (thời gian sinh sản hoặc thời gian thế hệ)
thƣờng là 20 phút cho tới vài ngày.
Để phát triển, vi sinh vật cần các chất dinh dƣỡng. Các nguyên tố cần thiết
cho sự dinh dƣỡng của vi sinh vật bao gồm N (nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ), C, một số
nguyên tố khoáng (P, Na, K, Mg, Cu, Fe, Zn…). Khi các chất dinh dƣỡng cạn kiệt,
và khi pH, nhiệt độ của môi trƣờng sinh hóa vƣợt qua các trị số tối ƣu thì quá
trình phát triển của vi sinh vật bị dừng lại.
Sự sinh trƣởng của vi sinh vật đƣợc chia làm nhiều giai đoạn, bao gồm:
- Giai đoạn chậm: Giai đoạn để vi sinh vật thích nghi với môi trƣờng mới
và bắt đầu quá trình phân bào.
- Giai đoạn tăng trƣởng: Giai đoạn này các tế bào vi khuẩn tiến hành phân
bào và tăng nhanh về số lƣợng. Tốc độ phân bào phụ thuộc vào thời gian cần thiết

cho các lần phân bào và lƣợng thức ăn trong môi trƣờng.
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
12

- Giai đoạn cân bằng: Lúc này mật độ vi khuẩn đƣợc giữ ở một số lƣợng ổn
định. Nguyên nhân là do các chất dinh dƣỡng cần thiết cho quá trình tăng trƣởng
của vi khuẩn đã bị sử dụng hết hoặc số lƣợng vi khuẩn sinh ra bằng số lƣợng vi
khuẩn chết đi.
- Giai đoạn chết: Số lƣợng vi khuẩn chết đi nhiều hơn số lƣợng vi khuẩn
sinh ra, do đó mật độ vi khuẩn giảm nhanh.


Hình 1.7. Đƣờng cong sinh trƣởng của vi sinh vật [8].
1.2.4 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật
Theo S.F. Karel và cộng sự (1985), kỹ thuật cố định tế bào đƣợc định nghĩa
là “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn trong một vùng không
gian nhất định, nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn” [28].
Có 4 phƣơng pháp cố định chính:
- Cố định tế bào lên bề mặt chất mang rắn.
- Nhốt tế bào trong cấu trúc gel.
- Kết bông tế bào.
- Vi bao tế bào.
Tuy nhiên, trong lĩnh vực xử lý nƣớc thải thƣờng sử dụng 3 phƣơng pháp
đầu.
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
13


Hình 1.8. Các phƣơng pháp cố định tế bào [34].
1.2.4.1 Kỹ thuật cố định tế bào trên chất mang rắn

Theo Y. Kourkoutas và cộng sự (2004), quá trình cố định tế bào trên chất
mang rắn thực chất là sự hấp phụ thông qua các liên kết ion, tĩnh điện, liên kết cộng
hoá trị, hoặc liên kết hydro, liên kết Van der Waals. Chiều dày của lớp tế bào hấp
phụ thƣờng rất mỏng (khoảng 1 mm) và giảm dần trong quá trình lên men. Khả
năng hấp phụ phụ thuộc vào nhiệt độ, mật độ tế bào, diện tích bề mặt tiếp xúc của
chất mang [34].
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
14

Các chất mang thƣờng sử dụng là các polysaccharide có nguồn gốc tự nhiên
(cellulose, gỗ, mùn cƣa, dextran…), polysaccharide tổng hợp (các dẫn xuất của
polystyrene), hoặc các hợp chất vô cơ (ceramic, thuỷ tinh xốp, silicate…).
 Ưu điểm:
- Phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện.
- Tế bào dễ dàng tiếp xúc với cơ chất. Vì thế quá trình trao đổi chất ít bị
ảnh hƣởng.
 Nhược điểm:
- Đối với trƣờng hợp hấp phụ vật lý, liên kết giữa tế bào và chất mang
không bền, tế bào dễ bị rửa trôi, hiệu suất cố định thấp (40-60%).
- Khi điều kiện môi trƣờng thay đổi (pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất,…),
khả năng bảo vệ tế bào của phƣơng pháp này thấp.
1.2.4.2 Kỹ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel
Theo T. Branyik và cộng sự (2005), nhốt tế bào trong cấu trúc gel là quá
trình bao bọc tế bào vào trong cấu trúc gel, nhằm ngăn cản tế bào khuếch tán ra môi
trƣờng xung quanh nhƣng vẫn cho phép tế bào trao đổi chất với môi trƣờng. Hình
dạng của chất mang thƣờng là các hạt gel hình cầu, đƣờng kính 0.3-5 mm.
Chất mang thƣờng sử dụng là polysaccharide (alginate, agar, pectin…),
protein (gelatin, collagen…), hoặc polymer tổng hợp (polyvinyl alcohol,
polyacrylamide…).
Quá trình trao đổi chất giữa môi trƣờng bên trong và bên ngoài hạt gel đƣợc

thực hiện do sự chênh lệch nồng độ cơ chất [32].
 Ưu điểm:
- Phƣơng pháp đơn giản, dễ tối ƣu hoá quá trình cố định, chi phí thấp.
- Hạt gel có độ bền cao, có thể thể chứa đƣợc mật độ tế bào rất cao.
- Hạt gel có thể bảo vệ tế bào trƣớc những điều kiện bất lợi của môi
trƣờng.

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU
15

 Nhược điểm:
- Tế bào có thể phát triển trên bề mặt hạt gel và tách khỏi hạt gel.
- Nồng độ cơ chất và sản phẩm tại bề mặt hạt gel và tại tâm khác nhau. Do
đó hoạt tính và đặc điểm sinh lý của tế bào tại các vị trí khác nhau cũng
khác nhau.
- Khí CO
2
sinh ra trong quá trình lên men có thể làm nứt vỡ hạt gel.
1.2.4.3 Kỹ thuật kết bông tế bào
Một số loài vi sinh vật có khả năng tự kết lại với nhau thành một khối (kết
bông tự nhiên) [26], [32]. Tuy nhiên phƣơng pháp này ít đƣợc áp dụng trong thực tế
vì có khá nhiều nhƣợc điểm:
- Việc điều khiển quá trình cố định phức tạp và tốn kém.
- Quá trình trao đổi chất của tế bào ở tâm khối hạt bị hạn chế.
- Khả năng bảo vệ tế bào trƣớc điều kiện bất lợi của môi trƣờng thấp.
1.2.4.4 Yêu cầu đối với chất cố định
- Rẻ tiền.
- Bền vững và ổn định về mặt cơ, lý, hoá.
- Bền vững dƣới sự tấn công của vi khuẩn.
- Chất cố định có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có diện tích bề mặt lớn, có

thể sử dụng ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng…
1.2.5 Giới thiệu về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis thuộc giới bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ
Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus [39].
Bacillus subtilis là loại vi khuẩn rất phổ biến, đƣợc tìm thấy trong đất,
nƣớc, không khí, và từ sự phân huỷ thực vật [37].