chuyển gen và các phương pháp chuyển gen ở thực vật

CHUYỂN GEN
CHUYỂN GEN
VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN
VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN
Ở THỰC VẬT
Ở THỰC VẬT
KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
KHÁI NIỆM CHUNG
MỤC ĐÍCH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
XU HƯỚNG ÁP DỤNG VÀ MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC
VẬT
CÁC ĐẶC ĐIỂM ƯU VIỆT CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN SO
VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG TRUYỀN THỐNG
Kỹ thuật di truyền
Kỹ thuật di truyền
Là kỹ thuật chuyển gen để tạo
ra giống cây trồng, vật nuôi
hay vi sinh vật như ý muốn của
con người
Một phân đoạn ADN trên
nhiễm sắc thể chịu trách
nhiệm về một đặc tính
của sinh vật
Gene
Khái niệm chung
Gen là gì?
Gen là một đơn vị của vật chất di truyền. Bản thân nó
hoặc kết hợp với các gen khác quy định một tính trạng
của cơ thể.

Về mặt phân tử, một gen là một đoạn ADN (ở một số
virút là ARN) mã hoá hoặc trực tiếp hoặc tham gia vào
việc tổng hợp nên một phân tử protein, hay trong một số
trường hợp là các phân tử ARN ribosom (rARN), hoặc
ARN vận chuyển (tARN), hoặc một số các phân tử ARN
cấu trúc khác.
Gen (ADN) -> ARN -> Protein -> Tính trạng
Biến nạp gen (chuyển gen / kỹ thuật di truyền)
ở thực vật là khái niệm dùng mô tả quá trình
chuyển một hoặc một số gen ngoại lai vào trong
tế bào thực vật nhằm tạo ra một tính trạng mới
mà trước đó cơ thể thực vật đó không có.
Khái niệm chung
Biến nạp gen
ở thực vật
là gì?
Các gen biến nạp có thể
có nguồn gốc khác nhau.
Nó có thể được tách ra từ
một nguồn tế bào khác có
trong tự nhiên, hoặc được
tổng hợp bằng các kỹ
thuật sinh học phân tử.
Nguồn gốc của
gen biến nạp
Quá trình biến nạp gen được coi là thành công khi
gen biến nạp sau quá trình chuyển gen kết hợp ổn
định với ADN của hệ gen nhân của tế bào biến nạp.
Tế bào biến nạp này sau đó được tái sinh thành cây
hoàn chỉnh với sự biểu hiện của gen biến nạp, và duy

trì ổn định trong các thế hệ sau nhờ quá trình thụ
tinh bình thường.
MỤC ĐÍCH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
MỤC ĐÍCH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
1. Nghiên cứu và làm sáng tỏ chức năng của một gen được quan tâm hay
từng phần của gen đó.
2. Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một gen nội bào.
3. Chuyển các gen quy định các tính trạng mong muốn vào tế bào để thu
nhận được các tính trạng mới ở tế bào và cây chuyển gen.
Trong đó, các gen quy định các tính trạng mong muốn được quan tâm
nghiên cứu nhiều hơn cả, gồm:
+ Các gen kháng bệnh (virus, nấm, vi khuẩn, sâu bệnh, giun tròn…)
+ Gen chịu hạn, lạnh, và các diều kiện bất lợi khác của môi trường
+ Gen kháng thuốc diệt cỏ
+ Gen cải tạo các đặc tính về chất lượng (thay đổi thành phần axít béo, tăng cường
thành phần axít không no, tăng cường thành phần các axít amin không thay thế,
gen chín chậm, v.v…)
QUÁ TRÌNH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT ĐƯỢC THỰC HIỆN NHƯ THẾ NÀO?
QUÁ TRÌNH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT ĐƯỢC THỰC HIỆN NHƯ THẾ NÀO?
Giai đoạn 1. Giai đoạn chuyển gen (giai đoạn biến nạp).
Trong giai đoạn này, gen mong muốn thường được chuyển vào tế bào hoặc
mô thực vật.
Giai đoạn 2. Giai đoạn tái sinh cây.
Trong giai đoạn này, các mô tế bào được chuyển gen được chọn lọc ra và cho
tái sinh để phát triển thành cây.
Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định
thành công của một thí nghiệm biến nạp. Nếu sự biến nạp xảy ra mà không
có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến
nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công.
CÁC YÊU CẦU CƠ BẢN ĐỐI VỚI HỆ THỐNG TÁI SINH

CÁC YÊU CẦU CƠ BẢN ĐỐI VỚI HỆ THỐNG TÁI SINH
- Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng phân chia
in vitro nhanh.
- Các mô, tế bào này phải có khả năng tiếp nhận gen mới.
- Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen.
- Cây tái sinh phải có tỷ lệ sống (khi đưa
ra ngoài đất trồng) cao, tần số biến dị
thấp (tối thiểu), và khả năng hữu thụ cao
để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu
ban đầu để tiếp tục tiến hành chuyển gen
trong điều kiện in-vivo sau này.
- Các phương pháp chuyển gen (biến nạp gen) đều chuyển gen vào các tế bào, hay mô –
nói cách khác tế bào và mô là đơn vị tiếp nhận gen mới.
hệ thống tái sinh là điều kiện
tiên quyết để thực hiện thành
công biến nạp gen
Các loại mô sử dụng làm hệ thống tái sinh:
► Phải có khả năng tái sinh cao và thuận lợi cho việc chuyển
gen.
●Mô sẹo có nguồn gốc
khác nhau.
●Mô lá, thân mầm
● Phôi non,
phôi trưởng thành
VÍ DỤ VỀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CÁC CÂY BIẾN NẠP TỪ CÁC TẾ BÀO KHÁC NHAU
Dạng tế bào / mô đích PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CÂY BIẾN NẠP
Tế bào hoặc mô nuôi cấy in vitro
(cultured cells / tissues)
Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis),
hoặc phát sinh phôi (embryogenesis).

Phôi non (immature embryos), hoặc
các tế bào đang phát sinh cơ quan
(organogenic cells)
Tái sinh cây in vitro từ các dòng tế bào biến nạp
Các tế bào ở phôi non, và mô phân
sinh hoa
Sự phát triển tiếp tục của phôi, chồi, hay hoa sẽ cho một cây
khảm.
Hạt phấn có nguồn gốc từ các dòng tế
bào biến nạp được sử dụng cho việc
tạo ra các hạt cây được biến nạp
thông qua quá trình thụ tinh bình
thường
Tạo các cây biến nạp trực tiếp qua con đường thụ tinh với
hạt phấn chín (mature pollens) đang phát triển mà ADN của
nó đã được xử lý biến nạp
Hạt phấn Tạo các cây biến nạp trực tiếp qua con đường thụ tinh với
hạt phấn chín (mature pollens) đang phát triển mà ADN của
nó đã được xử lý biến nạp
GIAI ĐOẠN CHUYỂN GEN
GIAI ĐOẠN CHUYỂN GEN
Các véctơ chuyển gen
Các véctơ chuyển gen là các phân tử ADN mang đoạn gen cần
biến nạp.
Ngoài ra chúng còn có các đoạn ADN có cấu trúc đặc thù nhằm
tăng hiệu quả các các quá trình biến nạp giúp quá trình biến
nạp có thể thực hiện được.
Cấu trúc của
véctơ chuyển gen
1. Có một đoạn ADN khởi động (promoter). Đây là một đoạn ADN có liên

quan và cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã. Nó thường có một vị trí bám
cho enzym ARN polymeraza, một điểm khởi đầu phiên mã, và một số vị trí
bám khác của các protein điều khiển / điều hoà quá trình phiên mã (CaMV-
35S-promoter, nos-promoter …)
Vùng gắn enzyme
giới hạn (MCS)
Gen kháng
kháng sinh
Vi khuẩn
Điểm tái bản
Vi khuẩn
Prokaryote
Promoter
Gen c bi n n pđượ ế ạ
Eukaryote
Promoter
Vùng 3’ chứa tín hiệu
polyadenine hoá
Gen chỉ thị
chọn lọc
Eukaryote
Promoter
3’- PolyA
SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ
SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ
CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
ATG TAG
Cấu trúc của véctơ
chuyển gen

Vùng gắn enzyme
giới hạn (MCS)
Gen kháng
kháng sinh
Vi khuẩn
Điểm tái bản
Vi khuẩn
Prokaryote
Promoter
Gen c bi n n pđượ ế ạ
Eukaryote
Promoter
Vùng 3’ chứa tín hiệu
polyadenine hoá
Gen chỉ thị
chọn lọc
Eukaryote
Promoter
3’- PolyA
SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ
SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ
CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
ATG TAG
2. Có một đoạn ADN kết thúc (terminator). Đây là đoạn ADN cần thiết cho
sự kết thúc của quá trình phiên mã và giải phóng phân tử mARN khỏi sợi
khuôn ADN. Đoạn kết này thường có một trật tự tín hiệu polyadenin, như
AATTAA hoặc AACCAA, giúp cho phân tử mARN bền vững hơn.
4. Một đoạn ADN chứa các trật tự nucleotid đặc trưng cho sự nhận biết
của các enzyme giới hạn, thường ký hiệu là MCS (multi-cloning sites). Nhờ

đoạn ADN người ta có thể dùng enzym giới hạn đặc hiệu để cắt và tái tổ
hợp phân tử ADN của véctơ với đoạn ADN mang gen cần biến nạp.
3. Một đoạn ADN chịu
trách nhiệm cho quá trình
tái bản (replication; Điểm
tái bản) thường có nguồn
gốc vi khuẩn, như ColE1.
Cấu trúc của véctơ
chuyển gen
Vùng gắn enzyme
giới hạn (MCS)
Gen kháng
kháng sinh
Vi khuẩn
Điểm tái bản
Vi khuẩn
Prokaryote
Promoter
Gen c bi n n pđượ ế ạ
Eukaryote
Promoter
Vùng 3’ chứa tín hiệu
polyadenine hoá
Gen chỉ thị
chọn lọc
Eukaryote
Promoter
3’- PolyA
SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ
SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
ATG TAG
5. Các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes).
Các gen này thường tổng hợp nên các phân tử protein giúp phân biệt các tế
bào đã được biến nạp khỏi các tế bào không được biến nạp (gen chọn lọc),
hoặc ghi nhận sự hoạt động của gen biến nạp (gen chỉ thị).
Cấu trúc của véctơ
chuyển gen
Vùng gắn enzyme
giới hạn (MCS)
Gen kháng
kháng sinh
Vi khuẩn
Điểm tái bản
Vi khuẩn
Prokaryote
Promoter
Gen c bi n n pđượ ế ạ
Eukaryote
Promoter
Vùng 3’ chứa tín hiệu
polyadenine hoá
Gen chỉ thị
chọn lọc
Eukaryote
Promoter
3’- PolyA
SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ
SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
ATG TAG
Các gen chọn lọc thường có tính trội, thông thường có nguồn gốc từ vi
khuẩn nhưng hoạt động của chúng được kiểm soát bởi các promoter kiểu
Eukaryote.
Các gen chọn lọc phổ biến gồm:

۞
۞ Các gen kháng kháng sinh như kanamycin (neomycin
phosphotransferase-nptII), hygromycin (hygromycin phosphostransferase-
hpt), streptomycin (streptomycin phosphotransferaza),

۞
۞ Các gen kháng chất diệt cỏ, như glyphosate hoặc bialaphos
(phosphinothricin, BASTA): gen bar có nguồn gốc vi khuẩn mã hoá cho
enzyme làm bất hoạt BASTA là phosphinothricin acetyltransferaza (PAT).

۞
۞ Các gen khác (gen pmi – phosphate manose isomerase- chuyển hoá
manose thành glucose. Nhờ vậy, cây có thể sống trên môi trường không có
glucose (manose là nhân tố chọn lọc)
GIỚI THIỆU VỀ GEN CHỌN LỌC (selectable marker gene)
BIẾN NẠP GEN Ở
BIẾN NẠP GEN Ở
THỰC VẬT
THỰC VẬT
Các nhân tố chọn lọc
Các nhân tố chọn lọc
-

Kanamycin
Kanamycin
-


Hygromycin
Hygromycin
-


Basta
Basta
-


Manose
Manose
GEN CHỈ THỊ (reporter gene)
♣ Các gen gen chỉ thị là các gen có trách nhiệm thông báo là gen cần
biến nạp đã gắn vào hệ gen thực vật và bắt đầu hoạt động hay chưa.
♣ Các gen chỉ thị thường được dùng bao gồm:
+ β - galactosidase *
+ β - glucuronidase (GUS) *
+ Neomycin-phosphatase (NPT)
+ Chloramphenicol-acetyl transferase (CAT)
+ Alkaline phosphatase
+ Luciferase *
+ Protein phát huỳnh quang xanh lục GFP *

(green fluorescence protein) và các dẫn xuất của nó.
+ Protein chuyển trạng thái năng lượng cộng hưởng phát huỳnh
quang FRET (fluorescent resonance energy transfer)
Lactose Galactose + Glucose
β - galactosidase
β-D-glucuronide + H2O Axit glucuronic + Glucose
β - glucuronidase
X-Gal
5-Brom-4-chlor-3-idolyl-β-D-
galactoside
β

-

g
a
l
a
c
t
o
s
i
d
a
s
e
5-Brom-4-chlor-indigo
X-Gluc
5-Brom-4-chlor-3-idolyl-β-D-

glucuronid
β

-

g
l
u
c
u
r
o
n
i
d
a
s
e
5-Brom-4-chlor-indigo
Không màu
Màu xanh sẫm
β
- galactosidase & β - glucuronidase
Sử dụng gen chỉ thị gus
Vector chuyển gen
NGUYÊN TẮC
Sự biểu hiện
của gen gus ở
mô hoa, mô lá
và phôi ngô

non được
chuyển gen
Sử dụng gen chỉ thị Luciferase
Nguyên tắc
Luciferase là một loại protein
có trọng lượng 62 kDa phát
ra ánh sáng ở bước sóng 562
nm (màu vàng-xanh lục).
Là gen được phát hiện và
tách ra từ loài côn trùng
Photynis pyralis.
Sử dụng gen chỉ thị Luciferase
Sử dụng gen chỉ thị GFP (green fluorescene protein)
GFP là một loại protein có
trọng lượng 32 kDa phát ra
ánh sáng ở bước sóng 509 nm
(màu xanh lục sáng).
Là gen được phát hiện và
tách ra từ loài sứa Aequorea
victoria.
Sử dụng gen chỉ thị GFP (green fluorescene protein)
Ở thực vật
Ở CHUỘT THÍ NGHIỆM