Các Phương pháp trong Chọn giống Thực vật

101
Chương 6
Các Phương pháp trong Chọn giống
Thực vật

I. Các phương pháp chọn lọc cơ bản
Chọn lọc là một trong những phương pháp cơ bản và quan trọng được
ứng dụng rộng rãi trong chọn giống. Có hai kiểu chọn lọc cơ bản, đó là:
chọn lọc theo kiểu hình và chọn lọc theo kiểu gene; nhưng tất cả đều dựa
trên cơ sở là nguồn biến dị di truyền của sinh vật.
Ngày nay chúng ta đều biết rằng, chỉ có các biến dị di truyền (các đột
biến, biến dị tổ hợp) mới đóng vai trò là nguồn cung cấp nguyên liệu cho
quá trình chọn lọc và tiến hoá của sinh vật.
Trong khi Darwin xây dựng thuyết chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân
tạo, ông cũng đã phân bịêt được các biến dị di truyền (biến dị không xác
định) và biến dị không di truyền (biến dị xác định), nhưng chưa giải thích
được nguyên nhân của chúng. Về vai trò sáng tạo của chọn lọc,
+ Chọn lọc tự nhiên
Theo quan điểm của Darwin, sinh vật không ngừng phát sinh các biến
dị cá thể trong quá trình sinh sản và dưới tác dụng của các điều kiện môi
trường sống. Chỉ những biến dị nào có lợi cho bản thân sinh vật thì được
giữ lại, còn các biến dị nào không có lợi thì bị đào thải. Chọn lọc tự nhiên
thường xuyên diễn ra, giúp cho sinh vật mang các biến đổi thích nghi trên
cơ thể ngày càng hợp lý. Có những trường hợp chọn lọc tự nhiên thúc đẩy
và hỗ trợ cho chọn lọc nhân tạo, làm cho quá trình chọn lọc phát huy
nhanh hơn. Ví dụ, đặc tính chống chịu sâu bệnh, chịu hạn của cây trồng
vừa có lợi cho con người, vừa có lợi cho sinh vật. Ngược lại, đối với một
số đặc tính như rụng hạt ở cây ngũ cốc, chất lượng nông sản cao... thì giữa
chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo mâu thuẫn nhau. Do vậy sự thúc
đẩy quá trình hình thành giống mới xảy ra chậm hơn. Vì vậy trong công

tác chọn giống, chọn lọc nhân tạo có tác dụng vô cùng quan trọng để tạo
ra giống mới.
+ Chọn lọc nhân tạo
Darwin là người đầu tiên tổng kết đầy đủ nhất về vai trò tác dụng của
tác dụng nhân tạo. Theo Darwin, biến dị, di truyền và chọn lọc là ba yếu tố
quyết định sự tiến hoá của sinh vật. Chọn lọc nhân tạo đã tích luỹ những
biến dị có lợi và loại bỏ những biến dị không có lợi cho con người. Chính

102
chọn lọc nhân tạo đã tạo nên các đặc điểm thích nghi kỳ diệu trên cơ thể
vật nuôi, cây trồng (phù hợp với các thị hiếu thẩm mỹ và nhu cầu về kinh
tế của con người). Nếu như trong chọn lọc tự nhiên, động lực của chọn lọc
là đấu tranh sinh tồn, thì trong chọn lọc nhân tạo động lực thúc đẩy chính
là lợi ích kinh tế của con người.
II. Các nhân tố ảnh hưởng đến chọn lọc
1. Hệ thống sinh sản của cây trồng
Ở cây tự thụ phấn(autogamous), do đặc điểm sinh học về cấu tạo hoa,
việc lai tạo với cây trồng khác trong cùng loài gặp nhiều khó khăn. Mặt
khác, phần lớn cây tự thụ phấn là đồng hợp tử. Hạt giống thương phẩm
của nó đựơc sản xuất bằng phương pháp tự thụ phấn. Còn ở các cây giao
phấn hay thụ phấn chéo, việc lai tạo trong tự nhiên xảy ra thuận lợi. Đặc
điểm của những cây dị giao là dị hợp tử, do vậy hiệu ứng trội sẽ đóng góp
việc hình thành các tính trạng.
Phương pháp chọn giống ở cây sinh sản vô tính nói chung là các biến
dị xảy ra đều tạo nên các kiểu gene đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. Chọn ra
kiểu gene mong muốn trong môi trường nhất định sẽ tạo ra các dòng vô
tính phục vụ sản xuất. Ở đây nhân tố môi trường có tác động nhất định đến
các hệ thống sinh sản của cây.
2. Hiện tượng ưu thế lai
Ưu thế lai là hiện tượng thường gặp ở tất cả các loài cây giao phấn và

một số loài cây tự thụ như: đậu tương, cà chua, lúa mì, lúa... Hạt lai
thương mại hiện nay đã được áp dụng rộng rãi ở cả các cây tự thụ phấn và
cây giao phấn (xem chương 4).
3. Cấu trúc của bộ máy di truyền tế bào
Mức độ đa bội có ảnh hưởng nhất định đến chiến lược chọn giống cây
trồng: tứ bội thể được dùng thông dụng ở các loài cây thức ăn gia súc
nhằm làm tăng sản lượng chất khô và các đặc tính tốt khác. Việc chọn lọc
một tính trạng nào đó như khả năng chống chịu sâu bệnh của củ cải
đường, khoai tây... bằng cách chọn các dạng tam bội tỏ ra có hiệu quả hơn.
4. Tính trạng số lượng và tính trạng chất lượng
Tuỳ theo tính trạng nhà chọn giống quan tâm là tính trạng số lượng
hay tính trạng chất lượng mà có các phương pháp chọn lọc khác nhau.
Thông thường, tính trạng chất lượng được kiểm tra bởi một gene, còn tính
trạng số lượng do nhiều gene kiểm tra và chịu ảnh hưởng lớn bởi môi
trường và tác động qua lại giữa các gene.
Đối với tính trạng số lượng, phương pháp chọn giống thường được áp

103
dụng là chọn lọc theo chu kỳ hay chọn lọc hồi quy. Càng có nhiều gene
tham gia thì sẽ ít có cơ hôi tạo ra sự ngẫu nhiên để đạt được một tổ hợp
gene tốt nhất của một chu kỳ chọn lọc. Do vậy cần có sự phối hợp của
chọn lọc nhằm làm tăng các tổ hợp tốt nhất ở chu kỳ tiếp theo. Trong
trường hợp này, phương pháp chọn giống hồi quy giúp thu được các tính
trạng tốt ở mỗi chu kỳ.
5. Sự hoạt động của các gene (xem cơ sở di truyền học của hiện tượng ưu
thế lai, chương 4)
III. Các nguyên tắc cơ bản của chọn lọc
Ngoài những nguyên nhân khách quan ảnh hưởng đến quá trình chọn
lọc như mức độ biến dị của tính trạng được chọn à phương pháp chọn lọc,
thì nguyên nhân chủ quan cũng góp phần quan trọng và mang tính quyết

định, do vậy cần tuân thủ các nguyên tắc cơ bản khi chọn lọc.
(1) Có mục tiêu và phương hướng: Mục tiêu và phương hướng của
nhà chọn giống càng cụ thể và rõ ràng thì công tác chọn giống càng nhanh
chóng có hiệu quả.
(2) Chọn vật liệu khởi đầu thích hợp: Nguyên tắc này mang tính quyết
định đối với công tác chọn giống. Ví dụ, khi muốn tạo ra cây trồng có tính
chịu rét, chịu hạn, chịu mặn hoặc khả năng chống chịu sâu bệnh v.v. cần
chọn những vật liệu có các gene chống chịu về những đặc tính này và cần
được thực tiễn sản xuất thừa nhận các đặc tính này trên quy mô lớn.
(3) Cần dựa vào tính trạng trực tiếp và tính trạng tổng hợp: Các tính
trạng có mối quan hệ mật thiết với nhau, sự tương quan này còn phụ thuộc
vào nhiều yếu tố. Việc phát hiện ra mối tương quan càng sớm bao nhiêu
thì kết quả chọn lọc càng nhanh bấy nhiêu. Ví dụ, tính trạng chịu hạn của
cây ngoài các đặc điểm về cấu tạo bộ rễ ra thì đặc điểm về kích thước lá,
đường kính lá, đặc điểm về hình dáng là góp phần quan trọng cho tính
trạng tổng hợp chịu hạn của cây trồng.
(4) Vật liệu chọn giống cần đảm bảo trồng trong điều kiện đồng đều
và thích hợp: Đây là nguyên tắc bắt buộc, vì chỉ có trong những điều kiện
phù hợp như vậy, các đặc tính hay tính trạng của giống cây trồng mới biểu
hiện ra và thông qua công việc đánh giá, quá trình chọn lọc đó mới đảm
bảo tính khách quan và chính xác.
(5) Ruộng chọn giống cần áp dụng các biện pháp kỹ thuật phù hợp:
Muốn đánh giá tiềm năng năng suất của giống cây trồng, cần áp dụng
những biện pháp kỹ thuật tối ưu về đất đai, thời vụ phân bón, tưới tiêu...
Còn muốn đánh giá giống trong điều kiện sản xuất thì áp dụng các quy
trình kỹ thuật ngoài sản xuất mà không có bất kỳ một sự ưu tiên nào ngoài

104
việc chọn lọc sao cho các giống ngày càng trở nên thuần chủng.
(6) Cần chọn lọc theo đúng mục tiêu đề ra và phải chọn lọc trong môi

trường phù hợp: Chẳng hạn, trong việc chọn các giống chịu mặn, chịu
úng, chịu hạn... thì các vật liệu chọn giống cần trồng trong điều kiện tự
nhiên tương ứng như: mặn, úng, hạn.... Hoặc trong đánh giá khả năng
kháng bệnh cũng vậy, vật liệu chọn tạo cần gieo trồng trong mùa vụ có
dịch bệnh phát sinh mạnh nhất.
(7) Kết hợp chọn lọc ở trong phòng và trên đồng ruộng trong suốt thời
kỳ sinh trưởng của giống, khi đó các giống cây trồng mới được chọn ra
một cách nhanh chóng và chuẩn xác.
IV. Sơ lược về các phương pháp chọn giống truyền thống và hiện
đại thông dụng
1. Một số phương pháp chọn giống truyền thống
Chọn giống là một quá trình liên tục để thoả mãn nhu cầu thay đổi của
một nền nông nghiệp. Nói chung, các phương pháp chọn giống truyền
thống vẫn tương đối phổ biến, trong đó tái tổ hợp giữa các kiểu gene ưu tú
vẫn là khâu then chốt để tạo ra vật liệu chọn giống cho quá trình chọn lọc.
Các phương pháp chọn giống truyền thống dựa vào sự tái tổ hợp của các
gene và nhiễm sắc thể thông qua sinh sản hữu tính của sinh vật (tuân theo
các nguyên lý di truyền cổ điển của Mendel và Morgan).
Các quy trình chọn giống khác nhau đã được sử dụng cho các kiểu cây
trồng khác nhau, tuỳ thuộc vào phương thức sinh sản là tự thụ phấn hay
giao phấn. Đối với lúa, phương pháp chọn giống theo phả hệ là thông
dụng nhất. Các bố mẹ được chọn kỹ lưỡng và lai thông qua thụ phấn bằng
tay (Hình 6.1). Trong chương trình chọn giống kháng, thông thường một
dạng bố mẹ là giống đã được cải tiến và dạng kia là một giống kháng hoặc
loài hoang dại. Phải mất vài thế hệ lai và chọn lọc để chuyển gene kháng
cho dạng bố mẹ đã được cải tiến và phục hồi các đặc tính mong muốn của
dạng bố mẹ cải tiến (năng suất, chất lượng hạt, v.v.). Tại Viện nghiên cứu
lúa quốc tế (IRRI, đặt tại Manila - Philippines), mỗi năm có tới hàng chục
ngàn dòng chọn giống được kiểm tra và lưu giữ về khả năng kháng rầy
nâu và sâu hại lá. Tại đây đã lai tạo và phóng thích nhiều giống lúa mới

(IR-8, IR-36, IR-64,...) góp phần tạo nên cuộc "cách mạng xanh" trong
những năm 1960 và 1970 ở các nước đang phát triển.

105


Hình 6.1
Hình trên: Hoa lúa, khử nhị đực và tiến hành lai giữa hai giống lúa
thông qua thụ phấn bằng tay. Hình dưới: Một giống lúa bán lùn, năng suất cao
gọi là IR-8 (trái), một phần của cuộc cách mạng sanh lần thứ hai, được IRRI tạo
ra bằng cách lai chéo giữa hai dòng lúa bố mẹ: PETA từ Indonesia (giữa) và
DGWG từ Trung Quốc (phải). Với thân thấp hơn và cứng hơn, giống lúa mới có
thể mang các bông to hơn nhưng không bị đổ.

2. Một số phương pháp chọn giống hiện đại
Sự phát triển của công nghệ sinh học (CNSH) trong vài thập niên gần
đây đã và đang đưa lại các kiểu quy trình chọn giống mới. Trong chọn lọc
với sự hỗ trợ của marker (marker-assisted selection), các marker DNA
liên kết với các tính trạng quan tâm (ví dụ các gene kháng côn trùng) được
sử dụng để cải tiến hiệu quả của chọn giống. Các marker DNA còn hỗ trợ
cho việc phân tích số lượng, tác dụng và sự đinh khu trên nhiễm sắc thể
của các gene thứ yếu ở thực vật, thông qua một quá trình gọi là phân tích
các locus tính trạng số lượng (quantitative trait loci = QTL).
Kỹ thuật di truyền (genetic engineering) cho phép sử dụng bất kỳ sinh
vật nào để làm nguồn cung cấp tính kháng. Chẳng hạn, vi khuẩn Bacillus
thuringiensis (Bt) là nguồn cung cấp gene mã hoá các độc tố diệt côn
trùng đã được dùng để tạo ra giống lúa chuyển gene kháng được loại sâu
đục thân (xem Hình 6.2). Vấn đề này sẽ được thảo luận kỹ ở chương 9.
CNSH bao gồm một các loạt phương pháp và quy trình sử dụng cơ thể
sống và các hệ thống sinh học được biến đổi để tạo ra sản phẩm mới và

tăng năng suất cây trồng, vật nuôi. Trong trồng trọt và nhất là trong cải

106
lương giống cây trồng, hầu hết các quy trình CNSH sử dụng nuôi cấy mô
và tế bào in vitro từ mảnh mô, tế bào phân lập, mô sẹo, tế bào trần hoặc
mô phôi để thực hiện quá trình biến đổi, rồi sau đó cho tái sinh cây hoàn
chỉnh. Điều cần thiết là phải hiểu và nắm vững sự tái sinh cây từ nuôi cấy
mô đối với từng loại xác định trước khi áp dụng để bổ sung cho phương
pháp chọn tạo giống hiện hành. kết quả nuôi cấy mô và tế bào mấy chục
năm qua cho thấy nuôi cấy tế bào từ các loài cây trồng khác nhau hay các
kiểu gene khác nhau trong nội bộ một loài, hoặc thậm chí từ các bộ phận
khác nhau trên cùng một cây có phản ứng khác nhau đối với một kỹ thuật
nuôi cấy cụ thể. Điều này đã cản trở việc xây dựng các qui trình đồng nhất
để có thể áp dụng thường xuyên trong các chương trình chọn giống cho
nhiều loài cây trồng. Để ứng dụng kỹ thuật này trong chương trình chọn
tạo giống cần phải vạch ra các quy trình cụ thể cho từng loại vật liệu di
truyền và môi trường nuôi cấy.
2.1. Nuôi cấy mô và tế bào
Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn năng của tế bào
soma ở thực vật và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đường
nuôi cấy mô và tế bào. Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh cây hoàn
chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào trần (protoplast) mới trở thành hiện thực.
Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật phân lập
hay mảnh mô thực vật tách rời trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện
vô trùng. Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Người ta đã xây dựng được các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh
cây cho một số loài như thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn
quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng trên đồng ruộng, như bông và đậu lấy
hạt thì việc thiết lập các quy trình để áp dụng rộng rãi khó hơn nhiều. Ở
những loài cây này tần số tái sinh thấp và kết quả tái sinh từ nuôi cấy

không chỉ thay đổi theo loài mà còn phụ thuộc vào kiểu gene trong một
loài, nguồn mô cấy, tuổi và sức khoẻ của mô cấy, môi trường dinh dưỡng
và nhiều yếu tố khác. Nhìn chung, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào cho
phép nhân nhanh những kiểu gene có giá trị hay vật liệu chọn giống trong
một môi trường có kiểm soát. Một số khả năng ứng dụng của nhân nhanh
đối với cây trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị hợp tử, nhân kiểu gene
tự bất hợp, nhân bố mẹ bất dục trong chương trình chọn giống lai, nhân
vật liệu sạch bệnh, bảo quản và trao đổi nguồn gene quốc tế...
Ở đây chỉ giới thiệu sơ lược một số kỹ thuật nuôi cấy in vitro liên
quan trực tiếp tới quá trình chọn giống.
(1) Nuôi cấy phôi, noãn và thụ phấn in vitro
Các nhà chọn giống chủ yếu đã và đang tận dụng biến dị di truyền

107
hiện có trong nguồn gene trồng trọt bằng cách sử dụng nhiều sơ đồ lai và
chọn lọc khác nhau. Tuy nhiên với thâm canh và độc canh, một ít kiểu
gene chọn lọc về những tính trạng có ý nghĩa kinh tế biến dị di truyền
ngày một giảm trong nguồn gene trồng trọt. Thậm chí trong một số trường
hợp, nguồn biến dị đối với một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế không đủ
thoả mãn, ví dụ: tính kháng bệnh vàng lụi, sâu đục thân, chịu mặn ở lúa...
Để khắc phục những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất,
nhà chọn giống cần có nguồn gene kháng sâu bệnh từ các loài hoang dại
thân thuộc hoặc không thân thuộc. Một khó khăn lớn khi sử dụng các loài
hoang dại để lai với cây trồng là tính bất hợp khi lai. Trong một số trường
hợp, các phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường
yếu và không có khả năng sống do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ
không đầy đủ và chúng thường bị chết trong một thời gian ngắn sau khi
hình thành hợp tử và không thể phát triển thành hạt có khả năng sống. Vì
vậy, nuôi cấy phôi hay cứu phôi là một phương pháp để khắc phục hàng
rào bất hợp, bảo đảm để phôi non sinh trưởng, nảy mần, và phát triển

thành cây con. Thông qua sử dụng phương pháp này người ta đã tạo ra
nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng như lúa mì, lúa nước, đại
mạch, bông, đậu, đỗ, các loài cây ăn quả, cây cảnh và nhờ vậy nhiều gene
có ích đã được chuyển vào cây trồng.
Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy để cứu phôi từ các tổ hợp lai
xa mà không cần tách phôi ra khỏi noãn. Noãn chứa phôi lai non được
tách ngay sau khi thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi
trường dinh dưỡng. Bằng con đường nuôi cấy noãn phôi có thể nuôi cấy ở
giai đoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát triển
trong noãn có môi trường hoá học và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy
bên ngoài noãn.
Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập noãn chưa thụ tinh,
cấy noãn trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng, và thụ
phấn cho noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua thành noãn và
túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng. Phương pháp này đã được áp dụng để
tạo con lai giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào
noãn bình thường sau khi thụ phấn.
(2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây đơn bội:
Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải
tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F
2
lớn và chọn lọc các dòng mong
muốn trong các thế hệ phân ly từ F
2
đến F
7
để cuối cùng tạo ra các dòng
đồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để
tạo ra các dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do

108
đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống mới.
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu
bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra
cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây
lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy
bao phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn bội kép có thể được
sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn.
Thời gian cần thiết để tạo ra một giống hay một dòng tự phối bằng phương
pháp đơn bội kép được rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền
thống. Các dòng đơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải thiện hiệu quả
chọn lọc đối với nhiều tính trạng vì trong quần thể không có phương sai
trội, đồng thời gene lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này đã được
áp dụng thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra giống lúa và lúa mì.
Tuy nhiên, hạn chế trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả
năng nuôi cấy khó và tính đặc thù cao của kiểu gene. Ví dụ, các nhà chọn
giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu quả bằng các nhà
chọn giống lúa Japonica do các kiểu gene Indica khó nuôi cấy hạt phấn
còn bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của bao phấn, điều kiện sinh lý
của cây cho phấn, điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh
dưỡng, điều kiện nuôi cấy và hiệu quả lưỡng bội hoá bằng colchicine.
(3) Biến dị dòng soma và chọn lọc dòng tế bào:
Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối
và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây dồng nhất
và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú.
Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây
trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy
trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao
gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc
thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh.

Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là
biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983).
Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và
mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của
genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di
truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng
và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng
soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus Fiji, bệnh
đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977);
khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng

109
sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh
ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996).
Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả
năng chọn lọc dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế
bào trong một không gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc
bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn
lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến
dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới
có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các đặc
tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt, nhôm,
axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả
năng kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gene phân
lập kháng với các điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong
chương trình chọn giống.
2.2. Lai tế bào soma hay dung hợp tế bào trần
Trong các phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tính là
phương pháp cơ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao
tử. Tuy nhiên, việc lai hữu tính chỉ thực hiện được các cá thể trong một

loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Lai giữa các loài có quan hệ xa
nhau thường rất khó khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính
hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguồn biến dị di truyền cần thiết
cho việc cải lương cây trồng. Vì vậy một phương pháp mới được đề xuất
bởi Keller và Melchers (1973) là nhằm khắc phục hàng rào lai hữu tính
giữa các loài có quan hệ họ hàng xa nhau là phương pháp dung hợp tế bào
soma hay dung hợp tế bào trần.
Đó là kỹ thuật cho phép hợp nhất các tế bào soma không có thành tế
bào của cá thể hoặ các loài khác nhau, và sau đó cho tái sinh cây lai từ các
tế bào đã dung hợp. Trong lai hữu tính, các tính trạng liên quan DNA bào
quan kiểm soát hoàn toàn giống cây mẹ vì không có sự tổ hợp các cơ quan
tử của bố và mẹ. Trong dung hợp tế bào trần, ngoài khả năng dung hợp
nhân, còn có khả năng xảy ra hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di
truyền hoàn toàn mới. Ty thể và lạp thể của hai tế bào khác nhau có thể
hợp nhất hoặc là tái tổ hợp tạo ra một tế bào dị tế bào chất, gọi là cybrid.
Như vậy, bằng con đường lai soma người ta có thể thu được tổ hợp mới
của lạp thể hay ty thể và tương tác mới giữa nhân và tế bào chất. Dung
hợp tế bào trần là một quá trình nhiều giai đoạn, bao gồm việc phân lập tế
bào trần từ các loài khác nhau, dung hợp tế bào trần từ hai loài khác nhau,
giám định, nhân sản phẩm dung hợp và cuối cùng là tái sinh cây lai hữu
dục là sản phẩm dung hợp.

110
Lai soma được sử dụng có hiệu quả để kết hợp khả năng kháng các
bệnh virus ở khoai tây từ các kiểu gene trong một loài cũng như từ các loài
khác nhau (Venzen, 1994). Lai soma là một phương tiện có hiệu quả để
chuyển bất dục đực tế bào chất và đa dạng hoá nguồn bất dục trong việc
tạo giống lai.
2.3. Chuyển gene hay kỹ thuật di truyền
Kỹ thuật di truyền thực vật là sự chuyển một đoạn DNA lạ, thường là

một gene có chức năng mã hoá cho một thông tin hay đặc điểm có lợi nhất
định vào tế bào thực vật như khả năng kháng sâu hại, kháng virus hay
kháng thuốc trừ cỏ. Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gene lạ được lồng
vào genome, biểu hiện ra kiểu hình va di truyền ổn định được gọi là cây
chuyển gene. Gene lạ có thể có nguồn gốc từ vi sinh vật thực vật, động
vật, thậm chí gene tổng hợp. Quá trình chuyển gene bao gồm nhiều bước:
xác định và phân lập gene có ích, nhân gene, chuyển gene vào tế bào thực
vật, tái sinh tế bào chuyển nạp thành cây hoàn chỉnh và đánh giá sự biểu
hiện của gene.
Trong các bước trên, kỹ thuật chuyển gene đóng một vai trò quyết
định đối với kết quả chuyển gene. Chuyển gene vào tế bào thực vật có thể
thực hiện gián tiếp thông qua vector hay trực tiếp. Sau đây là ví dụ về sự
chuyển qua thông qua Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens.
A. tumefaciens là vi khuẩn gây khối u ở cây hai lá mầm và phản ứng
hình thành khối u là kết quả của sự kiện chuyển gene tự nhiên. Mấu chốt
của sự hình thành khối u là Ti-plastmid (Ti: tumor inducing) của vi khuẩn
chứa các gene mã hoá sinh tổng hợp các horrmon (auxin và cytokinin)
chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u. Các gene này nằm trong vùng
T-DNA (transfered DNA) của plasmid. Khi plasmid xâm nhập vào tế bào
của cây, cùng T-DNA được chuyển vào genome. Đoạn T-DNA là yếu tố
di truyền vận động trong quá trình chuyển gene.
Ý nghĩa của Agrobacterium trong kỹ thuật di truyền là khả năng
chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật. Lợi dụng phương thức chuyển
gene tự nhiên các nhà khoa học thực vật dựa vào kỹ thuật phân tử điều
khiển T-DNA để thiết kế hệ vector bằng cách lồng đoạn DNA cần chuyển
gắn vào cùng T-DNA của vi khuẩn, sau đó cho cây nhiễm các vi khuẩn
chứa plasmid đã biến đổi. Để lây nhiễm người ta nuôi cấy tế bào trần thực
vật, tế bào đơn trong trong mooi trường lồng, hoặc đặt mô cấy trong dung
dịch huyền phù chứa vi khuẩn có plasmid biến đổi trong một thời gian

nhất định. Quá trình chuyển nạp thông qua Agrobacterium gồm các bước
sau đây:

111
- Phân lập gene có ích từ thể cho (DNA lạ) và nhân gene
- Loại bỏ T-DNA khỏi Ti-plasmid của các dong vi khuẩn đã chọn lọc
- Chuyền DNA lạ vào Ti-plasmid cùng với promotor và một gene chỉ
thị có khả năng chọn lọc dễ dàng (ví dụ gene uidA của vi khuẩn mã hoá β-
glucuronidaza thường gọi là gene GUS, hay gene kháng kháng sinh).
- Đưa plasmid đã biến đổi vào tế bào thực vật
- Chọn tế bào được chuyển gene
- Tái sinh tế bào được chuyển gene
- Chọn cây biểu hiện được chuyển (cấy chuyển gene)

Lớp vỏ áo hạt
Máy bắn
hạt
Băn các phôi với các tiểu
hạt vàng có lồng gene Bt
vào trong các tế bào cây lúa
Phủ một lớp hạt vàng
nhỏ lên gene Bt
Cách ly gene độc
từ tế bào Bt. Sửa
đỏi để sử dụng
trong pls và tạora
nhiều bản sao
Đưa các phôi vào môi
trường sinh trưởng
Nhiễm sắc thể

Cách ly phôi
từ hạt lúa
Phôi
Cây lúa
chuyển gene
Tái sinh các cây mạ từ
các mô sẹo phát triển
từ phôi được biến nạp
Cho các phôi sinh trưởng trên
môi trường để xác định các
phôi nào đã được biến nạp
gene Bt
Hình 6.2
Tạo giống lúa Bt bằng phương pháp súng bắn gene (particle
bombardment method). Đây là một trong nhiều phương pháp có thể sử dụng để
chuyển các gene mới sang cây lúa bằng kỹ thuật di truyền.
Ở một số loài cây dễ nuôi cấy như khoai tây và cà chua, các mẫu lá cắt

112
rời được nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn trong một thời gian ngắn.
Sau đó các mẫu lá được đưa vào môi trường dinh dưỡng. Trong khoảng
thời gian đó vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và xâm nhập vào các tế bào lá
rồi tạo ra một số tế bào chuyển gene. Vì chỉ một phần nhỏ tế bào được
chuyển gene nên cần phải tiến hành chọn lọc. Việc chọn lọc thông thường
dựa vào gene chọn lọc, đó là gene kháng kháng sinh hay kháng thuốc trừ
cỏ. Sau đó các mẫu lá được chuyển vào môi trường khác chứa một chất
kháng sinh để diệt Agrobacterium còn sót lại và một chất kháng sinh khác
hay thuốc trừ cỏ để loại trừ các tế bào không chuyển gene.
Các tế bào được chọn được chuyển sang một loạt các môi trường dinh
dưỡng để tái sinh cây. Kết quả tái sinh và tạo cây chuyển gene phụ thuộc

vào loài cây. Phương pháp chuyển gene thông qua Agrobacterium được áp
dụng rất thành công ở nhiều loài cây hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây và
cà chua.
2.4. Giám định nguồn gene và chọn lọc dựa nhờ chỉ thị di truyền
Giám định chính xác các giống, dòng và nguồn vật liệu khởi đầu cho
tạo giống vô cùng quan trọng đối với việc chọn lọc bố mẹ để tạo ra nguồn
biến dị di truyền. Ví dụ, quan hệ họ hàng là một yếu tố xác định việc chọn
bố mẹ ở cả cây tự thụ phấn lẫn cây giao phấn. Tạo giống dòng thuần
thường dựa vào việc sử dụng các dòng có quan hệ thân thuộc, trong khi đó
con lai tốt nhất được tạo thành từ tổ hợp của các bố mẹ tự phối có quan hệ
xa nhau. Có thể xác định mức độ thân thuộc bằng cách kiểm tra gia phả,
năng suất của con lai và những đặc điểm hình thái. Các phương pháp xác
định này thường không chính xác.
Để tăng độ chính xác trong giám định nguồn gene, những năm gần
đây các nhà chọn giống đã áp dụng phương pháp điện di isozyme và tính
đa hình về độ dài của phân đoạn cắt hạn chế (restriction fragment length
polymorphism, viết tắt: RFLP). Điện di enzyme đựa vào việc định lượng
một loạt các enzyme chứa trong các mô đặc thù, chẳng hạn cây đang nảy
mầm. Trong mỗi enzyme có thể xác định được các allele khác nhau
(allozyme hay isozyme) nhờ tính di động khác nhau trên màng
polyacrylamide gel trong một điện trường. Tính di động của enzyme phụ
thuộc trọng lượng phân tử, tính tích điện và cấu trúc ba chiều của nó.
RFLP là những phân đoạn DNA tạo ra khi DNA được phân giải bởi
các enzyme phân giải DNA gọi là enzyme cắt hạn chế (restriction
endonulease). Các phân đoạn cắt có độ dài khác nhau và có trọng lượng
phân tử khác nhau được tách ra trên môi trường điện di. Các kiểu gene
khác nhau tạo ra một bộ RFLP khác nhau khi được cắt bởi cùng một
enzyme và đây là cơ sở để phân biệt các cá thể khác nhau. cuối cùng sự