Luận văn công nghệ sinh học Vi nhân giống lan gấm anoectochilus formosanus hayata

LỜI CẢM ƠN

Đề tài tốt nghiệp này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ
Sinh Học – Môi trường, Trường Đại học Lạc Hồng dưới sự hướng dẫn của Ths.
Vưu Ngọc Dung và Ths. Mai Hương Trà, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi trường
Trường Đại học Lạc Hồng.
Để hoàn thành tốt bài báo cáo nghiên cứu này chúng tôi đã nhận được nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể.
Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường -
Trường Đại học Lạc Hồng cho phép chúng tôi thực hiện đề tài này.
Cảm ơn cô Vưu Ngọc Dung và cô Mai Hương Trà, người trực tiếp hướng dẫn đề
tài nghiên cứu của chúng tôi đã đóng góp nhiều ý kiến và tận tình hướng dẫn cho
chúng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, trình bày báo cáo.
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm khoa
Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Lạc Hồng đã tạo điều kiện
thuận lợi giúp đỡ trong suốt quá trình nghiên cứu.
Cảm ơn các bạn, anh chị trong nhóm sinh viên thực tập tốt nghiệp đã giúp đỡ
chúng tôi hoàn thành đề tài.
Và cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn
dành sự cảm thông chia sẻ, giúp đỡ và động viên chúng tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn!

Biên Hòa, ngày 24 tháng 11 năm 2013
Sinh viên




MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
LỜI MỞ ĐẦU 1
PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU 2
1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 2
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 3
1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 3
1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3
1.5. KẾT CẤU CỦA ĐỀ TÀI 3
PHẦN II: NỘI DUNG 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 4
1.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô 4
1.1.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro 5
1.1.3. Các bước nhân giống in vitro 6
1.1.3.1. Tạo thể nhân giống in vitro 6
1.1.3.2. Nhân giống in vitro 6
1.1.3.3. Chuyển cây in vitro ra vườn ươm 7
1.1.3.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro 7
1.1.4. Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nhân giống in vitro 7
1.1.4.1. Ưu điểm 7
1.1.4.2. Hạn chế 8
1.1.5. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô 8
1.1.5.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản 8
1.1.5.2. Về mặt thực tiễn sản xuất 9

1.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 9

1.2.1. Một số loại môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô 9
1.2.2. Thành phần hóa học của các môi trường nuôi cấy 10
1.2.2.1. Các chất khoáng 11
1.2.2.2. Các Vitamin 11
1.2.2.3. Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy 11
1.2.2.4. Yếu tố làm đặc môi trường 12
1.2.2.5. Các chất điều hòa sinh trưởng 12
1.2.2.6. Các chất kháng sinh 13
1.2.3. Độ pH môi trường 14
1.3. TỔNG QUAN VỀ LAN GẤM 14
1.3.1. Tình hình sản xuất 14
1.3.2. Nhu cầu thị trường lan 15
1.3.3. Nguồn gốc và kỹ thuật trồng lan 16
1.3.3.1. Vị trí phân loại 16
1.3.3.2. Nguồn gốc và phân bố . 16
1.3.3.3. Đặc điểm hình thái 17
1.3.3.4. Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến lan Gấm 17
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ NUÔI CẤY LAN GẤM 18
1.4.1. Trên thế giới 18
1.4.2. Ở Việt Nam 19
1.4.3. Kết luận 20
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22
2.1.1. Mẫu mô 22
2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị 22
2.1.2.1. Chuẩn bị phòng thí nghiệm 22
2.1.2.2. Chuẩn bị dụng cụ 22
2.1.2.3. Các thao tác trong phòng cấy 23

2.1.2.4. Điều kiện 24

2.2. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 24
2.2.1. Môi trường Knudson C 24
2.2.2. Các chất điều hòa sinh trưởng 25
2.2.3. Dịch chiết khoai tây 25
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.3.1. Nội dung nghiên cứu 25
2.3.2. Bố trí thí nghiệm 26
2.3.2.1. Th nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA
3
tới
môi trường tái sinh chồi. 26
2.3.2.2. Th nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới sự phát
sinh hình thái và hệ số nhân chồi 27
2.3.2.3. Th nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát
sinh rễ 29
2.3.3. Xử l số liệu: 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. KẾT QUẢ 31
3.1.1. Th nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA
3
tới môi
trường tái sinh chồi 31
3.1.2. Th nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới sự phát sinh
hình thái và hệ số nhân chồi 35
3.1.3. Th nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh
rễ 39
3.2. THẢO LUẬN 46
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
4.1. KẾT LUẬN 49
4.2. KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Số chồi tái sinh qua các giai đoạn
Biểu đồ 3.2: Biểu diễn số chồi tái sinh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy
Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của môi trường đến sự nhân nhanh chồi và phát triển chồi
Biểu đồ 3.4: Biểu diễn số chồi nhân nhanh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy
Biểu đồ 3.5: Biểu diễn chiều cao của chồi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy
Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của môi trưởng đến sự ra rễ và phát triển rễ
Biểu đồ 3.7: Biểu diễn số rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy
Biểu đồ 3.8: Biểu diễn chiều dài rễ phụ thuộc và môi trường nuôi cấy

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần môi trường Knusond C
Bảng 2.2: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và Kinetin trong môi
trường tái sinh chồi
Bảng 2.3: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và NAA trong môi trường
nhân nhanh chồi
Bảng 2.4: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và NAA trong môi trường
phát sinh rễ
Bảng 3.1: Kếtquả ảnh hưởng các môi trưởng đến sự tái sinh chồi đến hình thái chồi
Bảng 3.2: Kết quả ảnh hưởng các môi trường lên sự nhân chồi
Bảng 3.3: Kết quả ảnh hưởng các môi trường tới sự ra rễ


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata
Hình 1.2: Các dạng sản phẩm lan Gấm thô và lan Gấm chế biến
Hình 1.3: Lan Gấm
Hình 2.1: Sơ đồ Phòng nuôi cấy mô, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường
Hình 2.2: Nồi hấp Autoclave
Hình 2.3: Cân phân tích
Hình 3.1: Số chồi hình thành trên môi trường TS5 sau 2,4,6 tuần
Hình 3.2: Số chồi hình thành trên môi trường KC7 sau 2,4,6 tuần
Hình 3.4: Sự phát triển của rễ sau 6 tuần
Hình 3.5: Quy trình vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BAP: 6 – Benzylamino – purine
IBA: Indol Butyric Acid
KT: Forchlorfenuron
CĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng
CĐHSTTV: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
GA
3
: Giberellin A
3
NT: Nghiệm thức
NAA: Naphthaleneacetic acid
2,4- D: 2,4 – diclorophnoxyacetic acid
B1: Thiamin – HCl
UV: Ultraviolet (tia cực tím)
MT: Môi trường

1
LỜI MỞ ĐẦU

Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan
trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công
nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Công nghệ nuôi cấy mô tế
bào thực vật đã được du nhập vào nước ta từ những năm 1960 tại miền Nam và vào
đầu những năm 1970 tại miền Bắc. Tuy nhiên chỉ từ cuối những năm 1980 trở lại
đây công nghệ mô - tế bào mới phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng, nhiều phòng
thí nghiệm, nghiên cứu đã được xây dựng và triển khai ở hầu khắp các tỉnh thành
trong cả nước. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là
lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật đang không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác
chọn tạo và nhân giống cây giống. Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào
việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao mang tính cạnh tranh
trên thị trường quốc tế.
Nhiều loài hoa qu được phục tráng nhằm bảo tồn giống. Như các loài hoa khác,
hiện nay hoa lan đã được phục hồi rất nhiều chủng loại. Không chỉ bởi vì bảo quản
nguồn giống mà bản thân hoa lan cũng mang lại nhiều lợi ch như làm cảnh, chiết
xuất dược liệu, làm thuốc,
Trên thị trường hiện nay, bên cạnh những loài hoa truyền thống, hoa lan ngày
càng được ưa chuộng bởi vẻ hiện đại, sang trọng, ưu điểm lâu tàn, hương thơm đặc
biệt, đa dạng mà hầu như không có loại hương liệu nhân tạo nào sánh được.
Lan Gấm (Anoectochilus sp) ngoài những ưu điểm trên, nó còn có giá trị y học
và tiềm năng kinh tế rất lớn.
Việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan Gấm được triển khai sẽ cung cấp
những cơ sở khoa học và thực tiễn nhằm mục đch đáp ứng nhu cầu về số lượng
cũng như chất lượng cây giống loài lan này cho thị trường trong nước và ngoài

nước.

2
PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU
1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Sự phát triển của y học cổ truyền đặc biệt là Đông y Trung Quốc đã khiến cho
lan Gấm Anoectochilus formosanus trở thành một loài dược liệu quý, đặc biệt
Anoectochilus formosanus Hayata là loài có giá trị dược liệu và thương mại cao trên
thế giới. Để đáp ứng nhu cầu sử dụng, Trung Quốc đầu tư phát triển nền công
nghiệp Anoectochilus. Với nhu cầu nguyên liệu lớn, Trung Quốc tận thu nguồn lan
Gấm từ các nước trong khu vực mà chủ yếu ở Việt Nam.
Năm 2011, trên những cánh rừng Tây Nguyên, người dân kéo nhau đi săn tìm
cây lan Gấm để bán cho thương lái Trung Quốc. Chỉ trong thời gian ngắn loài lan
này đã có nguy cơ biến mất khỏi Việt Nam nếu như các cơ quan chức năng không
vào cuộc khôi phục lại nguồn giống. Năm 2007, lan Gấm được đưa vào Sách Đỏ
Việt Nam, xếp hạng EN A1a, c, d.
Tài liệu nghiên cứu của Đài Loan cho biết, đây là loài cây qu giá có tác dụng
tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, chữa trị vết thương do rắn độc cắn.
Có tính kháng khuẩn, chữa bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính. Ngoài ra còn
dùng chữa thần kinh suy nhược, ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy thận, di tinh,
đau lưng, phong thấp, tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt. Dùng cây (khô, tươi) nấu nước
uống chữa đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt cao, tăng huyết áp, liệt
dương, rối loạn chức năng gan, lá lách và bệnh ung thư…[1]
Nhờ quý hiếm và có tnh dược liệu quý nên giá cây lan Gấm tươi được bán trên
thị trường thế giới từ 200 - 300 USD/kg (thân, rễ, lá, hoa). Cây khô có giá từ 3.200
USD/kg, nếu thu hái trong tự nhiên giá cao gấp 3 lần. Trung Quốc, Đài Loan, Nhật
đã trồng và xuất khẩu lan Gấm mang lại nguồn thu lớn. Tiềm năng sản xuất và xuất
khẩu cây lan Gấm rất lớn nếu được đầu tư đúng mức.[1]
Ở Việt Nam do việc khai thác quá mức mà loại lan này gần như cạn kiệt ngoài tự
nhiên. Chnh vì thế để đáp ứng được nhu cầu giống với số lượng lớn của thị trường

người ta áp dụng nhân giống bằng nuôi cấy mô.
Nhận thức được vấn đề và góp phần đáp ứng nhu cầu thực tiễn chúng tôi thực

3
hiện đề tài “Vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata”.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Nhân được số lượng lớn cây lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata, cây
khỏe và phát triển tốt trong điều kiện in vitro.
1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là lan
Gấm Anoectochilus formosanus Hayata do
Viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Ch
Minh cung cấp.
Phạm vi nghiên cứu của đề tài là xây
dựng quy trình nhân giống lan Gấm từ mẫu
cây con in vitro. (Cây in vitroTái sinh
chồi  Nhân chồi Ra rễ  Cây con )
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô trường Đại học Lạc
Hồng.
Hình 1.1: Lan Gấm Anoectochilusformosanus Hayata
1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tổng quan tài liệu
Thực nghiệm
Bố trí thí nghiệm
Nuôi cấy mô thực vật
Phân tích và xử lý số liệu thống kê
1.5. KẾT CẤU CỦA ĐỀ TÀI
Gồm các chương mục và nội dung sơ lược của chương mục.
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4
PHẦN II: NỘI DUNG
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô [2]
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật đưa một mô, bộ phận hoặc tế bào của
thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có kiểm soát về: thành phần chất khoáng,
điều hòa sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm
để mô, bộ phận đó sinh trưởng, phát triển theo mục đch của người nuôi cấy. Kỹ
thuật này dựa trên hai nguyên tắc sau:
1.1.1.1. Tính toàn năng của tế bào
Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng
phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
Năm 1922 con người đã nuôi được đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa
thảo trong 12 ngày. Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào được chứng
minh bằng thực nghiệm. Sau 43 năm (năm 1965), đã nuôi từng tế bào riêng biệt của
cây thuốc lá và tạo được cây thuốc lá hoàn chỉnh trong ống nghiệm. Kết quả này
chứng minh đầy đủ tnh toàn năng của tế bào.
1.1.1.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào
đó. Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế
bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay
trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó
gọi là quá trình phản biệt hóa. Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả
năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác

nhau. Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó thì càng khó xảy ra
quá trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật,
tế bào thần kinh động vật. Người ta đã kết rằng: những tế bào càng gần với trạng
thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.

5
Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế
bào của cơ quan sinh sản rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa. Vì vậy nói một cách
hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ
quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn
xuống gốc. Các tế bào động vật nói chung khó nuôi cấy hơn do chúng đã được biệt
hóa quá sâu sắc và vì thế quá trình phản biệt hóa rất khó thực hiện.
1.1.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro [3]
1.1.2.1. Nuôi cấy đốt thân
Sử dụng mẫu cấy là một đoạn thân ngắn có chứa chồi ngủ.
Chồi này được kch thch tăng trưởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá
được hình thành.
Tiếp tục cấy chuyền trên môi trường dinh dưỡng thích hợp đến khi đủ số lượng
cần thiết để chúng được cảm ứng ra rễ trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển
ra trồng trong đất.
1.1.2.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh trưởng, chồi đỉnh, chồi bên, có kch thước khoảng
0.58 – 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi
cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo
thành một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích
thch sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh.
1.1.2.3. Gieo hạt in vitro
Hạt giống lan Gấm gieo trên môi trường nền có bổ sung các chất hữu cơ, hạt
giống sẽ nảy mầm sau 4 tháng nuôi cấy.
Cấy chuyển sang môi trường thch hợp có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng,

sau 4 tháng cấy chuyển qua môi trường tạo cây hoàn chỉnh.
Khi cây được 10 tháng tuổi, chuyển cây lan Gấm in vitro ra trồng trong khay
ngoài vườn ươm có hệ thống làm mát (cooling pad hoặc phun sương).

6
Để nâng cao tỉ lệ nảy mầm của hạt lan gấm, hiện nay người ta dùng nấm
Rhizoctonia cộng sinh với hạt, đã làm tăng tỉ lệ nảy mầm lên 80% trong môi trường
OMA, gồm bột yến mạch, dịch chiết nấm men và agar.
1.1.3. Các bước nhân giống in vitro [4]
Để nhân giống được một cây con hoàn chỉnh có khả năng thch ứng với môi
trường tự nhiên bằng phương pháp nhân giống in vitro thì trải qua 4 bước:
Tạo thể nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro
Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Chuyển cây in vitro ra vườn ươm.
1.1.3.1. Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đch tạo thể nhân
giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi và thể cắt đốt, ngoài ra còn
có thể giò. Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên
của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người
ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống
trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA
3
và các chất hữu cơ khác.
1.1.3.2. Nhân giống in vitro
Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đch tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi
cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với
quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng
sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được

duy trì trong thời gian vô hạn.
1.1.3.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển
ra ngoài vườn ươm. Cây con phải mạnh khỏe nhằm nâng cao sức sống khi ra ngoài
môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các
chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy

7
ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro.
Thường dùng các chất thuộc nhóm Auxin kích thích ra rễ.
1.1.3.4. Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro
được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi
chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn cây con dễ bị mất nước,
mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ
chiếu sáng thấp, nhiệt độ không kh mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy
trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày
đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo thành trong
quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý
với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ.
1.1.4. Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nhân giống in vitro [4]
1.1.4.1. Ưu điểm
So với các phương pháp nhân giống khác thì phương pháp nhân giống in vitro
có một số thuận lợi là:
Những cây nhân giống in vitro đồng nhất về di truyền.
Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây
như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn… mà
ngoài tự nhiên không thể thực hiện được.
Hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian
ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại.

Được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, cây khỏe mạnh, sạch virus thông
qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như
nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm
Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.
Tạo dòng toàn cây cái hoặc toàn cây đực theo mong muốn.
Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen.

8
Ngoài ra, phương pháp vi nhân giống còn giảm được nhiều công sức chăm
sóc, nguồn mẫu dữ trữ lâu dài và chiếm ít thời gian so với phương pháp nhân giống
truyền thống.
1.1.4.2. Hạn chế
Hạn chế chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất
cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây
trồng có giá trị kinh tế hoặc quí hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu
thương mại hoặc bảo tồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy mô và
tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo.
Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết,
ghép và nhân giống bằng hạt.
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác
với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không
giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu
nhân giống, nhưng sau đó có chiêu hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm
lượng các chất kch thch sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu  khắc
phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền.
1.1.5. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô [5]
1.1.5.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản
Nuôi cấy mô đã sớm mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản

chất của sự sống.
Thông qua nuôi cấy mô và tế bào chúng ta đã tiến hành so sánh đặc tính của cơ
thể và các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể. Thực tế đã chứng minh là
cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó là nhóm tế bào không
chuyên hóa gọi là mô sẹo và từ mô sẹo có thể kích thích thành cây hoàn chỉnh.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô chúng ta có thể tiến hành tìm hiểu và nghiên
cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ vì vậy mà bệnh lý sẽ được giải
quyết một cách cơ bản.

9
1.1.5.2. Về mặt thực tiễn sản xuất
Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng giống và nhân nhanh
giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy mô còn
có triển vọng sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học. Bằng phương pháp nuôi
cấy mô sau một thời gian có thể tạo thành một sinh khối lớn các hoạt chất: alkaloic,
glycoside, các steoid, các chất dính dùng trong thực phẩm.
Những lợi ích trong nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp:
Kiểm soát được dịch bệnh hại cây trồng, ta có thể loại bỏ được những cá thể
nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh.
Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống
đem vào sản xuất.
Kiểm soát được từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch.
Tạo sự đồng loạt về giống, cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu
hoạch.
Làm tăng năng suất chất lượng cao giúp tiêu thụ nhanh và đem lại thu nhập
cao.
1.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY [6]
1.2.1. Một số loại môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô
Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành công
của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu gen, các kiểu

nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt
phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường. Khi bắt đầu nuôi
cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên
cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Một số môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô như:
Môi trường Murashige và Skoog (1962) (môi trường MS).
Môi trường Lloyd và McCoown (1981) (môi trường WP).
Môi trường White (1954) (môi trường W).
Môi trường Nitsch (1951).

10
Môi trường Gamborg, Miller và Ojima (môi trường B5).
Môi trường Schengk và Hilderbrant (1972) (môi trường SH).
Môi trường Nitsch và Nitsch (1969).
Môi trường Ahuja’s Aspen Culture (1983).
Môi trường Chu (1975).
Môi trường Knop (1884).
Môi trường Knudson C (1946).
Môi trường Heller (1953, 1955).
Môi trường Vacin và Went (1949).
1.2.2. Thành phần hóa học của các môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy phải cung cấp các nguyên tố quan trọng và dinh dưỡng cần
thiết cho sự phát triển của cây in vitro. Sự lựa chọn hay phát triển môi trường nuôi
cấy là một bước quan trọng trong bất cứ đề tài nuôi cấy mô tế bào nào.
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một
số thành phần cơ bản sau:
Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Các vitamin
Các amino acid
Nguồn carbon: một số loại đường

Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai
tây,
Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại thạch (agar)
Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự
sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.
Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn
môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:
Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về
thành phần môi trường.

11
Mục đch nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô
sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân
giống…)
Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…)
1.2.2.1. Các chất khoáng
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng.
Nguyên tố đa lượng bao gồm N, P, K, Mg, S và Ca. Các nguyên tố đa lượng này
thường tồn tại ở dạng muối và tồn tại trong dung dịch. Đây là nguyên liệu để những
tế bào hình thành nên cấu trúc của mình.
Nguyên tố vi lượng điển hình thường sử dụng như các nguyên tố Fe, Cu, Zn,
Mn, Bo, I, Co. Nhờ các nguyên tố vi lượng này mà cây mới sinh trưởng và phát
triển bình thường. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào thành phần của enzym xúc tác
cho phản ứng sinh hóa diễn ra trong tế bào.
1.2.2.2. Các Vitamin
Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các
loài khác nhau là khác nhau.
Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin
cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng

tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Trong các loại
vitamin, B1 được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic
(B3) và pyridoxine (B6) cũng có thể được bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy
tăng cường sức sinh trưởng của mô.
1.2.2.3. Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy
Than hoạt tính: Bổ sung than hoạt tnh vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi
ích và có tác dụng khử độc. Khả năng kch thích sự tăng trưởng của than hoạt tính
là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy. Than
hoạt tnh thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5-3% (w/v).
Nước dừa: Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kch thch sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích

12
phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được sử dụng ở
nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v).
Một số hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ phức tạp: Nước cốt cà chua, dịch chiết khoai
tây nghiền, dịch chiết mạch nha, dịch chiết nấm men (yeast extract), casein thuỷ
phân (casein hydrolysate) cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo
hay cơ quan nuôi cấy.
1.2.2.4. Yếu tố làm đặc môi trường
Trong nuôi cấy mô thực vật người ta thường dùng một số vật liệu làm giá thể để
nâng đỡ mô và chồi, giữ cho cây đứng vững trong môi trường. Nguyên liệu phổ
biến nhất trong nuôi cấy mô là agar. Người ta hoà agar vào trong môi trường, làm
tan ở nhiệt độ cao (trên 60C) và làm đặc lại ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra tuỳ thuộc
từng vật liệu nuôi cấy mà người ta sử dụng các vật liệu khác làm giá thể như: giấy
lọc, vải, một số màng nhân tạo.
Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại
gelidum. Bởi vì agar là sản phẩm lấy từ tảo biển, nên nó có những tác động sinh lý
trên mô thực vật. Loại agar sử dụng để làm đông môi trường có thể ảnh hưởng đến
kết quả thí nghiệm. Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục môi trường

do các chất cặn trong agar gây nên. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra
dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60 - 100
0
C, đặc lại khi nhiệt độ còn 35
0
C vì vậy agar
ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân huỷ bởi
enzym thực vật. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ
cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường.
1.2.2.5. Các chất điều hòa sinh trưởng
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc
nhiều chất điều hòa sinh trưởng như Auxin, Cytokinin và Giberellin là rất cần thiết
để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt
cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo
loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các
chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chnh sau đây:

13
Nhóm Auxin: Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng
thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các
thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô
sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái… đặc biệt có hoạt tính cao
khi phối hợp sử dụng với các Cytokinin.
Nhóm Cytokinin: Các Cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone
liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi
trong nuôi cấy mô. Chức năng chủ yếu của các Cytokinin là kích thích phân chia tế
bào, tạo và nhân callus, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô
Nhóm Gibberellin: Trong đời sống thực vật Gibberellin đóng vai trò quan trọng
đối với nhiều quá trình sinh l của thực vật. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Gibberellin có các chức năng cơ bản như kch thch kéo dài chồi do tăng cường

phân bào và kéo dài tế bào, phá ngủ hạt giống, kiểm soát sự ra hoa của các cây 2
năm tuổi.
1.2.2.6. Các chất kháng sinh
Chất kháng sinh là chất được sản xuất bởi các loài vi sinh vật khác nhau, hoặc
làcác chất kháng sinh tổng hợp. Chúng có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng của
các vi sinh vật khác và cuối cùng làm tiêu huỷ chúng.
Vai trò của các loại thuốc kháng sinh trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật:
Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy tế bào và
mô thực vật.
Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy.
Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi
môi trường và mô nuôi cấy (sau nuôi cấy, hỗn hợp Agrobacterium với tế bào thực
vật để chuyển gen hoàn thành).
Sử dụng kháng sinh trong môi trường chọn lọc để chọn các tế bào hoặc mô
đã được chuyển gen (mang gen chỉ thị kháng kháng sinh). Các tế bào không được
chuyển gen sẽ bị chết trong môi trường có kháng sinh ở nồng độ thích hợp.

14
1.2.3. Độ pH môi trường
Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi
cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết
của th nghiệm. Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,8 - 6,0 trước khi
khử trùng. Nhìn chung nếu độ pH cao hơn 6 sẽ làm môi trường bị cứng và nếu thấp
hơn 5 thì agar khó đông.
1.3. TỔNG QUAN VỀ LAN GẤM
1.3.1. Tình hình sản xuất [7]
Theo y học cổ truyền Đài Loan, A. formosanus Hayata tươi hoặc khô nấu nước
uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp
cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực (Lin và Wu 2007). Đại
học Công nghệ Y dược và Cao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan đã sử

dụng A. formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ thể
và kháng virus cúm A. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện A. formosanus Hayata chứa
hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch. Dịch
chiết A. formosanus Hayata có khả năng kháng virus, kháng sung viêm và bảo vệ
gan. Chiết xuất của cây A. formosanus khô có chứa 4-hydroxycinnamic acid, β-
sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid (Takatsuki,S., 1992).
Trung Quốc, Đài Loan, Nhật đã trồng và xuất khẩu lan Gấm mang lại nguồn thu
lớn.
Sau hơn hai mươi năm nghiên cứu, đầu tư và phát triển, lan Gấm dần trở thành
đặc sản của Đài Loan. Đài Loan trở thành nơi cung cấp giống chất lượng cao và
chuyển giao công nghệ cho các thành phố khác của Trung Quốc, cũng như các nước
trong khu vực.
Nam Kinh với hàng trăm công ty sản xuất lan Gấm với giá trị sản lượng hàng
năm trên sáu trăm triệu đô la Mỹ.
Phúc Kiến đã đầu tư 160 triệu nhân dân tệ cho việc xây dựng các nghiên cứu và
phát triển nuôi cấy mô, trồng trọt, sản xuất, chế biến và khai thác với sản lượng
hàng năm là 5 tỷ cây. [19]

15
Tiềm năng sản xuất và xuất khẩu cây lan Gấm rất lớn nếu được đầu tư đúng
mức. Việt Nam đã tìm thấy 15 loài lan Gấm phân bố rải rác tại Kon Tum, Cúc
Phương, Kẻ Bàng, Lai Châu, Tam Đảo, Sapa… Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có
nghiên cứu đánh giá nào về mặt dược liệu. Vài năm gần đây, nhiều người dân một
số tỉnh Tây Nguyên đã và đang tìm kiếm, tận thu cây lan Gấm bán cho thương lái
đưa qua Trung Quốc, nhiều học sinh thôn bản nghỉ học săn tìm vì mức giá hấp dẫn,
giá thu mua ban đầu 600.000 đồng/kg tăng lên vài triệu đồng/kg. Bị săn tìm quá
mức, loại lan này gần như cạn kiệt ngoài tự nhiên.
Nhận thức được tiềm năng, giá trị kinh tế của loài lan này, Công ty CP công
nghệ cao Bắc Nam đang xúc tiến đầu tư trồng lan Gấm theo hướng dược liệu tiêu
thụ nội địa và xuất khẩu, hiện đã hoàn thành quy trình nhân giống và chuẩn bị triển

khai sản xuất quy mô công nghiệp. Các địa bàn tiềm năng triển khai là Kon Tum,
Lâm Đồng…
Cây lan Gấm sau thu hoạch có thể xuất khẩu ở dạng thô, sản phẩm gồm thân, rễ
và lá phơi khô xuất khẩu cho các nước chế biến trà dược, thực phẩm chức năng,
thạch lan và đặc biệt là chiết xuất chất 3(R)-3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide
để từ A. formosanus và A. koshunensis để sản xuất biệt dược kinsenoside chữa trị
tăng huyết áp.

Hình 1.2: Các dạng sản phẩm lan Gấm thô và lan Gấm chế biến
1.3.2. Nhu cầu thị trường lan

16
Ở Việt Nam, lan Gấm là một vị thuốc Đông y có vị ngọt, hơi chát, tnh mát.
Có tác dụng tư âm nhuận phế, thanh nhiệt lương huyết nhưng không thông dụng,
chủ yếu được săn tìm làm cảnh. Giới sành lan xem lan Gấm như một loài lan cảnh
phong thủy, xua đuổi tà ma trong nhà và có thể chữa bách bệnh. Vì thế, cây này
đang từ vài chục đến vài trăm nghìn/cây thành món hàng độc được "săn" với giá rẻ
nhất là 1 triệu đồng/cây.
Vài năm trở lại đây, với nhu cầu sử dụng dược phẩm từ thiên nhiên, lan Gấm
được xem như loài thảo dược quý, có giá trị thương mại cao trên thế giới. Trung
Quốc, Đài Loan, Nhật đã trồng và xuất khẩu lan Gấm mang lại nguồn thu lớn. Nước
ta có tiềm năng trồng, sản xuất và xuất khẩu cây lan Gấm rất lớn nhưng chưa được
đầu tư đúng mức.
1.3.3. Nguồn gốc và kỹ thuật trồng lan
1.3.3.1. Vị trí phân loại [14]
Giới: Plantae
Ngành: Anggiospermatophyta
Lớp: Monocotyiedoneae
Bộ: Asparagales
Họ: Orchidaceae

Chi: Anoectochilus
Hình 1.2: Lan Gấm
1.3.3.2. Nguồn gốc và phân bố [8]
Cây lan Gấm (Anoectochilus sp) còn gọi là cây Kim cương, Kim tuyến, Mộc sơn
thạch tùng, thuộc họ Orchidaceae, gồm bốn chi: Ludisia, Anoectochilus, Goodyera,
Macodes và trên 50 loài. Trong đó chi Anoectochilus có số loài phong phú nhất (30-
40 loài) và loài có giá trị dược liệu và thương mại cao trên thế giới hiện nay là
Anoectochilus formosanus Hayata. Loài này được phát hiện ở Srilanka, Malaysia,
Ấn Độ, Nhật Bản, Nam Trung Quốc, Australia và quần đảo Nam Thái Bình Dương.
Việt Nam đã tìm thấy 15 loài lan Gấm phân bố rải rác tại Kon Tum, Cúc
Phương, Kẻ Bàng, Lai Châu, Tam Đảo, Sapa, Lâm Đồng…

17
1.3.3.3. Đặc điểm hnh thái
Thân cây thuộc loại địa lan thân bò rồi đứng cao khoảng 20 cm, thân tròn có
nhiều nách, màu tm, mọng nước, phần cây non có nhiều lông mềm, mang 2-6 lá
mọc cách, xòe trên mặt đất.
Lá hình trái xoan hoặc hình trứng, gần tròn ở gốc và nhọn ở đầu, dài 3–4 cm và
rộng 2 – 3 cm, trên mỗi chiếc lá có 3 - 5 sọc gân dọc. Mặt trên màu nâu sậm có vệt
vàng ở giữa và mạng gân màu hồng nhạt, mặt dưới màu nâu nhạt. Cuống lá dài 2
3 cm, gốc cuống tạo thành bẹ lá ôm lấy thân.
Hoa mọc thành từng cụm, với cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 5 - 10 hoa màu
hồng phủ lông đỏ, dài 2,5 cm với cánh môi dài 1,5 cm mang 6-8 ria mỗi bên, đầu
môi chẻ thành 2 thùy thuôn đầu tròn. Bầu dài 13 mm, có lông thưa [17].
1.3.3.4. Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến lan Gấm [9]
Ánh sáng: Lan Gấm cần nhiều ánh nắng, nhưng phải che lưới để phòng bị cháy
lá. Nhiều ánh sáng sẽ dễ ra hoa, có nhiều hoa hơn và mầu sắc sẽ trung thực hơn,
thiếu ánh sáng sẽ làm cho hoa nhạt đi.
Nhiệt độ: Lan Gấm cần nhiệt độ thay đổi ngày nóng, đêm lạnh. Ban ngày 27-
32°C, ban đêm 10-15°C. Lan có thể chịu nóng tới 38°C và lạnh tới -1°C miễn là

không đóng băng, ngoài ra nếu không có sự cách biệt giữa ngày và đêm tối thiểu từ
13-16°C, hầu như lan sẽ không ra hoa.
Nước: Tưới nước mỗi tuần một lần, nhưng mùa hè cần tưới nhiều hơn, có thể
tưới 2-3 lần tùy theo địa phương, không nên để cây bị thiếu nước lúc cây đang phát
triển, khi cây đã ngưng tăng trưởng bớt tưới nước, nhưng đừng để cây bị khô rễ, sẽ
làm cho cây bị khựng lại, và có thể sẽ không ra hoa.
Độ ẩm: Từ 40-70%, mùa hè cần tưới nước xuống giá thể hay phun sương vào
buổi sáng hay chiều để tăng thêm độ ẩm.
Giá thể: Giá thể thoáng nhưng vẫn giữ ẩm tốt như xơ dừa, vỏ thông….
Phân bón: Khi mùa phát triển cho cây con, cần bón phân 30-10-10 mỗi tuần một
lần, chỉ dùng ¼ của công thức của nhà sản xuất để tránh cây bị cháy lá. Khi cuối
tháng 8 dùng phân bón 6 – 30 -30 hay 10 – 52 - 10, cuối tháng 11 ngưng tưới phân,

18
chỉ tưới nước thường, tưới thêm phân sẽ làm cho nụ hoa bị nóng có thể bị rụng hay
bị có tật.
Thay chậu: Trung bình 2 - 3 năm nên thay chậu một lần - nếu trồng bằng vỏ
thông, 4 - 5 năm một lần - nếu trồng bằng vỏ dừa.
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ NUÔI CẤY LAN GẤM
1.4.1. Trên thế giới
Hơn một thập niên trở lại đây, Đài Loan xem lan Gấm là thuốc quý bởi tác dụng
dược l đa dạng của nó. Việc sử dụng và khai thác quá mức đã làm cạn kiệt nguồn
lan Gấm ngoài môi trường tự nhiên, thậm chí có một số loài đứng trước bờ vực tiệt
chủng. Trước nhu cầu đó, kĩ thuật nuôi cấy mô lan Gấm nở rộ để đáp ứng nhu cầu
của thị trường.
Năm 1992, Chen ZY và cộng sự nghiên cứu cho thấy môi trường thích hợp ra rễ
lan Gấm là môi trường ½ MS, 0,7 μg/l NAA, 30 g/l sucrose, 6,5 g thạch/l, pH 5,5.
Bổ sung BA, IBA và zeatin có thể thúc đẩy sự hình thành và phát triển chồi. Nồng
độ BA 1,0-2,0 μg/l, IBA 0,5-0,7 μg/l chồi phát triển tốt nhất. Nếu bổ sung thêm 0,1-
0,5 μg/l zeatin, chồi hình thành và phát triển thuận lợi hơn.[14]

Năm 1993, Ninh Hạ Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Đài Loan đã nhân
giống thành công lan từ hạt và thân trong điều kiện in vitro.
Năm 1997, Fan Zinan và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tnh đối
với sự phát triển rễ của lan Gấm, kết quả cho thấy bổ sung 0,2% than hoạt tính giúp
rễ phát triển tốt, lão hóa chậm. [16]
Năm 2003, Ling-Chin Chou và Doris Chi-Ning Chang thực hiện thành công kĩ
thuật dùng nấm Rhizoctonia cộng sinh với hạt để tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt trên
môi trường OMA, gồm yến mạch, nấm men và agar.[17]
Đến năm 2005, Wang Yaying, Linrong Yao đã chỉ ra nếu bổ sung 3,5 ppm BA,
0,5 mg/l KT, 0,2 ppm NAA vào môi trường ½ MS là tốt nhất cho sự phát triển rễ
lan Gấm. [18]
Nhiều công trình nghiên cứu đã xác định được hoạt tính của các thành phần hóa
học có trong lan Gấm.

19
Cho đến nay ngành công nghiệp Anoectochilus đã phát triển mạnh mẽ ở Trung
Quốc.
Sau hơn hai mươi năm nghiên cứu, đầu tư và phát triển, lan Gấm dần trở thành
đặc sản của Đài Loan. Đài Loan trở thành nơi cung cấp giống chất lượng cao và
chuyển giao công nghệ cho các thành phố khác của Trung Quốc, cũng như các nước
trong khu vực.
Nam Kinh với hàng trăm công ty sản xuất lan Gấm với giá trị sản lượng hàng
năm trên sáu trăm triệu đô la Mỹ.
Phúc Kiến đã đầu tư 160 triệu nhân dân tệ cho việc xây dựng các nghiên cứu và
phát triển nuôi cấy mô, trồng trọt, sản xuất, chế biến và khai thác với sản lượng
hàng năm là 5 tỷ cây. [19]
1.4.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, hơn một thập niên trở lại đây lan Gấm mới được chú ý nhân giống
và trồng thử nghiệm ở một số vùng như Lâm Đồng, Kom Tum….
Năm 2011, Trung tâm sinh học thực nghiệm, Viện Ứng dụng công nghệ đã nhân

giống in vitro thành công cây dược liệu lan Gấm thuộc Sách đỏ Việt Nam.
Cây giống lan Gấm có thể tạo từ nhân in vitro các nốt thân, hạt giống và các bộ
phận sinh dưỡng của cây. Tuy nhiên sự sinh trưởng các của cây lan Gấm in vitro
chậm, kéo dài thời gian nhân giống. Hiện nay nhiều nước chủ yếu sản xuất cây lan
Gấm từ nuôi cấy hạt in vitro.
Các trường Đại học như Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh, Đại học
khoa học tự nhiên Hà Nội, Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã có những kết quả
nghiên cứu về lan Gấm như:
Đề tài: “Ảnh hưởng của agar và một số chất điều hòa sinh trưởng trong môi
trường vi nhân giống đến sinh trưởng, phát triển cây lan Gấm (Anoectochilus
formosanus Hayata” [11] đưa ra kết quả:
Ở hầu hết các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển chồi lan Gấm trên cả hai môi
trường nền có bổ sung BA và TDZ cho thấy có agar tốt hơn không có agar.
Nồng độ BA 2,0 ppm và TDZ 1,5 ppm trên môi trường MS có agar là tốt