Nghiên cứu điều chế mangosteen hỗn hợp các xanthon của vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) và thử tác dụng kháng vi khuẩn của mangosteen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
**************************




NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ MANGOSTEEN “ HỖN HỢP
CÁC XANTHON” CỦA VỎ QUẢ MĂNG CỤT VÀ THỬ TÁC
DỤNG KHÁNG VI KHUẨN CỦA MANGOSTEEN


HƯỚNG DẪN: PGS.TS. HÀ HUY KẾ
TS. PHAN QUỐC KINH
NGƯỜI THỰC HIỆN: LÊ THỊ THANH THANH
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT
KHÓA: 14



LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC




Hà Nội – 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây măng cụt có tên khoa học là Garcinia mangostana L., thuộc họ
Bứa Clusiaceae (Guttierae), là loài cây ăn quả nhiệt đới rất quen thuộc ở
Đông Nam Á. Cây măng cụt còn có tên khác là Giáng Châu, Sơn Trúc Tử ,
người phương Tây gọi quả măng cụt là “ Nữ hoàng của trái cây ” (Queen of
fruits)… Ở nước ta măng cụt được trồng nhiều ở các tỉnh miền Đông Nam
Bộ và đồng bằng sông Cửu Long, một số ít được trồng ở miền Trung. Măng
cụt hiện được trồng nhiều tại Thái Lan, Campuchia, Myanmar, Sri Lanka và
Philippin.
Từ lâu nền y học cổ truyền Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ đã sử dụng vỏ
quả măng cụt để chữa bệnh tiêu chảy, bệnh lỵ, đau bụng, bệnh vàng da,
…[1], [3], [6]. Nhiều nghiên cứu cho thấy quả măng cụt chứa các hydroxy,
prenyl xanthon, flavonoid, triterpenoid. Các hợp chất này thể hiện hoạt tính
kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, kháng virut, chống ôxy hoá, giảm
đau [8] … Những nghiên cứu mới nhất cho thấy hoạt chất chứa trong vỏ quả
măng cụt gây độc rất mạnh cho dòng tế bào ung thư gan, ung thư vú, ức chế
tế bào ung thư máu HL60 của người [29], kháng được vi khuẩn Helicobacter
pylori (Hp) gây viêm loét dạ dày và kháng virut HIV. Khi được sử dụng với
liều cao để đắp ngoài da của chuột, không gây phản ứng phụ, trị được mụn
và vết thương lành rất nhanh [42]. Nhiều nghiên cứu cho thấy có rất nhiều
chất chống lão hoá, trong đó có khoảng 200 loại mạnh nhất được gọi là
xanthon, và các nhà nghiên cứu y khoa đã tìm thấy khoảng 40 dẫn xuất
xanthon tồn tại trong vỏ quả măng cụt. Trong đó, hoạt chất được nghiên cứu
nhiều nhất là mangosteen (có chứa α–mangostin; β–mangostin và γ–
mangostin). Hiện nay trên thế giới các hoạt chất của vỏ quả măng cụt được
sử dụng rộng rãi với nhiều sản phẩm có chứa mangosteen ở dạng thực phẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

chức năng như: mangosteen capsules, xanthon juice (nước ép) … Ở Việt
Nam công ty dược phẩm Kingphar cũng đã sản xuất ra sản phẩm Kingphar

Phyma, Kingphar Codanbe, …
Từ trước tới nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình công bố về
nghiên cứu chiết xuất xác định các xanthon từ vỏ quả măng cụt như các
nhóm tác giả: Đào Hùng Cường, Đỗ Thuý Vân (2010), nghiên cứu chiết tách
và xác định xanthon [2]; Hà Diệu Ly và cộng sự (2009), cô lập xanthon có
hoạt tính kháng khuẩn [5]; Nguyễn Văn Đậu (2009), phân lập 6 xanthon từ
vỏ quả măng cụt [8]; Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2012), nghiên cứu quy trình
tách chiết α-mangostin từ vỏ quả măng cụt quy mô phòng thí nghiệm [4];
Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2003), tác dụng của dịch chiết vỏ quả
măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn sâu răng Streptococcus
mutans” [7], … Tuy nhiên các nghiên cứu này chủ yếu là các nghiên cứu
trong phòng thí nghiệm, chưa thấy có tài liệu nào ở Việt Nam công bố về
nghiên cứu chiết xuất mangosteen (có chứa các xanthon) ở quy mô công
nghiệp, để phục vụ cho việc sản xuất các thực phẩm chức năng, trong hoàn
cảnh trang thiết bị chiết xuất ở các nhà máy của Việt Nam vẫn đang ở quy
mô thủ công, chưa được hiện đại hoá. Luận văn này nhằm góp phần nghiên
cứu quy trình sản xuất mangosteen “hỗn hợp các xanthon” dựa vào các dung
môi có sẵn ở Việt Nam, rẻ tiền và không dễ cháy nổ. Quy trình chiết xuất
bằng ngâm kiệt, an toàn hơn quy trình chiết xuất bằng các dung môi hữu cơ
dễ cháy khi gia nhiệt và giá thành các dung môi hữu cơ này rất đắt. Luận văn
này chủ yếu tập trung nghiên cứu phương pháp chiết xuất bằng soxhlet để
nghiên cứu hàm lượng mangosteen có trong vỏ quả măng cụt và chiết tách
xác định các xanthon chính có trong mangosteen và thử hoạt tính kháng sinh
với vi khuẩn thường gặp ở Việt Nam là Staphylococus aureus. Trên cơ sở đó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

sẽ sử dụng phương pháp ngâm kiệt chiết bằng ethanol 95
o
, để có thể sản xuất
mangosteen ở Việt Nam với giá thành rẻ và với quy trình tương đối an toàn.

Với mục đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu điều chế
mangosteen “hỗn hợp các xanthon” của vỏ quả măng cụt (Garcinia
mangostana L.) và thử tác dụng kháng vi khuẩn của mangosteen” với mục
tiêu:
- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất mangosteen từ vỏ quả măng cụt
bằng phương pháp đơn giản nhất để có thể dễ dàng đưa vào sản xuất
trên quy mô lớn.
- Thử tác dụng kháng khuẩn của mangosteen và α-mangostin đối với
loại vi khuẩn thường gặp ở Việt Nam là Staphylococus aureus ở các
nồng độ mangosteen và α-mangostin khác nhau.









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về măng cụt
1.1.1. Giới thiệu tổng quan về măng cụt
Măng cụt có tên khoa học: Garcinia mangostana L., thuộc họ Bứa
Clusiaceae (Guttiferae). Tuỳ theo từng quốc gia măng cụt cũng có nhiều tên
gọi khác nhau: mangosteen (Anh, Mỹ), mangoustanier (Pháp), Sơn trúc tử
(Trung Quốc), mangostán (Tây Ban Nha), manggis (Indonesia, Malaysia),
mangkhut (Thái Lan, Lào), … Tên La - tinh: Garcinia mangostana, tên
“Garcinia” để ghi nhớ nhà thực vật học Laurence Garcia, người đã sưu tập

các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn Độ vào thế kỷ 18, “mangostana” và tên tiếng
Anh là mangosteen đều xuất phát từ tên Mã lai là “mangustan”.
1.1.1.1. Nguồn gốc và phân bố
Cây măng cụt có nguồn gốc từ Mã Lai và Indonesia, được trồng từ
hàng chục thế kỷ. Ngày nay bắt gặp khắp Đông Nam Á, Ấn Độ, Myanma
cũng như ở Sri Lanka, Philippine, được các nhà truyền giáo đạo Gia tô di
thực vào miền Nam Việt Nam, như ở các tỉnh Tây Ninh, Gia Định. Hiện nay
măng cụt chủ yếu được trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (Cần Thơ,
Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang, Kiên Giang, Bình Dương, Cà Mau, Trà
Vinh, …) với tổng diện tích lên tới gần 5000 ha, cho sản lượng khoảng 4500
tấn/năm. Theo dự án phát triển sản xuất và xuất khẩu rau, hoa quả tươi của
Việt Nam, dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt ở vùng đồng bằng
sông Cửu Long lên khoảng 11300 ha, cho sản lượng 24000 tấn/năm. Cây
măng cụt đòi hỏi điều kiện thổ nhưỡng khắc khe, khí hậu nóng và ẩm, vì vậy
cây măng cụt chủ yếu được trồng nhiều ở miền Nam Việt Nam, không tiến
xa ra vùng khí hậu lạnh ở miền Bắc mà chỉ dừng lại ở Huế [3].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Hình 1. Vùng trồng nhiều măng cụt ở Việt Nam
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Măng cụt là loại cây to, cao trung bình 7 – 12m, nhưng cũng có thể
cao đến 20 – 25m. Thân có vỏ màu nâu đen sậm, có nhựa màu vàng. Lá dày,
dai và cứng, bóng, mọc đối, màu lục sẫm, mặt trên của lá có màu sậm hơn
mặt dưới, hình thuôn dài 15 – 25cm, rộng 6 – 11cm, cuống dài 1 – 2cm. Hoa
đa tính thường là hoa cái và hoa lưỡng tính. Hoa mọc đơn hay từng đôi. Quả
hình cầu tròn, đường kính khoảng 4 – 7cm, vỏ quả màu đỏ tím, dày và xốp,
trong đỏ tươi như rượu vang, phía dưới có lá đài, phía đỉnh có đầu nhuỵ.
Quả chứa 5 – 8 hạt, quanh hạt có lớp áo bọc màu trắng, ăn ngọt, thơm ngon.

Mỗi quả trung bình nặng 60 – 80g [3], [6].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Theo kinh nghiệm của những người trồng măng cụt thì sau khi trồng 5
năm, măng cụt mới ra hoa và kết quả. Năm đầu chỉ được 15 – 20 quả/cây,
sau 10 năm thu được từ 350 – 500 quả/cây, sau 15 năm có thể thu được 1000
– 1500 quả/cây. Cây trổ hoa vào tháng 2 – 5, ra quả trong các tháng 5 – 8.

Hình 2. Hình ảnh quả măng cụt
1.1.1.3. Thành phần hoá học
Lá cây chứa protein (7,8%), tanin (11,2%), các xanthon (1,6–
dihydroxy–3–methoxy–2–isoprenyl xanthon; gartanin; 1,5,8–trihydroxy–3–
methoxy–2-isoprenyl xanthon), ethyl methyl maleimid glucopyranosid [16],
cùng những triterpenoid như cycloartenol, friedlin, α–sitosterol, betulin,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

mangiferadiol, mangiferolic acid, cyclolanostendiol, hydroxy
cyclolanostenon [35].
Vỏ quả là phần được nghiên cứu nhiều nhất, nó chứa khoảng 40
xanthon (Phụ lục 2) [25]. Thành phần chính là những xanthon như α–
mangostin, β–mangostin, γ–mangostin, isomangostin, trioxyxanthon,
pyranoxanthon, dihydroxy methyl butenyl xanthon, trihydrroxy methyl,
butenyl xanthon, pyrano xanthenon [18], [23], [41]. Những garcinon A, B,
C, D, E; mangostinon; garcimangoson A, B, C; gartanin; egonol;
epicatechin; procyanidin từ măng cụt nguồn gốc Việt Nam, benzophenon
glucosid với hàm lượng ít và vỏ quả chứa 7 – 13% tanin [3].
Một vài nghiên cứu xác định thành phần hoá học của ruột thân cây
của măng cụt gồm tetrahydroxy xanthon và dẫn xuất O-glucosid,
pentahydroxy xanthon, maclurin [17]. Vỏ cây cũng là bộ phận chứa nhiều
xanthon khác nhau (Phụ lục 3) [25]. Ngoài ra trong thịt quả măng cụt có

nhiều thành phần dinh dưỡng khác (Bảng 1) [25].
Bảng 1. Thành phần dinh dưỡng trong thịt quả măng cụt

Các thành phần
Hàm lƣợng
Fructose
2,4%
Sucrose
10,0%
Glucose
2,2%
Maltose
0,1%
Lactose
< 0,1%
pH
3,52
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Độ ẩm
80,69%
Protein
0,50%
Chất xơ
1,35%
Vitamin B
2

< 0,08 mg/100 g
Vitamin B

1
0,08 mg/100 g
Vitamin A/B – caroten
< 50 IU/100 g
Vitamin C
7,2 mg/100 g
Vitamin E
0,6 IU/100 g
Nitơ
0,08%
Photpho
9,21 mg/100 g
Kali
61,6 mg/100 g
Canxi
5,49 mg/100 g
Đồng
0,06 mg/100 g
Sắt
0,17 mg/100 g
Magiê
13,9 mg/100 g
Mangan
0,10 mg/100 g
Natri
6,43 mg/100 g
Kẽm
0,12 mg/100 g

1.1.2. Tổng quan về các dẫn chất xanthon

1.1.2.1. Cấu trúc
Nhân xanthon có tính đối xứng, được đánh số theo quy ước quốc tế
(danh pháp IUPAC). Nguyên tử C1 – C4 được đánh từ vòng bên phải và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nguyên tử C5 – C8 đánh ở vòng bên trái. Hệ thống đánh số được dựa trên
khung cơ bản xanthen-9 [10]. Các xanthon được phân loại thành 5 nhóm
chính: xanthon oxy hoá đơn giản, xanthon glycosid, prenyl xanthon,
xanthonolignoid và các loại khác [28].
Khung xanthon có cấu trúc tương tự khung acridon, alkakoid có nhiều
trong họ cam (Rutaceae), nhưng chúng khác nhau ở chỗ nguyên tử nitơ
trong nhân acridon được thay thế bằng nguyên tử oxy. Các acridon cũng có
màu vàng như xanthon.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.2.2. Tính chất lý hóa của α-mangostin, β- mangostin, γ-mangostin
Xanthon trong vỏ quả măng cụt được nghiên cứu nhiều là α-
mangostin, β-mangostin, γ-mangostin và gartanin:
* α-mangostin [11], [43]:
Tên khoa học: 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis-(3-methyl-2-
butenyl)-9H-xanthen-9-one; 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-di(3-methyl-2-
butenyl) xanthon.
CTPT: C
24
H
26
O
6

TLPT: 410,46
Độ chảy: 180 - 181ºC.
* β-mangostin [24]:
Tên khoa học: 1,6-dihydroxy-3,7-dimethoxy-2,8-bis-(3-methyl-2-
butenyl)-9H-xanthen-9-one; 1,6-dihydroxy-3,7-dimethoxy-2,8-di(3-methyl-
2-butenyl) xanthon.
CTPT: C
25
H
28
O
6

TLPT: 424,49
Độ chảy: 173 - 174ºC.
* γ-mangostin [24]:
Tên khoa học: 1,3,6,7-tetrahydroxy-2,8-bis-(3-methyl-2-butenyl)-9H-
xanthen-9-one; 1,3,6,7-tetrahydroxy-2,8-di(3-methyl-2-butenyl) xanthon.
CTPT: C
23
H
24
O
6

TLPT: 396
Độ chảy: 207ºC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Đặc điểm của các xanthon này là tinh thể màu vàng, dễ tan trong các

dung môi hữu cơ (alcol, ether, aceton …), không tan trong nước [3], [43].
Trong phân tử các xanthon có một tới nhiều nhóm – OH nên khi chuyển
sang môi trường kiềm phổ hấp phụ tử ngoại ở vùng 318 – 321nm được
chuyển dịch đến vùng 365 – 370nm (bathochrom).
Các xanthon có nhóm – OH tự do cũng dễ dàng bị methyl hoá bởi
dimethyl sunfat như γ-mangostin được methyl hoá thành β-mangostin, mặt
khác γ-mangostin cũng có thể điều chế được bằng phản ứng demethyl hoá α-
mangostin sử dụng piperidin làm xúc tác [24].
1.1.3. Tác dụng và công dụng của măng cụt và xanthon.
1.1.3.1. Theo y học cổ truyền
Quả măng cụt ngoài tính chất thơm ngon, nó còn được dùng nhiều để
làm thuốc. Từ lâu, ở Ấn Độ, măng cụt được kê vào nhiều thang thuốc cổ
truyền, đặc biệt chống viêm, chữa tiêu chảy, ức chế dị ứng, làm giản phế
quản trong bệnh hen suyễn [9]. Ngoài ra quả măng cụt còn xem như là
những thuốc chống dịch tả, bệnh lỵ, kháng vi khuẩn, kháng vi sinh vật,
chống suy giảm miễn dịch. Người Thái Lan dùng nó để chữa vết thương
ngoài da [35]. Người Mã Lai dùng nước sắc từ vỏ quả măng cụt chữa lỵ, đau
bụng, tiêu chảy, bệnh vàng da. Ở Việt Nam theo Đông y, vỏ quả măng cụt
có vị chua chát, có tính bình, đi vào hai kinh phế và đại tràng, có công năng
thu liễm, sáp trường, chỉ huyết, dùng trị tiêu chảy, ngộ độc thức ăn [1]. Hiện
nay ở Việt Nam, Bộ Y tế đã cho phép sử dụng hoạt chất xanthon được chiết
từ vỏ quả măng cụt vào sản xuất thuốc chữa bệnh tiêu chảy, bệnh lỵ.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.3.2. Theo y học hiện đại
Ngày nay, nền y học hiện đại đã có nhiều khám phá mới về công dụng
của măng cụt và cũng như của các xanthon, sau đây là một số công dụng
chính:

- Tác dụng chống oxy hoá: hoạt tính chống oxy hoá rất cao, chống các phần
tử gây lão hoá, giúp tinh thần thêm minh mẫn hơn [10], [13], [15], [16],
[40].
- Tăng cường sinh lực.
- Kháng vi khuẩn, kháng nấm: nhiều loại xanthon và những dẫn xuất của
chúng đã được chứng minh có đặc tính kháng nấm và kháng vi khuẩn, kể cả
những vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh ( Staphylococcus aureus,
Fusarium oxysporum vasinfectum, Dreschlera oryzae, Trichophyton
mentagrophytes, Microporum gypseum, Epidermophyton floccosum,
Mycobacterium tuberculosis…). Vì vậy, măng cụt được dùng làm thuốc
chống lại các bệnh truyền nhiễm, cải thiện được tình trạng dạ dày, tiết
niệu…[13], [15], [40].
- Chống lại các chứng viêm: chứng viêm kinh niên có thể dẫn đến đái tháo
đường type II, ung thư, thấp khớp, lãng trí, bệnh tim mạch và các căn bệnh
nguy hiểm khác. Các xanthon trong măng cụt chống lại chứng viêm ở tế bào
qua sự ngăn chặn các nhiễm thể COX 2 [10], [40].
- Ức chế sự oxy hoá của LDL, vì thế có tác động làm giảm cholesterol [45].
- Ngăn ngừa bệnh tim mạch, giảm huyết áp: bệnh tim và xơ vữa động mạch
xảy ra khi tính đàn hồi của các mạch máu quanh tim giảm đi. Măng cụt giúp
củng cố hệ thống tuần hoàn qua khả năng kháng khuẩn và chống lão hoá.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Khi những mạch máu bền vững hơn, nguy cơ mắc bệnh tim cũng giảm theo
[45].
- Có tác dụng bảo vệ tế bào gan, ức chế những tế bào ung bướu, vì vậy nó
được xem là một chất có tác dụng chống ung thư. Hiện nay tác dụng chống
ung thư của măng cụt đang là vấn đề rất được quan tâm:
+ Nabandith và cộng sự (2004) - Bộ môn ung thư của Đại học y khoa
Ryukyus, Okinawa Nhật Bản cho thấy α-mangostin có tác dụng phòng ngừa
tiền ung thư ở ruột già [33].

+ Moongkarndi và cộng sự (2004) - Bộ môn vi sinh vật của Đại học Mahidol
Bangkok, Thái Lan thử tính chống tăng sinh của 9 dược liệu ở dòng tế bào
ung thư tuyến vú bằng dịch chiết ethanol cho thấy măng cụt có tiềm năng rất
lớn về chống ung thư [32].
+ Sato và cộng sự (2004) - Bộ môn sinh học phân tử Đại học Tohoku, Nhật
Bản nghiên cứu tác dụng làm tế bào tự huỷ (apoptosis) của 8 xanthon trên u
tế bào ưa crôm (pheochromocytoma) ở chuột lớn. Trong số những xanthon
này, α-mangostin chiết từ vỏ măng cụt, có tác dụng mạnh nhất với EC50 =
4µM. α-mangostin tác dụng trên đường gây tự huỷ của ty lạp thể
(mitochondrial apoptotic pathway) và ức chế Ca
2+
- ATPase đáng kể [38].
+ Moongkarndi và cộng sự (2004) - Bộ môn vi sinh của Đại học Mahidol
Bangkok, Thái Lan cũng chứng minh dịch chiết thô methanol của vỏ quả
măng cụt có tác dụng trên dòng tế bào ung thư vú [31].
+ Mandal và cộng sự (1992) - Viện kỹ thuật sinh học quốc tế Gifu, Nhật Bản
nghiên cứu tác dụng của 6 xanthon từ vỏ quả măng cụt lên sự tăng trưởng tế
bào của dòng tế bào ung thư bạch cầu HL60 ở người, α-mangostin ức chế
hoàn toàn ở nồng độ 10µM bằng cách cảm ứng tế bào tự huỷ [28].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

+ Ho và cộng sự (2002) - Bộ môn nghiên cứu giáo dục bệnh viện cựu chiến
binh Đài Bắc, Đài Loan, chiết và làm tinh khiết 6 xanthon từ vỏ quả măng
cụt dùng sắc ký từng phần rồi thử tính độc hại tế bào qua 14 dòng tế bào ung
thư người, kể cả 6 dòng tế bào ung thư gan. Kết quả cho thấy garcinon-E có
tính diệt tế bào ung thư người mạnh nhất cũng như tế bào ung thư dạ dày và
phổi [22].
Tuy nhiên tất cả các nghiên cứu trên đều thực hiện trong ống nghiệm,
chưa có nghiên cứu nào thử lâm sàng để có thể chứng minh măng cụt chữa
được bệnh ung thư trên người.

- Tác dụng giảm đau: một số xanthon có khả năng ức chế hoạt động của
enzyme cyclo-oxygenase, nên măng cụt được dùng điều trị những chứng
đau, viêm, làm hạ nhiệt độ cơ thể khi bị sốt [10].
- Tác dụng chống dị ứng: các xanthon trong măng cụt ức chế sự tổng hợp
histamin nên có tác dụng chống dị ứng [34].
1.1.4. Độc tính
Các xanthon của vỏ quả măng cụt không độc. Priya và cộng sự [37] đã
thử độc tính của dịch chiết từ vỏ quả măng cụt trên chuột cống 6 tuần tuổi
với liều lượng tương ứng 1,0g; 2,0g; 3,0g vỏ quả măng cụt/kg chuột (số
lượng chuột mỗi nhóm 6 con). Kết quả:
 Sau 14 ngày chuột vẫn bình thường, không có con nào chết.
 Trọng lượng chuột không có gì thay đổi so với đối chứng.
 Giải phẫu bệnh lý: các cơ quan trong cơ thể chuột (tim, gan, thận, phổi
và óc) vẫn bình thường và trọng lượng của các cơ quan cũng không khác
gì so với đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.5. Nguyên tắc chiết xanthon.
Để chiết các dẫn xuất xanthon từ vỏ quả măng cụt, từ trước đến nay
đã có nhiều tác giả nghiên cứu [17], [18], [20], [24], [31], [39], [43]. Các
dung môi thường dùng là: petrolether, toluen, benzen, hexan, ethylacetat,
chloroform, aceton, methanol, ethanol, acetonitril … Theo khảo sát của
Misra [30] thì dung môi để chiết xuất α-mangostin tốt nhất là methanol, sau
đó đến các dung môi khác theo thứ tự khả năng hoà tan giảm dần như sau:
methanol > chloroform > ethanol > aceton > ethylacetat
Ở đề tài này chúng tôi tiến hành chiết xuất các dẫn xuất xanthon bằng
phương pháp soxhlet với dung môi là ethanol 95
o
ở nhiệt độ 80
o

C, ethanol
95
o
là dung môi hoà tan xanthon tốt, rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại. Hơn nữa khi
chiết với số lượng lớn xanthon từ vỏ quả măng cụt để đưa vào sản xuất thì
dùng ethanol 95
o
sẽ thiết thực và mang lại hiệu quả kinh tế cao.
1.1.6. Tinh chế xanthon
Để tinh chế các dẫn xuất xanthon từ cao măng cụt, nhiều tác giả đã áp
dụng các phương pháp thông dụng như:
 Sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel 60 (Merck) [44] hoặc Woelm
acid alumina grade III [18]. Sau đó rửa giải bằng các hỗn hợp dung môi
từ ít phân cực đến phân cực hơn để tách các hợp chất.
 Sắc ký lớp mỏng điều chế (preparative chromatography) để phân lập
riêng từng hợp chất [24].
1.1.7. Các phương pháp phân tích các dẫn xuất xanthon
♦ Sắc ký lớp mỏng [19]:
+ Chất hấp phụ là silicagel 60 F
254
(Merck) và với hệ dung môi như:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

benzen – methanol (95:5); chloroform – hexan (90:10)
chloform – ethylacetat – methanol (80:10:5)
benzen – ethylacetat (75:5) hoặc (17:3)
+ Thuốc thử hiện màu:
- Phun dung dịch FeCl
3
5%.

- Xông hơi iod.
- Phun dung dịch acid sulfuric trong ethanol, sau đó sấy ở nhiệt độ
110
o
C.
- Phun dung dịch anisaldehyd trong acid sulfuric và sấy ở nhiệt độ
110
o
C.
- Soi phát quang dưới đèn tử ngoại.
♦ Phân tích α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin bằng các phương pháp:
UV, IR, MS, HPLC,
1
H-NMR và
13
C-NMR [12], [14], [19], [20], [24], [27],
[43], [44].
1.2. Giới thiệu tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus
1.2.1. Vi khuẩn Staphylococus aureus
Staphylococus có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “staphyle” nghĩa là
chùm nho. Vi khuẩn Staphylococus là các cầu khuẩn Gram dương, không
tạo nha bào, có đường kính khoảng 1µm, không di động và sắp xếp theo
mọi hướng và thường tạo thành cụm trông giống như chùm nho và được gọi
là tụ cầu khuẩn. Có thể nói tụ cầu khuẩn là một trong những vi khuẩn nổi
tiếng nhất, được các nhà vi khuẩn học quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Các
nhà vi khuẩn học như Robert Koch (1878) và Louis Pasteur (1880) đều rất
quan tâm nghiên cứu tụ cầu khuẩn ngay từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi
sinh vật học.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Tụ cầu khuẩn được chia làm hai nhóm chính: tụ cầu có enzyme
coagulase (Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng,
Staphylococcus intermedius) và tụ cầu không có enzyme coagulase
(Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus,
Staphylococcus heamolyticus, Staphylococcus capitis,… ). Nhờ có enzyme
coagulase mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn
lạc màu vàng. Do vậy vi khuẩn Staphylococcus aureus được gọi là tụ cầu
vàng. Còn nhóm vi khuẩn không có enzyme coagulase, trên môi trường
nuôi cấy có máu, nhóm vi khuẩn này tạo thành khuẩn lạc màu trắng như sứ
hoặc màu trắng ngà, nên thường gọi nhóm vi khuẩn này là tụ cầu trắng.



Hình 3. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.2. Đặc tính và các yếu tố độc lực của vi khuẩn Staphylococus aureus
Năm 1926, Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa
sự hiện diện của hoạt động enzyme coagulase của vi khuẩn với khả năng gây
bệnh của nó. Tuy nhiên, đến năm 1948 phát hiện này mới được chấp nhận
rộng rãi. Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây
bệnh và không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của enzyme
coagulase. Enzyme này gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa
quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen . Enzyme này cùng với yếu tố kết
cụm (clumping factor) của một enzyme vách vi khuẩn, giúp tụ cầu vàng tạo
kết tủa fibrin trên bề mặt của nó. Tính chất này là yếu tố bệnh sinh cực kỳ
quan trọng và yếu tố cũng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán.
Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có liên quan đến
cấu tạo của vách vi khuẩn.
 Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ

polysaccharide. Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi
khuẩn chống lại hiện tượng thực bào.
 Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại
protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các
globuline miễn dịch. Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số
lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch
có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa: chúng là các
receptor cho các đại thực bào. Quá trình gắn trên giúp tụ cầu vàng
tránh không bị thực bào bởi đại thực bào.
 Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất
kết dính gian bào. Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng
nhấy niêm mạc.
Các yếu tố độc lực ngoại bào
Ngoài enzyme coagulase và yếu tố kết cụm, tụ cầu còn sản xuất một
số enzyme quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi
khuẩn này.
 Hyaluronidase: enzyme này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ
chức tế bào vật chủ, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tế bào vật
chủ.
 Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết
các tế bào hạt cũng như đại thực bào.
 Exfoliatine: là các enzyme phá hủy lớp thượng bì. Enzyme này gây
tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell
do tụ cầu.
 Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt. Các độc
tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm.
 Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội

chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng.
 Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được enzyme penicillinase
(beta-lactamase). Enzyme này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ
bản của các kháng sinh như penicilline G, ampicilline và
ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và dụng cụ chiết xuất xanthon
2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất
* Nguyên liệu: vỏ quả măng cụt được cung cấp từ công ty thuốc nam Đà
Lạt, vỏ khô, độ ẩm 10 - 12%.
* Hoá chất: EtOH, EA (CH
3
COOC
2
H
5
), MeOH (CH
3
OH), benzen (C
6
H
6
),
nước cất, thuốc thử anisaldehyd (4-methoxy benzaldehyd), acid sulfuric
(H
2

SO
4
), than hoạt tính.
2.1.2. Máy móc và dụng cụ
- Phổ tử ngoại UV – VIS được đo trên máy Shimazu 3001 tại Viện Khoa
học – Hình sự, Bộ công an.
- Phổ hồng ngoại IR được đo trên máy Impact 410 – Nicolet tại Viện Khoa
học – Hình sự, Bộ công an.
- Phổ khối (MS) được đo trên máy HP – 5989 – MS tại Viện hoá học, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được đo trên máy Hitachi DAD
L215 tại Cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng, Bộ Khoa học công nghệ và
môi trường.
* Các dụng cụ cần thiết:
- Pipet các loại, bình cầu 2L, cốc có mỏ các loại 100ml, 200ml, 500ml, 5L.
- Phễu lọc, đũa thuỷ tinh, giấy lọc.
- Bình chạy sắc ký bản mỏng 20x20cm (Đức).
- Bản mỏng silicagel 60 F
254
của Merck.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Silicagel dùng cho sắc ký cột ( cỡ hạt 0,063-0,200mm)
- Cân kỹ thuật, cân tiểu ly, bình ngâm kiệt, nồi đun cách thuỷ, tủ sấy.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu chiết xuất xanthon
Sau khi tham khảo nhiều tài liệu về các phương pháp chiết xuất, phân
tích, thử tác dụng dược lý các hoạt chất từ vỏ quả măng cụt của nhiều tác
giả trên thế giới và ở Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu qua các
bước như sau:
1. Chiết mangosteen từ vỏ quả măng cụt bằng phương pháp soxhlet với dung

môi EtOH 95
o

- Chiết cao măng cụt thô với dung môi EtOH 95
o

bằng soxhlet trong 6 giờ,
nhiệt độ 80
o
C.
- Loại tạp chất qua cột silicagel và than hoạt tính.
- Phân lập α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng điều chế.
- Xác định α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin bằng các phương pháp:
UV, IR, MS, HPLC.
2. Chiết mangosteen bằng phương pháp ngâm kiệt, ứng dụng cho sản xuất
quy mô lớn.
2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus của
mangosteen và α-mangostin
Tiến hành theo DĐVN IV, phụ lục 13.9. Xác định hoạt lực thuốc
kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật.
- Địa điểm thực hiện: Khoa vi sinh, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương,
Bộ Y tế.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Chủng chỉ thị: Staphylococcus aureus ATCC 6538.
- Môi trường định lượng (pH sau khi tiệt khuẩn: 7,9 ± 0,1).
Pepton 6,0g
Casein thuỷ phân từ pancreatin 4,0g
Cao thịt bò 1,5g

Cao nấm men 3,0g
Glucose.H
2
O 1,0g
Thạch 15,0g
Nước cất 1000 ml
Điều chỉnh pH của môi trường bằng dung dịch acid phosphoric 2N
hoặc dung dịch Natri hydroxyd 2N nếu cần. Điều chỉnh pH trước khi tiệt
trùng ở nhiệt độ 121
o
C trong 15 phút bằng nồi hấp.
- Chuẩn bị đĩa petri: sử dụng đĩa petri đáy phẳng, đã diệt khuẩn, đặt trên mặt
phẳng nằm ngang, đun chảy môi trường định lượng đã chuẩn bị ở trên. để
môi trường nguội đến khoảng 60
o
C, đổ 12ml môi trường vào đĩa petri để tạo
lớp nền bằng phẳng, để đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Thêm hỗn dịch vi
khuẩn (10
7
tế bào/ml) với nồng độ 1/100 (để có được môi trường chứa 10
5
tế
bào vi khuẩn/ml) vào môi trường đã để nguội 45
o
C-50
o
C, đây là nồng độ
thích hợp để tạo được vòng vô khuẩn sắc nét, lắc đều, tránh tạo bọt. Hút 10
ml môi trường đã cấy vi khuẩn vào mỗi đĩa petri, để đông tự nhiên ở nhiệt
độ phòng.

- Dùng khoan thạch (đường kính trong 6 mm) đục 6 lỗ trên đĩa thạch petri
sao cho cách đều nhau, dùng kim vô khuẩn lấy cục thạch ra.
- Dung dịch đệm phosphat (pH sau khi tiệt khuẩn: 8,0 ± 0,1)
Dikali hydrophosphat 16,73g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Kali đihdrophosphat 0,52g
Nước cất vừa đủ 1000ml
Điều chỉnh pH của dung dịch đệm bằng dung dịch acid phosphoric 2N
hoặc dung dịch Natri hydroxyd 2N nếu cần. Tiệt trùng dung dịch đệm
phosphat ở nhiệt độ 121
o
C trong 15 phút bằng nồi hấp.
- Chuẩn bị mẫu mangosteen: cân 0,1g mangosteen, thêm 0,9ml EtOH 96
o
,
lắc đều đến khi tan hết, thu được dung dịch 1/10. Pha loãng tiếp tục bằng
dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để thu được 3 dung dịch với 3 nồng độ:
+ Nồng độ 1/50 (tương ứng với 2mg mẫu): lấy 0,2ml của dung dịch 1/10
thêm vào 0,8ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0.
+ Nồng độ 1/100 (tương ứng với 1mg mẫu): lấy 0,5ml của dung dịch 1/50
thêm vào 0,5ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0.
+ Nồng độ 1/200 (tương ứng với 0,5mg mẫu): lấy 0,5ml của dung dịch
1/100 thêm vào 0,5ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0.
- Tương tự với mẫu α-mangostin, ta tiến hành giống mẫu mangosteen, cân
0,1g mẫu và cũng pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để thu
được 3 dung dịch với 3 nồng độ: 1/50, 1/100, 1/200.
- Các dung dịch chứng: pha dung dịch EtOH 20% (tương ứng với nồng độ
EtOH trong dung dịch 1/50), pha dung dịch EtOH 10% (tương ứng với nồng
độ EtOH trong dung dịch 1/100), pha dung dịch EtOH 5% (tương ứng với

nồng độ EtOH trong dung dịch 1/200).
- Tiến hành định lượng theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, với dung
dịch chứng và dung dịch của mẫu thử vào mỗi lỗ thạch là 90µl. Trên đĩa có
6 lỗ, trong đó 3 lỗ được nhỏ các dung dịch của mẫu thử lần lượt với nồng độ
1/50, 1/100, 1/200 và 3 lỗ thạch còn lại, ta nhỏ lần lượt các dung dịch EtOH
chứng 20%, 10%, 5%. Để trong tủ ấm 37
o
C trong 24 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng quy trình chiết xuất mangosteen bằng soxhlet.
Sơ đồ tóm tắt quy trình



Hình 4. Sơ đồ chiết xuất mangosteen
Chiết bằng soxhlet trong 6
giờ, nhiệt độ 80
o
C
Bỏ bã
Dịch chiết
Cất thu hồi dung môi, sấy khô
Cao măng cụt thô




Mangosteen (chứa các xanthon)

- Hoà vào MeOH
- Tách mangosteen bằng sắc ký lớp mỏng điều
chế, chất hấp phụ silicagel 60 F
254
(Merck),
dung môi: benzen-MeOH (tỷ lệ: 95:5), lọc.
α-mangostin, β-mangostin,
γ-mangostin
Phân tích xác định cấu trúc:
UV, IR, MS, HPLC

Bột vỏ quả măng cụt

EtOH 95
o

V
1

β-mangostin
V
2

α-mangostin
V
3

γ -mangostin
- Hoà vào EA
- Chạy qua cột silicagel – than hoạt tính

(tỷ lệ: 1:1).
- Rửa giải EA
- Cất loại bớt dung môi, sấy khô