Nghiên cứu hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza, trong đất và rễ cam tại quỳ hợp, nghệ an

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
*




LÊ THỊ THỦY




NGHIÊN CỨU HỆ NẤM
CỘNG SINH ARBUSCULAR MYCORRHIZA,
TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC





Thái Nguyên - 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2

MỞ ĐẦU
Sự cộng sinh giữa nấm và rễ cây trồng đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào
năm 1885 do A.B.Fank – nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức. Nhƣng phải
đến năm 80 của thế kỷ 20 mới đƣợc tập trung nghiên cứu và ứng dụng trong
sản xuất.
Nấm rễ cộng sinh là hiện tƣợng rất phổ biến trong tự nhiên, có khoảng
60 – 80% các loài thực vật trên thế giới có mối quan hệ cộng sinh với nấm nội
cộng sinh. Đây là mối quan hệ cộng sinh không thể tách rời: Nấm không có rễ
thì không thể tồn tại, cây không có nấm cây sinh trƣởng yếu vàng và chết
[11]. Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh vai trò của nấm cộng sinh
mang lại những lợi ích to lớn, thiết thực đối với quá trình sinh trƣởng và phát
triển của cây trong điều kiện bất lợi của môi trƣờng, bởi vậy chỉ trong điều
kiện đất đai khô hạn, nghèo dinh dƣỡng thì nấm rễ mới phát huy tốt vai trò
cộng sinh của mình. Chính vì vậy, hình thức cộng sinh này đã và đang đƣợc
nghiên cứu (về phân loại, sinh học phân tử, ảnh hƣởng của chúng đối với thực
vật ) và ứng dụng vào thực tiển sản xuất nông – lâm nghiệp ở nhiều nƣớc
trên thế giới.
Ở Việ t Nam, diện tích đất trồng trên cạn là rất lớn (3 317 270 ha), chủ
yếu là các loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, trong phát triển sản
xuất thƣờng gặp khó khăn về vấn đề nƣớc tƣới, đất chua và dinh dƣỡng . Vì
vậy, việc nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phát triển nấ m cộng sinh Mycorrhiza
cho một số cây trồng chính tại các vùng sinh thái phục vụ sản xuất Nông –
Lâm nghiệp bền vững ở nƣớc ta nhằm nâng cao năng suất cây trồng, duy trì
và bảo vệ và nâng cao độ phì nhiêu của đất là vấn đề cấp bách cần đƣợc quan
tâm hiện nay. Cho đế n nay, một số nhà khoa học của Viện Lâm nghiệp, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Thổ nhƣỡng nông hóa… cũng đã công bố những
nghiên cứu cơ bản về nấm rễ cộng sinh. Kết quả của những nghiên cứu này

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3

mới chỉ dừng lại ở mức phân lập, lƣu giữ bào tử nấm cộng sinh và nghiên cứu
xƣ̉ lý đấ t ô nhiễ m chì có sƣ̉ dụ ng nấ m Mycorrhiza. Tuy nhiên vẫn chƣa có
nghiên cứu về khả năng cộng sinh của nấm cộng sinh trên cây cam nhằ m tạ o
ra chế phẩ m là m tăng năng suấ t và chấ t lƣợ ng.
Trong các loại cây ăn quả, Cam Vinh là một loại cây ăn quả đặc sản
truyền thống có giá trị dinh dƣỡng cao, đồng thời cũng rất có giá trị về kinh
tế. Tuy nhiên, diện tích trồng cam ở đây đang dần bị thu hẹp và chất lƣợng
của cam đang ngày càng bị mai một. Với mong muốn có thể góp phần nào đó
vào việc cải thiện năng suất, chất lƣợng cam, nhóm nghiên cứu tiến hành
nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU HỆ NẤM CỘNG SINH ARBUSCULAR
MYCORRHIZA, TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN‟‟. Với mục tiêu
và nội dung nghiên cứu sau:
Mục tiêu nghiên cứu :
Nghiên cứu hệ nấm nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) trên
đất trồng cam ở Xã Minh Tân - Phủ Qùy – Nghệ An. Trên cơ sở đó, góp phần
đề xuất các giải pháp về phân bón, canh tác nhằm làm tăng năng suất, chất
lƣợng chè, ổn định độ phì nhiêu, cải thiện môi trƣờng đất vùng trồng cam.
Nội dung nghiên cứu:
 Xác định thành phần loài AMF tại vùng nghiên cứu.
 Xác định đặc điểm phân bố AMF trong đất trồng cam tại Phủ Qùy –
Nghệ An.
 Xác định loài AMF trong đất trồng cam bằng kỹ thuật sinh học phân
tử.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH TÊN GỌI ARBUSCULAR MYCORRHIZA
FUNGI (AMF)
Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên đƣợc Frank – nhà bệnh cây lâm
nghiệp ngƣời Đức – đƣa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ
cây và nấm ngoại cộng sinh [53]. Sƣ̣ cộ ng sinh củ a Mycorrhiza vớ i rễ đƣợ c
mô tả nhƣ (hình 1.1). Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm)
và Rhiza (rễ). Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng
sinh và nấm nội cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và
Orchid, từng đƣợc gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với
dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và
Orchidaceae. Tuy nhiên, tên gọi này tồn tại không lâu vì không có ý nghĩa
[33]. Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi
của hình thức cộng sinh này. Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng
bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là
“Vesicules” (gọi là thể V). Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi
(chùm) trong tế bào thƣờng đƣợc quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A).
Do vậy, tên gọi “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) đƣợc
hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây [19]. Bên cạnh đó, một số bài
báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular –A
rbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [23]. Những
nghiên cƣ́ u sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nhƣng
không phải tất cả nấm nội cộng sinh đều hình thành thể V. Do vậy, loại hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5

cộng sinh này có thể đƣợc đổi tên là “Arbuscular Mycorrhiza”. Nói chung,
tên gọi của nó vẫn chƣa hoàn toàn thống nhất.
Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 đƣợc tổ chức tại
Lisboa – Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi”
(AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này. Do vậy, trong các tài liệu mới đƣợc
công bố, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã đƣợc
thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza”
vào năm 2008 [28].

Hình 1.1. Sƣ̣ cộng sinh của AMF trong rễ cây trồng.
1.2. PHÂN LOẠI MYCORRHIZA
Đặc điểm nhận dạng của một số loài bào tử AMF (dựa theo phân loại
của Gerdemann, 1963) [32] bảng 1.1.

5
Bảng 1.1. Đặc điểm nhận dạng của một số loại bào tử AMF
Tên chi
Tên loài
Hình dạng
Mầu sắc
Kích
thước
(µm)
Đặc điểm
Glomus
Aggregatum
Hình cầu, hình trứng, có cuống nhỏ
Có mầu nâu, mầu nâu đỏ, một số có

mầu vàng nhạt
120-175
Thành bào tử mỏng, có 2 lớp.
Ambisporum
Hình cầu hoặc hình trứng
Mầu nâu, nâu đậm
100-150
Thành bào tử mỏng.
Marcaropus
Hình cầu hoặc hình trứng
Nâu hoặc mầu vàng nhạt
100-125
Thành bào tử mỏng, có quả bào tử.
Acaulospora

Appendicul
a
Hình cầu
Có mầu vàng nhạt
150-175
Thành bào tử dày, 1-6 µm.
Delicate
có quả bào tử, hình cầu
Có mầu nâu, nâu đậm
100-175
Thành bào tử dày.
Dilatata
Hình cầu, có quả bào tử
Có mầu nâu, đen
125-200

Thành bào tử dày,có nhiều lớp.
Myriocarpa,
Có quả bào tử, hình cầu hoặc gần
hình cầu.
Có mầu nâu hoặc nâu nhạt
120-175
Thành bào tử dày, có vách ngăn.
Bireticulata
Hình cầu, dạng quả lê
Có mầu nâu nhạt hoặc vàng nhạt
150-200
Thành bào tử dày, có 3-4 lớp.
Lacunose.

Hình cầu
Có mầu nâu hoặc nâu nhạt
120-175
Thành bào tử mỏng,1-2 lớp
Entrophora
colombiana

Hình cầu hoặc hình trứng
Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng nhạt
120-200
Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2
nhóm
schenckii.

Hình cầu ,hình tròn
Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng

150-200
Thành dày chia bào tử thành 3 lớp.
Sclerocystis

Coccogena

Bào tử có dạng hình cầu, gần hình
cầu, elip
Có mầu nâu nhạt
100-150
Thành bào tử mỏng có 2 lớp.
Coremioides
Bào tử có hình cầu,
Có mầu nâu, nâu đậm
120-180
Thành bào tử có 3 lớp,chia làm 2
nhóm.
Glomites
Rhyniensis
Hình cầu hoặc hình elip
Có mầu nâu đậm
150-200
Thành bào tử có cấu trúc kiểu liên
tiếp, gồm nhiều lớp.
Gigaspora

Candida,
Bào tử thƣờng có hình cầu và gần
hình cầu, một số có hình elip
Có mầu nâu, nâu đậm, mầu nâu đỏ

120–160
Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2
nhóm
Albida
Bào tử có dạng hình cầu, hoặc elip
Có mầu vàng nhạt
120-150
Thành bào tử có cấu trúc nối tiếp,
gồm 3 – 5 lớp.

6
Căn cứ về mặt hình thái có thể chia nấm rễ thành 3 loại chủ yếu: Nấm rễ
ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh.
* Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza): Đây là một loại nấm
hình thành mạng lƣới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô sợi nấm dày
đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút. Nấ m r ễ
ngoại cộng sinh thƣờng có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận
thấy bằng mắt thƣờng).
* Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza): Đặc trƣng là không có sự
biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và
không có mạng lƣới Hartig. Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là: nấm rễ nội
cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng
ngăn (SEM). Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ
có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular).
* Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh (Ectendomycorrhiza): Mang đặc trƣng
của 2 loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng nhƣ sinh lý.
Hiện nay, ngƣời ta nhận thấy có 7 hình thức cộng sinh:
* Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AMF): Cộng sinh kiểu tạo bụi (chùm).
* Ectomycorrhizas (ECM): Nấm rễ ngoại cộng sinh.
* Orchid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây họ Lan

(Orchidaceae).
* Ericoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây thuộc bộ Đỗ
Quyên (Ericales).
* Ectendo Mycorrhizas: Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh.
* Arbutoid Mycorrhizas: Nấm rễ có cả nội cộng sinh và ngoại cộng sinh
nhƣng chỉ xuất hiện giới hạn trong các chi Arbutus, Arctostaphylos và Arctous
của họ Đỗ Quyên (Ericaceae).
* Monotropoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh xuất hiện trong họ
Monotropaceae của bộ Đỗ Quyên (Ericales).
Theo thống kê của Harley (1959), khoảng 3% số cây có hoa ở các loài cây gỗ
và cây bụi có ECM, 90% các loài cây thân cỏ có AMF, ngoài ra một số loài
cây gỗ có cả ECM và AMF [32].

7

Hình 1.2. Biểu đồ cây phát sinh chủng loại AMF
( [62])

8
1.3. PHÂN LOẠI BÀO TỬ AMF
Thông thƣờng, việc phân loại nấm nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các
đặc điểm hình thái và cấu trúc (Bảng 1.1). Một trong những cơ sở quan trọng
để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton. Phƣơng pháp ADN và
giải phẫu sẽ đƣợc dùng để đánh giá quan hệ ở mức cao hơn do Smith và
Tinker đề xuất 1997 [51].
Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang áp dụng dựa trên cơ sở hệ
thống phân loại của Morton và Benny đƣa ra vào năm 1990 và đƣợc hoàn
chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó [39].
Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trƣớc hết phải kể đến việc
hình thành chi Endogone năm 1808. Tiếp đó là chi Glomus do anh em

Tulasne mô tả năm 1844. Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ
Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc
điểm chung. Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phƣơng pháp
nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF.
Năm 1959, Moss (nhà Giải phẫu thực vật) và Bowen (nhà Sinh thái học)
đã đƣa ra hệ thống mô tả dựa trên cấu trúc vách tế bào, màu sắc và đặc điểm
tế bào chất [40]. Tuy nhiên, khi áp dụng phƣơng pháp này thì Gerdermann đã
phát hiện ra rằng Endogone có số lƣợng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và
tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh: Endogone,
Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora,
Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) [31].
Với hệ thống phân loại của Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học –
Viện Hàn lâm khoa học Ấn Độ đã phân lập từ đất vƣờn ƣơm 4 chi AMF:
Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh
(Endogone).

9
Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đƣa 5 loài AMF ra khỏi chi
Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [58], đến năm 1987 Walker
cũng đề xuất nhƣ trên [60]. Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của
Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ:
Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này đƣợc đặt trong bộ mới
Glomales [39].
Năm 1998,Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscular
mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan – ACT) đề nghị công nhận 2
chi mới là Glomites và Jimtrappea. Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT
thƣờng đƣợc sử dụng ở các nƣớc châu Á.
Năm 2008, Shipra Singh và đtg tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là:
Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là: Archacospora và
Paraglomus [49].

1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MYCORRHIZA
Phương pháp tách bào tử
Muốn tiến hành phân loại thì công việc đầu tiên là tách bào tử từ đất.
Thông thƣờng, bào tử đƣợc tách bằng sàng ƣớt và lọc. Phƣơng pháp này đƣợc
sử dụng để lọc tuyến trùng từ đất do Gerdermann đã cải biên cho phù hợp với
nấm nội cộng sinh [32]. Trên cơ sở đó nhóm tác giả Daniel và Skipper (1982)
và tiếp sau đó tác giả Tommerup (1992) đã cải tiến thành phƣơng pháp sàng
ƣớt (wet sieving) qua rây kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose
(dịch 50%) [25, 56].
Quan sát, đếm số lượng bào tử
Tùy vào kích cỡ, quá trình quan sát bào tử có thể đƣợc thực hiện trên
kính lúp hoặc kính hiển vi có độ phóng đại nhỏ. Số lƣợng bào tử đƣợc xác
định bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có chia ô của hãng
Satorrius [24].


10
Xác định dạng xâm nhiễm
Để xác định các dạng xâm nhiễm, ngƣời ta tiến hành nhuộm Tryphan
blue (0,005%) làm biến màu thể cần xác định trong rễ của cây chủ, do Philip
và Hayman đề xuất cụ thể nhƣ sau: Đầu tiên, nấm rễ cộng sinh đƣợc rửa
nhiều lần bằng nƣớc cất nhằm loại bỏ đất và các tạp chất hữu cơ bám trên bề
mặt của rễ sau đó đun nóng bằng dung dịch KOH 10% ở nhiệt độ 90
o
C trong
vòng 2h, sau đó rửa bằng axít và biến màu bởi Tryphan blue, kết quả là sợi
nấm sẽ bắt màu xanh [43]. Đối với thực vật có nhiều sắc tố trong rễ,
Kormanik và cộng sự đề xuất phƣơng pháp sử dụng fuschin làm mất màu
những mẫu rễ cây cần quan sát [35]. Năm 1996 tác giả Brundrett đã đƣa ra
một phƣơng pháp mới với thuốc nhuộm là Chlorazol black E, nhờ đó có thể

quan sát một cách rõ ràng những giai đoạn của AMF trong rễ cây chủ [24].
Tuy nhiên, tất cả các phƣơng pháp trên đều có chung một nhƣợc điểm là
tốn thời gian và gây phá hủy mẫu. Mặt khác, quá trình và mức độ biến đổi
màu là khác nhau với từng mẫu rễ. Đa số các loài thuộc chi Gigaspora và
Scutellospora biến đổi màu rất mạnh với Tryphan blue mà không phụ thuộc
vào loài cây chủ theo Morton (1988) [38]. Nhƣng có loài chỉ biến màu trung
gian với Tryphan blue nhƣ Acaulospora trapei [18]. Thậm chí, một số loài
của chi Glomus (G.leptoticum, G.maculosum…) hoặc loài Acaulospora
myriocarpa lại không biến màu với Tryphan blue [38].
Mức độ chặt chẽ của mối quan hệ giữa thực vật và AMF đƣợc thể hiện
thông qua số lƣợng bào tử có trong đất. Tuy nhiên, việc xác định số lƣợng bào
tử đôi khi gặp nhiều khó khăn. Để giải quyết vấn đề đó, ngƣời ta thƣờng dùng
một chỉ số trung gian là “hệ số xâm nhiễm”. Phƣơng pháp đơn giản là cắt hệ
thống rễ thành những mẩu nhỏ và xác định tỷ lệ Mycorrhiza. Tuy nhiên,
phƣơng pháp này không hiệu quả khi tỷ lệ Mycorrhiza lớn. Năm 1975, dựa
trên cơ sở phƣơng pháp đƣờng chéo của nhóm tác giả Newman, Sparling và
Tinker lần đầu tiên áp dụng với AMF, sau đó đƣợc dùng để so sánh với các
phƣơng pháp xác định khác. Hiện nay, phƣơng pháp này rất thông dụng [52].

11
1.5. SỰ PHÁT TÁN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA AMF ĐỐI VỚI THỰC
VẬT CHỦ
Năm 1991, tác giả Friese và Koske cho rằng tất cả bào tử của AMF đều
phán tán một cách thụ động với những nhân tố tích cực là gió và động vật
[29]. Nhƣng theo MacMahon và Warner thì những vùng khô hạn, gió là nhân
tố quan trọng nhất tạo ra sự lây nhiễm tự nhiên của AMF [36]. Ngƣợc lại, với
những nơi ẩm ƣớt, động vật lại là nhân tố đóng vai trò chủ yếu [29].
Năm 1983, Hayman cho rằng số lƣợng bào tử AMF trong đất là chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá mức độ ƣu thế của loài. Trong đất canh tác, số lƣợng
loài và số lƣợng bào tử nhiều hơn trong đất tự nhiên [34]. Mặt khác theo tác

giả Friese thì AMF không dễ phát tán nên tầng đất canh tác là vị trí tốt nhất để
xác định số lƣợng bào tử [29].
Đồng thời với những nghiên cứu về phân loại, tách bào tử, cấu trúc
AMF thì ảnh hƣởng của AMF đối với sự sinh trƣởng của cây cũng đƣợc quan
tâm từ rất sớm.
Năm 1963, tác giả Gerdemann đã sử dụng đất không khử trùng nhƣ
một cách lây nhiễm AMF và đã chứng minh đƣợc rằng cây trồng sẽ phát triển
nhanh khi có mặt AMF [32]. Năm 1959, trong một báo cáo khoa học khác đã
chỉ ra rằng, việc nhiễm AMF làm tăng sinh trƣởng của cây táo con từ chồi
[40]. Cho đến năm 1968, Gerdemann tiến hành thí nghiệm trên cây ngô và
yến mạch cũng cho kết quả tƣơng tự [30].
Nhƣ vậy, trong nhiều năm qua, những nghiên cứu về AMF chỉ tập
trung vào vấn đề ảnh hƣởng của chúng đối với sinh trƣởng cây trồng mà
không biết rằng giá trị AMF mang lại cho thực vật chủ còn lớn hơn nhiều.
Năm 1968, bào tử nấm nội cộng sinh có thể sống cùng với thực vật trong
chậu và đƣa ra phƣơng pháp nhân nuôi thì những nghiên cứu về AMF và ảnh
hƣởng của chúng đối với thực vật mới đƣợc tiến hành sâu rộng trên nhiều lĩnh

12
vực nông lâm nghiệp [30, 41]. Các nhà khoa học đã chứng minh rằng: AMF
không chỉ làm tăng khả năng sinh trƣởng, phát triển của cây trồng mà còn có
thể làm tăng khả năng hấp thu khoáng (nhƣ phốtpho, đồng, kẽm…) trong đất;
làm giảm mức độ “sốc” của cây khi đất bị nhiễm mặn, đất quá ẩm, nhiệt độ
đất cao và nhiều nguyên nhân khác.
Về khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh của AMF,
Schonbeck và Dehne (1989) đã nghiên cứu trên 11 loại cây trồng phổ biến là
đậu, lúa mạch, lúa mì, cà rốt, ngô, hành, thuốc lá, cà chua, dƣa chuột, rau
diếp, hồ tiêu đã nhận thấy, chúng làm giảm 40% các bệnh ở rễ thƣờng gặp
trên các loại cây chủ này [48]. Năm 2000, tác giả Ted cũng chỉ ra kết quả
tƣơng tự khi nghiên cứu khả năng chống bệnh ở các cây nhiệt đới có AMF

(giảm 30 – 45% các tác nhân gây bệnh) [54].
Năm 2002, bằng thực nghiệm, Bali và đtg, đã chứng minh hiệu quả của
AMF đối với bệnh héo cây bông do nấm Fusarium gây ra. Đối với bệnh ở rễ
gây ra bởi tuyến trùng, AMF có thể cải thiện sức sống của cây chủ, từ đó hạn
chế những thiệt hại về sản lƣợng, đặc biệt với những vùng đất có hàm lƣợng
P
2
O
5
thấp và cây đƣợc nhiễm AMF trƣớc khi bị nhiễm tuyến trùng. Nhƣ vậy,
AMF có thể làm giảm nguồn bệnh hoặc giảm ảnh hƣởng của bệnh ở rễ có
nguyên nhân do nấm và tuyến trùng gây ra. Tuy nhiên, tác dụng của AMF
không thể hiện rõ đối với bệnh ở lá và bệnh do virus [20].
Khi nghiên cứu số lƣợng AMF trong đất, Schuybert và đtg đã nhận thấy
rằng: Ở các loại đất khác nhau, số lƣợng bào tử AMF là khác nhau [50].
Năm 1989 tác giả Schonbeck đã phân lập đƣợc 15 loài thuộc 3 chi khác
nhau là: Glomus, Sclerocystis, Acaulospora trong đất vùng rễ của cây nho và 7
loài thuộc chi Glomus trong đất vùng rễ của cây táo [48]. Trong đất trồng trọt
thƣờng xuyên (đất trồng lúa nƣớc, đậu, lúa mỳ và nhiều loại cây trồng khác)
luôn có số lƣợng bào tử AMF cao hơn nhƣng thành phần loài của AMF lại thấp
hơn so với trong đất tự nhiên. Năm 1989 Schonbeck và Dehne nghiên cứu về

13
mối quan hệ giữa AMF với các vi sinh vật vùng rễ, cho thấy sự có mặt AMF đã
làm tăng đáng kể lƣợng vi khuẩn tổng số (đặc biệt là nhóm Pseudomonas) [48].
Khi nhiễm 3 loài Gigaspora margarita, Glomus macrocarpum và
Glomus caledonium cho cây dâu tây, đã làm tăng đáng kể sinh khối và hàm
lƣợng phốtpho trong cây, trong đó, Gigaspora margarita có hiệu quả kích
thích mạnh hơn 2 loài còn lại. Năm 1982, Dehne cũng phát hiện tác dụng kích
thích sinh trƣởng của AMF trên cây hành và cây ngô [26]. Đến năm 1989,

nghiên cứu khác còn phát hiện thêm bên cạnh khả năng tăng sinh khối, tăng tỷ
lệ thân/rễ thì việc nhiễm AMF còn làm tăng hoạt động của enzyme
nitrogenase và tăng mức độ đồng hoá phốtpho của các cây họ đậu [59]. Ngoài
ra, Sung và đtg còn chứng minh đƣợc rằng: Thông qua hoạt động trao đổi chất
của mình, AMF có ảnh hƣởng đến Pyrophotphat (PPi) trong cây chủ, điều này
cho thấy tác dụng rất lớn của AMF đối với toàn bộ quá trình sinh trƣởng và
phát triển của cây chủ [48].
Năm 2004, Trần Văn Mão đã nghiên cứu hiệu quả của nấm VA –
Mycorrhiza chủ yếu là nấm Glomus, về khả năng hấp thu dinh dƣỡng P. Hàm
lƣợng P trong tế bào rễ cây bắp có sự cộng sinh của nấm VA-Mycorrhiza tăng
35% đối với các loài nấm Glomus mosseae và 98% đối với loài nấm Glomus
fasciculatum. Hàm lƣợng P đƣợc tích luỹ trong rễ bắp ở dạng hỗn hợp phân tử
P hữu cơ và acid hoà tan. Hàng ngày P đƣợc di chuyển đến các bộ phận của
cây bắp theo phƣơng pháp động lực học, và phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh
trƣởng của cây [7].
Nhƣ vậy, các kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của AMF đối với sự sinh
trƣởng và phát triển của các loại cây trồng khác nhau cho thấy chúng đều có
tác dụng tăng sinh khối, tăng quá trình trao đổi chất và thu nhận chất dinh
dƣỡng, tăng hoạt động của các enzyme.
Tóm lại vai trò cộng sinh của Mycorrhiza đối với sự sinh trƣởng, phát
triển của cây trồng đƣợc khái quát nhƣ sau [52]:

14
* Khả năng huy động nƣớc và các chất dinh dƣỡng: Hệ sợi nấm cộng
sinh xung quanh vùng rễ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, tăng khả năng hút
nƣớc và các chất dinh dƣỡng. Đối với các chất dinh dƣỡng kém di động (nhƣ
ion phốtphat, đồng, kẽm…), cây trồng hút các ion này nhanh hơn khả năng
khuếch tán của chúng trong dung dịch đất nên thƣờng hình thành vùng hẹp
cạn kiệt xung quanh rễ. Khi đó, hệ sợi nấm nhanh chóng dài ra, vƣợt qua
vùng cạn kiệt để đến với nơi có đủ phốtpho dễ tiêu. Do có đƣờng kính nhỏ

hơn so với lông hút của rễ, sợi nấm có thể len lỏi khắp nơi trong đất, kể cả các
lỗ hổng rất nhỏ mà rễ không qua đƣợc để hút dinh dƣỡng cung cấp cho cây.
Đối với phốtpho bị cố định chặt, sợi nấm cộng sinh sẽ tiếp cận và tiết ra các
axít hữu cơ qua phản ứng của anion hữu cơ phân tử nhỏ (nhƣ oxalate…) để
sau đó có thể đổi chỗ cho phốtpho (bị hút chặt bề mặt bởi hydroxide kim loại)
bằng phản ứng trao đổi, hoà tan oxide kim loại, tạo phức kim loại trong dung
dịch, do vậy ngăn chặn đƣợc sự kết tủa của phốtphát kim loại. Nấm cộng sinh
Mycorrhiza còn giải phóng phốtpho vô cơ thông qua khoáng hoá chất hữu cơ
(thuỷ phân hợp chất ester phốtphát hữu cơ). Các hình thức cộng sinh Ericoid
Mycorrizha và Ectomycorrizha còn có vai trò quan trọng trong việc khoáng
hoá nitơ. Chỉ cần một lƣợng nhỏ AMF có thể huy động dinh dƣỡng từ khối
lƣợng lớn xác thực vật có tỷ lệ C/N cao (hàm lƣợng lignin và tannin cao).
* Dòng chảy cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza: Dòng cacbon có
thể chỉ theo một chiều cƣỡng bức từ cây xuống AMF hoặc cũng có thể theo
chiều thoả thuận do AMF tự phân giải hợp chất giàu cacbon ở đất. Dòng chảy
cacbon từ cây xuống đất không làm cây trồng thiếu hụt cacbon vì khi AMF
xâm nhiễm vào rễ cây sẽ kích thích quá trình quang hợp mạnh hơn gấp bội
(trừ trƣờng hợp ánh sáng quá yếu). Trong hệ sinh thái, dòng chảy cacbon
xuống nấm và đất có một số vai trò quan trọng sau:
- Sợi AMF sản sinh ra các enzyme thủy phân (nhƣ protease,
phosphatase…) có vai trò quan trọng trong quá trình khoáng hoá chất hữu cơ
và huy động chất dinh dƣỡng cho cây trồng.

15
- Sợi nấm kéo dài làm tăng liên kết với các hạt đất, cải thiện cấu tƣợng
đất, thông thƣờng có đến 1 – 20 m sợi nấm/gam đất.
- Tạo nên cộng đồng vi sinh vật vùng rễ. Đây là chỉ tiêu quan trọng để
đánh giá độ phì nhiêu của đất.
* Tăng khả năng chống chịu hạn: trong môi trƣờng đất khô nấm rễ giúp
cây hấp thu nƣớc bằng cách tăng cƣờng tốc độ thoát hơi nƣớc so với những

cây không có nấm rễ cộng sinh. Allerm cho rằng tác dụng của nấm trong vùng
khô hạn biểu hiện chủ yếu là làm tăng tính chịu hạn của cây và tăng nhanh tốc
độ truyền nƣớc trong cây. Năm 1982, Berea và đtg lại cho rằng tác dụng của
nấm rễ là cải thiện kết cấu đất và nâng cao lƣợng nƣớc trong đất từ đó làm
tăng khả năng hấp thu nƣớc cho cây [21].
* Giúp cây chống chịu với bệnh hại: nấm cộng sinh ở rễ cây có tác
dụng bảo vệ cây chống lại một số vi sinh vật gây bệnh nhƣ Phytophthora
infestans (một loài tảo tƣơng tự nấm). Do Phytophthora infestans không thể
xâm nhập qua hệ sợi nấm để lọt vào rễ [10].
- Ngăn chặn cơ học sự xâm nhập của nguồn bệnh bằng cấu trúc sợi nấm
đan xen trong rễ cây.
- Sản sinh các hợp chất kháng sinh (antibiotic).
- Cạnh tranh dinh dƣỡng với vi sinh vật gây bệnh, góp phần làm tăng sức
đề kháng cho cây chủ.
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AMF TRÊN THẾ GIỚI BẰNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nấm Mycohriza ở mức độ phân
tử nhƣ RFLP, RAPD khuyếch đại trên nhiều vùng khác nhau của nấm đƣợc
thống kê theo bảng 1.2. Tuy nhiên việc phân loại bào tử bằng sinh học phân
tử vẫn còn nhiều hạn chế do khả năng thu nhận DNA tổng số từ bào còn thấp.

16
Bảng 1.2. Kết quả nghiên cứu AMF bằng sinh học phân tử [45]
Vùng
gen
Kỹ thuật sinh
học phân tử
Đoạn mồi
Tế bào đích
Tài liệu

tham khảo
SSU
rDNA
Genomic
DNA
PCR PCR–
RADP
VANS1
OPA-02 và OPA-04
OPA-18 và P124
OPA-18 và P124
Glomales
Glomusversiforme
Gl. mosseae . Gl. Caledoniu
Acaulosporalaevis
Gigasporamargarita
Scutellospora gregaria
109
39



SSU
rDNA
PCR
VANS1 và NS21
G. intraradices
83
Genomic
DNA

Competitive
PCR
PO và M3
G. Mosseae
46
ITS
PCR–RFLP
ITS1 và ITS4
Glomus sp., Scutellospora
sp.
41
SSU
1492¢
PCR
NS71 và SSU1492¢
Gigaspora sp.
75
Partial
rDNA
PCRpartial
SS38 và VANS1
VANS1
VAGIGA
Rễ và bảo tử của AM,
Scutellospora và Glomus
Gigasporaceae
30
ITS1 and
ITS2
PCR

ITS1 và ITS2
G. margarita
32
ITS
PCR
ITS1 và ITS4
G.mosseae và Gigaspora
margarita
29
SSU
rDNA
PCR-RFLP
PCRnested
LR1 và FLR2
FLR2-5.23 và
FLR2-8.23
LR1-23.46
Dƣới nhóm của Glomales
G. mosseae, G. intraradices
G. roseae
45
28S
rDNA
PCR–SSCPs
LSU-Primers
Glomus sp.
82
SSU
rDNA
PCR

NS31 và AM1
Glomus sp.
4

17
SSU
rDNA
PCR–SSCP
Nested-PCR
VANS1
ITS, AM1
Dƣới nhóm của Glomales

60
ITS
PCR–RFLP
ITS1 và ITS4
G. mosseae
74
ITS
Nested PCR–
SSCP
Eukaryotic
universal primer
Glomus sp.
Glomus-specific ITS primer
110
ITS
Nested-PCR
ITS 5 và ITS4

Glomeromycota (except
Archaeosporaceae)
44
ITS
PCR
SSU-Glom/LSU-
Glom 1
ITS5 và ITS4
Các nhóm chính với
Glomeromycota
44

1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM
Ở Việt Nam, Mycorrhiza đƣợc nghiên cứu từ những năm 60 của thế kỷ
XX nhƣng đến nay mới đạt đƣợc một số kết quả nghiên cứu về nấm ngoại
cộng sinh, hầu nhƣ chƣa có thành tựu trên nấm nội cộng sinh, đặc biệt là với
cây cam.
Nghiên cứu đầu tiên về nấm cộng sinh trong lâm nghiệp là việc sử dụng
lớp đất tầng mặt của rừng thông để gieo ƣơm cây con - đây có thể đƣợc coi
nhƣ một hình thức nhiễm nấm tự nhiên của Lâm Công Định và đã đƣợc sử
dụng nhƣ một biệp pháp lâm sinh trong một thời gian khá dài [2].
Sau đó là các kết quả nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Giao (1976) về sự có
mặt của nấm ngoại cộng sinh ở rễ cây thông. Nghiên cứu sử dụng nấm cộng
sinh thuần chủng để tạo rễ nấm cho cây thông con, kết quả cho thấy sự vƣợt
trội về chiều cao và đƣờng kính của những cây đƣợc nhiễm nấm so với công
thức đối chứng là 20 – 30% [1]. Bên cạnh đó, Nguyễn Sỹ Giao và Nguyễn
Thị Nhâm (1980) còn nghiên cứu sử dụng nấm nội cộng sinh để phòng bệnh
vàng còi ở thông con và cũng đã đạt đƣợc những kết quả nhất định [3].
Từ năm 1970 – 1980, Viện Nghiên cứu lâm nghiệp (nay là Viện Khoa
học Lâm nghiệp Việt Nam) đã tiến hành phân lập và nuôi cấy thuần chủng

18
nấm cộng sinh [3]. Một vài thí nghiệm đã đƣợc tiến hành trên đất cằn với cây
chủ là một số loài thông nhập nội. Tuy nhiên, những thí nghiệm này sau đó
phải dừng lại vì nhiều lý do. Những nghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh
trong lĩnh vực lâm nghiệp trong giai đoạn tiếp theo bị ngƣng trệ [15,16].
Năm 1998, Phạm Quang Thu và đtg tiếp tục nghiên cứu về nấm cộng
sinh với thực vật, kết quả là xác định đƣợc 37 loài nấm (thuộc 9 họ và 7 bộ)
cộng sinh với 3 loài thực vật (thông nhựa Pinus merkussi, thông đuôi ngựa
Pinus massoniana và thông caribe Pinus caribaea). Công trình này đƣợc coi
nhƣ sự khởi đầu lại cho những nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, đặc
biệt trên đối tƣợng cây lâm nghiệp. Kết quả không chỉ dừng lại ở việc xác
định thành phần loài nấm mà còn đi sâu hơn trong việc nghiên cứu sản xuất
các chế phẩm nấm cộng sinh, ứng dụng rộng rãi trong gieo ƣơm cây con ở
keo và bạch đàn. Đây là một mốc quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng nấm
cộng sinh vì đã chủ động đƣợc nguồn nấm lây nhiễm thông qua các chế phẩm
sinh học. Giá trị của nghiên cứu này còn đƣợc thể hiện trong thực tiễn sản
xuất tại tỉnh Vĩnh Phúc, sử dụng chế phẩm nấm cộng sinh đã cải thiện đáng
kể tình hình sinh trƣởng của cây trồng ở nhiều vùng đất đồi [14]. Đối với
AMF với cây dƣợc liệu, nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đƣợc cũng chỉ dừng
lại ở thu thập mẫu bào tử nấm cộng sinh [5].
Một điều đáng mừng cho khoa học Việt Nam về nấm cộng sinh nói
chung và AMF nói riêng tại Hội thảo về nấm cộng sinh đầu tiên của Việt Nam
đã đƣợc tổ chức tại Viện Thổ nhƣỡng nông hoá vào năm 2004 với sự góp mặt
của các nhà nghiên cứu cơ bản thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội và các ngành
nông nghiệp, lâm nghiệp, dƣợc học Tuy các tham luận tại Hội thảo này còn
mang tính lý luận, ít đề cập đến các kết quả nghiên cứu nhƣng nấm nội cộng
sinh đã đƣợc chú ý nhƣ một nội dung chính của Hội thảo, một số nhà khoa
học còn đề xuất định hƣớng nghiên cứu AMF trong những năm tiếp theo.

19
Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Sức và đtg [12], khi tiến
hành nghiên cứu “Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) và
quần thể vi sinh vật trong đất trồng bƣởi đặc sản Đoan Hùng, Phú Thọ” đã
phát hiện sự có mặt của AMF trong tất cả các mẫu thu thập đƣợc nhƣng tỷ lệ
xâm nhiễm thấp chỉ đạt mức 3/5 [33], khả năng nảy mầm của các bào tử nấm
rễ bƣởi thấp (chỉ đạt 16%). Trong một nghiên cứu khác, các tác giả đã sử
dụng 3 loại cây ký chủ (ngô, cao lƣơng, lúa mạch) và 3 chủng AMF để nhân
bào tử rồi đƣa ra kết luận: Khi nhân bào tử nhờ cây ký chủ, mỗi loài cây ký
chủ thích hợp cho một chủng nấm, riêng cao lƣơng không thích hợp dùng làm
cây ký chủ để nhân nhanh bào tử AMF, thời gian thu bào tử tốt nhất là 25 –
40 ngày sau khi cây ký chủ mọc [13].
Các kết quả nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh (2005, 2007)
trên cây họ đậu cũng cho một số kết quả khả quan ban đầu [8, 9]. Cùng năm
2007, Nguyễn Hoàng Yến công bố công trình nghiên cứu đầu tiên về phân bố
của AMF trong cây họ Sao dầu ở Đồng Nai [17].
Tuy có nhiều tài liệu đề cập đến vai trò của nấm cộng sinh AMF nhƣng
chƣa có nghiên cứu về vai trò của nấm cộng sinh đối với cây cam cũng nhƣ
ảnh hƣởng của các biện pháp kỹ thuật canh tác, dinh dƣỡng đất đến nấm cộng
sinh trên cây cam.Các nghiên cứu sâu rộng về AMF ở mức độ sinh học phân
tử, bằng các phƣơng pháp nhƣ RFLP, RAPD chƣa đƣợc tiến hành hoặc chƣa
đƣợc công bố.
Tóm lại, mối quan hệ cộng sinh nấm rễ – thực vật ít đƣợc quan tâm
nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam, đặc biệt chƣa có công trình khoa học
nào nghiên cứu về AMF ở cây cam. Bởi vậy đề tài: “Nghiên cứu hệ nấm cộng
sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An”
đƣợc thực hiện nhằm góp phần thiết thực vào hƣớng nghiên cứu mới: Ứng
dụng AMF để nâng cao năng suất cây cam nói riêng và cây trồng nông – lâm
nghiệp nói chung trên cơ sở bảo vệ môi trƣờng sinh thái theo hƣớng phát triển
bền vững trong thế kỉ XXI.

20
CHƯƠNG II
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Mẫu
Sử dụng 60 mẫu đất và rễ đƣợc lấy ở các tầng đất khác nhau (0 – 20 cm, 20
– 40 cm, 40 – 60 cm) tại đất trồng cam ở Xã Minh Tân - Quỳ Hợp – Nghệ An.
Thời gian lấy mẫu vào thán 8 và tháng 10 năm 2011.
Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR
MỒI
Trình tự nucleotide
VANS1_5
5' GTC TAG TAT AAT CGTTAT ACA GG 3'

NS21
5
’
AAT ATA CGC TAT TGG AGC TGG 3
’


2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Hóa chất:
Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR (buffer, dNTP, enzyme taq
polymerase…) do hãng Fermentas PureXtreme (Mỹ) cung cấp và bộ Kit tách
chiết DNA, tinh sạch DNA nhập từ hãng QIAGEN (Canada). Ngoài ra, một
số hóa chất khác còn đƣợc chúng tôi sử dụng nhƣ: EtBr, gel agarose, dung
dịch đệm TAE 1X…

Thiết bị chủ yếu:
- Bộ rây với các kích cỡ: 10.000 m; 70.000 m; 5.000 m; 2.500 m;
1.000 m; 750 m; 500 m; 250 m; 90 m và 40 m.
- Kính hiển vi quang học Olympus BH với hệ thống chụp ảnh chống
rung.
- Bộ vi gắp và bộ hút chân không áp suất thấp.
- Phễu hút kèm giấy lọc Whatman số 1 – 4.

21
- Tủ lạnh -20
0
C Vestfrost (Đan Mạch), Máy li tâm BioFuge fresco
(Đức), Lò vi sóng Sharp (Nhật Bản), Cân điện tử Precisa (Thụy Sỹ),
Máy chu trình nhiệt GenAmp PCR System 9700 (Mỹ), Máy chụp gel
BioRad (Đức), Tủ lạnh Toshiba (Nhật Bản), Máy điện di Mupid –
2plus (Nhật Bản), Máy li tâm nhanh Picofuge (Mỹ), Máy giải trình tự
ABI 3100 Bio System (Mỹ), Pipette Gilson (Pháp), Bể ổn nhiệt
Memmert (Hàn Quốc), Bộ dụng cụ điện di (Đài Loan), Máy đo quang
phổ (Đức).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp tách bào tử
- Lấy mẫu, bảo quản mẫu: Theo phƣơng pháp của Hayman 1983, mẫu
lấy ở ba tầng phẫu diện khác nhau: Tầng 0 - 20 cm, tầng 20 – 40 cm và tầng
40 – 60 cm. Mẫu sau khi lấy đƣợc bảo quản ở 4
o
C cho đến khi phân tích [34].
- Tách bào tử từ đất: Sử dụng kỹ thuật sàng ƣớt (wet siewing) qua rây
kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) theo Daniel&
Skipper (1982) [26], Tommerup (1992) [56].
Bƣớc 1:

+ Cân mẫu đất 50 g
+ Loại bỏ các mảnh rác thô và đá trong mẫu đất
+ Sau đó cho lƣợng đất đã cân vào trong nƣớc để ít nhất 30 phút trƣớc khi
sàng, các khối đất to phải đƣợc đập vỡ.
Bƣớc 2:
+ Đất đƣợc trộn đều trong ca dung tích 1lít nƣớc, sau đó để trong 10 phút
cho các mẫu đất lớn lắng xuống rồi gạn dịch sang một loạt sàng có kích thƣớc
khác nhau.

22
+ Quá trình rửa và gạn lọc đƣợc lặp lại nhiều lần cho tới khi nƣớc trong
rễ và các mẫu rác thô đƣợc giữ lại trên sàng có kích thƣớc lớn nhất, còn bào
tử đƣợc giữ lại trên sàng có kích thƣớc bé nhất.
Bƣớc 3:
+ Thu lại các vật chất bám trên sàng có kích thƣớc bé nhất sau đó chuyển qua
các ống ly tâm, tiến hành ly tâm lần 1 ở 5000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút.
+ Sau bƣớc này các cặn lơ lửng và rác đƣợc loại bỏ.
Bƣớc 4:
+ Cho 50 µl dung dịch sucrose 50% vào ống ly tâm rồi lắc mạnh các ống
(Hình 2.5)
+ Tiếp tục ly tâm ở tốc độ 11000 vòng/ phút trong 2 phút để tách bào tử
từ thành phần đất. Sau khi ly tâm, bào tử nằm trong dung dịch huyền phù
sucrose.
Bƣớc 5:
+ Hút dịch huyền phù sucrose đƣợc cho lên giấy lọc và đặt trên phễu
Buchner trƣớc khi lọc hút chân không (dùng giấy lọc Whatman GF/A số 1-4).
+ Đặt giấy lọc chứa bào tử vào đĩa petri rồi đem quan sát bào tử dƣới kính
hiển vi điển tử.
Bƣớc 6:
Bào tử sau khi đƣợc phát hiện dƣới kính hiển vi đƣợc chụp ảnh. Số

lƣợng bào tử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có
chia ô của hãng Satorri.
- Xác định hình dạng và kích thƣớc của bào tử: Bảng so sánh của
Morton [38].
- Xác định các dạng xâm nhiễm AMF: Nhuộm Tryphan blue có cải tiến
của Brundrett Mark và cộng sự [25].
- Xác định tên chi và loài: Theo Schenck và cộng sự [47].

23
- Giữ giống các bào tử AMF: Lây nhiễm chủ động vào chậu chứa đất cát
khử trùng trƣớc khi trồng cây ký chủ ngô [18].
- Màu sắc của bào tử: Xác định bằng bảng màu chuẩn 4 nhân tố.

24

Hình 2.1. Bảng mầu so sánh để phân loại nấm Mycorrhiza