Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Pseudomonas sp. ĐA 3.1 trong kiểm soát nấm hại cây trồng Rhizoctonia và Fusarium

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT




LÊ ĐÌNH QUYỀN




NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN
Pseudomonas SP. ĐA3.1 TRONG KIỂM SOÁT NẤM
HẠI CÂY TRỒNG Rhizoctonia VÀ Fusarium




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC






Hà Nội – 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN
Pseudomonas SP. ĐA3.1 TRONG KIỂM SOÁT NẤM
HẠI CÂY TRỒNG Rhizoctonia VÀ Fusarium


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30



Học viên: Lê Đình Quyền
Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. QUYỀN ĐÌNH THI



Hà Nội - 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của PGS TS
Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó Viện trưởng Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã định hướng
nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về kinh phí, hóa
chất và trang thiết bị nghiên cứu giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của TS Đỗ Thị Tuyên cùng tập
thể Phòng Công nghệ sinh học enzyme.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, các cô trong viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi trong quá
trình học tập.
Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và cơ quan công tác, luôn động viên và là
động lực tinh thần để tôi hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2012
Học viên

Lê Đình Quyền



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 10
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12
1.1 Bệnh cây trồng do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra 12
1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium và Rhizocronia hại cây trồng 12
1.1.2 Tình hình bệnh hại cây trồng do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra tại
Việt Nam 15

1.1.3 Biện pháp phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng 16
1.2 Vi khuẩn Pseudomonas 18
1.2.1 Khái quát về vi khuẩn Pseudomonas 18
1.2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng của chủng Pseudomonas trong kiểm soát
nấm bệnh trên thế giới 19
1.2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm sinh học kiểm soát nấm
bệnh tại Việt Nam 22
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24
2.1 Chủng giống 24
2.2 Hóa chất 24
2.2.1. Dung dịch và đệm 24
2.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy 25
2.3 Thiết bị 25
2.4 Sàng lọc chủng Pseudomonas có khả năng ức chế nấm F. oxysporum và R.
solani cao 26
2.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế nấm 26
2.6 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 26
2.6.1 Tách chiết DNA tổng số 26
2.6.2 Khuếch đại gen bằng PCR 27
2.6.3 Gắn sản phẩm PCR vào pJET1.2 27
2.6.4 Biến nạp plasmid 27
2.6.5 Tách chiết plasmid 28
2.6.6 Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn 29
2.6.7 Điện di trên gel agarose 29
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.6.7 Đọc trình tự nucleotide 29
2.7 Tách chiết hoạt chất thứ cấp bằng dung môi phân cực 30
2.8 Sắc kí cột 30
2.9 Sắc kí bản mỏng 30

2.10 Sắc ký khối phổ 30
2.11 Phân tích cấu trúc bằng cộng hƣởng từ hạt nhân 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn có độc lực cao với nấm F. oxysporum và R. solani 32
3.2 Định tên chủng 32
3.3 Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1
34
3.4 Đánh giá tính chất lí hóa của dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp.
ĐA3.1 35
3.4.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ 35
3.4.2 Ảnh hƣởng của pH 37
3.4.3 Ảnh hƣởng của proteinase K 38
3.5 Tinh sạch hoạt chất thứ cấp ngoại bào ức chế nấm 39
3.5.1 Tách chiết và tinh sạch hoạt chất từ dịch nuôi cấy ngoại bào từ chủng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 39
3.5.2 Xác định cấu trúc hoạt chất tinh sạch từ Pseudomonas sp. ĐA3.1 40
3.5.3 Đánh giá tính chất lí hóa của hoạt chất tinh sạch 44
3.5.4 Hoạt tính ức chế tối thiểu (MIC) của hoạt chất PCA với nấm R. solani và
F. oxysporum 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48
KẾT LUẬN 48
ĐỀ NGHỊ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
Tài liệu tiếng việt: 49
Tài liệu tiếng Anh: 50
PHỤ LỤC………………………………………………………………………… 54



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng 24
Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng 25
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào Pseudomonas sp. ĐA3.1 lên sinh
trƣởng của F. oxysporum 35
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào Pseudomonas sp. ĐA3.1 lên sinh
trƣởng của sợi nấm R. solani 35
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hoạt chất ức chế nấm tinh sạch từ Pseudomonas
sp. ĐA3.1 (CDCl3,
1
H: 500 MHz;
13
C: 125,76 MHz) δppm. 41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái nấm F. oxysporum trên đĩa PDA (A) và bào tử nấm F.
oxysporum soi trên kính hiển vi (B) 12
Hình 1.2. Hình thái nấm R. solani trên đĩa PDA (A) và sợi nấm R. solani soi trên
kính hiển vi (B) 13
Hình 1.3. Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 trên đĩa thạch (A) và
hình thái tế bào (B) 18
Hình 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn ức chế nấm F. oxysporum (A) và R. solani (B)
32
Hnh 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách
chiết từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1; Dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc lựa chọn
(C); Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (D). M: Marker. 33
Hình 3.3. Cây phân loại chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 (HQ914782.1: P.
aeruginosa strain TAUC7; HM597240.1: Pseudomonas sp. MB65; HM439411.1:
P. aeruginosa strain PCP26; FN645730: P. aeruginosa) 33
Hình 3.4. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của chủng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 ở các nồng độ khác nhau sau 5 ngày nuôi cấy 34
Hnh 3.5. Hình ảnh ức chế phát triển của dịch nuôi cấy ngoạ i bà o tƣ̀ chủ ng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 với nấm F. oxysporum (AD) và R. solani (EH) sau 5
ngày nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau. (A, E: nồ ng độ 1%; B, F: nồ ng độ 10%; C,
G: nồ ng độ 20%; D, H: nồ ng độ 50%; 1: đĩa đối chứng, 2: đĩa thí nghiệm). 34
Hình 3.6. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của chủng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí ở các nhiệt độ sau 5 ngày nuôi cấy 36
Hình 3.7. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng của dịch ngoại bào Pseudomonas sp. ĐA3.1

sau khi xử lí ở 100°C đối với F. oxysporum và R. solani sau 5 ngày nuôi cấy. (A, C:
F. oxysporum; B, D: R. solani; C: không xử lý; D: Đối chứng âm). 36
Hình 3.8. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của dịch lọc
ngoại bào Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí ở các độ pH khác nhau 37
Hình 3.9. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng của dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas
sp. ĐA3.1 sau khi xử lí pH đối với F. oxysporum (AD) và R. solani (EH) sau 5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ngày thử nghiệm. (A, E: pH 2; B, F: pH 4; C, G: pH 8; D, H: pH 10). 1: Môi trƣờng
nuôi cấy ban đầu; 2: Dịch nuôi cấy. 37
Hình 3.10. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của dịch lọc
ngoại bào Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí với proteinase K ở nồng độ khác
nhau sau 5 ngày xử lý 38
Hình 3.11. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng của dịch lọc ngoại bào Pseudomonas sp.
ĐA3.1 sau khi xử lí proteinase K đối với nấm F. oxysporum (A, B) và R. solani (C,
D) (A,C: 0,1 mg/ml proteinase K; B,D: 0,5 mg/ml Proteinase K; 1,2: Đĩa thí
nghiệm; 3: Dịch không xử lý; 4: Đối chứng âm). 39
Hình 3.12. Sắc ký đồ TLC hoạt chất tinh sạch từ Pseudomonas sp. ĐA3.1 (A) (1:
hoạt chất tinh sạch, 2: dịch chiết). Thử hoạt tính ức chế F. oxysporum của các phân
đoạn tinh sạch (B) (1: đối chứng nƣớc cất, 2: methanol, 3: dịch sau chiết, 4: dịch
nuôi cấy; 5-7: các phân đoạn tinh sạch) 40
Hình 3.13. Phổ
13
C (A) và phổ
1
H (B) của hoạt chất ức chế nấm tinh sạch từ chủng
P. aeruginosa ĐA3.1. 41
Hình 3.14. So sánh dữ liệu phổ NMR (A, B) và cấu tạo phân tử (C, D) của hoạt
chất tinh sạch từ chủng P. fluorescens 2-79 (A), (C) và chủng Pseudomonas sp.
ĐA3.1 (B), (D). 42

Hình 3.15. Cấu trúc phân tử của PCA tinh sạch từ chủng P. aeruginosa ĐA3.1 42
Hình 3.16. Qui trình tinh sạch hoạt chất PCA từ dịch nuôi cấy của Pseudomonas sp.
ĐA3.1 phân lập ở Việt Nam 43
Hình 3.17. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani của hoạt chất PCA tinh
sạch sau khi xử lí với nhiệt độ (A), với pH khác nhau (B), với proteinase K (C) 44
Hnh 3.18. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (AD) và R. solani (EH) của
hoạt chất PCA tinh sạch xử lý với nhiệt độ (A, E), với pH khác nhau (B, C, F, G),
với proteinase K (D, H) sau 5 ngày nuôi cấy. 44
Hnh 3.19. Khả năng ức chế nấm F. oxysporum và R. solani của hoạt chất PCA tinh
sạch từ chủ ng Pseudomonas sp. ĐA3.1 45
Hình 3.20. Hoạt tính ức chế tối thiểu của PCA với F. oxysporum (A) và R. solani
(B) tách chiết và tinh sạch từ dịch nuôi cấy chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 ở nồng
độ: 30, 40, 50, 60, 70, 80 g/ml 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
bp
Base pair
DNA
Deoxyribonucleic acid
RNase
Ribonuclease
dNTP
2-Deoxynucleoside 5-triphosphate
ĐC
Đối chứng
EtBr
Ethidium bromide
HCN
Hydrogen Cyanide

MIC
Minimum Inhibition Concentrate
IPM
Integrated Pests Management
PCR
Polymerase chain reaction
PCA
Phenazine-1-Carboxylic Axit
TLC
Thin Layer Chromagraphy
Taq
Thermus aquaticus
TE
Tris EDTA
TBE
Tris boric acid EDTA
v/v
volume/volume (thể tích/thể tích)
w/v
weight/volume (khối lƣợng/thể tích)


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
Hàng năm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất
nông nghiệp. Chúng phá hủy đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm
11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp trên thế giới. Trong các loại bệnh cây thì bệnh
do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium và Rhizocronia
gây ra chiếm tỉ lệ tƣơng đối lớn. Nấm bệnh Fusarium và Rhizoctonia gây bệnh trên

nhiều loại cây rau quả và cây lƣơng thực nhƣ lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu.
Chúng có khả năng tồn tại trong đất trong một thời gian dài, phát sinh và gây hại
ngay từ giai đoạn cây con và kéo dài cho tới khi thu hoạch nếu không áp dụng các
biện pháp phòng trừ triệt để.
Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là
sử dụng các loại thuốc hóa học. Mặc dù có ƣu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả
và tác dụng nhanh, nhƣng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhƣợc điểm
nhƣ hiệu quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm bệnh trong đất, nhanh bị ức chế
bởi nấm bệnh sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu
đến sức khỏe con ngƣời. Bên cạnh việc làm giảm chất lƣợng lƣơng thực, thực
phẩm, các loại hóa chất còn tích tụ trong đất, gây ô nhiễm môi trƣờng và làm cho
sản xuất kém bền vững. Hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, việc sử dụng
các chế phẩm vi sinh thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh
cây trồng do vi sinh vật gây ra đang là xu hƣớng chủ yếu. Các chế phẩm này đang
đƣợc sử dụng rộng rãi nhằm tạo ra một nền nông nghiệp hữu cơ an toàn và bền
vững.
Pseudomonas là chi vi khuẩn phổ biến trong môi trƣờng, đã đƣợc sử dụng
trong kiểm soát nhiều bệnh hại cây trồng khác nhau. Từ những năm 1970, trên thế
giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng Pseudomonas để phòng trừ nấm
bệnh bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm đã đƣợc sản xuất và thƣơng mại hóa
(Kommedahl, Chang-Mew, 1975; Cook, Rovira, 1976; Howell, Stipanovic, 1980;
Aziz et al., 2012). Tuy nhiên, kết quả đạt đƣợc trong nghiên cứu và sử dụng các chế
phẩm sinh học bảo vệ thực vật còn hạn chế. Chi phí thuốc bảo vệ thực vật trên thế
giới đạt hơn 39,4 tỷ USD trong năm 2007, giá trị thƣơng mại của thuốc bảo vệ thực
vật sinh học đƣợc sử dụng trên toàn thế giới chỉ chiếm 1,9% tổng giá trị của các loại
thuốc bảo vệ thực vật (Kiely et al., 2004; Grube et al., 2011). Vì vậy, việc tăng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt nấm Fusarium và Rhizoctonia
từ chủng Pseudomonas là cần thiết.

Trong khuôn khổ đề tài của Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, viện Công
nghệ Sinh học, viện KH&CN Việt Nam năm 2009-2012 do Bộ Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn làm chủ quản, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi
khuẩn Pseudomonas sp. ĐA 3.1 trong kiểm soát nấm hại cây trồng Rhizoctonia
và Fusarium″. Với mục tiêu nghiên cứu sàng lọc đƣợc chủng Pseudomonas từ bộ
chủng giống có hoạt tính ức chế nấm Fusarium và Rhizoctonia mạnh, đánh giá tính
chất lý hóa và thử hoạt tính của dịch lọc ngoại bào. Tinh sạch hoạt chất thứ cấp,
đánh giá tính chất lý hóa của hoạt chất tinh sạch có hoạt tính ức chế nấm. Từ đó ứng
dụng vào sản xuất chế phẩm sinh học kiểm soát nấm bệnh hại cây trồng Fusarium
và Rhizoctonia.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Bệnh cây trồng do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra
1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium và Rhizocronia hại cây trồng
Fusarium là một họ lớn của nấm sợi phân bố rộng rãi trong đất và gắn với
thực vật. Hầu hết các loài đều sống kí sinh vô hại và là thành viên tƣơng đối phong
phú của cộng đồng vi sinh vật đất. Fusarium oxysporum (F. oxysoprum) là phân tán
rộng rãi nhất của các loài Fusarium đƣợc tìm thấy trên toàn thế giới (Snyder,
Hansen, 1940). F. oxysporum phát triển trên đĩa môi trƣờng PDA thƣờng ở dạng
tròn đồng tâm, có màu tím nhạt (Hình 1.1A), chúng không có giai đoạn sinh dục
điển hình, nhƣng sản xuất ba loại bào tử vô tính: bào tử nhỏ (microconidia), bào tử
đính lớn (macroconidia) và bào tử hậu (chlamydospores). Bào tử nhỏ là các bào tử
sản xuất nhiều nhất, nó có hình bầu dục, hình elip hoặc thận đƣợc định hình và sản
xuất trên sợi nấm trên bề mặt. Bào tử đính lớn, có 3-5 tế bào và nhọn hai đầu hoặc
cạnh cong, đƣợc tìm thấy trên khối bào tử phân trên bề mặt của cây bị bệnh (trong
môi trƣờng bào tử phân có thể thấy thƣa thớt hoặc không tồn tại) (Hình 1.1 B). Bào
tử hậu thƣờng đƣợc hình thành đơn lẻ hoặc theo cặp, nhƣng đôi khi có thể đƣợc tìm
thấy trong các cụm, hoặc chuỗi ngắn. Nó là bào tử tròn có vách dày đƣợc sản xuất
trong giai đoạn cuối trên một sợi nấm hoặc trong bào tử đính lớn. Bào tử hậu không

giống nhƣ các bào tử khác có thể tồn tại trong đất trong một thời gian dài (Gordon,
Martyn, 1997; Đoàn Thị Thanh, 2005).


A
B
Hình 1.1. Hình thái nấm F. oxysporum trên đĩa PDA (A) và bào tử nấm F. oxysporum soi
trên kính hiển vi (B)
Nấm F. oxysoprum là một tác nhân gây bệnh đất phổ biến với cây lá
mầm, làm chết và phân hủy chất hữu cơ trong cây. Nó tồn tại trong đất nhƣ sợi
nấm và các loại bào tử, nhƣng thƣờng tồn tại trong đất nhƣ bào tử hậu. Lây lan
mầm bệnh theo hai cách cơ bản: lây lan khoảng cách ngắn qua bắn nƣớc, bằng thiết
bị trồng trọt và khoảng cách dài qua cấy ghép và hạt giống bị nhiễm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

bệnh. F. oxysporum gây hại cho một cây khỏe mạnh bằng lây nhiễm của sợi nấm
hoặc nảy mầm bào tử xâm nhập các mô gốc của cây trồng qua những vết thƣơng ở
gốc, rễ. Các sợi nấm phát triển trong tế bào thông qua vỏ gốc và vào xylem . Một
khi trong xylem, sợi nấm phát triển trong mạch xylem và sản xuất bào tử nhỏ (bào
tử vô tính). Bào tử nhỏ có thể nhập vào dòng nhựa và đƣợc vận chuyển lên. Trƣờng
hợp dòng chảy của nhựa cây dừng bào tử nhỏ nảy mầm. Cuối cùng, các bào tử và
sợi nấm làm tắc nghẽn các mạch dẫn của cây, ngăn chặn cây trồng lấy và chuyển
hóa các chất dinh dƣỡng. Cuối cùng cây trồng thoát hơi nƣớc nhiều hơn nó có thể
vận chuyển, đóng lỗ khí, lá héo và cây chết. Sau khi cây chết nấm xâm nhập vào tất
cả các mô, hình thành bào tử và tiếp tục lây nhiễm sang các cây lân cận (Farr et al.,
1989; Larkin et al., 1993).
Rhizoctonia solani (R. solani) là loại nấm gây bệnh thực vật với một loạt các
thực vật và phân bố trên toàn thế giới. Là tác nhân gây bệnh thực vật đã đƣợc phát
hiện cách đây hơn 100 năm. R. solani thƣờng xuyên tồn tại nhƣ dạng sợi sinh
trƣởng trên cây (Hình 1.2) hoặc trong môi trƣờng và đƣợc xem là một tác nhân gây

bệnh truyền qua đất. R. solani đƣợc biết đến gây ra các bệnh thực vật khác nhau nhƣ
thối cổ áo, thối rễ, héo thân R. solani tấn công chủ của nó khi cây đang trong giai
đoạn sớm của cây nhƣ hạt giống nảy mầm và cây giống, thƣờng đƣợc tìm thấy
trong đất (Ogoshi, 1987).


A
B
Hình 1.2. Hình thái nấm R. solani trên đĩa PDA (A) và sợi nấm R. solani soi trên kính hiển
vi (B)
R. solani là nguồn bệnh hoại sinh tồn tại và sinh sống trong đất, tấn công các
thực vật cƣ trú ở đó. Tác nhân gây bệnh này đƣợc biết là gây thiệt hại cây trồng
nghiêm trọng bằng cách tấn công chủ yếu là rễ và thân cây thấp của cây trồng và
mặc dù nó có một loạt các cây trồng làm kí chủ, mục tiêu chính của chúng là các
loại cây thân cỏ. R. solani sẽ đƣợc coi là một loại nấm đảm nếu giai đoạn sinh sản
hữu tính dồi dào. Hiện nay chƣa biết nó sản xuất bất kỳ bào tử vô tính mặc dù nó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

đƣợc coi là có một vòng đời sinh sản vô tính. Thỉnh thoảng, bào tử sinh dục
(basidiospores) đƣợc sản xuất trên các cây bị nhiễm bệnh (Gerhardson, 2002).
Nấm R. solani Kühn gây hại trên nhiều loại cây khác nhau nhƣ lúa, ngô, cà
chua, khoai tây, thuốc lá, lạc, đậu đỗ, bông, cải bắp, xà lách. Tùy theo loại cây và
giai đoạn sinh trƣởng của cây mà bệnh có nhiều triệu chứng khác nhau nhƣ thối đen
rễ, lở cổ rễ, thối gốc thân, khô vằn (đốm vằn), thối lá. Trên cây cà chua, thuốc lá
vƣờn ƣơm, đậu đỗ bệnh gây hại vào thời kỳ cây con ở rễ, cổ rễ, gây ủng nƣớc cây
chuyển sang màu nâu đen, cây đổ rạp gọi là bệnh lở cổ rễ. Trên ngô, bệnh hại trên
bẹ, phiến lá, thân và bắp ngô tạo ra nhiều vết lớn loang lổ, đốm vằn da hổ, hình
dạng bất kỳ nhƣ hình đám mây. Vết bệnh lan từ lá phía dƣới gốc lên bắp, cờ, làm
cây tàn lụi, bắp thối, gây tổn thất lớn trên các giống ngô mới.
Nấm R. solani có thể tồn tại trong đất trong nhiều năm trong các hình thức

hạch nấm. Hạch nấm của Rhizoctonia có lớp bên ngoài dày làm tăng khả năng sống
sót và chúng hoạt động nhƣ cấu trúc ngủ đông cho tác nhân gây bệnh. Trong một số
trƣờng hợp hiếm hoi mầm bệnh cũng có thể tìm thấy dƣới dạng sợi nấm nằm trong
đất. Nấm đƣợc lây nhiễm vào cây trồng bởi các kích thích hóa học đƣợc phát ra bởi
sự phát triển cây trồng hoặc dƣ lƣợng thực vật phân hủy. Quá trình thâm nhập của
mầm bệnh có thể đƣợc thực hiện trong một số cách. Thâm nhập có thể xảy ra thông
qua sự thâm nhập trực tiếp của các lớp biểu bì cây hoặc bằng các con đƣờng qua các
lỗ hở tự nhiên của cây. Sợi nấm sẽ tiếp xúc với cây và gắn với cây thông qua tăng
trƣởng, chúng bắt đầu sản xuất một cấu trúc thâm nhập vào tế bào của cây và sử
dụng chất dinh dƣỡng từ các tế bào của cây. Mầm bệnh cũng có thể sản xuất các
enzyme phân hủy thành tế bào thực vật và tiếp tục sinh trƣởng và phát triển bên
trong các mô chết. Sự phá hủy của thành tế bào và thâm nhập của mầm bệnh trong
cây này tạo thành các hạch nấm. Sau khi chúng thành công sợi nấm thâm nhập vào
cây chủ gây hoại tử và hình thành hạch nấm trong và xung quanh các mô bị nhiễm
bệnh mà sau đó dẫn đến các triệu chứng khác nhau liên quan với các bệnh nhƣ thối
rễ, thối thân, lở cổ rễ, khô vằn Mầm bệnh mới đƣợc sản xuất trên hoặc trong các
mô thực vật và đƣợc lặp đi lặp lại một chu kỳ mới khi các nguồn lây bệnh mới (thực
vật) trở nên có sẵn (Farr et al., 1989; Ceresini, 2011).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.2 Tình hình bệnh hại cây trồng do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra tại
Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh nấm F. oxysporum và R. solani là một trong những bệnh
quan trọng gây hại đồng thời nhiều loại cây trồng nhƣ cà chua, khoai tây, ngô, đậu
tƣơng, cây ăn quả, sầu riêng. Hàng năm sản lƣợng nông nghiệp thất thu do bệnh này
tới hàng chục tỷ đồng (Báo cáo của FAO, 2010). Ngƣời ta ƣớc tính rằng năm 2010
thiệt hại bệnh thực vật, bao gồm cả chi phí kiểm soát, lên tới khoảng 701,2 triệu đô
la. Hai trong các cây quan trọng bị hai bệnh nấm trên gây hại mà có ý nghĩa kinh tế
và sản lƣợng nông nghiệp cao là cây ngô, cây đậu tƣơng. Vì hai cây trên là cây
lƣơng thực và cây công nghiệp ngắn ngày quan trọng, mạng lại hiệu quả kinh tế cao

trên thế giới và ở Việt Nam nhƣng lại bị bệnh do nấm F. oxysporum và R. solani
gây hại nặng ở miền Bắc Việt Nam. Để sản phẩm an toàn cần có các biện pháp sinh
học canh tác để hạn chế bệnh do nấm F.oxysporum và R. solani gây hại ngoài đồng
và truyền qua hạt đậu tƣơng và ngô.
Bệnh đốm-cháy lá do nấm R. solani Kühn gây ra xuất hiện từ khi cây bông
mới mọc và bệnh tiếp tục phát triển mạnh về cuối vụ, gây hại nặng cho cây bông ở
vùng Đồng Nai (Bùi Thị Ngần, 2001). Ngoài cây bông nấm R. solani Kühn còn gây
hại trên cây đậu xanh, cây ngô, cây cối xay, cây hoàng manh Nguyễn Kim Vân
(2003) đã tìm thấy 7 bệnh hại phổ biến trên cải bắp ở các vùng trồng rau Hà Nội và
một số tỉnh lân cận trong đó bệnh thối cải bắp do nấm R. solani gây hại nghiêm
trọng và thƣờng xuyên ở các vùng điều tra với tỷ lệ bệnh từ 26% đến hơn 50%, đặc
biệt ở huyện Ðông Anh (Hà Nội) và huyện Từ Sơn (Bắc Ninh) bệnh hại rất nặng ở
giai đoạn cuốn bắp đến thu hoạch (Nguyễn Kim Vân, 2003).
Đỗ Tấn Dũng (2006) nghiên cứu cho thấy bệnh lở cổ rễ dó nấm R. solani
gây ra là bệnh hại phổ biến trên nhiều loài cây trồng cạn thuộc họ cà, họ đậu, họ bầu
bí, mức độ nhiễm bệnh trên các cây ký chủ cà chua, lạc, đậu tƣơng, đậu đũa và dƣa
chuột cũng khác nhau. Phạm vi ký chủ của nấm R. solani vùng Hà Nội năm 2005-
2006 gồm các cây cà chua, khoai tây, lạc, đậu tƣơng, đậu xanh, đậu đũa, đậu trạch,
dƣa chuột (Đỗ Tấn Dũng, 2007).
Bệnh lở cổ rễ hại bông ở vùng Duyên hải miền Trung chủ yếu là do nấm R.
solani gây ra. Ngoài ra, còn có một số tác nhân khác nhƣ F. oxysporum nhƣng ở
mức thấp. Bệnh lở cổ rễ do nấm R. solani gây hại từ khi hạt nảy mầm cho đến giai
đoạn 25 ngày tuổi, đặc biệt gây hại nặng khi cây bông đƣợc 2-3 lá thật, cây bông
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

càng lớn ít bị ảnh hƣởng. Nguồn nấm gây bệnh lở cổ rễ chủ yếu tồn tại trong đất.
Đối với nguồn nƣớc tƣới và hạt giống chƣa phát hiện ra.
1.1.3 Biện pháp phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng
Biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học
Biện pháp phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng phổ biến hiện nay vẫn là sử

dụng các loại thuốc hóa học với ƣu điểm là dễ sản xuất ở quy mô lớn với giá thành
rẻ, phổ tác dụng rộng với độc lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh. Tuy nhiên,
chúng ngày càng bộc lộ rõ những nhƣợc điểm nhƣ nhanh bị ức chế bởi côn trùng,
gây ô nhiễm đất, nguồn nƣớc và không khí, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời.
Thuốc bảo vệ thực vật nói chung và thuốc diệt nấm bệnh nói riêng đƣợc sử dụng
tràn lan làm cho các loài gây hại biến đổi nhanh chóng và ức chế thuốc. Hiệu quả
của viêc sử dụng thuốc ngày càng thấp ngƣợc lại với chi phí ngày càng cao
(Carrasco, 1989). Ƣớc tính có khoảng 520 loài côn trùng, 150 loài vi sinh vật gây
bệnh cây và 273 loài cỏ dại đã ức chế lại thuốc (Stuart, 2003).
Một số thuốc bảo vệ thực vật có thời gian phân hủy lâu, sau khi đƣợc phun
cho cây trồng sẽ thẩm thấu một phần vào đất và các mạch nƣớc ngầm. Các chất này
khi đã ngấm vào đất do đó nguy cơ bị ngộ độc thuốc diệt côn trùng rất cao. Thuốc
bảo vệ thực vật tổng hợp có độc lực mạnh, phổ tác dụng rộng cũng có nghĩa là có
tính chọn lọc kém. Chúng không chỉ tiêu diệt các đối tƣợng gây hại mà còn tiêu diệt
cả những loài có ích nhƣ động vật ăn côn trùng, các loài kí sinh côn trùng hại cây
trồng (Pimentel et al., 1993), tiêu diệt ong mật và côn trùng thụ phấn cho cây làm
cho nhiều cây trồng thụ phấn nhờ côn trùng giảm năng suất và chất lƣợng (Mussen,
1990).
Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học làm cho thực phẩm bị nhiễm
độc gây ngộ độc cấp tính hoặc mạn tính cho ngƣời sử dụng (Zhou et al., 2011).
Trên thế giới, hàng năm có khoảng 26 triệu trƣờng hợp bị ngộ độc (không tử vong)
thuốc bảo vệ thực vật (Richter, 2002), 750 nghìn trƣờng hợp ngộ độc mạn tính, 3
triệu trƣờng hợp phải nhập viện và 200 nghìn trƣờng hợp tử vong (Hart, Pimentel,
2002). Ở Việt Nam, khoảng 15-20 triệu ngƣời thƣờng xuyên phơi nhiễm với thuốc
bảo vệ thực vật (Đại học Quốc gia Hà Nội, 2009). Theo báo cáo của Cục Y tế dự
phòng và Môi trƣờng - Bộ Y tế, năm 2009 có 4515 trƣờng hợp bị nhiễm độc thuốc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

bảo vệ thực vật trong đó có 138 trƣờng hợp tử vong (Cục Y Tế Dự Phòng Và Môi
Trƣờng – Bộ Y Tế, 2009). Con số trên mới chỉ là kết quả thống kê đƣợc đối với các

trƣờng hợp đã nhập viện.
Biện pháp phòng trừ sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học
Vì những nhƣợc điểm của thuốc bảo vệ thực vật hóa học, xu hƣớng chung
trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam hiện nay là hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực
vật hóa học, sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để thay thế dần nhằm phát triển
nền nông nghiệp hữu cơ an toàn và bền vững. Các chế phẩm sinh học tác dụng có
chọn lọc, mỗi chế phẩm chỉ tác dụng lên một hay một số đối tƣợng nhất định, không
hoặc chỉ gây ảnh hƣởng đến một số ít loài ăn sâu bọ, các loài kí sinh sâu bọ và các
sinh vật có ích khác. Do vậy, các hệ sinh thái đƣợc phun các chế phẩm này không bị
xáo trộn, đảm bảo sự ổn định bền vững của đất trồng trọt. Chế phẩm khi phát tán
sang các khu vực lân cận cũng không gây ảnh hƣởng tiêu cực đến cây trồng ở đó.
Các chế phẩm chứa yếu tố diệt nấm bệnh là vi sinh vật có khả năng duy trì
hiệu quả kéo dài, chúng không chỉ tiêu diệt nấm bệnh đang phá hoại mà còn tồn tại
trong đất từ thế hệ này sang thế hệ khác.
Do có tác dụng chọn lọc đến đối tƣợng gây hại, các chế phẩm sinh học sẽ
không đƣợc sử dụng tràn lan, do vậy nguy cơ ức chế thuốc của nấm bệnh sẽ đƣợc
giảm thiểu, mỗi chế phẩm đƣợc sử dụng trong thời gian lâu hơn làm giảm chi phí
nghiên cứu sản xuất các chế phẩm mới thay thế.
Các chế phẩm sinh học có thành phần chính là các cơ thể sống hoặc có
nguồn gốc từ cơ thể sống, chúng dễ bị phân hủy thành các chất không độc sau một
thời gian ngắn sử dụng, không làm ô nhiễm đất, nƣớc, không khí. Vì các chế phẩm
này đã đƣợc chọn lọc để tác dụng đến từng loài côn trùng nhất định, trong trƣờng
hợp các cơ thể sống từ chế phẩm còn tồn tại đƣợc trên các nông sản cũng không gây
ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời. Nếu phát tán vào các thủy vực, các chế phẩm
này ít gây ảnh hƣởng xấu đến các sinh vật ở đó và do vậy không làm giảm giá trị
khai thác nguồn lợi thủy sản cũng nhƣ sự cân bằng của hệ sinh thái.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Mặc dù có một số nhƣợc điểm nhƣ giá thành sản xuất còn cao, hoạt lực
không mạnh bằng hóa chất tổng hợp, hiệu lực tác dụng chậm, hiệu quả bị ảnh

hƣởng nhiều bởi các điều kiện ngoại cảnh, nhƣng với các ƣu điểm vƣợt trội so với
hóa chất tổng hợp về độ thân thiện với môi trƣờng, hệ sinh thái và sức khỏe con
ngƣời, các chế phẩm sinh học ngày càng đƣợc nhận đƣợc nhiều sự quan tâm trong
nghiên cứu và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp.
Biện pháp khác
Đồng thời với việc áp dụng 2 biện pháp trên có thể áp dụng kết hợp với một
số biện pháp trong quá trình sản xuất nhƣ các biện pháp canh tác: áp dụng biện pháp
luân canh cây trồng, các kỹ thuật trồng trọt. Kết hợp với biện pháp cơ học và lí học:
xử lí đất, phơi đất, xử lí hạt giống và đất bằng nhiệt, nhổ bỏ bỏ cây bệnh… Áp dụng
quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) nhằm đem lại hiệu quả phòng trừ bệnh hại hiệu quả
nhất.
1.2 Vi khuẩn Pseudomonas
1.2.1 Khái quát về vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas là chi của Grammaproteobacteria, thuộc họ
Pseudomonadaceae có 191 loài đã đƣợc mô tả (Baltch, Smith, 1995).


A
B
Hình 1.3. Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 trên đĩa thạch (A) và hình
thái tế bào (B)
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình
que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Có kích thƣớc 0,5-1 x 1,5-5 μm, có
khả năng chuyển động bằng một hay nhiều tiêm mao.
Tính chất nuôi cấy: Pseudomonas mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy
thông thƣờng, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 37°C nhƣng phát triển đƣợc ở nhiệt độ 5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- 42°C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhƣng phát triển đƣợc ở pH 4,5 - 9,0. Trên môi
trƣờng đặc có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi. Có xu

hƣớng mọc lan (Hình 1.3A), 1 loại xù xì bờ không đều, đôi khí có loại khuẩn lạc
nhầy. Trên môi trƣờng thạch máu đa số gây tan máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh
phẩm thƣờng gặp loại khuẩn lạc thứ nhất. Trong các nuôi cấy từ môi trƣờng thƣờng
gặp loại khuẩn lạc thứ hai (Blazevic et al., 1973). Trong môi trƣờng lỏng vi khuẩn
mọc thành váng ở trên. Pseudomonas mọc đƣợc ở trên môi trƣờng SS (shigella
salmonella), đây là đặc điểm để phân biệt với trực khuẩn Whitmore. Tính chất đặc
trƣng của Pseudomonas là sinh sắc tố và chất thơm. Có hai loại sắc tố chính
pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan trong nƣớc và chloroform, khuếch tán ra môi
trƣờng làm môi trƣờng có màu xanh. Pyoverdin: là loại sắc tố huỳnh quang, tan
trong nƣớc nhƣng không tan trong chloroform, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím.
Sắc tố này không bền vững dễ mất đi trong điều kiện nuôi cấy không tốt. Sắc tố của
Pseudomonas dƣới ảnh hƣởng của các nguyên tố hóa học có thể thay đổi thành màu
nâu, đen. Pseudomonas sinh ra chất thơm là kimetilamine (Doring et al., 1987).
Tính chất sinh hóa: P. aeruginosa sử dụng một số loại đƣờng bằng hình thức
oxy hóa có sinh acid nhƣ glucose, mannitol, arabinose, galactose, fructose. Không
lên men đƣờng lactose. Một số phản ứng sinh hóa đặc trƣng: oxydase (+), citrat-
cimmons (+), catalase (+), indol (-), H
2
S (-), LDC (-), urease (-).
Cấu tạo ức chế nguyên: ức chế nguyên lông H: ức chế nguyên này chung cho
cả giống, dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ. ức chế nguyên thân O: đặc hiệu cho từng type,
bản chất là lipopolysaccharide, bền với nhiệt độ. Dựa và ức chế nguyên này chia
Pseudomonas thành 12 nhóm (Vander et al., 1984; Baltch, Smith, 1995).
Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trƣờng. Sự biến
dƣỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi
trƣờng khác nhau nhƣ nƣớc, đất, trên cây và trong các động vật Trong số những
loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể đƣợc sử dụng trong công
nghệ sinh học (Walker et al., 2004; Breidenstein et al., 2011).
1.2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng của chủng Pseudomonas trong kiểm soát
nấm bệnh trên thế giới

Mỗi năm, bệnh nấm gây thiệt hại mùa màng trên thế giới đã lên đến hàng
trăm triệu dollar mặc dù đã sử dụng thuốc sát trùng (Farr et al., 1989). Những vấn
đề về môi trƣờng và sự phát triển ức chế thuốc ở các nấm bệnh đã làm giảm hiệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

quả của các loại thuốc diệt nấm. Do vậy các chất ức chế nấm do các vi sinh vật đất
sản sinh ra là một nguồn thuốc sinh học mới, an toàn đầy tiềm năng. Do những
nguyên nhân này và các nguyên nhân khác mà ngƣời ta quan tâm đặc biệt tới kiểm
soát sinh học (nghĩa là sử dụng các vi sinh vật tự nhiên hoặc các sản phẩm của
chúng để hạn chế sự tấn công và gây hƣ hại bởi các mầm bệnh thực vật) (Andrews,
1992).
Vào thế kỷ 20, một số thuốc trừ sâu, dựa trên các phân tử biocidal, là công cụ
chủ yếu để tăng sản lƣợng và chất lƣợng thực phẩm và sản phẩm sợi. Do các vấn đề
về sức khỏe và môi trƣờng nên việc sử dụng nhiều hợp chất hóa học đã gây ra tranh
cãi và cần khẩn cấp các chất thay thế chúng. Ngoài việc tự ức chế của cây ngũ cốc,
chủ yếu là các biện pháp kiểm soát sinh học khác dựa vào toàn bộ cơ thể ức chế sâu
bọ tự nhiên. Một số cách tiếp cận khác về hoạt chất sinh học đƣợc thử nghiệm và số
chế phẩm chủng thƣơng mại tăng lên. Tuy nhiên, vẫn còn đòi hỏi nhiều về công
nghệ sinh học để có thể thay thế thuốc hóa học. Hiện nay chúng chƣa thể so sánh
đƣợc với các thuốc sát trùng hóa học do hiệu quả, thị trƣờng và các yếu tố khác,
nhƣng chúng vẫn có một tƣơng lai hứa hẹn cho việc sử dụng các chế phẩm sinh học
(Gerhardson, 2002).
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho rằng các chủng vi khuẩn Pseudomonas
sp. đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế các bệnh cây trồng (Kommedahl,
Chang-Mew, 1975; Cook, Rovira, 1976; Howell, Stipanovic, 1980; Henkes et al.,
2011). Hiệu quả của một vi sinh vật kiểm soát sinh học trong nhà kính và trên đồng
ruộng phụ thuộc vào sự sinh tổng hợp một hay nhiều chất đối ức chế sinh trƣởng
nấm (Handelsman, Stabb, 1996). Các chủng Pseudomonas sinh tổng hợp nhiều loại
ức chế sinh khác nhau nhƣ phenazine (Thomashow, Weller, 1988; Yang et al.,
2007; Pal'chykovs'ka et al., 2008), 2,4-diacetylphloroglucinol (Fenton et al., 1992;

Keel et al., 1992), pyrrolnitrin (Hill et al., 1994), pyoluteorin (Kraus, Loper, 1995)
và siderophore (Dowling, O’Gara, 1994; Sorensen et al., 1996; Uzair et al., 2008).
Bệnh thối rữa cổ rễ do Phytophthora capsici gây ra trên cây tiêu đen gây ảnh
hƣởng rất lớn đến năng suất của cây. Một số nghiên cứu đã cho thấy các chủng P.
fluorescens có khả năng đối ức chế, sinh tổng hợp nhiều chất ức chế với P. capsici
mầm bệnh thối rữa cổ rễ ở cây tiêu đen (Paul, Sarma, 2006). Ức chế tới 72% sự
phát triển hệ sợi của P. capsici đƣợc quan sát thấy trong các thí nghiệm nuôi cấy
kép. Chất chuyển hóa của chủng P. fluorescens IISR-6 đã ức chế hoàn toàn sinh bào
tử, pha phát triển mạnh nhất của P. capsici. Sự nảy mầm gián tiếp của túi bào tử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

cũng bị ức chế đáng kể. Ức chế phần trăm biến động từ 89-98%. Sự nảy mầm động
bào tử của P. capsici bị ảnh hƣởng âm tính bởi chất chuyển hóa của P. fluorescens,
tới 90% ức chế của sự nảy mầm đƣợc ghi nhận. Đánh giá tính chất một phần của
các chất chuyển hóa phát hiện ra hai ức chế sinh pyoluteorin và pyrrolnitrin. Các
chất chuyển hóa dễ bay hơi của P. fluorescens cũng ức chế các pha khác nhau trong
chu kỳ sống của P. capsici, đặc biệt sự phát triển hệ sợi và sinh bào tử. Hoạt chất
hydrogen cyanide (HCN) đƣợc phát hiện ở các chất chuyển hóa dễ bay hơi của các
chủng vi khuẩn Pseudomonas với hàm lƣợng khác nhau (Lanteigne et al., 2012).
Chủng P. fluorescens GRC2 đƣợc phân lập từ bầu rễ cây khoai tây, cho thấy
ức chế sinh ký sinh in vitro chống lại các tác nhân gây bệnh thực vật chính, M.
phaseolina và S. sclerotiorum. Sau 5 ngày ủ ở 28±1C, chủng này tạo ra vùng ức
chế rõ ràng trong dịch nuôi cấy kép, hạn chế phát triển của M. phaseolina và S.
sclerotiorum lần lƣợt 80,1% và 73,5%. Ảnh kính hiển vi điện tử quét từ vùng tƣơng
tác cho thấy mất màng cứng, quăn queo đứt quãng, biến dạng sợi và màng cứng và
ly giải đầu nối ở nấm M. phaseolina. Việc tạo lỗ, ly giải và phân đoạn đầu nối đƣợc
quan sát thấy ở S. sclerotiorum. Các kết quả tƣơng tự cũng đƣợc quan sát thấy khi
cả hai thể gây bệnh đƣợc nuôi ở môi trƣờng thạch nƣớc đậu nành tryptone để kề
nhau với dịch nổi 5 ngày của Pseudomonas GRC2. Những biến dạng ở nấm gây
bệnh là do Pseudomonas GRC2 sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp ức chế nấm

(Gupta et al., 2001).
Chủng P. syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và
syringotoxin, có các đặc tính chống nấm tiềm năng. Syringomycin là các
lipodepsipeptide nhỏ và trong số các peptide ức chế nấm vi khuẩn tiềm năng đã
đƣợc phát hiện ra. Syringomycin-E (SE) là peptide phổ biến nhất. SE diệt nấm A.
flavus, A. fumigatus, A. niger, F. moniliforme và F. oxysporum, có giá trị LD95 là
7,8 μg/ml đối với A. flavus và các giá trị LD95 với 1,9 μg/ml đối với các chủng nấm
khác (Segre et al., 1989; De Lucca et al., 1999).
Theo công bố của Makarand và cộng sự (2007) cho thấy chủng P.
aeruginosa sinh tổng hợp phenazine-1-cacboxylic acid có khả năng ức chế nấm A.
niger NCIM 1025, F. oxysporum NCIM 1008, S. rolfsii NCIM 1084, C. falcatum
NCIM. Có giá trị MIC với nấm S. rolfsii NCIM 1084 ở nồng độ 29 μg/ml. Ở nồng
độ 50μg/ml ức chế nấm F. oxysporum NCIM 1008 đạt 95% (Makarand et al.,
2007).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Henkes và cộng sự (2011) công bố chủng P. fluorescens CHAO có khả năng
ức chế hiệu quả với F. graminearum gây bệnh trên cây lúa mạch (Henkes et al.,
2011). Năm 2012, Seema và cộng sự công bố chủng P. aeriginosa SD12 có khả
năng sinh tổng hợp 1-hydrophenazine ức chế mạnh với nấm R. solani (Seema et al.,
2012).
1.2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm sinh học kiểm soát nấm
bệnh tại Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây
đã đƣợc quan tâm và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nƣớc trong những
năm vừa qua nhƣ ở Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện
KH&CNVN), Viện Bảo vệ thực vật (Bộ NN&PTNT), Viện Thổ nhƣỡng và Nông
hóa (Bộ NN&PTNT), Đại học Nông Lâm Tp HCM, Đại học Cần Thơ.
Các công bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật nhƣ Trichoderma (Trần Thị
Thuần, 1997; Đào Kiều Dung, 1999; Nguyễn Kim Vân, 2003; Trần Thị Thuần et

al., 2004), Bacillus (Nguyễn Ngọc Dũng et al., 2005; Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn
Minh Anh, 2007; Trần Phƣơng Thảo et al., 2007), Pseudomonas (Nguyễn Minh
Anh et al., 2003; Nguyễn Ngọc Dũng et al., 2003; Nguyễn Thị Tuyết Nhung et al.,
2004; Nguyễn Thị Tuyết Nhung et al., 2006) và Serratia (Lê Thị Hồng Minh et al.,
2005) đã đƣợc phân lập, tuyển chọn và đƣợc đánh giá là những tác nhân tiềm tàng
cho phát triển các chế phẩm sinh học để phòng chống nấm bệnh cây.
Việc nghiên cứu ứng dụng các vi sinh vật đối ức chế nấm bệnh cây đã đƣợc
thực hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt đƣợc những thành tựu bƣớc đầu nhƣ sử dụng
vi sinh vật đối ức chế nấm nhƣ một sinh vật chức năng trong sản xuất sinh bón hữu
cơ vi sinh; các chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm Trichoderma. Có vài
chục công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Trichoderma để phòng trừ nấm
gây bệnh cây trồng.
Kết quả tìm biện pháp sinh học đề phòng trừ nấm R. solani bằng cách dùng
nấm đối ức chế T. viride đã đƣợc nhóm nghiên cứu của Nguyễn Kim Vân thử
nghiệm cho thấy: Nấm T. viride có hiệu lực ức chế cao nấm R. solani trong điều
kiện phòng thí nghiệm và thí nghiệm bán đồng ruộng làm giảm mức độ thiệt hại của
nấm R. solani gây bệnh thối cải bắp (Nguyễn Kim Vân, 2003).
Có thể sử dụng chế phẩm sinh học nấm đối ức chế T. viride để phòng trừ
bệnh lở cổ rễ hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh cao 86% (trên cây cà chua)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

và 78% (trên cây dƣa chuột) trong điều kiện thí nghiệm chậu vại (Đỗ Tấn Dũng,
2007).
Nấm đối ức chế Trichoderma spp. có khả năng hạn chế sự phát sinh và gây
hại của bệnh lở cổ rễ hại bông. Quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh lở cổ rễ hại bông
có tác dụng hạn chế tốt khả năng phát sinh, phát triển và gây hại của nấm R. solani
trong điều kiện vụ Đông xuân 2005/2006 tại Quảng Nam. Tỷ lệ cây chết do bệnh
trên mô hình khoảng 1% nhƣng đối chứng gần 20%.
Đặc biệt, trong những năm qua, chế phẩm Antiforhis có tác dụng phòng
chống bệnh thối rễ, lở cổ rễ cây trồng do nấm F. oxysporum và R. solani có nguồn

gốc từ trong đất đã đƣợc phát triển trên cơ sở sử dụng hỗn hợp các chủng P.
fluorescens, P. chlororaphis và chủng B. pumilus tại Phòng vi sinh vật học đất,
Viện CNSH. Chế phẩm đã đƣợc khảo nghiệm trên diện hẹp trong điều kiện in vivo
tại Viện bảo vệ thực vật (Bộ NN&PTNT); kết qủa cho thấy chế phẩm Antiforhis
cho hiệu quả giảm bệnh gần bằng hoặc tƣơng đƣơng các hóa chất diệt nấm, tuỳ theo
từng chất. Kết qủa khảo nghiệm trên đồng ruộng cũng cho thấy, việc tƣới chế phẩm
Antiforhis đều có tác dụng làm giảm tỷ lệ cây con và cây trồng bị chết do bệnh thối
rễ trên cây dƣa ăn qủa các loại, cây cải bắp, cây cà chua và cây ớt ngọt (Nguyễn
Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh, 2007).


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 Chủng giống
Bộ chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas do Phòng Vi sinh vật đất, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam cung cấp. Chủng E. coli DH5α
(Invitrongen, Mỹ) đƣợc sử dụng để nhân plasmid.
Chủng nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani do phòng Bệnh cây,
Viện bảo vệ thực vật cung cấp.
2.2 Hóa chất
Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết: agarose
từ Rockland (Mỹ), chloroform, ethanol, methanol, ethylacetat, n-hexan của Merck
(Đức); Ethidium bromide, pJET1.2/blunt (Fermentas, Litva), T4 ligase, Taq
polymerase, proteinase K, RNase, enzyme giới hạn của Fermentas (Litva), mồi 16S
của Invitrogen (Mỹ), ampicillin của Mekopha (Việt Nam).
Các hóa chất khác để pha môi trƣờng: Peptone của Merck; cao nấm men,
glucose, glycerol của Difco (Mỹ), MgSO
4
, KH

2
PO
4
của Trung Quốc; glucose của
Việt Nam. Bản mỏng silicagel 60 F
254
(Merk) dùng để chạy sắc ký bản mỏng
(TLC), silicagel dạng hạt.
2.2.1. Dung dịch và đệm
Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng
Dung dịch
Thành phần, nồng độ
Dung dịch phá tế bào
100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0
Dung dịch proteinase K
20 μg/ml proteinase K
Dung dịch RNase
10 μg/ml Rnase
Dung dịch Sol I
50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8,0
Dung dịch Sol II
0,2 N NaOH; 1% SDS
Dung dịch Sol III
60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic
Đệm TBE 10x
108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
Đệm TE
100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0
Đệm tra mẫu DNA 6x
0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol

(FF); 60% (v/v) glycerol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar): 20 (g/l) khoai tây, đun sôi cách
thủy 2 giờ thu dịch chiết; 20 (g/l) glucose, 20 (g/l) agar.
Môi trường LB (Luria-Bertani): 10 (g/l) peptone; 5 (g/l) cao nấm men, 10
(g/l) NaCl; pH 7,5. Môi trƣờng thạch LB đƣợc bổ sung 20 (g/l) agar.
Môi trường KB (King’s B): 10 (g/l) peptone; 10 (g/l) glycerol; 0,5 (g/l)
MgSO
4
; 0,5 (g/l) KH
2
PO
4
; pH 7,0-7,5.
2.3 Thiết bị
Các thiết bị đƣợc sử dụng thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện
Công nghệ sinh học, Viện KH&CN Việt Nam (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng
Tên thiết bị
Hãng sản xuất
Bể ổn nhiệt
Trung Quốc
Box cấy LB-1234
Việt Nam
Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ)
Việt Nam
Cân phân tích AB 240
Sartorius (Thụy Sỹ)

Hệ thống chụp ảnh gel-doc
Pharmacia (Thụy Điển)
Hệ thống điện di ngang
Mupid α (Nhật Bản)
Lò vi sóng
SamSung (Hàn Quốc)
Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino
Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc nuôi cấy
Certomat HK (Đức)
Máy li tâm lạnh Mikro 22R
Hettich (Đức)
Máy PCR Mastercycler personal
Eppendorf (Đức)
Máy quang phổ UV-2500
LaboMed Inc (Mỹ)
Nồi khử trùng ES-315
Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh 4C, -20C, -80C
Toshiba, Sanyo (Nhật bản)
Kính hiển vi quang học
Trung Quốc
Máy cô quay Buchi
Đức