Nghiên cứu chọn tạo dòng mía hàm lượng đường cao bằng chỉ thị SSR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
o0o



NGUYỄN VĂN TRỮ


NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO DÒNG MÍA HÀM
LƢỢNG ĐƢỜNG CAO BẰNG CHỈ THỊ SSR


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC






Hà Nội, 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
o0o

NGUYỄN VĂN TRỮ

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO DÒNG MÍA HÀM
LƢỢNG ĐƢỜNG CAO BẰNG CHỈ THỊ SSR


Chuyên ngành
: Công nghệ Tế bào Thực vật
Mã số
: 60. 42. 30

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. LÊ THỊ BÍCH THỦY



Hà Nội, 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng kính
trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Bích Thủy, Trưởng Phòng Di truyền Tế bào
Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo
mọi điều kiện, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Ban
lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu Trường Đại học
Thái Nguyên, cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp
đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự ủng hộ nhiệt tình và các ý kiến đóng
góp của các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Di truyền Tế bào Thực vật.
Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn
ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình.

Hà nội, ngày 20 tháng 12 năm 2012
Học viên



Nguyễn Văn Trữ



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn
toàn trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và
các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Nguyễn Văn Trữ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo (Poaceae), bộ
lúa (Poal.,es), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae). Chúng là những cây có thân to,
mập, chia đốt cao từ 2 - 6 m. Tất cả các giống mía đang đượ c trồ ng trên thế giới đều
được lai tạo từ 2 loài S. officinarum và S. Spontaneum. Việc sử dụng hạn chế nguồn
vật liệu cho lai tạo trong suốt một thời gian dài làm cho các giống mía hiện đại có
quan hệ rất gần gũi về mặt di truyền.
Ngày nay, mía được trồng trên 200 quốc gia và vùng lãnh thổ. Cây mía trở
thành một trong những cây công nghiệp quan trọng của ngành công nghiệp sản xuất
đường. Ngoài ra, mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt, đặc biệt là
chống xói mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa, mía là cây rễ chùm và phát
triển mạnh trong tầng đất từ 0 - 60 cm (1 ha mía tốt có thể cho 13 - 15 tấn rễ sau thu
hoạch), đây là nguồn chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất. Phần bã mía chứa
nhiều cellulose có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, bìa các tông,
ép thành ván dùng trong kiến trúc Sản phẩm cặn bã còn lại sau khi chế biến đường
(bùn lọc) có thể sử dụng để sản xuất nhựa, xêrin, làm sơn, xi đánh giầy phế phẩm
còn lại dùng làm phân bón rất tốt. Trong tương lai bã mía còn có thể làm nguồn
nguyên liệu sản xuất bột giấy, làm sợi thay thế các loại cây rừng bị giảm đi.

Ở Việt Nam, mía được coi là cây trồng chủ đạo trong ngành công nghiệp
đường của cả nước. Bên cạnh đó, cây mía cũng góp phần xóa đói giảm nghèo ở
nhiều vùng trung du, miền núi nước ta (Nguyễn Đức Quang và công sự. 2005).
Hiện nay, nước ta có tới trên 60% các giống mía là những giống cũ như: ROC1,
ROC10, F156, F127… hoặc các dạng cây lai ghép nội chi phức tạp (Nguyễn Thị
Bạch Mai và công sự. 2005), mặc dù các giống này có đặc điểm dễ canh tác, thích
nghi rộng với nhiều vùng sinh thái của Việt Nam, nhưng trữ lượng đường rất thấp,
đang đứng trước nguy cơ suy thoái nguồn gen và giống cây trồng. Đối với các
giống mía nhập nội tuy có trữ lượng đường cao nhưng không phù hợp với khí hậu
Việt Nam, dễ bị nhiễm bệnh. Để làm giảm đến mức tối thiểu những hậu quả xấu của
S. Spontaneum và duy trì khả năng cho sucrose cao của S. officinarum. Một loạt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

phép lai ngược đã được thực hiện giữa con lai triể n vọ ng vớ i loà i S . officinarum.
Điề u nà y bướ c đầ u man g lạ i nhữ ng thà nh công trong việ c cả i thiệ n hà m lượ ng
đườ ng, kháng bệnh và khả năng mọc chồi cao . Tuy nhiên, về sau do gầ n nhau v ề
mặt di truyền nên nhữ ng tiế n bộ trong việ c lai mí a tạ o hầ u như không đượ c cả i thiệ n
(Sreenivasan et al., 1987; Lima et al., 2002; Pan et al., 2004). Thêm và o đó , việ c cá c
giố ng có nguồ n gố c di truyề n gầ n nhau khi bị nhiễ m tá c nhân gây bệ nh mớ i khả
năng bù ng phá t th ành dịch trên diện tích r ộng và nhanh chóng là rất cao , điề u này
gây thiệ t hạ i lớ n (Đỗ Ngọc Diệp và cộng sự. 2005). Do vậ y, yêu cầ u cấ p thiế t lú c
này với ngành mí a đườ ng là nghiên cứ u đa dạ ng di truyề n cá c giố ng mí a , để làm
nguồn vật liệu cho lai tạo. Mặc dù vậy, việc chọ n lọ c cá c cá thể c ó mức độ đa d ạng
di truyền cao dựa trên nguồn gốc địa lý, các tính trạng nông học, theo dõ i ph ả hệ
cho kết quả không chính xác, tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực. Đánh giá đa dạng
di truyền dựa trên các đặc điểm hình thái thường không chính xác do ảnh hưởng bởi
môi trường. Vì vậy, việc chọn lựa kỹ thuật để xác định được mối quan hệ di truyền
và chọn lọc được các tính trạng mong muốn, mà không ảnh hưởng bởi bất kỳ yếu tố
môi trường là hết sức cần thiết cho việc nghiên cứ u đa dạ ng di truyề n.
Trong những năm gần đây, nhiều loại chỉ thị ADN đã được sử dụng trong các

nghiên cứu chọn giống cây trồng: RADP, RFLP, SSR. Trong đó, kỹ thuậ t SSR đã
nhanh chóng trở thành kỹ thuật hữu hiệu và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên
cứu. SSR đượ c sử dụ ng rộ ng rãi trong nghiên cứu nhờ các đặc tính ưu việt của
chúng: sự phân bố rộ ng trong hệ gen , tính di truyền đồng trội , tính lặp lại, bản chất
đa allen và vị trí đặc hiệu ở nhiễm sc thể . Ở Việt Nam , việc chọn tạo giống mía
hàm lượng đường cao mớ i đượ c tiế n hà nh bằ ng việ c quan sá t cá c tí nh trạ ng hì nh
thái: số thân trên khó m, trọng lượng cây, đườ ng kí nh cây, khả năng kháng bệnh dựa
trên quan sá t đồ ng ruộ ng và mộ t số chỉ tiêu hó a sinh khá c : hàm lượng đườ ng, độ
Pol, độ Brix và xơ dự a trên nguồ n gố c cá c giố ng mí a : Cu Ba , Thái Lan , Trung
Quố c Do vậy, xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và khoa học, chúng tôi đã chọn đề
tài nghiên cứu “Nghiên cứu chọn tạo dòng mía hàm lƣợng đƣờng cao bằ ng chỉ
thị phân tử SSR”.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Mục tiêu của đề tài
- Đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn giống mía hàm lượng đường cao
được trồng ở Việt Nam.
- Chọn được các cặp lai ưu tú với tính trạng hàm lượng đường cao.
- Chọn lọc được một số dòng lai ưu tú có hàm lượng đường cao bằng các chỉ
thị SSR liên kết với tính trạng hàm lượng đường cao để đem trông khảo nghiệm.
Nội dung của đề tài Đề tài sẽ bao gồm một số nội dung chính với các vấn đề cần
giải quyết sau:
- Đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn 42 giống mía nghiên cứu.
- Sử dụng chỉ thị SSR liên kết với tính trạng hàm lượng đường cao để chọn
lọc các dòng lai có hàm lượng đường cao.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ 3/2011 đến 10/2012
- Địa điểm: phòng Di truyền Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học-
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phân loại, đặc điểm hình thái và sinh trƣởng của mía
Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo (Poaceae), bộ
lúa (Poal.,es), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae). Chúng là những cây có thân to,
mập, chia đốt cao từ 2 - 6 m. Các loại thực vật trong chi này đa số là các loại cỏ
sống lâu năm bao gồm khoảng 6 - 37 loài tùy theo hệ thống phân loại, sống chủ yếu
ở khu vực nhiệt đới và ôn đới trên thế giới. Mía được trồng để thu hoạch với mục
đích sản xuất đường. Trên cây mía, thông thường phần ngọn sẽ nhạt hơn phần gốc
(trong chiết nước mía). Đó là đặc điểm chung của thực vật: chất dinh dưỡng (hàm
lượng đường) được tập trung nhiều ở phần gốc (vừa để nuôi dưỡng cây vừa để dự
trữ). Đồng thời, do sự bốc hơi nước của lá mía, nên phần ngọn cây lúc nào cũng
phải được cung cấp nước đầy đủ cho lá. Tỷ lệ nước ở phần ngọn nhiều hơn phần
gốc làm cho ngọn cây mía nhạt hơn.
Mía là loại cây nhiệt đới nên đòi hỏi điều kiện độ ẩm rất cao. Nhiệt độ bình
quân thích hợp cho sự sinh trưởng của cây mía là 15-26
0
C. Giống mía nhiệt đới
sinh trưởng chậm khi nhiệt độ dưới 21
0
C và ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ 13

0
C
và dưới 5
0
C thì cây sẽ chết. Những giống mía á nhiệt đới tuy chịu rét tốt hơn nhưng
nhiệt độ thích hợp cũng giống như mía nhiệt đới. Thời kì nảy mầm mía cần nhiệt độ
trên 15
0
C tốt nhất là từ 26-33
0
C. Mía nảy mầm kém ở nhiệt độ dưới 15
0
C và trên
40
0
C. Từ 28-35
0
C là nhiệt độ thích hợp cho mía vươn cao. Sự dao động biên độ
nhiệt giữa ngày và đêm liên quan tới tỉ lệ đường trong mía. Giới hạn nhiệt độ thích
hợp cho thời kì mía chin từ 15-20
0
C. Vì vậy tỉ lệ đường trong mía thường đạt ở
mức cao nhất cho các vùng có khí hậu lục địa và vùng cao.
Mía là cây nhạy cảm với ánh sáng và đòi hỏi cao về ánh sáng. Thiếu ánh
sáng, mía phát triển không tốt, hàm lượng đường thấp. Mía cần thời gian tối thiểu là
1200 giờ tốt nhất là trên 2000 giờ. Quang hợp của cây mía tỉ lệ thuận với cường độ
và độ dài chiếu sáng. Thiếu ánh sáng cây hút phân kém, do đó phân đạm, lân và kali
chỉ hiệu quả khi ánh sáng đầy đủ. Vì vậy ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới mía vươn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

cao mạnh nhất khi bt đầu vào mùa hè có độ dài ngày tăng lên. Chính vì vậy, nó là
nhân tố quan trọng quyết định năng suất và sản lượng mía.
Mía là cây cần nhiều nước nhưng lại sợ úng nước. Mía có thể phát triển tốt
ở những vùng có lượng mưa từ 1500 mm/năm. Giai đoạn sinh trưởng mía yêu cầu
lượng mưa từ 100-170 mm/tháng. Khi chín cần khô ráo, mía thu hoạch sau một thời
gian khô ráo khoảng 2 tháng sẽ cho tỉ lệ đường cao. Bởi vậy các nước nằm trong
vùng khô hạn nhưng vẫn trồng mía tốt còn những nơi mưa nhiều và phân bố đều
trong năm thì việc trồng mía không hiệu quả. Gió bão làm cây đổ dẫn đến làm giảm
năng suất, giảm phẩm chất của cây. Chính vì vậy gió cũng là dấu hiệu quan trọng
trong công tác dự báo lên kế hoạch và chế biến làm sao tốn ít chi phí mà giá trị sản
xuất cũng như phẩm chất của mía nguyên liệu vẫn cao.
1.2. Diện tích và năng suất trồng mía ở Việt Nam và trên thế giới
Hiện nay có khoảng 200 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới trồng và
sản xuất mía đường, sản lượng trung bình đạt khoảng 13.246 triệu tấn (gấp 6 lần so
với củ cải đường). Năng suất trung bình của mía trên thế giới năm 2009 khoảng
70,3 tấn trên một hecta. Trong đó, khu vực có năng suất mía tốt nhất là các nông trại
mía ở Peru với năng suất trung bình khoảng 125,5 tấn trên một hecta. Brazil là quốc
gia trồng mía lớn nhất thế giới, với sản lượng hàng năm khoảng 672.000.000 tấn
một năm, năng suất trung bình khoảng 87 tấn trên hecta (Food And Agricultural
Organization of United Nations. 2009).
Bảng 1: Sản lượng mía của 10 nước đứng đầu thế giới năm 2009
Tên quốc gia
Sản lượng
(tấn)
Brazil
672,157,000
india
285,029,000
Thái lan
66,816,400

Pakistan
50,045,400
Mexico
49,492,700
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Colombia
38,500,000
Philippines
32,500,000
Australia
30,284,000
Argentina
29,000,000
Tổng sản lƣợng
mía thế giới
1,743,068,525

Ở Việt Nam, mía là cây trồng chủ đạo trong ngành công nghiệp đường của
cả nước. Theo số liệu thống kê diện tích mía cả nước năm 2012 là 283,222 ha, tăng
hơn vụ trước 11,822 ha, diện tích mía của 25 tỉnh có nhà máy đường cung cấp cho
các nhà máy chế biến niên vụ 2011/2012 là 270,961 ha. Năng suất mía bình quân cả
nước đạt 61,7 tấn/ha tăng so với vụ trước gần 2 tấn/ha, sản lượng mía cả nước được
17,5 triệu tấn. Sản lượng mía ép công nghiệp đạt 14,5 triệu tấn, sản xuất được
1.306.240 tấn đường. So với vụ trước, lượng mía ép công nghiệp tăng gần 2 triệu
tấn, sản lượng đường tăng 155,780 tấn. Mía được phân bố chủ yếu ở các vùng sinh
thái sau đây: Đồng bằng Sông Hồng, Đông Bc, Tây Bc, Bc Trung Bộ, Duyên
Hải Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long.
Diện tích trồng mía tập trung ở vùng Bc Trung bộ, Đông Nam bộ và đồng bằng
sông Cửu Long. Các tỉnh miền núi phía Bc và đồng bằng sông Hồng có diện tích

trồng mía ít, phân tán năng suất thấp. Về chất lượng mía, Theo báo cáo của các đơn
vị chế biến đường: chữ đường cao nhất ở Công ty CP mía đường Sông Con là 11,8
CCS và thấp nhất ở Công ty CP NIVL là 8,0 CCS còn lại hầu hết dao động trong
khoảng từ 8,5 đến 10 CCS. Trên cơ sở kết quả lượng mía đưa vào chế biến và lượng
đường thu được thì trữ lượng đường bình quân khi chế biến đạt khoảng 9,6 CCS
giảm hơn năm 2011(Báo cáo hiện trạng và giải pháp phát triển ổn định ngành Mía
đường 2012).



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 2: Diện tích và sản lượng mía ở các vùng sinh thái trong cả nước năm 2012
Vùng sinh thái
Diện tích
(ha)
Năng suất
bình quân
(tấn/ha)
Sản lượng mía
(tấn)
Miền bc
80,677
55,7
4,490,812
Duyên hải Nam Trung bộ
51,961
53,8
3,349,103
Tây Nguyên

45,274
Đông Nam bộ
34,359
77,2
7,178,990
Đồng bằng sông Cửu long
58,690
Cả nước
283,222
61,7
17,5

1.3. Hàm lƣợng đƣờng ở mía và các yếu tố ảnh hƣởng đến hàm lƣợng đƣờng
ở mía
Hàm lượng đường là một trong các yếu tố đánh giá chất lượng các giống
mía. Các nghiên cứu trước đây thường chỉ tập trung vào việc cải thiện năng suất
hoặc tính chống chịu của các giống mía khi lai tạo. Một trong những lý do chính các
nghiên cứu ít tập trung vào việc cải thiện hàm lượng đường trước đây bởi tính phức
tạp của tính trạng này. Đây là tính trạng đa gen, bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố và
mức biểu hiện ở từng giai đoạn khác nhau. Tuy nhiên, do việc sử dụng hạn chế
nguồn nguyên liệu ban đầu cho chọn giống làm cho việc tăng suất mía về sau không
được cải thiện nhiều. Ngoài ra, việc phải tăng chi phí cho quá trình thu hoạch, vận
chuyển và chế biến với số lượng lớn mà sản lượng đường không cải thiện được
nhiều đã làm cho giá trị cây mía bị giảm sút. Có rất nhiều yếu tố tác động đến hàm
lượng đường của một giống mía. Các giai đoạn khác nhau trong quá trình phát triển
của mía, phương pháp thu hoạch và quy trình sản suất mía.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.3.1. Sự ảnh hưởng của thời gian sinh trưởng và phương pháp thu hoạch đến
sản lượng đường thu nhận được
Đường là sản phẩm dự trữ chủ yếu của cây mía. Do vậy, tùy từng giai đoạn
phát triển mà hàm lượng đường ở cây mía thay đổi. Ở giai đoạn cây non, sản phẩm
của quá trình trao đổi chất chủ yếu phục vụ cho quá trình sinh trưởng và phát triển
nên hàm lượng đường thường rất thấp. Hàm lượng đường tăng dần theo thời gian
sinh trưởng của cây mía. Chúng đạt đỉnh vào giai đoạn mía chín và sau đó giảm
dần. Điều này được giải thích do giảm sự tăng trưởng trong khi tăng nhu cầu dữ trữ
các chất của cây mía. Các giống mía có thời gian sinh trưởng nhanh sẽ đạt trạng thái
chín sớm. Tùy từng giống mía mà có thời gian mía chín khác nhau, thậm chí ngay
cả cùng một giống mía nhưng trồng ở các khu vực địa lý và sinh thái khác nhau
cũng có thời gian chín khác nhau. Thời gian để đạt trạng thái chín của mía ở Ấn Độ
là khoảng 8-10 tháng, 10-11 tháng ở In-đô-nê-xi-a và 12-14 tháng ở Colombia. Ở
Việt Nam thời gian để mía đạt độ chín khoảng 10 – 11 tháng. Các giống mía chín
sớm đem lại nhiều lợi ích cho cả người trồng mía và ngành sản xuất mía đường.
Chúng giúp tiết kiện nguồn nguyên vật liệu cần thiết cho một chu kỳ sinh trưởng
của cây trồng, cho phép bt đầu sớm mùa vụ thu hoạch và tái sản xuất. Trước đây,
để xác định thời điểm mía chín, người nông dân thường dựa và tuổi mía và đặc
điểm sinh trưởng bên ngoài của cây mía. Điều này có thể làm giảm giá trị cây mía
nếu thu hoạch không đúng thời điểm mía chín. Muốn xác định thời điểm đúng thời
điểm mía chín dựa cần dựa trên một số chỉ tiêu: độ Brix, hệ số phân cực Pol và hàm
lượng đường thương mại (content commercial sugar –CCS). Tuy nhiên, hầu hết các
nghiên cứu thường tập trung vào hệ số Pol. Giá trị này được ghi nhận dao động từ
10,49 đến 17,86.
Ngoài sự ảnh hưởng của thời gian sinh trưởng, hàm lượng đường còn phụ
thuộc và hệ thống thu hoạch và phương pháp sản xuất. Các kết quả nghiên cứu cho
thấy việc thu hoạch bằng máy giúp đạt được hàm lượng đường cao hơn so với thu
hoạch bằng tay. Điều này được giải thích bởi năng suất thu hoạch máy nhanh đảm
bảo thu hoạch đúng thời điểm mía chín. Nhằm làm giảm công sức trong quá trình
thu hoạch, người ta thường tiến hành đốt diện tích mía cần thu hoạch để loại bỏ lá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

mía. Chúng không những giúp hạn chế khối lượng mía cần vận chuyển mà còn
giảm lượng bã mía trong quá trình nghiền. Kết quả nghiên cứu ghi nhận trong
khoảng 1 tấn bã mía có chứa trung bình 20 kg sucrose. Tuy nhiên, việc đốt mía
trước khi thu hoạch cũng làm ảnh hưởng đến chất lượng mía bảo quản. Điều này
được chứng minh qua sự sụt giảm hàm lượng đường trong các mẫu mía. Hàm lượng
đường giảm ở mẫu mía không đốt là 0,01 % và 0,23 % sucrose ở mẫu mía tiến hành
đốt trên mỗi giờ sau thu hoạch. Nguyên nhân của việc giảm hàm lượng đường là do
hoạt tính của các enzyme trong thân cây mía.
1.3.2. Các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp sucrose
Hàm lượng đường thu nhận phụ thuộc vào số lượng sucrose được tổng hợp
nên và số lượng chất bị phân giải phục vụ cho các quá trình sinh trưởng. Quá trình
này được kiểm soát bởi số lượng và hoạt tính của nhiều enzyme tổng hợp và phân
giải sucrose. Một loạt các enzyme: soluble acid invertase (SAI), sucrose synthase
(SS), neutral invertase (NI) và sucrose phosphate synthase (SPS) điều hòa sự tích
lũy sucrose trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển ở các lóng mía (Gutierrez-
Miceli et al., 2005). Phân tích hồi quy đa biến và phân tích mối tương quan trên 2
giống mía nghiên cứu với hoạt tính của các enzyme cho thấy hàm lượng sucrose tỷ
lệ nghịch với hàm lượng đường khử trong quá trình sinh trưởng và phát triển của
lóng. Ngoài ra, kết quả phân tích hệ số và phương trình hồi quy tối ưu cũng ghi
nhận được hàm lượng đường sucrose có mối tương thuận với hoạt tính của enzyme
SPS nhưng lại tỷ lệ nghịch với hoạt độ của SAI, SS và NI trong các mẫu nghiên cứu
(Verma et al., 2011; Jain et al., 2011). SAI và SPS là các enzyme quan trọng trong
việc điều hòa tích lũy sucrose trong quá trình sinh trưởng và phát triển của các lóng
cây mía. Phương trình hồi quy tuyến tính tương quan thuận của 2 enzyme đã được
xây dựng với mức ý nghĩa α = 0.05 (Pan et al., 2009). Nghiên cứu vai trò của các
enzyme ảnh hưởng đến hàm lượng đường được tích lũy, mở ra các hướng mới trong
quá trình tạo các giống hàm lượng đường cao. Một số enzyme có vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp sucrose đã được phân lập và nhân dòng. Đánh giá hiệu quả

của gen Pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (PFP) trong cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

mía chuyển gen cho thấy, hàm lượng đường của cây mía đã được cải thiện đáng kể
ở cả giai đoạn cây non và trưởng thành (Groenewald và Botha, 2008).
1.4. Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng
cao
Chỉ thị phân tử (molecular markers) hay còn gọi với các tên khác như dấu
phân tử, dấu chuẩn phân tử là một đoạn ADN liên kết với một vị trí nào đó trong hệ
genome. Chỉ thị phân tử được sử dụng trong sinh học phân tử và công nghệ sinh
học để nhận biết một trình tự ADN chưa biết. Ngày nay, chúng được sử dụng rộng
rãi trong chọn giống nhờ các đặc tính ưu việt và hiệu quả của chúng mang lại.
1.4.1. Cơ sở khoa học của ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống
(Marker Assisted Selection –MAS)
Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử sử dụng trong chọn giống là
phương pháp chọn lọc các tính trạng mong muốn một cách gián tiếp. Nếu một gen
điều khiển tính trạng quan tâm đã được xác định vị trí trên bản đồ nhờ các chỉ thị
phân tử đã biết, tức là các đoạn ADN lân cận (dùng để đánh dấu) thì có thể tiến
hành chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử . Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ
thị phân tử dựa trên sự có mặt hay vng mặt của trình tự hay băng chỉ thị đặc trưng
nằm ở trong hoặc gần gen kiểm soát tính trạng quan tâm. Dựa vào các băng đặc
trưng của chỉ thị sẽ biết được sự có mặt hay vng mặt của gen quan tâm hoặc đoạn
nhiễm sc thể mang allen mong muốn. Từ kết quả đó, chọn lọc được những cá thể
mang tính trạng mong muốn một cách nhanh chóng, chính xác và ổn định qua thế
hệ. Cụ thể, chỉ thị M có 2 allen M1 và M2 được xác định qua phân tích ADN là
nằm trên nhiễm sc thể ở vị trí gần với gen quan tâm Q (với biển đổi Q1 là tăng
năng suất và Q2 là là giảm năng suất). Nếu cá thể trong quần thể có allen M1, Q1
nằm trên một nhiễm sc thể và M2, Q2 nằm trên nhiễm sc thể khác thì ở bất cứ thế
hệ nào, các cá thể mang allen M1 sẽ có khả năng lớn cũng mang biến đổi Q1 (khả
năng này tùy thuộc vào M và Q gần nhau như ở mức độ nào trên nhiễm sc thể) nhờ

đó mà M1 có thể sử dụng trong chọn lọc. Kết quả tương tự với allen M2 và biến đổi
Q2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chỉ thị phân tử có các đặc tính ưu việt như: thông tin của chỉ thị phân tử sử
dụng cho cả cá thể bố, mẹ (không phân biệt giới tính) và ở bất cứ giai đoạn nào của
quá trình sinh trưởng. Ngoài ra, chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử còn có
thể thực hiện ở bất kỳ thế hệ nào, ngoài đồng ruộng cũng như trong nhà kính mà
không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố ngoại cảnh. Nhờ các đặc tính trên mà chỉ thị
phân tử ngày càng được sử dụng rộng rãi trong chọn giống ở nhiều loại cây trồng.
Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử còn được ứng dụng với các
tính trạng đa gen. Tính trạng được quy định bởi nhiều gen, trong đó các gen có các
đóng góp khác nhau đối với tính trạng mong muốn, thể hiện qua sự biểu hiện ở kiểu
hình. Thông thường để chọn lọc cần phải tiến hành phân tích ở mỗi thế hệ. Công
việc này đối với các tính trạng đa gen là không dễ dàng và rất tốn thời gian, hiệu
quả không cao. Tuy nhiên, nó có thể được giải quyết nhanh chóng nhờ việc sử dụng
nhiều chỉ thị liên kết với từng gen quy định tính trạng đó. Từng cá thể được xác
định mang bao nhiêu gen quan tâm quy định tính trạng quan tâm mà không cần
phân tích các thế hệ lai. Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử đặc biệt hiệu
quả với trường hợp cần đưa gen lặn hoặc cùng lúc đưa nhiều gen khác nhau vào
một hệ gen đích.
Cở sở cho ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống là tất cả mọi cơ thể
sống được cấu tạo từ tế bào, với vật chất di truyền là ADN. ADN là một chuỗi dài
các base nitơ. Trong đó, gen chỉ là đoạn nhỏ trình tự ADN, phần còn lại ADN
không mã hóa và vai trò của phần này vẫn chưa được hiểu rõ. Vật chất di truyền
trong cơ thể được tổ chức thành các sợi nhiễm sc thể và toàn bộ tổ chức này được
gọi là hệ gen. Ở cá thể lưỡng bội mỗi gen có hai allen một từ mẹ và một từ bố. Chỉ
thị phân tử không phải là một gen, chúng không có bất kỳ một tác động sinh học
nào. Chúng chỉ là một vi trí (cột mốc) trong hệ gen và chúng tuân theo các quy luật
cơ bản của di truyền. Do vậy chúng được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác một

các ổn định, không giống như các chỉ thị hình thái có thể nhìn thấy được cũng như
chỉ thị hóa học là các protein sản phẩm của gen.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Một cơ sở quan trọng khác cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn
giống là sự phát triển mạnh mẽ về loại cũng như số lượng chỉ thị phân tử. Các loại
và số lượng chỉ thị phân tử rất phong phú và đa dạng. Chỉ thị phân tử phân bố khp
nơi trong hệ gen, với các đặc tính riêng cho từng cá thể cũng như từng quần thể.
1.4.2. Tiêu chuẩn của chỉ thị phân tử sử dụng trong chọn giống
Trong thực tế có rất nhiều loại chỉ thị, ngay trong một loại chỉ thị cũng có
một số lượng rất lớn các chỉ thị. Tuy nhiên, để một chỉ thị phân tử được sử dụng
trong chọn lọc nó phải đảm bảo rất nhiều tiêu chí: cho lượng thông tin cao, mức độ
tin cậy, hiệu quả về thời gian và giá thành, kỹ thuật đơn giản… Tiêu chuẩn quan
trọng bậc nhất để chỉ thị đó được sử dụng trong chọn lọc đó là có vị trí xác định trên
bản đồ di truyền và có sự liên kết chặt chẽ với gen quan tâm. Khoảng cách giữa chỉ
thị sử dụng và gen quan tâm cần được xác định. Tuy nhiên, khoảng cách này không
thể xác định được một cách trực tiếp, mà phải thông qua các giá trị đo đếm được
như chiều cao cây, màu sc, và tính chống chịu. Những giá trị đó chính là dữ liệu
kiểu hình, dữ liệu này được kết hợp với dữ liệu kiểu gen qua sử dụng chỉ thị phân
tử. Từ đó, khoảng cách giữa chỉ thị và gen quan tâm được xác định, đơn vị tính của
khoảng cách này là centimorgan (cM). Một chỉ thị sẽ được sử dụng trong chọn lọc
khi khoảng cách tới gen đích < 5 cM.
1.5. Chỉ thị SSR
Trong những năm gần đây, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng rãi trong chọn
giống cây trồng nhờ những đặc điểm ưu việt và hiệu quả mà chúng mang lại. Chỉ thị
phân tử được sử dụng trong nhiều lĩnh vực: nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản
đồ liên kết tính trạng, chọn lọc phân tử, nghiên cứu di truyền quần thể. Có nhiều
loại chỉ thị khác nhau: RAPD, RFLP, SSR… Trong tất cả các loại chỉ thị, SSR được
sử dụng phổ biến và đem lại những thành tựu đáng kể. SSR được ứng dụng rộng rãi
nhờ những đặc trưng riêng biệt: khả năng biến đổi cao, bản chất đa allen, di truyền

đồng trội, khả năng lặp lại, sự phân bố trên khp hệ gen và có vị trị đặc hiệu trên
nhiễm sc thể. SSR là đoạn ADN có trình tự lặp lại liên tiếp, mỗi đơn vị lặp lại có
từ 2 đến 6 nucleotide và số lần lặp lại có thể từ hàng chục đến hàng trăm lần. Chính
sự khác nhau về số lần lặp lại đem lại mức độ đa hình giữa các allen. Chỉ thị SSR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

không những phân bố ở các đoạn trình tự không mã hóa mà còn tìm thấy trong đoạn
trình tự mã hóa, trong lục lạp (Chung et al., 2006) và ty thể của sinh vật
(Rajendrakumar et al., 2007). Hiện nay, số lượng chỉ thị SSR vẫn phát triển không
ngừng và ngày càng nâng cao khả năng ứng dụng trong chọn giống cây trồng.
1.5.1. Nguyên nhân phát sinh tính đa hình của chỉ thị SSR
Mức độ đa hình của chỉ thị SSR là do đặc điểm cấu tạo của chúng mang
lại. Bất kỳ sự thay đổi nào ở trong vùng lặp lại đều dẫn đến việc tăng hoặc giảm số
lần lặp tại vị trí đó. Kết quả của các đoạn lặp lại là một quá trình tiến hóa cơ bản của
sinh vật và đã được chứng minh là hết sức phức tạp (Ellegren et al., 2004; Pearson
et al., 2005). Quá trình tạo nên các đoạn lặp lại liên quan đến lỗi trượt trên sợi ADN
đơn (Slippage), sự tái tổ hợp sợi đôi ADN (sự trao đổi chéo không cân bằng, sự
chuyển gen) quá trình sửa chữa các đoạn đứt gãy, bị lỗi hoặc do các gen nhảy.
Trong quá trình sao chép phân tử ADN, quá trình di chuyển của ADN polymerase
III trên phân tử ADN tại vùng lặp lại có thể tạo ra các đoạn ADN mới có số lần lặp
lại tăng lên hoặc giảm đi (Wang et al., 2009a). Các sai xót trong quá trình sao chép
ADN được sửa chữa bởi phức hệ Mismatch repair (MMR). Do vậy tính ổn định của
đoạn lặp lại phụ thuộc vào sự cân bằng giữa lỗi trượt trên phân tử ADN và hiệu quả
của phức hệ MMR. Khi đột biến xảy ra ở gen mã hóa phức hệ MMR hoặc mức hiệu
quả của phức hệ giảm, sự mất ổn định của các SSR tăng lên. Ngoài ra các tác nhân
gây đột biến ở bên ngoài môi trường như: tia UV, các chất gây đột biến cũng làm
tăng tỷ lệ đột biến ở các chỉ thị SSR. Trong khi các đột biến điểm thường ct các
đoạn lặp dài thành các đoạn ngn hơn, thì slippage lại tạo nên các đoạn lặp lại dài.
Như vậy, tần số đột biến điểm cũng như slippage đều ảnh hưởng trực tiếp đến sự
phân bố của các chỉ thị SSR trong hệ genome. Ngoài 2 tác nhân chính bên trên gây

nên tính đa hình của các SSR, thì Retrotransposition cũng là một tác nhân gây nên
tính đa hình của các chỉ thị SSR. Retrotransposition là các đoạn ADN lặp lại được
tạo ra bởi quá trình phiên mã ngược từ phân tử ARN bất kỳ, chúng có thể chèn vào
vị trí bất kỳ nhiễm sc thể. Sự phát sinh các SSR nhờ sự kiện retrotransposition đã
được chứng minh khi phân tích hệ genome của lúa (Temnykh et al., 2001; Parida et
al., 2009) có tới 23,1% các microsatellite có chứa các trình tự tương đồng đáng kể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

với các retrotransposon. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng các retrotransposon
liên quan đến trình tự motif SSR để phát triển các chỉ thị di truyền đa hình trong
nghiên cứu. Việc thêm các retrotransposon vào giữa các gen có thể giữ vai trò chủ
yếu trong việc tăng kích thước của hệ genome sinh vật.

1.5.2. Phân bố SSR trong gen và ảnh hưởng của chúng.
Có nhiều bằng chứng đã chứng minh các SSR chiếm một phần lớn các
DNA không mã hóa. Tuy nhiên, gần đây nhiều kết quả nghiên cứu đã xác minh một
số lượng SSR nằm trong vùng mã hóa bộ gen. Mặc dù, số lần lặp lại của các SSR
trong vùng này tương đối thấp (Morgante et al., 2002; Li et al., 2004). Ví dụ, trong
ngũ cốc (ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến và lúa), chỉ có 1,5-7,5% SSRs nằm trong
vùng EST (Kantety et al., 2002;. Thiel et al., 2003). Kiểu lặp lại 2 nucleotide là phổ
biến nhất trong nhiều loài, nhưng tần số xuất hiện vùng mã hóa thấp hơn so với các
vùng không mã hóa (Li et al., 2002). Ở nhiều loài, trong vùng mã hóa kiểu lặp lại
SSR ba nucleotide nhiều hơn so với kiểu lặp đi lặp lại khác (Morgante et al., 2002;
Li et al., 2004). Sự phổ biến của kiểu lặp lại 3 nucleotide được giải thích bởi mã quy
định là mã bộ ba. Các kiểu lặp lại khác trong vùng mã hóa làm thay đổi các mã bộ
ba khác trong khung đọc. Ở thực vật, kiểu lặp lại 3 nucleotide phổ biến nhất là AAG
(Li et al., 2004). Mặc dù, trong các loại cây trồng lại là CCG (Cordeiro et al., 2001;
Varshney et al., 2002; Thiel et al., 2003). Các phổ biến của kiểu lặp lại CCG là một
đặc trưng riêng biệt của cây một lá mầm. Điều này có thể là do tỷ lệ GC cao trong
hệ gen hoặc tỷ lệ cao của một amino acid (Morgante et al., 2002). Đối với thực vật

2 lá mầm kiểu lặp lại đặc trưng là đơn nucleotide.
Vị trí của SSR trong hệ genome quyết định đến vai trò của chúng. Vì thế
chúng có khả năng ảnh hưởng đến toàn bộ chức năng di truyền như: điều hòa biểu
hiện gen, sinh trưởng và phát triển. SSR nằm trong vùng mã hóa, có thể ảnh hưởng
đến hoạt động của gen, biểu hiện của protein. Nếu chúng nằm trong vùng không mã
hóa 5’untranslated regions (UTR) hoặc các intron, chúng có thể ảnh hưởng đến quá
trình điều hòa và phiên mã gen (Lawson và Zhang., 2006). Theo các dữ liệu hiện có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thì số SSR trong vùng không mã hóa 5’-UTR nhiều hơn trong vùng mã hóa. Sự có
mặt của các SSR trong vùng 5’-UTR là cần thiết đối với một số gen. Sự thay đổi
trong các SSR này có thể điều hòa biểu hiện của gen đó qua quá trình phiên mã và
dịch mã. Độ dài của các SSR trong vùng 3’ UTR có thể gây nên hiện tượng trượt
trong quá trình phiên mã và tạo ra các phân tử mARN dài hơn. Điều này có thể gây
rối loạn quá trình ct nối phân tử mARN (splicing) và các chức năng nội bào khác.
Việc kéo dài các SSR trong vùng 3’ UTR cũng như trong các intron có thể làm bất
hoạt gen (gene silencing). Tất cả những thay đổi của các SSR trong gen (ngn đi
hay dài thêm) đều có thể dẫn đến sự thay đổi kiểu hình (Li et al.,. 2004). Tuy nhiên,
sự hiểu biết về các gen có chứa các SSR cũng như vai trò của các kiểu lặp lại SSR ở
cây trồng vẫn còn hạn chế (Varshney et al., 2005a). Fujimori và cộng sự (2003) cho
rằng các đoạn SSR nằm trong vùng 5’-UTR của gen thực vật có thể có vai trò như
yếu tố điều hòa biểu hiện gen. Ở lúa, hàm lượng amylose có mối tương quan với sự
thay đổi số lượng GA hoặc CT lặp lại trong 5’ UTR của gen waxy (Bao et al.,
2002). Tương tự ở ngô, kieur lặp lại (CCG)
n
trong vùng 5’ UTR của gen protein
ribosome ngô có liên quan đến sự điều hòa quá trình thụ tinh ở ngô (Dresselhaus et
al., 1999).
1.5.3. Xây dựng và phát triển chỉ thị SSR
Chỉ thị SSR được ứng dụng rất nhiều trong chọn giống cây trồng. Tuy

nhiên, sự phát triển của chúng mới chỉ tập trung vào một số loại cây trồng. Nguyên
nhân của sự hạn chế này là do việc xây dựng và phát triển chỉ thị này trên một đối
tượng mới gặp nhiều khó khăn. Theo phương pháp truyền thống, để xây dựng được
một chỉ thị SSR cho một loài mới cần có một thư viện genome của loài đó. Chỉ thị
SSR sẽ được phát hiện khi lai hàng nghìn colony với đầu dò (probe) có trình tự lặp
lại. Tuy nhiên, phương pháp này không hiệu quả đối với các microsatellite có tần số
thấp. Đặc biệt ở thực vật, khi kiểu lặp lại phổ biển là AT, chúng có thể đảo đầu xuôi
ngược gây khó khăn trong phân lập từ thư viện genome. Do vậy, đã có một vài
phương pháp thay thế cho phương pháp truyền thống như: dựa trên các băng nhân
lên từ phản ứng RAPD, sàng lọc trên dữ liệu trình tự EST, hay chuyển đặc hiệu các
chỉ thị của các loài liên quan. Tang và cộng sự (2008) đã xác định được một lớn chỉ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thị SSR đa hình bằng cách sử dụng nguồn dữ liệu trình tự EST sẵn có của khoai tây,
cà chua, gạo, arabidopsis và brassica (Tang et al., 2008). Ưu điểm của các chỉ thị
SSR – EST là phát hiện sự thay đổi ngay trong phần gen biểu hiện. Vì vậy, các chỉ
thị này sẽ là các chỉ thị liên kết chặt chẽ với các tính trạng nào đó và được sử dụng
trong chọn lọc. So với các chỉ thị SSR genome, chỉ thị SSR – EST có mưc đa hình ít
hơn Ngoài ra, do đặc tính bảo thủ của đoạn lặp lại. Các chỉ thị này còn có thể sử
dụng cho các loài có quan hệ gần gũi khác (Gupta et al., 2003 Ellis và Burke, 2007;
Varshney et al., 2007). Tuy nhiên, khi sử dụng trên các loài có quan hệ gần gũi, chỉ
thị SSR – EST đem lại hiệu quả cao hơn so với SSR genome. Parida
và cộng sự (2009) đã thử nghiệm khả năng thành công của các chỉ thị SSR genome
mía trên các loài Saccharum khác và với năm loài ngũ cốc. Tỷ lệ thành công với các
loài Saccharum khác 93,2 % và với 5 loài ngũ cốc là 25% (Parida et al., 2009).
1.5.4. Ứng dụng của chỉ thị SSR trong chọn giống cây trồng
Phân tích đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền giữa các
loài thực vật là những thông tin quan trọng cho chiến lược bảo tồn và phát triển các
giống cây trồng (Romero et al., 2009). Hơn nữa, những thông tin này cũng hữu ích
cho việc mô tả nguồn gen và phân loại thực vật. Trong những năm gần đây, chỉ thị

SSR đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định đa dạng di
truyền (sự thay đổi trong trình tự nucleotide, cấu trúc gen, nhiễm sc thể và toàn bộ
hệ genome) và các mối quan hệ phát sinh loài của loài dựa trên trình tự bảo thủ cao
của nó.
Một ứng dụng khác của chỉ thị SSR là xác định hiệu quả của cặp lai hữu
tính, trong đó đặc tính di truyền đồng trội của chỉ thị SSR đóng vai trò quyết định
và cho phép xác định mức đóng góp các allen của cá thể bố mẹ cho con lai trong
phép lai. Một số loại thực vật có hoa sinh sản lưỡng tính. Trong đó, chỉ những cá
thể cái mới có giá trị thương mại nhờ tạo ra các loại trái cây (đu đủ, kiwi,
seabuckthorn ) và các loại hạt (quả hồ trăn, hạt tiêu đen, jojoba vv ) Tuy nhiên,
các loại cây này không có sự khác biệt về mặt hình thái giữa cây đực và cây cái nên
không phân biệt được ở giai đoạn cây còn non và chỉ phân biệt được vào thời kỳ ra
hoa. Thời gian ra hoa của các loại cây này có thể mất vài tháng đến vài năm. Việc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

này gây tốn kèm và lãng phí rất nhiều. Sử dụng các chỉ thị SSR liên kết với giới tính
giúp chọn lọc ngay từ giai đoạn cây non, đem lại lợi ích kinh tế cao hơn. Một số chỉ
thị phân tử SSR liên kết với giới tính đã được sử dụng ở một số loài như: gai dầu
(Rode et al., 2005), dâu tây hoang dã (Spigler et al., 2008), hop (Jakse et al., 2008),
đu đủ Carica (Parasnis et al., 1999).
Chỉ thị phân tử SSR đã chứng minh có hiệu quả trong xác định các
vùng gen chịu trách nhiệm cho sự biểu hiện của các tính trạng nông học và quá trình
sinh lý quan trọng. Ngoài ra, chúng cũng được sử dụng trong phân tích cá locus tính
trạng số lượng (quantitative trait loci - QLT), mà qua đó có thể xác định được các
gen quy định các tính trạng mong muốn. Một số tính trạng liên quan đến các yếu tố
cấu thành suất, chất lượng quả, hạt, khả năng kháng sâu bệnh và các điều kiện bất
lợi của môi trường (Neeraja et al., 2007; Romero et al., 2009). Tuy nhiên, trái
ngược với các chỉ thị phát triển từ phát triển từ thư viện genome, Các chỉ thị EST-
SSRs có thể đóng góp trực tiếp allen chọn lọc bởi vì đã biết được chức năng của
chúng và chúng có thể liên kết với tính trạng mong muốn (Varshney et al., 2005a).

Bản đồ liên kết cũng đề cập đến mối liên kết chặt chẽ giữa chỉ thị phân tử với các
tính trạng kiểu hình. Điều này đặc biệt có ích trong quá trình chọn lọc nhờ sự trợ
giúp của chỉ thị phân tử với các tính trạng số lượng trong các chương trình chọn tạo
giống (Breseghello et al., 2006b).
1.6. Thành tựu nghiên cứu chọn giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao nhờ sự
trợ giúp của chỉ thị phân tử
1.6.1. Thành tựu nghiên cứu đa dạng di truyền các giống mía
Hiệu quả của các chương trình lai tạo phụ thuộc nhiều vào mức độ đa dạng
di truyền của bố me. Phương pháp đánh giá mức độ đa dạng di truyền bằng các chỉ
thị phân tử đem lại kết quả chính xác hiệu quả, qua đó sử dụng hiệu quả nguồn vật
liệu trong tương lai. Bao và cộng sự đánh giá đa dạng di truyền của 78 giống mía
trồng phổ biến ở Trung Quốc với 15 cặp mồi AFLP. Kết quả tỷ lệ đa hình trên các
locus trung bình là 82,55%. Hệ số tương đồng di truyền của 78 giống mía khác
nhau từ 0,453 đến 0,892, với hệ số trung bình là 0,682. Trong khi hệ số tương đồng
của các con lai từ các giống nghiên cứu là 0,765. Bảy mươi tám giống chia thành
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

bảy nhóm. Hầu hết các giống có mối quan hệ gần gũi đều nằm cùng một phân nhóm
phụ. Các giống được trồng ở các thời kỳ khác nhau cho thấy sự khác biệt đáng kể
trong hệ số tương đồng đa dạng di truyền, những giống đã phát triển trong những
năm 1980 đã có hệ số tương đồng cao nhất (0,318 5) và thấp nhất trong năm 1970
(0,264). Có sự khác biệt rõ ràng giữa các giống từ các tỉnh khác nhau với hệ số
tương đồng di truyền từ 0,195 đến 0,299. Nhóm có hệ số tương đồng cao nhất trong
nghiên cứu thuộc các giống của tỉnh Quảng Đông và thấp nhất từ Vân Nam (Bao et
al., 2009).
Chỉ thị AFLP được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền
nhờ các đặc tính ưu việt của chúng như: không cần biết trình tự của đối tượng
nghiên cứu, mức độ đa hình của chỉ thị cao, kết quả nghiên cứu chúng được phát
triển thành các chỉ thị đặc trưng liên kết với các tính trạng mong muốn. Sử dụng 16
cặp mồi AFLP nghiên cứu trên 36 giống mía trồng ở Pháp, Perera và cộng sự thu

được thu được tổng cộng 995 băng, số băng trung bình trên mỗi chỉ thị là 62 băng.
Trong đó có 193 băng đa hình, tỷ lệ băng đa hình khá thấp 19,40 %. Hệ số PIC của
chỉ thị dao động từ 0,01 đến 0,28. Các giống nghiên cứu được chia làm 7 nhóm nhỏ
với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,94 đến 0,99 (Perera et al., 2012).
Sử dụng 15 cặp mồi SSR phân tích mối quan hệ di truyền của 17 giống mía
chọn lọc, Pandey và cộng sự (2011) thu được 10 mồi đơn hình 5 mồi đa hình. Năm
mồi đa hình tạo ra 148 băng đa hình ở 17 giống mía. Dựa trên kết quả phân tích của
5 mồi đa hình và 10 mồi đơn hình xây dựng được mối quan hệ tương đồng di truyền
của 17 giống mía. Khoảng cách đa dạng di truyền của 17 giống dao động từ 0,36
đến 1,0 (Pandey et al., 2011). Mối quan hệ di truyền của các giống mía hiện đại khá
gần nhau thể hiện qua hệ số tương đồng cao giữa các giống mía (Banumathi et al.,
2010; Da Costa et al., 2011).
1.6.2. Kết quả lập bản đồ gen mía và các chỉ thị liên quan với tính trạng hàm
lượng đường cao
Mía được quan tâm sau các cây trồng khác trong việc sử dụng các chỉ thị
phân tử. Bởi sự phức tạp về mặt di truyền của chúng như: kích thước hệ gen lớn,
nhiều allen trên một locus (Souza et al., 2011; Marconi et al., 2011). Thông qua
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

phương pháp bản đồ chỉ thị đơn dòng đã làm cho dễ dàng phát triển bản đồ liên kết
di truyền và khả năng của chúng để nhận ra và xác định số lượng sự ảnh hưởng đơn
giản (Daugrois et al., 1996; Raboin et al., 2006) cũng như phức tạp (Ming et al.,
2001; Aitken et al., 2006) của những vùng gen lên tính trạng. Ming et al., (2001) đã
phát một số chỉ thị liên kết có quan hệ tuyến tính làm giảm sự tích trữ sucrose đã
được di truyền ở S. officinarum. Ngược lại, năm 2005 Reffay và cộng sự đã phát
hiện ra một vài chỉ thị phân tử liên kết làm tăng khả năng tích trữ sucrose cũng được
di truyền ở S. Spontaneum (Reffay et al., 2005). Với việc sử dụng 2 giống S.
officinarum và S. spontaneum để tạo quần thể cho việc lập bản đồ. Hai bản đồ liên
kết di truyền đã được xây dựng: một của S. spontaneum bao gồm 121 chỉ thị đã xác
định liên kết rải trên 45 nhóm liên kết, trong khi đó bản đồ S. officinarum có 146

chỉ thị đã xác định liên kết rải trên 49 nhóm liên kết. Nghiên cứu bản đồ một cách
chi tiết đã được trình bày trong báo cáo (Alwala et al., 2008; Andru et al., 2011).
Một điều quan trọng người ta tìm thấy là những cây mía có hàm lượng đường cao
đồng thời có một số lượng lớn QTL đối với các yếu tố cấu thành năng suất (Pastina
et al., 2012; Kasetsart et al., 2010). Điều này cho phép sử dụng chỉ thị phân tử trong
chọn tạo giống mía có hàm lượng đường cao. Với việc sử dụng một loạt các chỉ thị
phân tử như AFLP, SRAP, TRAP Alwala và cộng sự (2009) đã phát hiện ra một
số chỉ thị liên kết với một số tính trạng liên quan đến hàm lượng đường ở thời kỳ
sinh trưởng sớm cũng như muộn của mía.
Liên quan đến khả năng tích lũy sucrose trong cây mía chín, Lingle và
Irvine (1994) đã tìm thấy mối liên hệ ở mức độ cao của hoạt tính enzyme tổng hợp
sucrose với việc tăng khả năng tích lũy sucrose trong cây mía chín. Tuy nhiên, kết
quả của các tác giả khác (Zhu et al., 1997; Botha et al., 2000) chỉ ra không có sự
liên quan giữa hoạt tính enzyme tổng hợp sucrose và sự tích lũy sucrose. Các kết
quả trái ngược nhau này có thể do ảnh hưởng giữa các kiểu gen khác nhau, các
giống khác nhau. Allen mã hóa cho một enzyme hoạt động làm giảm hàm lượng
sucrose đã giải thích sự tương quan nghịch đã được tìm thấy giữa chỉ thị pA35 và
giá trị Pol.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Vinayak và cộng sự (2010) sử dụng 10 cặp mồi đặc hiệu để chọn lọc các
dòng có hàm lượng đường cao trong quần thể lai. Trình tự các mồi thiết kế dựa trên
nhận biết mức độ đa dạng của vùng promoter của gen tổng hợp sucrose, trình tự các
gen tổng hợp và chuyển hóa sucrose. Kết hợp quả phân tích với các mồi đặc trưng
và các chỉ tiêu liên quan đến hàm lượng đường, đã chọn lọc được 2 chỉ thị có khả
năng nhận biết các dòng mía có hàm lượng đường cao. Các băng đặc trưng của 2
chỉ thị có kích thước là: 230 và 500 bp. Ngoài ra, còn có một chỉ thị có khả năng
nhận biết dòng có hàm lượng đường thấp, với sự có mặt của băng đặc trương kích
thước khoảng 920 bp.
Một số bản đồ chỉ thị phân tử của cây mía đã được lập (Ming et al., 1998,

2002a; Hoarau et al., 2001; Aitken et al., 2005) nhưng hầu hết các chỉ thị này cũng
chỉ phủ kín 60% genome. Những bản đồ này đã được sử dụng để phân tích các QTL
bước đầu cho một số tính trạng liên quan đến hàm lượng đường (Ming et al., 2001,
2002b; Hoarau et al., 2002) và phát hiện nhiều QTL đóng góp phần nhỏ sự tích luỹ
hàm lượng đường trong cây mía. Sự nhận biết những QTL cho việc tăng cường tích
luỹ hàm lượng đường có thể cải thiện có hiệu quả chương trình chọn giống mía hiện
nay (Aitken et al., 2006).









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
Vật liệu sử dụng trong nghiên là các giống mía được trồng ở miền Bc và
một số giống trồng ở miền Nam Việt Nam. Các giống mía và quần thể con lai của
cặp lai Roc26 x K88-200 được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển
lúa lai, Viện Cây lương thực và cây thực phẩm - Viện Khoa học kỹ thuật nông
nghiệp Việt Nam. Gồm các giống trong bảng 1.
Bảng 3. Các giống mía sử dụng trong nghiên cứu
Stt
Tên mẫu
Bố mẹ
Xuất xứ

1
K95-84
K90-79 x K84-200
Thái Lan
2
Ern08-030
VN08-030
Việt nam
3
RB72-454
Không rõ bố mẹ
Braxin
4
32
Không rõ bố mẹ
Không rõ
5
K88-92
Uthong 1 x PL310
Thái Lan
6
C0414
Không rõ bố mẹ
Ấn Độ
7
Ty70-17
C87-51 x Ja60-5
Trung Quốc
8
KU00-1-61

K84-200 x đa giao
Thái Lan
9
KK2
Không rõ bố mẹ
Thái Lan
10
PLP85-86
Không rõ bố mẹ
Philippin
11
Ern08-028
(VN08-028)
Việt nam
12
Ern08-027
VN08-028
Việt nam
13
K93-027
Uthong 1 x Ehaew
Thái Lan
14
Roc26
71-296 x ROC11
Trung Quốc
15
KU60-1-58
Uthong 3 x NCo310
Thái Lan

16
K88-200
Không rõ bố mẹ
Không rõ
17
C1324-74
B45181 x C87-51
Cuba
18
KU60-2
K88-92 X K92-166
Thái Lan
19
K90-54
K83-74 x Uthong 1
Thái Lan
20
QD21
MT76-65 x MN 71-374
Trung Quốc
21
K95-156A
PL310 x Uthong 1
Thái Lan
22
Ku00-1-92
Uthong 1 x K84-200
Thái Lan
23
K95-283

Q79 (Open Pollination)
Thái Lan