Kiểm định nguồn gốc thực phẩm : Kỹ thuật miễn dịch enzyme

8/22/2014
1
KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM
BF5320
KỸ THUẬT ENZYME
Th.S HOÀNG QUỐC TUẤN
TS. NGUYỄN THỊ THẢO
KỸ THUẬT MIỄN DỊCH ENZYME (ENZYME
IMMUNOASSAY)
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Direct ELISA (ELISA trực tiếp)
ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
Sandwich ELISA
ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)
/>peptides, protein, antibodies, hormone,…
EIA (Enzyme ImmunoAssay)
• Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng
là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực
hiện qua hai bước:
• Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng
nguyên và kháng thể
• Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của
enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H
2
O
2
để
oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu
của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
8/22/2014
2

nitrophenol phosphate
Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác
biệt nhỏ giữa các kháng nguyên
nếu sử dụng kháng thể bắt và
kháng thể phát hiện khác nhau.
Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do
antispecies kháng thể được gắn enzyme
không phản ứng với kháng thể bắt kháng
nguyên.
8/22/2014
3
Ưu điểm: Đơn giản nhất
Nhược điểm:
• Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên
có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà
phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào
một epitope.
• Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với
từng đối tượng
8/22/2014
4
• Ưu điểm:
Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh
dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và
kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.
• Nhược điểm:
Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác
nhau. Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa
các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với
nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có

thể tin tưởng được
Direct ELISA (ELISA trực tiếp)
ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
8/22/2014
5
Sandwich ELISA
ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng
ELISA
• Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy
giếng
• Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng
nguyên
• Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên
8/22/2014
6
Ứng dụng phương pháp enzyme immunoassay
8/22/2014
7
Ứng dụng phương pháp enzyme immunoassay
Kháng nguyên Giới hạn phát hiện
Huyết thanh, albumin (Lợn) 1-10%
Dịch chiết cơ xương (Lợn, Gà) 250 ppm (Thịt lợn)
126 ppm (Gia cầm)
Desmin (Gà) 10%
Huyết thanh (Bò) <10%
Protein cơ đã gia nhiệt (Lợn) 0.5%
Huyết thanh albumin (Bò, Ngựa, Lợn) 3%
Albumin (Bò, Ngựa, Lợn, Gà) 0.6%
Dịch chiết Sarcoplasmatic (Lợn) 1%

Protein cơ hòa tan (Gà) 1%
Glycoprotein (Lợn) 0.06%
Protein cơ (Lợn) 1%
IgG (Lợn, Gà, Bò) <1%
Huyết thanh Protein (Trâu, Dê, Lừa) 0.1-1%
Tht và sn phm t tht
Sa và sn phm t sa
Kháng nguyên Giới hạn phát hiện
β-Lactoglobulin 0.5% sữa bò
κ-Casein 0.25% sữa bò
IgG Bò 0.0008% sữa bò tươi
Whey Protein Bò 1% sữa bò
Whey Protein Dê 0.5% sữa bò
α-S2-casein 0.5% sữa dê
β-lactoglobulin Bò 0.0001% sữa bò
γ3-Casein 0.2% sữa bò
IgG Dê 1% sữa bò
8/22/2014
8
8/22/2014
9
KỸ THUẬT ENZYME
Các chất có thể phân tích bằng phương pháp enzyme
Đường Axit/Muối Alcohol Chất khác
D-fructose Acetate Cholesterol Acetaldehyde
D-galactose L-ascorbate Ethanol Ammonia
D-glucose Citrate Glycerol Urea
Lactose Formate D-sorbitol
Maltose D-gluconate Xylitol
Tinh bột L-glutamate

Sucrose D-3-hydroxybutyrate
D-isocitrate
D-và L-lactate
Ammonia