Đề tài ảnh hưởng của vi khuẩn bacillus subtilis trong việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch tại phường khánh xuân thành phố buôn ma thuột

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ
BỘ MÔN SINH HỌC THỰC NGHIỆM
ĐỀ TÀI: ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG VIỆC
XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM RAU XANH SAU THU HOẠCH TẠI PHƯỜNG
KHÁNH XUÂN, THÀNH PHỐ BUÔN MA THUỘT
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trinh
Lớp: Cử nhân sinh K11
Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh hóa
Đắk Lắk, ngày 09 tháng 10 năm 2014
MỤC LỤC
Contents
2
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề.
Việt Nam là một nước đang phát triển với nền tảng là một nước nông nghiệp. Từ
một nước có hàng ngàn người chết vì nạn đói năm 1968. Đến nay, Việt Nam là một trong
những nước có số lượng nông sản xuất khẩu đứng đầu thế giới.
Đắk Lắk nói chung và phường khánh xuân nói riêng, là trung tâm sản xuất nông
nghiệp của vùng tây nguyên. Từ nhiều năm nay, khu vực sản xuất rau an toàn ở tổ dân
phố 12 thuộc hợp tác xã Nông nghiệp Thuận Hòa (Phường Khánh Xuân, TP. Buôn Ma
Thuột) đã trở thành nơi tin cậy của nhiều người tiêu dung, các nhà nghiên cứu khoa học
và các nhà quản lý sản xuất nông nghiệp.
Tổ sản xuất rau an toàn thuộc HTX Nông nghiệp Thuận Hòa được thành lập tháng
6 năm 2008 với số hội viên ban đầu là 28 hộ nông dân có tổng diện tích đất sản xuất là
5,6 ha, đến nay, số hội viên của HTX đã tăng lên 44 hộ với tổng diện tích là 6,6 ha
[1][6]
. Số
diện tích đất sản xuất rau tăng lên cũng đồng nghĩa với lượng phế phụ phẩm trong sản
xuất nông nghiệp cũng tăng lên. Lượng phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi thu hoạch
được người nông dân sử dụng dung dung để đun nấu và một phần rất nhỏ được dung để

sản xuất phân xanh. Tuy nhiên, hiện nay hầu hết các hộ dân đã chuyển sang dung các loại
nguyên liệu khác như: than, gas, điện…. Đặc biệt, vào mua mưa hoặc là những lúc gặp
dịch bệnh, lượng phế phụ phẩm tăng lên nhiều. Lượng phế phụ phẩm quá nhiều, người
dân không kịp xử lý và khi chúng tự phân hủy sẽ gây ra mùi hôi thối rất khó chịu làm ô
nhiễm môi trường và tọa điều kiện cho các vi sinh vật gây bệnh cho hoa màu phát triển,
gây ảnh hưởng đến hiệu quả của vụ canh tác tiếp theo.
Để góp phần vào việc giúp đỡ người nông dân xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp sau
khi thu hoạch, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus
Subtilis trong việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch tại phường Khánh
Xuân, Thành phố Buôn Ma Thuột”.
2. Mục tiêu đề tài.
3
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển
chọn trong chế phẩm sinh học xử lý nước thải của Nhật Bản và đánh giá khả năng xử lý
phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch của vi khuẩn Bacillus subtilis.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.
3.1. Ý nghĩa khoa học.
Đánh giá khả năng xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch (gốc rau và lá
rau bị hỏng) của vi khuẩn Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học xử lý môi trường của
Nhật Bản, từ đó bổ sung thêm nhóm vi khuẩn có giá trị này vào việc xử lý phế phụ phẩm
rau xanh tại phường Khánh Xuân, TP. Buôn Ma Thuột.
3.3.Ý nghĩa thực tiễn.
Việc nghiên cứu và sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng xử lý phế phẩm
rau xanh góp phần quan trọng trong việc giảm ô nhiễm môi trường và hạn chế các mầm
bệnh phát triển tại khu sản xuất rau an toàn ở phường khánh xuân, từ đó bảo vệ môi
trường và cải thiện tình hình sản xuất nông nghiệp ở đây.
4. Giới hạn của đề tài.
Trong quá trình thực hiện, vì lý do kinh phí có hạn nên đề tài không thể thực hiện
lặp lại thí nghiệm nhiều lần.
Địa điểm tiến hành thí nghiệm là tại khu sản xuất rau an toàn thuộc HTX Thuận

Hòa, tổ dân phố 12, phường Khánh Xuân, TP. Buôn Ma Thuột.
4
PHẦN I . TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về phường Khánh Xuân
1.1.1 Điều kiện tự nhiên
 Vị trí địa lý:
Diện tích: tổng diện tích tự nhiên là 21,88 km
2
. Phường Khánh Xuân được thành
lập ngày 21, tháng 1, năm 1995
Tọa độ:
• 12
o
38’34”B
• 107
o
59’17”Đ
- Phía Đông tiếp giáp phường Ea Tam, thành phố Buôn Ma Thuột.
- Phía Tây tiếp giáp xã Hòa Xuân, thành phố Buôn Ma Thuột.
- Phía Nam giáp xã Hòa Khánh, thành phố Buôn Ma Thuột.
- Phía Bắc giáp Phường Tân Thành, thành phố Buôn Ma Thuột.
 Địa hình, địa chất
Phường Khánh Xuân có địa hình tương đối gồ ghề và có hướng nghiêng dần từ
Đông sang Tây.
Đất nâu vàng trên đá Bazan thích hợp với nhiều loại cây công nghiệp hàng năm
và lâu năm.
Đất đỏ vàng trên đá phiến sét.
Đất đen trên sản phẩm đá Bazan.
 Khí hậu, thủy văn:
Phường Khánh Xuân nằm ở vùng khí hậu cận nhiệt đới, khí hậu gió mùa, một năm

có hai mùa rõ rệt, mùa mưa bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 10 và mùa nắng bắt đầu từ
tháng 11 đến tháng 4 năm sau.
Các thông số về điều kiện khí hậu của phường Khánh Xuân được trung tâm dự báo
khí tượng thủy văn tỉnh Đắk Lắk ( trạm Buôn Ma Thuột), ghi nhận từ năm 2004 – 2006
như sau:
+ Nhiệt độ, độ ẩm: Nhiệt độ bình quân khoảng 23,6
o
C. Độ ẩm bình quân là 84%,
thấp nhất là 71%. Về mùa khô không khí thường khô hạn.
5
+ Lượng mưa: Lượng mưa bình quân hàng năm khoảng 1.900-2.000 mm tập trung
vào mùa mưa (90%). Lượng mưa phân bố không đều, ảnh hưởng đến sản xuất nhất là sản
xuất nông nghiệp và sinh hoạt của nhân dân.
+ Hệ thống sông suối: có suối Ea Knia và suối Ea Tam.
+ Hệ thống Hồ, Đập: có hồ Thống Nhất, hồ Đồi Thông và đập Giò Gà.
1.1.2. Điều kiện kinh tế xã hội
 Dân số:
Năm 1999 phường Khánh Xuân có khoảng 21583 người. Hiện nay, dân số của
phường đã có khoảng 23.444 người với mật độ là 986 người/km
2
.
‘ Trên địa bàn phường có 16 thôn, buôn và có 2 dân tộc anh em cùng chung sống,
đó là dân tộc Kinh và Ê Đê.
Người dân chủ yếu sống bằng nghề nông (lúa, cà phê, hoa màu)
 Đất đai:
Tổng diện tích đất tự nhiên: 2.184 ha. Trong đó được phân ra:
- Đất nông nghiệp: 1.216,00 ha
• Đất trồng cây hằng năm: 653,02 ha
• Đất trồng cây lâu năm: 562,98 ha
- Đất lâm nghiệp: 64 ha

• Rừng tự nhiên: 0 ha
• Rừng trồng: 38,8 ha
 Nông nghiệp:
Tổng diện tích đất gieo trồng cả năm là 1.673 ha.
Trong đó trồng các loại cây sau:
Bảng 1: Các loại cây trồng và sản lượng hàng năm tại phường Khánh Xuân
TT
TÊN CÁC LOẠI
CÂY TRỒNG
SỐ LƯỢNG/
SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM
1 Cà phê 990 tấn
2 Tiêu 84 tấn
3 Điều 112,8 tấn
6
4 Lúa 2.628 tấn
5 Rau các loại 3.300 tấn
6 Hoa màu 45 ha/270 tấn
Chăn nuôi:
Bảng 2: Các loại vật nuôi và sản lượng hằng năm tại phường Khánh Xuân
TT
TÊN CÁC LOẠI VẬT
NUÔI
SỐ LƯỢNG/
SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM
1 Heo 700.000 kg
2 Gà 180.000 kg
3 Bò 375.000 kg
4 Ong 1.075 thùng
5 Cá 90.000 kg

Bảng 3: Các đại lý, của hàng cung cấp thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y, thủy sản,
phân bón.
T
T
TÊN ĐỊA CHỈ ĐIỆN THOẠI
7
1 HTX NN Thuận Hòa TDP 9 0500.3868631
2 HTX NN Thống Nhất TDP 2 05003827402
1.2. Phế phụ phẩm nông nghiệp
1.2.1. Khái niệm
 Khái niệm: Phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm tàn dư thực vật được để lại sau khi thu
hoạch các sản phẩm trồng trọt và phế thải sau quá trình chế biến nông sản bao gồm các
hợp chất hydratcacbon, protein, photpho khó tan và một số các hợp chất hữu cơ khác. Sản
phẩm sau quá trình phân hủy ngoài tác dụng cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng
còn có khả năng làm cho đất tơi xốp, cải thiện các đặc tính của đất, nhất là khả năng giữ
nước.
1.2.2. Các phương pháp xử lý:
Phế phụ phẩm trong sản xuất nông nghiệp bao gồm phế phụ phẩm sau khi thu
hoạch và các phế phụ phẩm sau khi chế biến. Lượng phế phụ phẩm thải ra hằng ngày là
rất nhiều. Ở nhiều nơi như ở đồng bằng sông cửu long, lượng phé phụ phẩm thải ra quá
nhiều mà người dân không có biện pháp xử lý đã gây ra hiện tượng ô nhiễm nghiêm
trọng.
Có nhiều biện pháp để xử lý các loại phế phụ phẩm nông nghiệp tùy thuộc vào loại
phế phụ phẩm được thải ra. Tuy nhiên, các biện pháp này chỉ mang tính khu vực, phụ
thuộc vào tập quán sản xuất của người dân.
 Dùng Làm thức ăn cho gia súc: Các loại phế phụ phẩm như rơm rạ, thân cây bắp, cây
mì… thường được người dân sử dụng để làm thức ăn cho các loại trâu bò.
 Dùng làm nguyên liệu để đun nấu: Ở một số vùng quê nghèo, người dân vẫn thường dùng
rơm rạ hay vỏ trấu để đun nấu phục vụ cho cuộc sống hằng ngày.
 Dùng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ: Các loại phế phẩm như rơm rạ, vỏ cà

phê, thân cây bắp… được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ tại một khu
vực nhỏ.
8
Tuy nhiên, vẫn còn một số lượng lớn phế phẩm không được sử dụng, đặc biệt là
phế phụ phẩm rau xanh. Chúng thường được người dân đem đổ bỏ sau khi thu hoạch, khi
phân hủy thì chúng tạo ra mùi hôi thối rất khó chịu và gây ô nhiễm môi trường.
1.3. Vi sinh vật dùng trong xử lý.
1.3.1. Các nhóm vi sinh vật
 Các vi khuẩn hiếu khí: Chủ yếu là các vi sinh vật thuộc các chi Arzotobacter,
Achromobacter, Pseudomonas, Cellumonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus, Cytophaga,
Angiococcus, Polyangium….
 Các vi khuẩn kị khí: Điển hình là các vi khuẩn có trong dạ dày của động vật nhai lại như
các vi khuẩn thuộc các chi Ruminococcus flavefeciens, R. albus, R. parvum, Bacteroides
succinpgenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium cellobioparum, Cillobacterium
cellulosolvens….
 Các xạ khuẩn hiếu khí: Là các vi khuẩn thuộc các chi Micromonospora, Proactinomyces,
Actinomyces, Streptomyces…
 Các nhóm vi nấm: Nẩm là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó tiết ra môi trường một
lượng lớn enzymes có đầy đủ các thành phần. Ví dụ như Nấm mốc ( thuộc các chi:
Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium…), Nấm đốm (ví dụ như các loài:
Ceratocystis sp, Cladosporium sp, Aureobasidium sp, …), Nấm mục (là các loại nấm
thuộc các chi: Chaetomium, Humocola và Phialophora).
[2]
1.3.2. Vi sinh vật phân giải cenlulose
Cenlulose là thành phần chủ yếu trong tế bào thực vật. Cenlulose là hợp chất rất
bền vững, đó là loại polysaccharide cao phân tử. Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật
sinh ra các men xúc tác cho quá trình phân giải cenlulose. Chúng có ý nghĩa rất lớn trong
việc thực hiện vòng tuần hoàn Cacbon trong tự nhiên, góp phần quan trọng trong việc
nâng cao độ phì nhiêu của đất.
Cenlulose có thể bị phân giải bởi các vi sinh vật hiếu khí trong điều kiện thoáng

khí. Ngoài ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia vào quá trình phân giải
cenlulose. Ví dụ như các loài vi khuẩn: Cytophaga, Cellulomonas, giống Bacillus, giống
Clostridium, Aspergillus, Penicillium….
 Cơ chế phân giải cenlulose:
[3]
9
Chất hữu cơ là thành phần rất quan trọng trong quá trình hình thành và làm thay
đổi độ phì của đất. Sự chuyển hóa các chất hữu cơ trong đất chủ yếu đi theo hai hướng là
vô cơ hóa các chất hữu cơ và mùn hóa vật chất hữu cơ.
Cenlulose bị VSV phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn.
Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác trong đất tạo ra
mùn.
Khi mùn được tạo thành, VSV lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình amon hóa,
sự chuyển háo này giúp đất tích lũy NH
3
, quá trình tạo thành NH
3
trong đất xảy ra rất
chậm chạm, điều này thì rất có lợi cho cây trồng vì quá trình này giải phóng từ từ NH
3
cho
cây hấp thụ:
Chất mùn + O
2
+ Vi sinh vật  CO
2
+ H
2
O + NH
3

1.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis.
1.4.1. Lịch sử phát hiện.
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 bởi Christion Erenberg
và ông đã dặt tên cho loài vi khuẩn này là “Vibrio subtilis”.
Hơn 30 năm sau, Casimir Davaine đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là
“Bacteridium”.
Đến năm 1872, Ferdimand Cohn đã quan sát loài vi khuẩn này có đầu hình vuông
và đặt tên là Bacillus subtilis.
Năm 1941, tổ chức y học Nazi của Đức đã phát hiện được vi khuẩn Bacillus
subtilis trong phân ngựa. Lúc đầu chủ yếu được dùng trong phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ
của Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949-1957, khi
Henry và các cộng sự tách được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis thuần khiết. Từ đó,
“thuốc subtilis” hay còn gọi là “subtilis therapy” ra đời và được sản xuất hàng loạt dùng
trong diều trị các chứng viêm đại tràng, viêm ruột, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa.
Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, nó được sử dụng rộngrãi trong y
học, thực phẩm, chăn nuôi.
[4]
1.4.2. Đặc điểm phân loại, sự phân bố và đặc điểm sinh thái học của vi khuẩn Bacillus
subtilis
 Đặc điểm phân loại:
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
10
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
 Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc, chúng phân bố
hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng nhiều cư trú trong đất, đặc biệt là cỏ khô nên còn
được gọi là trực khuẩn cỏ khô, thông thường các loại đất trồng trọt có chứa khoảng 10 –

100 triệu CFU/g. Các loại đất nghèo chất dinh dưỡng như đất ở vùng sa mạc, đất hoang
thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Bào tử và tế bào của vi khuẩn cũng được tìm thấy
ở vùng cửa sông và ở biển.
[4]
1.4.3. Đặc điểm hình thái và cấu tạo
Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương,hình que, ngắn và nhỏ, hai đầu nhỏ,
kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, các tế bào thường đứng riêng rẽ hoặc đôi khi các tế
bào nối lại với nhau tạo thành chuỗi dài ngắn khác nhau. Vi khuẩn có 8 – 12 lông, có khả
năng di động, sinh bào tử hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích
thước bào tử 0,8 – 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử,
không kháng a xít, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ.
Khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus subtilis khô, không màu hoặc màu xám trắng,
hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay
ít, bám chặt vào môi trường thạch.
Bacillus subtilis có lớp màng nhày (giáp mạc), được cấu tạo từ polypeptit chủ yếu
là a xít polyglutamic. Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu được
điều kiện khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh
bị tổn thương khi khô hạn.
[4]
1.4.4. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon cho quá
trình sinh tổng của bản thân, trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus
cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino axit
- Điều kiện phát triển: hiếu khí, là loài ưa nhiệt cao, nhiệt độ thích hợp là từ 36
o
C –
50
o
C, tối đa khoảng 60
o

C.
11
- Nhu cầu oxy: Bacillus subtilis phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy và phát
triển tốt trong môi trường giàu oxy vì vi khuẩn thuộc nhóm hiếu khí không bắt buộc.
- Độ pH: Bacillus subtilis phát triển mạnh ở pH = 7,0 – 7.4.
- Môi trường nuôi cấy:
+ Môi trường thạch đĩaTSA: khuẩn lạc tròn, rìa rang cưa không đều, có tâm sẫm
màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi
nâu.
+ Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám. rìa nhăn gợn sóng.
+ Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin.
+ Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
+ Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng
nhăn, lắng cặn kết lại như vầng mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
[4]
1.4.5. Đặc điểm sinh hóa
Khi lên men, vi khuẩn Bacillus subtilis không tạo ra các loại đường: glucose,
maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose.
Thử nghiệm Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase
(+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).
[4]
Bảng 4: Kết quả các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis.
Phản ứng sinh hóa Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh indol -
MR +

VP +
Sử dụng citrate +
Khử nitrat +
Tan chảy gelatin +
Di động +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Manitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +
12
1.4.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
1.4.6.1. Cấu tạo bào tử
Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,8 – 1,8µm. Phía ngoài cùng của bào tử là một
lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ của bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng
ngăn cản sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước. Bên dưới lớp vỏ là lớp
màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử
tự do không xảy ra sự trao đổi chất, vì vậy có thể giử ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều
năm.
Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hóa học và tính chất sinh lý.
[4]
1.4.6.2. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử
trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu
kì phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi ( khi dinh dưỡng trong môi
trường sống bị kiệt quệ). Bào tử phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm,
gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi, được tạo ra vào cuối thời kì

sinh sản của vi khuẩn
Quá trình hình thành bào tử bao gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng vi khuẩn Bacillus
subtilis cần khoảng 8 giờ để hoàn tất quá trình hình thành bào tử. Ban đầu khối nguyên
sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định
trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào
tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử.
Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi
tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của
chúng sẽ bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh
dưỡng chỉ có thể tạo ra một bào tử duy nhất nên đây không phải là một hình thức sinh sản
của vi khuẩn mà nó chỉ là một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện
sống bất lợi
[4]
.
1.4.7. Hệ enzymes của vi khuẩn Bacillus subtilis
13
Trong tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis, cũng như trong các vi sinh khác đều có
những enzymes xúc tác cho các phản ứng sinh hóa. Các enzyme này được sinh tổng hợp
và nằm trong sinh khối tế bào. Các enzyme này thường không có kkhar năng di chuyển
qua màng tế bào, chúng dược gọi là các enzyme nội bào.
Các enzyme nội bào của vi khuẩn Bacillus subtilis bao gồm: các enzyme thủy phân
như protease nội bào, penicillin amidase, catalase, amylase nội bào…; Các enzyme tổng
hợp như aspagagin-syntetase; Các enzyme tham gia vào các quá trình oxy hóa – khử như
Dehydrogenase, Oxydase, Cytochrom, Peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa
vật chatas có trong tế bào.
Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết
cho quá trình sống để thích nghi với điều kiện môi trường gọi là các enzyme ngoại bào.
Chúng bao gồm các enzyme như: amylase (α-amylase), β-glucanase, xylanase,
protease…
[5]

Bảng 6: Các enzymes của vi khuẩn Bacillus subtilis
Enzyme
Nhiệt độ tối
ưu (
o
C)
pH tối ưu Phản ứng thủy phân
α-amylase 70-80 5,6 – 6,2
Thủy phân liên kết α-1,4-glucoside trong
tinh bột và những polysaccharide khác, tạo
ra các dextrin và oligosaccharide.
β-glucanase 35-55 6,0 – 7,0
Thủy phân lien kết β-1,6-glucoside của β-
glucan tạo ra những chất có phân tử lượng
thấp.
Xylanase 25 5,0
Thủy phân lien kết xylan – một thành phần
của hemicellulose.
Protease 40 6,2 – 7,4
Thủy phân lien kết peptide, protein và các
polypeptide, tạo ra các peptide có phân tử
lượng thấp hơn và các amino axit.
1.4.8. Bộ gen của vi khuẩn Bacillus subtilis.
Trình tự bộ gen của vi khuẩn Bacillus subtilis đã được nghiên cứu giải mã thành
công và công bố lần đầu tiên năm 1997.
Bộ gen của vi khuẩn này chứa 4,2Mb, xấp xỉ 4.110 gen. Trong đó, chỉ có 192 gen
không thể thiếu được, có 79 gen được dự đoán là thiêt yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có
liên quan tới quá trình trao đổi chất của tế bào.
[4]
1.5. Tình hình nghiên cứu

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
14
Việc xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp đã và đang được rất quan tâm, đã có rất
nhiều nghiên cứu để xử lý và tái sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp.
Năm 2010 Nguyễn Duy Khang đã chủ nhiệm đề tài nghiên cứu sản xuất giá thể
trồng hoa lan từ các phế phụ phẩm nông nghiệp ở Lâm Đồng. Các nhà sinh học tại viện
nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã hoàn thiện được quy trình này.
[6]
Nhóm nghiên cứu đã sử
dụng các loại phế phẩm như bã mía, lõi ngô, vỏ đậu phộng, vỏ cà phê… đều có thể tận
dụng trong sản xuất phân hữu cơ nhờ các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, có khả năng phân
giải các phế phụ phẩm này thành các giá thể trồng hoa, không chỉ hoa địa lan mà còn có
thể trồng nhiều loại hoa cũng như các loại cây cảnh khác thay cho các giá thể truyền
thống. Hiện đề tài đang được tiếp tục phát triển theo hướng dự án thử nghiệm và sản xuất
trên diện rộng để đáp ứng nhu cầu của bà con nông dân.
Tại Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 diễn ra tại Đại học Đà
Nẵng năm 2010 2 sinh viên trường Đại học Bách Khoa đã báo cáo đề tài nghiên cứu sử
dụng các phế phẩm nông nghiệp để chế tạo tấm Panel cách nhiệt sử dụng trong dân dụng
và công nghiệp
[7]
. Các tấm panel mặc dù được sản xuất thủ công nhưng chất lượng thẩm
mỹ có thể sử dụng đượctrong công nghiệp và đời sống và có thể sử dụng vào nhiều mục
đích khác nhau như la phông, trang trí trần… đây là đề tài mới và ý nghĩa thực tiễn cao.
Năm 2013 Trần Thị Tâm, Lương Hữu Thành, Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản,
Phạm Bích Hiên đã nghiên cứu sử dụng vi sinh vật làm tác nhân sinh học xử lý phế phụ
phẩm nông nghiệp
[8]
. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis,
Streptomyces hygroscopicus, Bacillus polyfermenticus và Bacillus velezensis được lựa
chọn từ microbial di truyền nguồn lực của viện thổ nhưỡng Nông hóa cá thể phá vỡ các

hợp chất hữu cơ như cellulose, tinh bột, lexetin và protein, và cân nặng của phế thải nông
nghiệp giảm 60-70% sau 60 ngày xử lý bằng vi sinh vật.
15
PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và địa điểm tiến hành nghiên cứu
 Đối tượng nghiên cứu:
+ Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ chế phẩm xử lý nước thải của
Nhật Bản.
+ Phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch thu tại tổ sản xuất rau an toàn thuộc
HTX Thuận Hòa, tổ dân phố 12, phường Khán Xuân, thành phố Buôn Ma Thuột.
 Địa điểm tiến hành nghiên cứu:
+ Phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc bộ môn Sinh học thực nghiệm, khoa KHTN &
CN, trường Đại học Tây Nguyên.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng xử lý phế thải
nông nghiệp trong chế phẩm sinh học.
-Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis.
-Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn
Bacillus subtilis.
+ Môi trường nuôi cấy
+ Nhiệt độ
+ Độ pH
+ Tốc độ lắc
-Nghiên cứu một số yếu tố ảnh đến khả năng xử lý phế phụ phẩm rau xanh của
chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển chọn.
+ Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn xử lý.
+ Ảnh hưởng của thời gian xử lý
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu phế phụ phẩm rau xanh được thu gom tại vườn rau của một số hộ dân thuộc

khu sản xuất rau an toàn thuộc HTX Thuận Hòa. Sau khi thu gom, ta sẽ trộn đều những
thứ thu được rồi chia thành từng đống nhỏ để tiến hành nghiên cứu.
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ chế phẩm sinh học xử lý nước thải
Lấy 1g mẫu chế phẩm sinh học pha loãng bằng nước muối sinh lý; Cấy trải trên
môi trường dinh dưỡng MPB, ủ ở 37
o
C. Sau 24 giờ, thu từng khuẩn lạc đơn, cấy ria khuẩn
lạc trên môi trường thạch nghiêng. Làm thuần khiết khuẩn lạc sau nhiều lần cấy ria trên
16
đĩa thạch. Đánh dấu kí tự các chủng vi khuẩn. Quan sát, mô tả hình thí khuẩn lạc các dòng
vi khuẩn phân lập.
2.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng sử dụng oxy của vi khuẩn phân lập
Nguyên tắc: dựa trên nhu cầu khác nhau của vi khuẩn đối với oxy. Căn cứ vào
quan hệ đối với oxy, vi khuẩn được chia thành 4 nhóm lớn như sau:
1. Hiếu khí bắt buộc: vi khuẩn sinh trưởng trên bề mặt và lớp trên cùng của
ống môi trường.
2. Vi hiếu khí: vi khuẩn sinh trưởng cách bề mặt môi trường.
3. Kỵ khí không bắt buộc: vi khuẩn phát triển dọc theo cả chiều dài của ống
môi trường.
4. Kỵ khí bắt buộc: vi khuẩn chỉ phát triển dưới đáy ống môi trường.
Dựa vào vị trí phân bố trong ống môi trường như trên để xác định nhu cầu oxy của
vi khuẩn phân lập
[11]
.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị ống giống vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường MPB lỏng (cao thịt 3g,
pepton 10g, NaCl 5g, nước cất 1000ml; khử trùng ở áp suất 1atm trong 30 phút).
- Tạo các ống chứa khoảng hơn ½ môi trường MPB đặc để xác định nhu cầu oxy của các vi
khuẩn Bacillus subtilis. Sau khi khử trùng, không tạo thạch nghiêng, để ống nghiệm thẳng
đứng.

- Dùng que cấy đầu nhọn nhúng vào dung dịch giống và cấy giống vào đến đáy ống thạch
đứng. Chú ý: cấy giống vào khi môi trường thạch chưa đông cứng. Tất cả các thao tác
trên đều thực hiện trong box cấy vô trùng.
Thí nghiệm trên được lặp lại ba lần. Sau 20 ngày, quan sát và chụp hình kết quả về
cách hiện diện của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong ống thạch đứng để đánh giá nhu
cầu về oxy.
2.3.4. Phương pháp định danh vi khuẩn tuyển chọn
2.3.4.1. Phương pháp xác định hình thái, tính gram
Phương pháp xác định hình thái và kích thước của khuẩn lạc và tế bào của chủng
vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp vi sinh truyền thống.
Phương pháp đo kích thước tế bào: dùng thước đo thị kính và thước đo vật kính
quan sát dưới kính hiển vi quang học. Thước đo thị kính là một miếng thủy tinh tròn, ở
chính giữa có một thước nhỏ 5 mm được chia thành 100 phần bằng nhau và được đánh số
17
từ 0 − 100. Thước đo vật kính là một tấm thuỷ tinh, ở giữa có một thước nhỏ 1mm được
chia thành 100 khoảng đều nhau, vì vậy mỗi khoảng chia là 0,01mm hay 10 µm. Xác định
giá trị mỗi khoảng của thước đo thị kính.
Tiến hành đo kích thước theo trình tự sau:
- Đặt tiêu bản có vi sinh vật cần đo lên bàn kính. Điều chỉnh bàn kính sao cho thấy
rõ tế bào vi sinh vật và thước đo thị kính.
- Điều chỉnh bàn kính sao cho tế bào vi sinh vật nằm gọn và dọc theo thước đo thị
kính.
- Đếm số khoảng mà tế bào vi sinh vật choán chỗ, nhân với giá trị của mỗi khoảng.
Phương pháp xác định tính gram của chủng vi khuẩn được tuyển chọn.
Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm. Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn. Dùng phương
pháp nhuộm gram để xác định.
- Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất
màu giữa Crystal violet và iốt (trong dung dịch Lugol). Kết quả bắt màu tím.
- Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung môi tẩy màu thuốc nhuộm đầu, sẽ bắt màu
thuốc nhuộm bổ xung (đỏ vàng với safranin, đỏ tía với Fuchsin).

2.3.4.2. Phương pháp định danh sinh học phân tử
Mẫu được gửi đến Công ty Nam Khoa, Tại địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn,
phường Tân Hưng, quận 7, thành phố Hồ Chí Minh.
2.3.5. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn
Lấy 0,1ml chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi trong 10ml môi trường MPB lỏng và
đánh giá sự sinh trưởng của vi khuẩn qua phương pháp đo độ đục
[9]
(OD 610nm) của
dung dịch nuôi cấy vào các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 giờ. Dựa trên nồng độ
OD và thời gian nuôi cấy của chủng lập đồ thị đường cong sinh trưởng cho chủng được
tuyển chọn. Mỗi thời điểm khảo sát lặp lại 3 lần.
2.3.6. Phương pháp xây dựng đường cong tuyến tính giữa nồng độ vi khuẩn và chỉ
số OD 610nm
Nhân nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường MPB. Xác định độ đục của
dung dịch vi khuẩn ở các độ pha loãng khác nhau. Tại mỗi độ pha loãng của dung dịch
có OD trên được cấy trãi trên môi trường thạch đĩa. Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa môi
18
trường ở các độ pha loãng. Mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 đĩa peptri. Kết quả được
tính như sau:
Trong đó:
- A : Số tế bào vi khuẩn trong một mẫu ban đầu
- N : Tổng số khuẩn lạc đếm được
- n : Số đĩa có khuẩn lạc đếm được tại mỗi nồng độ pha loãng
( đĩa có số khuẩn lạc 25 – 250).
- v : Dung tích mẫu cấy vào mỗi đĩa
- fi : Độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm.
Dựa vào phương trình tương quan trên để xác định nồng độ tế bào vi khuẩn của
dung dịch thông qua chỉ số OD 610nm.
2.3.7. Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển
của vi khuẩn tuyển chọn

2.3.7.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy
Nghiên cứu trên 3 môi trường nuôi cấy sau:
+ Môi trường MPB (Cao thịt –Pepton) : NaCl 5g, pepton 10g, cao thịt 3g, nước cất
1000ml.
+ Môi trường nước mắm – Pepton : nước mắm 20ml, pepton 10g, nước cất 980ml.
+ Môi trường YEM : cao nấm men 1g, mannitol 10g, K2HPO4 0,5g, MgSO4.7H2O
0,2g, NaCl 0,1g, nước cất 1000ml.
Khử trùng môi trường ở 121
0
C, 20 phút.
Lấy 1ml giống chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển chọn vào bình có
chứa 50 ml môi trường, mỗi loại môi trường lặp lại 3 lần. Đánh giá sự thích hợp của vi
khuẩn với môi trường nuôi cấy qua đo độ đục (OD 610 nm) của môi trường sau thời
gian nuôi cấy 2 ngày. Lưu ý thí nghiệm này được thực hiện trong box cấy vô trùng. OD
càng cao chứng tỏ môi trường đó thuận lợi nhất đối với chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3.7.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ
Lấy 0,1ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis được lựa chọn cho vào 10ml môi
trường với các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 40
0
C. Sau 3 ngày nuôi cấy, thông qua đo
độ đục (đo OD 610nm) để đánh giá khả năng thích ứng của vi khuẩn. OD càng cao thì
19
nhiệt độ thuận lợi nhất cho sự phát triển của vi khuẩn được lựa chọn. Thí nghiệm được
lặp lại 3 lần.
2.3.7.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH
Lấy 0,1ml dung dịch vi khuẩn được lựa chọn cho vào mỗi ống nghiệm có chứa
10ml môi trường dinh đưỡng có độ pH khác nhau: 5, 6, 7, 8 và một mẫu đối chứng. Đánh
giá khả năng thích ứng của vi khuẩn qua chỉ số OD (610nm) sau 3 ngày nuôi cấy. OD
càng cao thì độ pH đó thuận lợi nhất cho sự phát triển của vi khuẩn được lựa chọn. Thí
nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.3.7.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc
Lấy 0,1 ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis được lựa chọn cho vào trong 50ml
môi trường dinh dưỡng phù hợp với các tốc độ lắc khác nhau: 100, 150, 200 vòng/phút.
Sau 3 ngày nuôi cấy, thông qua đo độ đục (đo OD 610nm) đánh giá khả năng thích ứng
của vi khuẩn. OD càng cao thì tốc độ lắc đó thuận lợi nhất cho sự phát triển của vi khuẩn
được lựa chọn.Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.8. Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của vi khuẩn đến gốc rau
2.3.8.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng xử lý
Lấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã được tuyển chọn, sau khi nhân giống, đem
pha loãng với môi trường nhân giống MPB ở các nồng độ khác nhau, ở từng độ pha loãng
đem đo OD, dựa trên phương trình tương quan về mật độ tế bào với OD từ đó suy ra mật
độ tế bào ở từng độ pha loãng khác nhau.
Tiến hành lấy 20ml giống pha loãng ở mỗi nồng độ khác nhau, bỏ vào 4 đống gốc
rau, mỗi đống có cân nặng khoảng 15kg đã được trộn đều.
Lô đối chứng gồm 2 lô, một lô không cho vi khuẩn vào và một lô cho chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis đã được phân lập trong đề tài của sinh viên Nguyễn Thị Duyên
Anh, lớp Cử nhân Sinh học K10.
Sau 5 ngày xử lý, thu mẫu, xác định khối lượng của gốc rau còn lại sau khi xử lý.
Thí nghiệm trên được lặp lại 3 lần.
2.3.8.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý đến khả năng xử lý
của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được theo dõi ở các lô thí nghiệm sau:
Lô 1: Thời gian xử lý 5 ngày.
Lô 2: Thời gian xử lý 10 ngày.
Lô 3: Thời gian xử lý 15 ngày.
Lô 4: Đối chứng (không sử dụng vi khuẩn).
20
Lấy 20ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển chọn, cho vào 5 đống
gốc rau, mỗi đống khoảng 15kg. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Dung dịch vi khuẩn cho
vào mỗi đống và mỗi lô phải đồng nhất.

Vào những thời điểm nghiên cứu của từng lô, thu mẫu và xác định khối lượng còn
lại sau khi xử lý.
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý trên phần mềm thống kê SPSS 16.0
Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa mật độ tế bào và chỉ số OD
được xử lý trên phần mềm Excel 2010.
21
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. />2214713/
2. />phan-huu-co-vi-sinh.htm
3. />vat-doc.htm
4. />tim-hieu-kha-nang-sinh-enzyme-protease-amylase-cua-vi-khuan-2428/
5. />6. />panel-cach-nhiet-su-dung-trong-dan-dung-v-462978.html
7. />ly-phe-phu-pham-nong-nghiep-1537965.html
8.
10. />%95ngquan/tabid/338/language/vi-VN/Default.aspx
Tài liệu nước ngoài:
11. Harry P. Rappaport, “A Bacillus Subtilis Proteinase”, The Journal of Biological
Chemistry, (1965), Vol. 240, No. 1.
22