các phương pháp tách chiết nucleic acid

Các phương pháp tách
chiết nucleic acid
Phạm Hùng Vân
Tách chiết DNA
•
Tách chiết thô, chưa tinh khiết được DNA
từ mẫu một cách hoàn toàn. Phương pháp
áp dụng cho các mẫu có nhiều DNA đích
(canh cấy vi khuẩn, tách chiết các mẫu
thuỷ sản )
•
Tách chiết tinh sạch, tinh khiết được DNA
từ mẫu một cách hoàn toàn
Tách chiết DNA bằng proteinase K

Là phương pháp tách chiết thô

Phương pháp dựa trên nguyên tắc dùng
dung dịch proteinase K, chất tẩy và nhiệt
độ để làm tiêu hóa protein bám trên DNA
của virus cũng như vi khuẩn. Ngoài ra
dung dịch cũng làm tiêu hóa các protein có
mặt trong bệnh phẩm
Tách chiết DNA bằng nhiệt

Là phương pháp tách chiết thô

Phương pháp dựa trên nguyên tắc dùng
nhiệt để tách DNA từ các tế bào vi khuẩn
hay KST (KSTRS) vào dung dịch, hay sử
dụng shock nhiệt trong dung dịch kiềm và

có chất tẩy (tách chiết mẫu thuỷ sản)
Tách chiết DNA bằng silica

Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng
cho nhiều loại mẫu thử khác nhau

Phương pháp này do BOOM sáng chế ra.
Nguyên tắc là dùng Guanidine thiocyanate
(GuSCN) để phá hủy hoạt tính các
nuclease, và các DNA trong mẫu sẽ bám
vào các hạt Silica, nhờ đó tách chiết được
DNA từ mẫu thử

Được nhiều công ty áp dụng để chế các kit
tách chiết sử dụng cột với màng lọc silica,
hay dùng các hạt từ bọc silica.
Tách chiết DNA bằng P/C/I

Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho
nhiều loại mẫu thử khác nhau

Mẫu thử khi được trộn cùng với dung dịch
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (P/C/I)
25:24:1 thì các protein trong mẫu thử sẽ bị
phenol làm biến tính và vón cục lại. Khi ly
tâm, nhờ có sự hiện diện của chloroform nên
các vón cục này sẽ bị tách ra và tập trung
trong lớp phân cách giữa phase nước và
phase P/C/I. Phase nước chứa DNA trong
phase lỏng sẽ lấy ra và được làm kết tủa bởi

ethanol ở nồng độ muối cao
Tách chiết DNA bằng CTAB

Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho
tách chiết bộ gene tế bào vi khuẩn

Đầu tiên vách tế bào vi khuẩn bị lysozyme
làm yếu đi, rồi bị SDS ly giải. Sau đó các
protein vi khuẩn sẽ bị proteinase K tiêu hóa,
rồi các protein bị tiêu hóa nầy cùng các mảnh
vỡ tế bào bị CTAB kết tủa lại dưới sự hiện
diện của nồng độ muối cao. Các thành phần
lipid của vi khuẩn lại bị chloroform/isoamyl
alcohol lấy đi, bộ gen DNA của vi khuẩn trong
phase lỏng sẽ bị kết tủa nhờ isopropanol.
Tách chiết DNA bộ gene bạch cầu

Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng
cho tách chiết bộ gene tế bàobạch cầu

Phương pháp nầy dùng đệm carbonat-
ammonium lạnh có EDTA để ly giải các tế
bào trong mẫu máu, sau đó ly giải nhân
các tế bào bạch cầu bằng một dung dịch
đệm kiềm có thêm SDS. Dùng thêm
proteinase K để làm tan protein tế bào để
phóng thích hoàn toàn bộ gen DNA vào
dung dịch. Cuối cùng tủa bộ gen DNA
bằng isopropanol.
Tách chiết RNA

•
Không có phương pháp tách chiết thô
•
Tách chiết tinh sạch, tinh khiết được RNA
từ mẫu một cách hoàn toàn
Tách chiết RNA bằng silica

Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho
nhiều loại mẫu thử khác nhau

Phương pháp này do BOOM sáng chế ra.
Nguyên tắc là dùng Guanidine thiocyanate
(GuSCN) để phá hủy hoạt tính các nuclease,
và các RNA trong mẫu sẽ bám vào các hạt
Silica, nhờ đó tách chiết được RNA từ mẫu
thử. Nếu muốn loại bỏ hoàntoàn DNA thì có
thể dùng DNAse

Được nhiều công ty áp dụng để chế các kit
tách chiết sử dụng cột với màng lọc silica,
hay dùng các hạt từ bọc silica.
Tách chiết RNA bằng Trizol

Là phương pháp tách chiết RNA toàn phần, áp
dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau

Phương pháp dựa trên phương pháp do
CHOMCZYNSKI và SACCHI sáng chế. Nguyên tác
là dùng Guanidine 14M và urea, phối hợp với
phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây

biến tính các protein, kết quả là các protein trong
mẫu thử sẽ bị vón lại, DNA sẽ tan trong phase
phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và
sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào
chloroform và quay ly tâm lắng tách. RNA trong
phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ
isopropanol với sự hổ trợ của tRNA và glycogen.
Kiểm chứng độ nhạy của bộ thuốc
thử tách chiết nucleic acid

Thực hiện tách chiết trên chứng [+] là mẫu thật
có chứa số copies biết rõ của rồi pha loãng các
dịch tách chiết để thực hiện PCR để xác định LOD
của phương pháp.

Thực hiện tách chiết trên chứng [-] là mẫu thật
có thêm vào nucleic acid vi sinh vật đích có lượng
tương đương LOD của phương pháp

Cho thêm vào mẫu thử nucleic acid của chứng nội
tại có lượng tương đương LOD của phương pháp
rồi cùng tách chiết với mẫu thử. Phương pháp này
kiểm tra được độ nhạy của tách chiết trên từng
mẫu thử
Kiểm chứng độ nhạy (LOD) của phương pháp PCR
phát hiện vi khuẩn đích, thực hiện hai lần liên tiếp
1,9: 100copies, 2,10: 10copies, 3,11: 1 copies
Kết quả kiểm tra chất lượng bộ thuốc thử
NK
DNAPREP-BOOM. Đối tượng

dùng kiểm tra là huyền dịch M. tuberculosis TB1 chứa 10.000 tế bào vi
khuẩn/ml được pha loãng để có 1,000 tế bào vi khuẩn/10ul (TB2),
100/10ul (TB3), 10/10ul (TB4), và 1/10ul (TB5). Kiểm tra bộ thuốc thử
NK
DNAPREP-BOOM cần kiểm tra và bộ
NK
DNAPREP-BOOM được sản xuất
trước đó. Thể tích huyền dịch để tách chiết là 100ul, thôi ra 100ul rồi
lấy 10ul dịch tách chiết để chạy PCR phát hiện M. tuberculosis trên PCR
mix đã biết độ nhạy đạt 1 copy/thể tích phản ứng
Mô hình phòng thí nghiệm real-time PCR
dành cho chẩn đoán
Mô hình phòng thí nghiệm PCR
dành cho chẩn đoán
Đảm bảo chất lượng khi
áp dụng PCR cho chẩn đóan
Phạm Hùng Vân*
*Giảng viên BM. Vi Sinh-Khoa Y-ĐHYD, Phó PTN Y Sinh ĐHYD TP. HCM, Trưởng Phòng Thí Nghiệm NK-BIOTEK
Tại Việt Nam, PCR và qPCR được sử dụng khá
rộng rãi và hữu dụng tại
Việt Nam trong chẩn đóan, chỉ định
điều trị và theo dõi điều trị bệnh nhiễm HBV,
HCV, HIV, lao, CMV, Dengue…