Báo cáo hóa học đề tài :Đánh giá sự biến đổi chất lượng giống của một số chủng Bacillus trong thời gian bảo quản ở nhiệt độ 4ºC

Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
LỜI CẢM ƠN
Sau 4 năm học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, đặc
biệt là sau khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng nỗ lực của
bản thân tôi còn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của nhà
trường, các thầy giáo, cô giáo, gia đình và bạn bè.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Tuyết Lê đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực tập cũng như
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn
Dinh dưỡng- Thức ăn, Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường đại
học Nông Nghiệp Hà Nội đã góp ý và chỉ bảo để tôi hoàn thành khóa luận.
Để hoàn thành khóa luận này, tôi còn nhận được rất nhiều sự động viên,
khích lệ của những người thân trong gia đình và bạn bè. Tôi xin chân thành
cảm ơn những tình cảm cao quý đó.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 08 năm 2013
Sinh viên
Đàm Thị Hoa
Khoa CN & NTTS 1 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết Tắt Tiếng Việt
VK Vi khuẩn
B Bacillus
ĐK Đường kính
MT Môi trường
TB Tế bào
LB Luria-Broth
ml Mililit
mm Milimet

H Giờ
Cs Cộng sự
ºC Độ Celcius
VSV Vi sinh vật
TĐC Trao đổi chất
Khoa CN & NTTS 2 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trực khuẩn Bacillus là một trong những vi khuẩn có vai trò probiotic
như các vi khuẩn lactic. Việc sử dụng các loài Bacillus trong chăn nuôi đã
được tiến hành từ lâu và đã đem lại nhiều lợi ích cho người chăn nuôi do các
loài Bacillus có khả năng sinh trưởng trong mọi điều kiện của môi trường nhờ
hình thành bào tử. Chúng sản sinh nhiều loại enzyme khác nhau như
protease, amylase. Đặc biệt chúng có khả năng sản sinh các hoạt chất kháng
khuẩn với hoạt chất kháng khuẩn rộng. Hiện nay, các loài Bacillus được sử
dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học và là tác nhân nitrat hóa, có khả
năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và chất thải khác nhờ
khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu cơ như protease, amylase. Chúng
còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật
gây bệnh như Vibrio, Aeromonas do chất lượng nước nuôi bị giảm. Chính vì
vậy, các loài Bacillus là một trong những vi khuẩn không thể thiếu trong các
chế phẩm sinh học để xử lý chất thải động vật.
Để thu được những chủng giống vi khuẩn Bacillus có phẩm chất sinh
học tốt đáp ứng yêu cầu của sản xuất các chế phẩm sinh học hay tạo ra các
giống khởi động có chất lượng cao thì khân phân lập, chọn lọc đóng vai trò
then chốt. Tuy nhiên, công việc chọn lọc này cũng rất tốn kém, đòi hỏi rất
nhiều công sức và phụ thuộc rất nhiều vào công tác bảo quản giống sau phân
lập. Các chủng giống được chọn lọc tự nhiên thường có sức sống tốt và có các

đặc tính sinh học cao nhưng chúng rất dễ bị biến đổi đặc tính sinh học hoặc
sinh những biến dị không mong muốn nếu khâu bảo quản và giữ giống không
tốt.
Hiện nay có rất nhiều các phương pháp bảo quản, giữ giống vi sinh vật
hiệu quả như đông lạnh, đông khô…. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi
Khoa CN & NTTS 3 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
phải có thiết bị, máy móc hiện đại mà nhiều phòng thí nghiệm trong nước
chưa đáp ứng được. Vì vậy, các chủng giống sau phân lập chọn lọc vẫn được
giữ giống với phương pháp truyền thống là cấy truyền trên thạch nghiêng và
bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4
o
C. Phương pháp này đơn giản, dễ thực
hiện, không tốn kém nhưng lại có một số nhược điểm như thời gian bảo quản
ngắn, dễ bị biến đổi đặc tính sinh học của giống hoặc gây thoái hóa giống.
Xuất phát từ thực tế trên, để đánh giá sự biến đổi các đặc điểm về hình
thái cũng như đặc tính sinh học của một số chủng Bacillus sử dụng làm chế
phẩm sinh học trong chăn nuôi trong quá trình giữ giống, chúng tôi tiến hành
đề tài: “Đánh giá sự biến đổi chất lượng giống của một số chủng Bacillus
trong thời gian bảo quản ở nhiệt độ 4ºC”.
1.2. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU
1.2.1. Mục đích
Theo dõi các chủng Bacillus trong quá trình bảo quản, đánh giá sự biến
đổi đặc tính sinh học của chúng trong các điều kiện và khoảng thời gian khác
nhau, từ đó xác định điều kiện thích hợp để bảo quản vi khuẩn Bacillus.
1.2.2. Yêu cầu
Trong quá trình theo dõi đánh giá, vi khuẩn phải đạt được các yêu cầu:
- Không có sự biến đổi về mặt hình thái.
- Không có sự biến đổi về đặc tính sinh hóa.
- Giữ được khả năng phân giải Protein.

- Giữ được khả năng phân giải tinh bột.
- Có khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
Khoa CN & NTTS 4 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. VI KHUẨN BACILLUS VÀ VAI TRÒ TRONG SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM SINH HỌC
2.2.1. Đặc điểm sinh học
Theo mô tả trong khóa phân loại Bergey (2008), vi khuẩn Bacillus (B.)
thuộc lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae. Đặc điểm của chung của họ
này là các vi khuẩn hình gậy, bắt màu Gram dương, sinh nội bào tử, phần lớn
có khả năng di động nhờ các lông roi xung quanh thân. Họ Bacillaceae sinh
nội bào tử được chia thành 2 chi:
- Chi sinh nội bào tử yếm khí là Clostridium
- Chi sinh nội bào tử hiếu khí là Bacillus
Chi Bacillus gồm các trực khuẩn Gram dương, nhưng khi nuôi cấy lâu
chúng có thể bắt màu Gram âm khi nhuộm. Các trực khuẩn Bacillus là loài
sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, sinh nội bào tử. Chúng có ở mọi nơi
trong tự nhiên. Phần lớn các loài Bacillus không gây bệnh nhưng một số loài
là nguyên nhân gây bệnh ở người và động vật như Bacillus anthracis (gây
bệnh than Anthrax) và B. cereus (gây ô nhiễm thực phẩm).
Một số loài Bacillus:
a. Bacillus subtilis:
Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm
1872, là một loài thuộc chi Bacillus, thuộc họ Bacillacaea. B. subtilis là trực
khuẩn có kích thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, đứng riêng rẽ, không tạo thành chuỗi;
Bắt màu Gram dương, nhưng không đồng nhất; Có khả năng di động. Chúng
sinh nội bào tử hình ovan, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm, có kích thước 1,5-
1,8 x 0,6-0,9µm. Phần lớn bào tử được hình thành sau 48h nuôi cấy và không

làm phình tế bào. Ở điều kiện 100
o
C, bào tử của B. subtilis chịu được 180
Khoa CN & NTTS 5 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa
chất, tia bức xạ.
Trên môi trường thạch nghiêng, vi khuẩn mọc dày, khuẩn lạc khô đục
mờ, rìa răng cưa hoặc lượn sóng. Mọc lan tràn, có màu trắng xám. Trên môi
trường dịch thể: Môi trường trong, hình thành màng dày, dai, nhăn nheo, lượn
sóng.
B. subtilis có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein)
để tạo thành vòng phân giải có đường kính lớn. Trong môi trường Litmus
milk, chúng gây peptone hóa chậm và thường bị kiềm hóa
Bacillus subtilis là loài tự dưỡng hiếu khí, một vài chủng sinh trưởng
yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng từ 28-40
o
C, tối đa là 50
o
C,
một số chủng có thể sinh trưởng ở 55
o
C. Phân bố: trong đất, cỏ khô, các hợp
chất hữu cơ bị phân hủy
B. subtilis được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại
enzyme, ví dụ như amylase được sử dụng để rũ hồ hàng dệt, làm biến hình
tinh bột trong sản xuất giấy. B. subtilis cũng sản xuất các protease bao gồm
subtilisin được sử dụng chất tẩy rửa và công nghiệp thuộc da. Tuy nhiên, đáng
chú ý là B. subtilis được sử dụng để sản xuất nhiều loại kháng sinh như
difficidin, oxydifficidin, bacilli, bacillomyin B và Bacitracin. Các loại kháng

sinh này được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng da do vi khuẩn và
ngăn cản sự nhiễm trùng do đứt tay hoặc bị bỏng.
B. subtilis cũng được bán như là một sản phẩm probiotic thương mại ở
nhiều nước châu Âu từ nhiều năm trước mặc dù sự hiểu biết về cơ chế tác
động của chúng còn rất hạn chế (Green D.H và cộng sự, 1999) như chế phẩm
Enterogermina
®
được bán ở Italy vào những năm 1950 gồm 4 chủng B.
clausii hoặc Bactisubtil
®
có chứa B. cereus (Huynh và cộng sự, 2005).
b. Bacillus licheniformis
Là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,6-0,8x1,5-3µm, đứng riêng
rẽ, không tạo thành chuỗi, có khả năng di động, sinh nội bào tử 0,6-0,9x1-
Khoa CN & NTTS 6 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
1,5µm, hình cầu hoặc hình trụ, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào, vách
bào tử mỏng. Phần lớn bào tử xuất hiện sau 48 giờ nuôi cấy ở 37
o
C, không
làm phình thân tế bào.
Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành những khuẩn lạc có kích
thước lớn, lan tràn, bề mặt khô hoặc nhăn nheo, rìa phát triển dạng lông nhỏ,
màu trắng đục. Nuôi cấy trong môi trường dịch thể: môi trường trong, có xuất
hiện màng dày, dai, nhăn nheo.
Có khả năng phân giải tinh bột và phân giải protein có nguồn gốc là
gelatin và casein. Chúng sinh trưởng tốt ở nồng độ muối từ 5-8%, bị ức chế ở
nồng độ muối cao. Là trực khuẩn hiếu khí, một số chủng sống yếm khí tùy
tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 32-45
o

C, tối đa từ 50-56
o
C. Một số
chủng B. licheniformis có khả năng sản sinh hoạt chất kháng khuẩn là
Bacitracin.
Cũng giống như B. subtilis, B. licheniformis được nuôi cấy để thu
enzyme alkaline proteases (làm sạch không khí, làm mềm lông trong công
nghiệp da, bột giặt sinh học…), alpha-amylases (biến tính tinh bột trong sản
xuất giấy…); các hoạt chất kháng khuẩn như penicillinases, pentosanases,
bacitracin, proticin, 5'-inosinic acid, inosine, citric acid, và L-tryptophan
(Gherna et al., 1989).
c. Bacillus megaterium
Là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 1,2-1,5 x 2-4µm.
Đứng riêng rẽ hoặc nối thành chuỗi ngắn. Có khả năng di động. Sinh bào tử
hình elip nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào. Vách bào tử mỏng, phần lớn
bào tử xuất hiện sau 48h nuôi cấy. Bào tử không làm phình tế bào.
Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành khuẩn lạc lớn, dạng S, tròn
trơn nhẵn bóng, bề mặt vồng lên, rìa gọn, không lan, dạng kem màu trắng
ngà.
Sinh trưởng trong môi trường dịch thể: môi trường đục, đồng nhất, có
cặn, không xuất hiện màng trên bề mặt.
Khoa CN & NTTS 7 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
B. megaterium được coi là trực khuẩn không có hại. Có khả năng phân
giải tinh bột và protein (gelatin và casein). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 28-
35
o
C, tối đa từ 40-45
o
C. B. megaterium được sử dụng trong công nghiệp để

sản xuất enzyme amidase, sử dụng cho sản xuất kháng sinh penicillin.
d. Bacillus polymyxa
Trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 0,6-1 x 2-7µm,
không tạo thành chuỗi. Có khả năng di động. Sinh bào tử hình elip, nằm ở
trung tâm hoặc ở một đầu.
Nuôi cấy trên môi trường thạch sinh khuẩn lạc nhỏ, mỏng, trong lan
tràn, rìa phân thùy hoặc có dạng lông. Bề mặt thô nhám, màu trắng. Ở môi
dịch thể, môi trường đục đồng nhất hoặc có cặn lơ lửng. Cặn keo dính, đôi khi
trên bề mặt có màng.
B. polymyxa không sinh trưởng ở môi trường có 5% NaCl. Chúng có khả
năng phân giải tinh bột và protein (casein và gelatin), đường kính vòng phân
giải rộng. Trong môi trường Litmus milk, gây đông vón sữa và có sinh khí.
Các chủng B. polymyxa có thể sống hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện. Điều kiện
nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 28-35
o
C, tối đa là 40
o
C, không sinh trưởng
ở nhiệt độ 45
o
C. Một số chủng B. polymyxa có khả năng sản sinh các hoạt
chất kháng khuẩn là polymyxin.
e. Bacillus cereus
Là trực khuẩn hình gậy, hai đầu vuông, đứng thành chuỗi từ ngắn đến
dài, xếp lộn xộn không theo một trật tự nào. Trực khuẩn bắt màu Gram
dương, có khả năng di động và hình thành bào tử. Bào tử hình elip, nằm ở tâm
hoặc lệch tâm tế bào, kích thước 1-1,5µm. Phần lớn các chủng hình thành bào
tử sau 18-24h nuôi cấy, không làm phình thân tế bào.
Nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, hình thành khuẩn lạc lớn, khô, bề
mặt phẳng, rìa không đều, có xu hướng lan ra ngoài. Màu trắng ngà. Trong

môi trường dịch thể, làm đục môi trường, đục nhiều, đồng nhất cặn mềm dễ
tan, có hoặc không hình thành màng trên bề mặt. B. cereus có khả năng phân
giải tinh bột và protein (gelatin và casein), sống hiếu khí, một số chủng là
Khoa CN & NTTS 8 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 30
o
C, đối đa từ 37-48
o
C.
Chúng phân bố nhiều trong đất, bụi, trong thực vật, sữa…, có khả năng gây
bệnh ngộ độc thực phẩm cho người và động vật do ăn phải thực phẩm nhiễm
B. cereus.
f. Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis là trực khuẩn Gram dương, phân bố ở trong đất. Về
mặt hình thái, tương tự như B. cereus. Trong quá trình hình thành bào tử B.
thuringiensis hình thành các tinh thể protein có khả năng kháng côn trùng là
δ-endotoxins (hay cry protein) được mã hóa bởi gen cry . Trong phần lớn các
chủng B. thuringiensis các gen cry nằm trong plasmid. Vì vậy, bào tử và các
tinh thể protein kháng côn trùng của B. thuringiensis đã được sử dụng như là
một loại thuốc trừ sâu sinh học từ những năm 1920. Ngày nay chúng có tên
thương mại là Dipel và Thuricide. Bacillus thuringiensis serovar israelensis,
là một chủng được sử dụng rộng rãi để kiểm soát ấu trùng muỗi (lavicide).
Tuy nhiên các chủng B. thuringiensis cũng sản sinh độc tố đường ruột
enterotoxins, .
2.1.2. Vai trò của trực khuẩn bacillus trong sản xuất chế phẩm probiotics
2.1.2.1. Khái niệm về Probiotic
Mặc dù khái niệm Probiotic đã được biết đến vào những năm đầu thế
kỷ 20 tuy nhiên định nghĩa về probiotic vẫn chưa được đưa ra cho đến thập
niên 60. Năm 1965, Lilly và Stillwel cho rằng, probiotic là “những chất do vi

sinh vật tiết ra có khả năng kích thích sự tăng trưởng của những vi sinh vật
khác” và hiểu rằng probiotic là một khái niệm đối lập với kháng sinh. Parker
(1974) lại có quan điểm hoàn toàn khác về probiotic “đó là những vi sinh vật
và các hoạt chất của chúng có vai trò cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột”.
Fuller (1989) cũng theo quan điểm này, đưa ra định nghĩa về probiotic “là
thức ăn bổ sung gồm các vi sinh vật sống có lợi cho vật chủ bằng cách cải
thiện cân bằng sinh thái đường ruột”. Havennar và Huis in’t Veld (1992) đã
mở rộng định nghĩa về probiotic: “Là một vi sinh vật đơn lẻ hay hỗn hợp các
Khoa CN & NTTS 9 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
vi sinh vật sống khi sử dụng cho người và động vật mang lại những ảnh
hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện hệ sinh vật đường ruột.
Trong năm 1996, Schaafsma quan niệm probiotic là “những vi sinh vật sống,
khi tồn tại trong đường ruột với một số lượng nhất định sẽ mang lại những
ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe vượt trội hơn so với các chất dinh dưỡng cơ
bản vốn có”.
Đứng trên quan điểm về miễn dịch và dinh dưỡng, Naidu và cộng sự
(1999) cho rằng probiotic là “một dạng thức ăn bổ sung vi sinh vật mang lại
những ảnh hưởng có lợi cho các hoạt động sinh lý của vật chủ do tăng cường
hệ miễn dịch đường ruột cũng như cải thiện sự cân bằng về dinh dưỡng và
cân bằng vi sinh vật trong đường ruột”. Theo Laurent Verschuere và cộng sự
(2000) "Probiotics là sinh vật sống có ảnh hưởng tốt cho vật chủ nhờ vào sự
biến đổi hệ sinh vật gắn với vật chủ hay xung quanh vật chủ, từ đó cải thiện
khả năng sử dụng thức ăn, nâng cao khả năng chống bệnh của vật chủ, và cải
thiện môi trường xung quanh". Tuy nhiên, đến năm 2001, FAO/WHO đã đưa
ra một định nghĩa phù hợp nhất về probiotic như sau “probiotics là những vi
sinh vật sống khi được đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ mang lại
các lợi ích về sức khỏe cho vật chủ”.
Định nghĩa này được đưa ra dựa trên những quan điểm sau:
- Probiotics phải là những vi sinh vật sống.

- Probiotics phải cung cấp các lợi ích về mặt sinh lý cho vật chủ, các
lợi ích này phải được xác định qua thực nghiệm được tiến hành trên
các vật chủ được lựa chọn
- Probiotics không cần phải giới hạn về cách sử dụng (qua đường ăn
hoặc uống)
Ngày nay, các probiotics thường có những đặc điểm sau:
- Là vi sinh vật sống
- Tác động trực tiếp có lợi cho hệ tiêu hóa của người và động vật
- Đề kháng lại với các yếu tố chế biến thức ăn.
Khoa CN & NTTS 10 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
- Có khả năng chống lại stress trong dạ dày, ruột. Thích nghi và tăng
trưởng nhanh chóng trong đường ruột
- Giải phóng ra sản phẩm trao đổi chất hữu ích (Enzyme, các axit hữu
cơ…).
- Kiểm soát được quần thể vi sinh vật đường ruột
- Không hại đến tế bào niêm mạc ruột sinh vật chủ.
- Có tác dụng ngăn cản vi sinh vật gây bệnh
- Phải đạt các yêu cầu, qui định an toàn sinh học, vệ sinh thực phẩm
và có ảnh hưởng cơ lợi lên sức khoẻ.
Cơ chế tác động của probiotics (Sanders, 2009):
- Sản sinh các hợp chất kháng khuẩn như các axit hữu cơ, các
bacteriocins
- Tăng cường đáp ứng miễn dịch (ví dụ như tiết IgA) đối với các tác
nhân gây bệnh hoặc vaccine
- Làm giảm viêm nhiễm
- Hỗ trợ đáp ứng miễn dịch trong giai đoạn đầu, giúp cho đáp ứng miễn
dịch được cân bằng tốt hơn, giảm nguy cơ phát sinh dị ứng.
- Cải thiện chức năng của lớp “rào cản” ở niêm mạc ruột
- Tăng cường sự ổn định hoặc giúp phục hồi hệ vi sinh vật đường ruột

khi có rối loạn tiêu hóa
- Giảm sự bám dính của các tác nhân gây bệnh
- Cung cấp các protein chức năng (như lactase) hoặc enzyme (tự nhiên
hoặc được clone)
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, các probiotic có thể phục hồi chức năng
bình thường của đường ruột, và từ đó làm giảm tiêu chảy khi bị rối loạn tiêu
hóa do điều trị kháng sinh dài ngày. Ngoài ra, probiotics còn có thể ngăn cản
hoặc điều trị nhiễm trùng âm đạo, nhiễm trùng đường tiết niệu; giúp kiểm soát
đáp ứng miễn dịch (viêm dạ dày), giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột,
Khoa CN & NTTS 11 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
ngăn cản eczema ở trẻ em; giảm ung thư bọng đái. Probiotics cũng được sử
dụng trong điều trị ung thư ruột (Truter I. 2010)
2.1.2.2. Vai trò của Bacillus trong sản xuất chế phẩm sinh học
Vi khuẩn “probiotic” đầu tiên được phát hiện bởi nhà khoa học người
Nga Metnhicop năm 1912 là vi khuẩn lactic Lactobacillus sp. Rất nhiều loài
vi khuẩn có hoạt tính sinh học được biết đến sau đó như enterococci,
streptococci, bifidobacteria. Đây là những vi khuẩn tìm thấy trong hệ vi sinh
vật đường ruột của người và động vật hay còn được gọi là nhóm vi khuẩn bản
địa. Ngoài các vi khuẩn lactic, các loài Bacillus cũng được biết đến với vai trò
probiotic.
a. Bacillus được sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho người :
Các chế phẩm sử dụng cho người được chia thành hai nhóm:
- Nhóm phòng và trị bệnh
- Nhóm thực phẩm chức năng (thực phẩm bảo vệ sức khỏe và thực
phẩm bổ sung)
* Nhóm phòng và trị bệnh
Các sản phẩm sử dụng cho trẻ em để phòng bệnh tiêu chảy (chủ yếu do
rota virus). Các sản phẩm này khi sử dụng thường phải có ý kiến của bác sỹ
điều trị. Có thể kể đến, Biosporin

®
gồm các bào tử của 2 loài Bacillus là B.
subtilis và B. licheniformis, được sản xuất ở một số nước Đông Âu. B. subtilis
chủng 3 hoặc 2335 trong chế phẩm sản sinh kháng sinh loại isocourmarin,
aminocourmarin A, có khả năng chống lại Helicobacter pylori (Pinchuk và
cộng sự, 2001). Các chủng B. subtilis từ Biosporin
®
có khả năng thay đổi để
tạo thành một interferon và một sản phẩm mới là Subalin được chứng nhận
của Nga sử dụng trong điều trị thú y với mục đích kháng virus và kháng u
(Beliavskaia, 2001).
Ở một số nước Đông nam Á, do việc sử dụng kháng sinh tràn lan và
phổ biến, nên người ta đã sử dụng các chế phẩm probiotics như là một chất bổ
trợ. Chính vì vậy, một số lượng lớn các chế phẩm sinh học đã được sản xuất,
Khoa CN & NTTS 12 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
tất cả đều mang ít chủng được xác định. Ví dụ như: Biosubtyl (Việt Nam)
chứa B. pumilus hoặc B. cereus; Bibactyl (Việt Nam) chứa B. subtilis; Biscan
(Hàn Quốc) gồm bào tử của B. polyfermenticus… Nguồn gốc của các chủng
này khó được xác định.
Các sản phẩm probiotic có chứa Bacillus còn được sử dụng điều trị
bệnh uremia. Công ty Kibow Biotech (Mỹ) sản xuất sản phẩm probiotics từ
B. coagulans để điều trị bệnh viêm dạ dày ruột. Chế phẩm này được sản xuất
dựa vào khả năng tiết hợp chất kháng khuẩn là bacteriocin - Coagulin là loại
kháng sinh phổ rộng đối với các vi khuẩn đường ruột (Hyronimus và cộng sự,
1998). Các báo cáo khoa học cũng cho thấy lợi ích của các chế phẩm sinh học
Bacillus trong điều trị viêm đường tiết niệu (Meroni và cộng sự, 1983).
* Nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe và thực phẩm bổ sung
Một số lượng lớn các sản phẩm có chứa Bacillus được sử dụng cho
mục đích thức ăn bổ sung bảo vệ sức khỏe với những sự khuyến cáo như tăng

cường sức khỏe cho người sử dụng, phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật
đường ruột …Natto là một sản phẩm lên men từ đậu tương của Nhật Bản với
B. subtilis hoặc B. subtilis var natto. Các chủng này có những tính chất
probiotics như kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể, sản sinh vitamine K2
và các chất chống ung thư (Tsukamoto và cộng sự, 2001).
b. Bacillus được sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho động vật
Tại châu Âu, khi các loại kháng sinh bị cấm sử dụng dưới dạng thức ăn
bổ sung năm 2006, các nhà khoa học đã quan tâm đến các chất thay thế kháng
sinh như prebiotics, synbiotics và probiotics. Hai loại sản phẩm probiotic
thành phần có chứa trực khuẩn Bacillus đã được các nước EU cấp phép cho
động vật sử dụng là BioPlus
®
2B và Toyocerin
®
. Trong đó, BioPlus
®
2B gồm
hỗn hợp 2 chủng Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis với vai trò giúp
cải thiện cân bằng hệ sinh thái đường ruột của lợn, từ đó tăng cường tiêu hóa,
hấp thu, giảm tỷ lệ tiêu chảy.
Khoa CN & NTTS 13 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
Toyocerin
®
chỉ gồm một chủng B. cereus var toyoi. Chủng này được coi
là an toàn cho vật nuôi bởi vì chúng không sản sinh độc tố đường ruột và
không truyền tính kháng kháng sinh (SCAN, 2000; 2001).
Tuy nhiên, rất nhiều chế phẩm sinh học có sử dụng các chủng Bacillus
đã không được cấp phép sử dụng cho động vật vì chúng có chứa các chủng
sản sinh độc tố gây hại cho sức khỏe của con người, ví dụ như chế phẩm

Paciflor
®
C10 chứa chủng B. cereus (CIP 5832) sản sinh độc tố; chế phẩm
Esporafeed Plus
®
chứa chủng B. cereus mang gen kháng kháng sinh
tetracycline là tetB.
Sử dụng các loài Bacillus trong chăn nuôi sản đem lại nhiều lợi ích cho
người chăn nuôi do:
- Bacillus tồn tại trong vật nuôi và trong môi trường sống
- Có khả năng sinh trưởng trong mọi điều kiện của môi trường (nhờ
hình thành bào tử
- Sản sinh nhiều loại enzyme khác nhau
- Hoạt động kháng các loại mầm bệnh một cách trực tiếp thông qua
ức chế sinh trưởng hoặc gián tiếp thông qua cơ chế cạnh tranh
- Đặc điểm của bào tử: tồn tại lâu trong cơ thể; Dễ dàng dịch chuyển
qua dạ dày, ruột mà không bị ảnh hưởng của axit, dịch mật; Đề
kháng tốt với nhiệt độ lên đến 60
o
C, đề kháng với sự khô hạn.
c. Bacillus được sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho thủy sản
Trong nuôi trồng thủy sản, một số chế phẩm sinh học thương mại có
chứa bào tử của trực khuẩn Bacillus như chế phẩm kiểm soát sinh học
Biostart
®
(Mỹ) là một hỗn hợp gồm các loài B. megaterium, B. licheniformis,
Paenibacillus polymyxa và hai chủng B. subtilis; Liqualife
®
(Cargill), sử dụng
4 loài Bacillus không xác định; Promarine

®
(Đài Loan) chứa 4 chủng thuộc
loài B. subtilis; Toyocerin
®
chứa chủng B. cereus var toyoi (NCIMB-
40112/CNCM-1012) với nồng độ tối thiểu là 1x10
10
tế bào/g (Gatesoupe,
1999).
Khoa CN & NTTS 14 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
Các loài Bacillus được sử dụng như là một tác nhân kiểm soát sinh học
và là các vi khuẩn nitrat hóa, có khả năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ
thức ăn thừa và chất thải khác nhờ khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu
cơ như protease, amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn
làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh như Vibrio, Aeromonas…. do chất
lượng nước nuôi bị giảm (Verschuere và cộng sự, 2000).
2.2. BIẾN DỊ Ở VI SINH VẬT
2.2.1. Khái niệm
Biến dị là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do tác động
của các yếu tố môi trường và quá trình tái tổ hợp di truyền.
Quá trình biến dị thường tạo ra những dòng có khả năng thích ứng tốt
hơn với điều kiện ngoại cảnh.
2.2.3. Các dạng biến dị
Có hai loại biến dị là: Biến dị kiểu hình và biến dị kiểu gen.
2.2.3.1. Biến dị kiểu hình
Là những biến dị về các tính trạng bên ngoài, tạm thời, thuận nghịch và
không ổn định của quần thể vsv. Biến dị xuất hiện do sự tác động của các
nhân tố ngoại cảnh. Những biến dị này xuất hiện chậm và mất đi khi các yếu
tố làm xuất hiện chúng mất đi do đó đây là biến dị không di truyền.

Vi khuẩn trở nên mập hơn nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu
chất dinh dưỡng, trái lại, trong môi trường nghèo dinh dưỡng, tế bào sẽ có
dạng mảnh hoặc dạng cầu bất thường.
- Sức căng bề mặt của môi trường như độ axit (pH) tăng cao cũng làm
vi khuẩn mập, ngắn hơn.
a. Biến dị hình thái vsv
Hình thái của vsv có thể thay đổi do ảnh hưởng của những yếu tố khác
nhau: Thành phần hóa học của môi trường; Điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ,
áp suất…); Những chất độc (chất sát trùng, kháng sinh…)
b. Biến dị về dạng khuẩn lạc
Khoa CN & NTTS 15 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
Được coi là biến dị gây ra bởi điều kiện môi trường. Nguyên nhân do
những tổn thương trong cấu trúc của tế bào vi khuẩn có thể tạo nên những
biến dạng của khuẩn lạc. Ví dụ: Những vi khuẩn cùng loài khi phát triển
trên môi trường đặc có thể hình thành khuẩn lạc láng (dạng S) hoặc nhám
(dạng R). Trong một số điều kiện nuôi cấy sẽ tạo ra khuẩn lạc trung gian
không ổn định như khuẩn lạc con, khuẩn lạc lùn nhỏ, khuẩn lạc G mọc trên
mặt, khuẩn lạc L mọc ở rìa khuẩn lạc bình thường, khuẩn lạc lớn nhầy…
Một số vsv có biến dị về màu sắc khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi
trường chọn lọc (Serratea marcesceus) hoặc sinh sắc tố làm biến đổi màu sắc
của môi trường
2.2.3.2. Biến dị kiểu gen
Biến dị kiểu gen là chỉ những biến đổi xảy ra trong cấu trúc gen. Mỗi
biến dị dẫn đến sự thay đổi trình tự nucleotid tạo ra các alen khác nhau. Đột
biến có thể xảy ra do biến đổi nhiều nucleotid hoặc do một nucleotid. Đột
biến gen không thể phát hiện được khi quan sát tế bào học.
Trong tự nhiên, dù giữ trong điều kiện nào, tất cả các gen đều có đột
biến, được gọi là đột biến tự nhiên hay ngẫu nhiên (spontanous mutation).
Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít. Các gen khác nhau của cùng

một loài có thể có tần số đột biến khác nhau, nhưng tần số đột biến tự nhiên
của mỗi gen là một số ổn định.
Ngoài thiên nhiên, hiện tượng đột biến của vi sinh vật xảy ra rất thường
xuyên, nhưng không phải đột biến nào cũng biểu hiện ra tính trạng bên ngoài.
Nếu đột biến có tính trội thì tính trạng đột biến sẽ thể hiện ngay, nhưng nếu
gen đột biến có tính lặn thì tính trạng đột biến không thể hiện ra ngay mà nằm
trong trạng thái lặn khá lâu.
Trong phòng thí nghiệm chỉ có một số ít chủng đột biến có thể quan sát
được vì chỉ theo dõi được một số ít tính trạng như tốc độ sinh trưởng, hình
thái khuẩn lạc, kháng thuốc kháng sinh…
Khoa CN & NTTS 16 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
Đột biến kiểu gen có thể làm thay đổi nhiều tính trạng của vsv, nhưng
thường thấy là:
- Thể đột biến bền vững với kháng sinh: gặp ở vk gây bệnh
- Thể đột biến sinh hóa: sự đột biến của một số gen kiểm soát sự hình
thành và hoạt động của một số enzyme chuyển hóa làm thay đổi nhu
cầu về dinh dưỡng, kiểu lên men…
- Thể đột biến hình thái: sự đột biến hình thành các thể không còn khả
năng hình thành tiêm mao (đột biến gen kiểm soát tổng hợp flagelin)
- Thể đột biến khuẩn lạc: Thay đổi hình dạng, trạng thái của khuẩn lạc
(dạng R thành dạng S…)
- Ngoài ra còn thấy có đột biến thay đổi tính kháng nguyên, thay đổi độc
lực, sự đề kháng chất độc….
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN VI SINH VẬT
2.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật
Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy
trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay
bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau
đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích

hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng
vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực
tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như:
Staphylococi, Colifom… có thể sống được vài năm theo cách này. Cho dù khá
phổ biến và được dùng trong các cơ sở nghiên cứu, nhưng phương pháp này
cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
- Dễ bị tạp nhiễm và dẫn đến mất chủng giống gốc.
- Mất hoặc nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo
quản.
- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các
chủng bảo quản.
Khoa CN & NTTS 17 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
- Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền
không thích hợp.
- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do
đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.
a. Cấy truyền trên môi trường dịch thể
- Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10ml môi trường nuôi cấy vi
sinh vật trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121
o
C trong 15 phút.
Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản.
- Một vòng que cấy chủng vi sinh vật bảo quản được đưa vào môi
trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở nhiệt độ thích hợp trong 72 giờ. Phải
kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản.
- Sau đó các mẫu được giữ ở 4
o
C.

Thông thường, theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay
đổi 2 – 6 tháng.
b. Cấy truyền trên môi trường thạch
Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như trên môi trường dịch
thể nhưng ở đây môi trường được bổ sung thạch (1,6%). Giống sau khi cấy
được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau
đó được để ở 4 – 8
o
C. Định kỳ để cấy truyền giống, tuỳ từng nhóm vi sinh vật
khác nhau mà định kỳ cấy truyền khác nhau, song giới hạn tối đa là 3 tháng.
Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp
cấy truyền dịch thể, thông thường giống được bảo quản 3 – 6 tháng.
c. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng
Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyển nhiều lần, cụ
thể là hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cho
lớp thạch môi trường bị khô dần và giống có thể bị chết, thì phủ lên môi
trường thạch có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng parafil dày khoảng
10mm. Lớp parafil này sẽ hạn chế được sự tiếp xúc của vi sinh vật đối với
Khoa CN & NTTS 18 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
oxy không khí (O
2
) và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch, do
vậy giống có thể bảo quản được lâu hơn và không bị nhiễm tạp, thoái hóa.
Những chủng đã được xử lý ở trên sẽ được giữ trong tủ lạnh ở 5
o
C và có thể
bảo quản nhiều năm.
2.3.2. Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát, hạt
a. Bảo quản giống trong cát

Dùng cát sông rửa sạch bằng nước nhiều lần đến khi nước không đục,
sấy khô, sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất và rác bẩn. Có thể dùng axit clohydric
đặc để oxy hóa các chất hữu cơ. Sấy khô ở 120
o
C trong 3 – 4 giờ. Chia cát
khô vào ống nghiệm thủy tinh đã sấy thanh trùng ở 160 – 180
o
C khoảng 2 giờ.
Ta có thể kiểm tra độ vô trùng của cát bằng cách cho môi trường dịch đường
hóa và thịt – peptone vô trùng vào ống cát đã hấp thanh trùng. Sau đó cho vào
tủ ấm 28 – 30
o
C khoảng một tuần. Quan sát hàng ngày nếu thấy loại dịch này
đục thì coi như cát chưa vô trùng.
Đổ cát đã chuẩn bị vào các ống nghiệm giống đã thanh trùng sao cho
cát không rơi vào mặt thạch, không dính lên thành ống nghiệm. Úp mặt thạch,
dùng que cấy cào bào tử vào cát, đổ cát có bào tử vào ống nghiệm vô trùng
lắc đều. Chỉ bảo quản những ống cát vào bào tử khô không bị ướt và vón cục,
các ống cát giống đậy bằng nút bông. Dùng parafil nóng chảy phết lên nút
bông của ống nghiệm giúp cho ống giống không bị ẩm ướt và giữ ở nhiệt độ
phòng hay ở 4 – 6
o
C.
Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống và cấy vào
các ống thạch nghiêng, sau đó chọn lựa và cấy chuyển tiếp.
b. Bảo quản giống trong đất khô
Nghiền đất và rây lấy những hạt bằng nhau. Chia đất nghiền vào các
ống nghiệm, thêm 1 – 2 giọt nước, có thể thêm 1 – 2% CaCO
3
để trung hòa

các loại đất chua hoặc cho một ít than hoạt tính vào đáy ống để cho đất sau
khi thanh trùng luôn khô. Đậy bông và để các ống nghiệm có đất vào giỏ đem
hấp thanh trùng hai lần ở 120
o
C một giờ cách nhau một ngày. Kiểm tra độ vô
Khoa CN & NTTS 19 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
trùng của môi trường giữ giống như đối với cát và giữ giống trong đất như ở
cát. Ngoài ra ta có thể giữ giống trong hỗn hợp cát và đất. Phương pháp này
bảo quản thành công với giống Clostridium pasteurianum.
c. Giữ giống trên hạt
Có thể giữ bào tử nấm mốc, xạ khuẩn trên các hạt thực vật khác nhau. Ở
Liên Xô cũ thường bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh trên hạt kê: chọn
hạt kê vàng đã làm sạch, cho vào nước sôi khuấy trộn đều, giữ 30 phút cho các
hạt thấm ẩm hoàn toàn rồi lọc. Tãi kê ẩm ra trên mặt khay để xoa cồn, làm
nguội các hạt phải rời nhau rồi cho vào từng lọ (khoảng 15 – 16g mỗi lọ thể
tích 250ml). Các bình đậy nút kín và thanh trùng ở 115
o
C khoảng 30 – 40 phút.
Thử vô trùng các giống bằng phương pháp trên. Cấy vào mỗi bình 2ml dịch
huyền phù bào tử hay khuẩn ty dinh dưỡng. Lắc nhẹ cho giống đều trên các hạt
kê và nuôi ở nhiệt độ 24 – 28
o
C trong 8 ngày. Sau đó sấy trong các thiết bị chân
không đến khi độ ẩm kê có giống phát triển không quá 8%. Kiểm tra giống và
tráng parafil lên nút bông. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong tối và khô.
2.3.3. Phương pháp đông khô và đông khô dịch thể trực tiếp
a. Phương pháp đông khô
Đông khô là quá tình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang
ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây, vi sinh vật được huyền phù trong môi trường

thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô
sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được
hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không.
Phương pháp này cũng phải cấy truyền và làm lại, nhưng thời gian giữa
các lần cấy chuyển kéo dài hơn so với phương pháp giữ giống trên thạch:
Giữ ở t
o
= -15
o
C đến -20
o
C : 6 tháng cấy chuyển một lần.
Giữ ở t
o
= -30
o
C : 9 tháng cấy chuyển một lần.
Giữ ở t
o
= -40
o
C : 1 năm cấy chuyển một lần.
Giữ ở t
o
= -50
o
C đến -60
o
C : 3 năm cấy chuyển một lần.
Giữ ở t

o
= -70
o
C : 10 năm cấy chuyển một lần.
Khoa CN & NTTS 20 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying)
Khác với phương pháp đông khô ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được
làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ
trước. Phương pháp này thường sử dụng cho nhóm vi khuẩn không có khả
năng sống trong điều kiện nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông.
Các thông số quan trọng cần chú ý:
- Tuổi của vi sinh vật bảo quản.
- Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.
- Tốc độ đông khô.
- Nhiệt độ đông khô thấp nhất.
- Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu.
Đây là phương pháp nhanh và thuận lợi khi phải bảo quản số lượng
mẫu lớn. Thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ
10 – 20 năm.
2.3.4. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản
trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị
bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196
o
C đến -80
o
C).
Khi bảo quản vi sinh vật theo phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ
trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một trong những nguyên nhân dẫn

đến vỡ tế bào là do tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình
thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này, người ta
đã bổ sung các chất làm hạn chê tốc độ lạnh sâu như Glycerol, DMSO
(dimethyl sulfoxide).
Bảo quản ở mức nhiệt độ cao hơn -30
o
C thì hiệu quả thấp hơn do tế bào
chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải.
Phương pháp này mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng cũng bộc lộ một số
nhược điểm như: kinh phí đầu tư cho thiết bị cao, rủi ro cháy nổ… Đặc biệt,
Khoa CN & NTTS 21 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
phương pháp này không thích hợp với những chủng vi sinh vật thường xuyên
dùng đến.
Nói chung, phương pháp này được áp dụng cho những chủng vi sinh
vật có những đặc tính quý mà không thích hợp với phương pháp đông khô.
Khoa CN & NTTS 22 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
PHẦN III
ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG –ĐỊA ĐIỂM – THỜI GIAN NGHIÊN CƯU
- Đối tượng: Một số chủng vi khuẩn Bacillus đang được bảo quản tại
phòng thí nghiệm bộ môn Dinh dưỡng-Thức ăn, khoa Chăn nuôi và nuôi
trồng thủy sản
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh, bộ môn Dinh dưỡng-Thức ăn,
khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nông nghiệp Hà
Nội.
- Thời gian : từ tháng 01đến tháng 07 năm 2013
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1 Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Bacillus trong thời

gian giữ giống:
- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
- Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn
3.2.2. Đánh giá sự biến đổi về đặc tính sinh học của các chủng Bacillus
- Đánh giá khả năng phân giải Protein.
- Đánh giá khả năng phân giải tinh bột
- Đánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Nguyên vật liệu
Môi trường LB:
Peptone: 10g
Cao men: 5g
NaCl: 10g
Agar : 16-20g
Nước cất: 100ml
Môi trường dịch thể thì không có thạch.
Khoa CN & NTTS 23 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
Hấp tiệt trùng ở 121
o
C trong 15 – 20 phút
Các chủng Bacillus sử dụng trong nghiên cứu:
+ 01 chủng Bacillus Megaterium (Bm)
+ 01 chủng Bacillus subtilis (Bs)
+01 chủng Bacillus licheniformis (Bli)
+ 01 chủng Bacillus polymyxa (Bp)
+ 01 chủng Bacillus cereus (Bc)
Tất cả các chủng giống đều được phân lập và chọn lọc mới.
3.3.2. Phương pháp bảo quản, giữ giống
Sử dụng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng (Agar

slope method) và bảo quản ở 4
o
C
Các chủng Bacillus sau khi phân lập và chọn lọc với mục đích sử dụng
làm giống khới động sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch LB ở 37
o
C/24-
48h để giữ giống. Kiểm tra tạp nhiễm giống trước khí bảo quản trong giống
trong tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4
o
C. Giống được cấy truyền 1 tháng một lần
sang môi trường LB mới.
Trong quá trình bảo quản, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về hình thái,
đặc tính sinh học của giống tại các thời điểm 0, 30, 60, 90 ngày.
3.3.3. Phương pháp xác định hình thái
- Hình thái tế bào được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Xem
phụ lục) và quan sát tiêu bản nhuộm dưới kính hiển vi quang học với độ
phóng đại 1500 lần.
- Quan sát bào tử bằng phương pháp nhuộm với Lục Malachite. Bào tử
bắt màu xanh, tế bào bắt màu đỏ
- Hình thái của bào tử được nhuộm với thuôc
- Quan sát hình thái, tính chất khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường thạch
bằng kính lúp có độ phóng đại 20 lần.
3.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải protein
Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch
Khoa CN & NTTS 24 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa:
Cao nấm men 5g NaCl 10g
Sữa tách bơ 300ml Nước cất 700ml

Agar 16 – 20g
Điều chỉnh pH = 6,1 – 6,5.
- Cấy các chủng cần kiểm ra vào các đĩa thạch trên, cấy dạng điểm,
nuôi cấy ở 35
o
C/24 – 48 giờ.
Kết quả:
+ Dương tính: Có vòng phân giải protein xung quanh khuẩn lạc. Dùng
thước để đo đường kính của vòng phân giải.
- Âm tính: Không có vòng phân giải
3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải tinh bột
- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa :
Tinh bột tan : 10g Cao thịt: 3g
Agar : 15-20g Nước cất: 1000ml
Điều chỉnh pH = 6,1 - 6,5
- Cấy các chủng cần kiểm tra vào các đĩa thạch trên, cấy dạng điểm, nuôi
cấy ở 35
o
C/24 – 48 giờ.
Kết quả:
Nhỏ đều dung dịch Lugol lên trên bề mặt thạch, để 15 phút.
+ Dương tính: Có vòng phân giải Tinh bột xung quanh khuẩn lạc, dùng
thước đo đường kính của vòng phân giải.
- Âm tính: Không có vòng phân giải
3.3.6. Đánh giá khả năng sinh trưởng ở các nhiệt độ khác nhau
- Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch LB dịch thể.
- Đưa vi khuẩn đã cấy vào tủ ấm. Điều chỉnh nhiệt độ của tủ ấm ở các
nhiệt độ 30
o
C, 35

o
C, 40
o
C, 50ºC, 55ºC. Đếm số lượng tế bào ở các thời điểm 0
giờ, 24 giờ, 48 giờ.
Khoa CN & NTTS 25 Trường đại học NN Hà Nội