đánh giá khả năng chịu lạnh và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ các giống lúa xuân châu hương, q5, c27, khang dân, u17 và nhị ưu 63 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM




TĂNG THỊ NGỌC MAI



ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH
VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG
CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG,
Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC






Thái Nguyên – Năm 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực. Một số kết quả đã được công bố cùng
PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công
trình nào khác.


Tác giả




Tăng Thị Ngọc Mai

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM



TĂNG THỊ NGỌC MAI


ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH
VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG
CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG,
Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.46.30


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm





Thái Nguyên – Năm 2011


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực. Một số kết quả đã được công bố
cùng PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì
công trình nào khác.
Tác giả

Tăng Thị Ngọc Mai
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào và
vi sinh), KTV Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Di truyền - Sinh học hiện đại)
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình
hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm, khoa Sau đại
học, bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống, Ban chủ
nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô giáo, cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Tác giả luận văn




Tăng Thị Ngọc Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
2,4D
2,4D – Axit dichlorphenoxyacetic
ADN
Axit deoxyribo nucleic
BAP
6 – Benzyl amino purin
bp
Cặp base (base pair)
cs
Cộng sự
cADN
Sợi ADN bổ sung tổng hợp từ mARN nhờ enzym phiên mã ngược
ĐC
Đối chứng
ĐVHĐ
Đơn vị hoạt độ
EDTA
Axit ethylen diamin tetra axetic
kb
Kilobase
MS
Môi trường Murashige và Skoog
mARN
ARN thông tin
NAA
Axit α – naphthyl axetic (α – naphthyl acetic acid)
PCR
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase

R
0
Cây tái sinh từ mô sẹo
R
1
Thế hệ thứ nhất của cây tái sinh
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA - Phân tích đa hình của ADN
được nhân bản ngẫu nhiên
TAE
Tris axetat EDTA
TTC
2,3,5, Trichloterazolium- chlorid
CTAB
Cetyl trimetyl amoni bromua


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các chữ viết tắt iii
Mục lục i
Danh mục các bảng iv
Danh mục các hình v

MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu về cây lúa 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa 3
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa 3
1.1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam 4
1.1.4. Đặc điểm sinh học của cây lúa nước 6
1.2. Lạnh và cơ chế chịu lạnh 7
1.2.1. Khái niệm về tính chịu lạnh của thực vật 7
1.2.2. Tác động của lạnh lên thực vật 8
1.2.3. Cơ chế chịu lạnh của thực vật và khả năng khắc phục 9
1.2.4. Tác hại của lạnh và tính chịu lạnh ở lúa 10
1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá và nâng cao khả năng
chống chịu ở cây trồng 11
1.3.1. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá khả năng chống chịu
của cây trồng ở mức độ mô - tế bào 11
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu ở
cây trồng 12
1.4. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích hệ gen thực vật 14
1.4.1. Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) 14
1.4.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 17
2.1.1. Vật liệu thực vật 17
2.1.2. Hoá chất và thiết bị 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 18
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 20
2.2.3. Phương pháp phân tích hoá sinh 21
2.2.4. Phương pháp phân tích sinh lý 23
2.2.5. Phương pháp sinh học phân tử 24
2.2.6. Xử lý kết quả và tính toán số liệu 26
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu lạnh của các giống lúa 27
3.1.1. Khả năng chịu lạnh của các giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm 27
3.1.2. Khả năng chịu lạnh của các giống lúa ở giai đoạn cây mạ 33
3.1.3. Khả năng chịu lạnh của các giống lúa ở mức độ mô sẹo 37
3.2. Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh của các giống lúa nghiên cứu
bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 45
3.2.1. Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu lạnh 45
3.2.2. Phân tích mức độ biến động di truyền quần thể R
0
46
3.2.3. Kết quả phân tích đa hình ADN của một số dòng lúa nghiên cứu bằng kỹ
thuật RAPD 47
3.2.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá lúa của một số dòng R
1
có nguồn gốc
từ mô sẹo chịu lạnh giống XCH 48
3.2.3.2. Phân tích đa hình bằng kỹ thuật RAPD 49
3.2.3.3. Mối quan hệ di truyền giữa của các dòng lúa nghiên cứu 58
3.2.3.4. Kết luận phân tích đa hình ADN hệ gen của 5 dòng lúa có nguồn gốc từ mô
sẹo chịu lạnh giống XCH bằng kỹ thuật RAPD 60
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống lúa nghiên cứu 17
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 25
Bảng 3.1. Hàm lượng đường khử của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi
xử lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 27
Bảng 3.2. Hoạt độ α - amylase của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi xử
lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 30
Bảng 3.3. Tương quan giữa hoạt độ α - amylase và hàm lượng đường khử 32
Bảng 3.4. Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh ở 4
0
C± 0,5
0
C trong 32 giờ ở
giai đoạn mạ 3 lá của các giống nghiên cứu 34
Bảng 3.5. Hàm lượng diệp lục trong lá lúa sau khi xử lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5

0
C ở giai
đoạn mạ 3 lá của 6 giống lúa nghiên cứu 35
Bảng 3.6. Khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh cây của các
giống lúa 38
Bảng 3.7. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý lạnh ở 5
0
C ± 0,5
0
C và nuôi phục
hồi 3 tuần 39
Bảng 3.8. Giá trị OD 485 nm của mô sẹo các giống lúa nghiên cứu 40
Bảng 3.9. Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo sau xử lý lạnh 41
Bảng 3.10. Khả năng tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý lạnh 43
Bảng 3.11. Mức độ biến động một số chỉ tiêu nông học của quần thể R
0
tái sinh từ
mô sẹo chịu lạnh của giống XCH 46
Bảng 3.12. Độ tinh sạch và hàm lượng ADN của 6 mẫu lúa nghiên cứu 48
Bảng 3.13. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lúa khi phân tích với
10 mồi ngẫu nhiên 49
Bảng 3.14. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu
nhiên của 6 mẫu lúa nghiên cứu 50
Bảng 3.15. Thống kê các phân đoạn ADN được nhân bản trong phản ứng RAPD với 6
mồi ngẫu nhiên 57
Bảng 3.16. Hệ số đồng dạng di truyền của các dòng của thế hệ R1 và giống gốc XCH.58



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 18
Hình 3.1. Hàm lượng đường khử của 6 giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm
khi xử lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 29
Hình 3.2. Hoạt độ α - amylase của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi xử
lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 31
Hình 3.3. Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh 4
0
C± 0,5
0
C ở giai đoạn cây mạ
3 lá của các giống nghiên cứu 34
Hình 3.4. Hàm lượng diệp lục của các giống sau khi xử lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 36
Hình 3.5. Tỷ lệ mô sẹo sống sót sau khi xử lý lạnh và nuôi phục hồi 40
Hình 3.6. Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo sau xử lý lạnh 42

Hình 3.7. Khả năng tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý lạnh 43
Hình 3.8. Một số hình ảnh trong nuôi cấy in vitro 45
Hình 3.9. Kết quả điện di ADN tổng số tách từ 6 mẫu lúa của giống XCH 48
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M2 51
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M4 52
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M7 53
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M8 54
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M10 55
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M14 56
Hình 3.16. Sơ đồ so sánh các dòng thế hệ R1 và giống gốc XCH ở mức độ phân tử khi
sử dụng các mồi M2, M4, M7, M8, M10, M14 59


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của Việt Nam và nhiều nước khác
trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Á. Khoảng 40% dân số thế giới sử dụng lúa
gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia sản xuất và tiêu
thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất và mức tiêu thụ cao tập
trung ở khu vực châu Á. Ở Việt Nam, lúa là cây trồng chiếm vị trí quan trọng trong
nền kinh tế quốc dân. Lúa gạo không chỉ là nguồn cung cấp lương thực thiết yếu mà
còn là nguồn thu ngoại tệ đáng kể. Theo số liệu thống kê năm 2010 của Cục Trồng
trọt, sản lượng lúa cả nước năm 2010 ở mức 39,9 triệu tấn, trong đó, các tỉnh phía
Nam chiếm trên 23,5 triệu tấn, riêng vùng đồng bằng sông Cửu Long đạt sản lượng
21,5 triệu tấn với năng suất bình quân 5,47 tấn/ha [55], [57], [58].
Cây lúa (Oryza sativa L.) là loại cây trồng rất mẫn cảm với các điều kiện
ngoại cảnh. Các yếu tố ngoại cảnh bất lợi thường xuyên tác động đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của cây lúa là: nhiệt độ cực đoan, hạn hán hay ngập úng, độ
mặn, ánh sáng bất lợi… Một trong những yếu tố đó là nhiệt độ thấp. Vùng núi phía
Bắc, đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ là những khu vực thường xuyên chịu
ảnh hưởng của lạnh và đây cũng chính là nguyên nhân là giảm năng suất lúa của
vùng. Lúa vụ đông xuân chịu tác động mạnh nhất của nhiệt độ thấp. Vì vậy, nghiên
cứu khả năng chịu lạnh và tăng cường khả năng chống chịu với nhiệt độ thấp nhằm
nâng cao năng suất và ổn định sản lượng của các giống lúa là yêu cầu thiết thực đối
với các tỉnh miền Bắc và khu vục Bắc Trung Bộ [3], [4].
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực nhằm cải tiến cây trồng,
đặc biệt trong chọn dòng tế bào có khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại
cảnh bất lợi. Đây là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng đã được sử dụng và tạo
ra những giống cây trồng mới có khả năng chống chịu cao trong một thời gian ngắn
so với các phương pháp truyền thống [2].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‘‘Đánh giá khả
năng chịu lạnh và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
giống lúa Xuân Châu Hƣơng, Q5, C27, Khang Dân, U17 và Nhị Ƣu 63 bằng kỹ
thuật nuôi cấy in vitro’’.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định khả năng chịu lạnh của một số giống lúa ở giai đoạn nảy mầm,
giai đoạn cây non và ở mức độ mô sẹo.
- Tạo được vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh ở lúa bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô - tế bào thực vật.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Đánh giá khả năng chịu lạnh ở một số giống lúa nghiên cứu
- Đánh giá khả năng chịu lạnh của lúa ở giai đoạn nảy mầm thông qua việc
xác định ảnh hưởng của nhiệt độ thấp tới hàm lượng đường khử và hoạt độ độ

enzyme α - amylase.
- Đánh giá khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ ba lá thông qua đánh giá
ảnh hưởng của lạnh đến tỉ lệ thiệt hại, hàm lượng diệp lục a, b sau khi xử lý lạnh
nhân tạo.
- Đánh giá khả năng chịu lạnh ở mức độ mô sẹo.
(2) Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô -
tế bào thực vật
- Sàng lọc dòng tế bào chịu lạnh, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh. Phân
tích đặc điểm nông học của quần thể R
0
.
- Đánh giá đa dạng một số dòng R
1
bằng kỹ thuật RAPD.









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây lúa

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa
Cây lúa (Oryza sativa L.) còn được gọi là lúa châu Á được thuần hoá từ
lúa dại ở ba trung tâm đầu tiên vùng Đông Nam Á: Assam (Ấn Độ), biên giới
Thái Lan - Myanmar, trung du Tây Bắc - Việt Nam. Theo tài liệu của Trung
Quốc, khoảng năm 2800 - 2700 trước Công Nguyên, Trung Quốc đã có nghề
trồng lúa. Markey và De Candolle, Roievich cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng ở
miền Nam - Việt Nam và Campuchia [4].
Tuy có nhiều tài liệu khác nhau và các nhà khảo cổ đã chứng minh nguồn
gốc khác nhau của cây lúa nhưng đa số các tài liệu đều cho rằng nguồn gốc cây lúa
ở vùng đầm lầy Đông Nam Á. Tổ tiên các loài lúa hiện nay là các dạng lúa dại
Oryza fatua, Oryza off Cinalis, Oryza minuta [4].
Lúa thuộc họ hoà thảo (Proaceae, trước đây gọi là họ Gramineae). Lúa trồng
thuộc chi Oryza. Chi Oryza có 23 loài phân bố rộng trên thế giới, trong đó có 2 loài
lúa trồng. Loài Oryza sativa L. được trồng phổ biến khắp các nước trồng lúa trên
thế giới và phần lớn tập trung ở châu Á. Loài Oryza gluberrima S. được trồng ở một
số nước thuộc châu Phi. Sự tiến hoá của cây lúa gắn liền với sự tiến hoá của loài
người, đặc biệt ở châu Á [4].
Loài lúa Oryza sativa L. được chia làm ba loài phụ: Loài phụ Japonica phân bố
ở nơi có vĩ độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu
bệnh; loài phụ Indica được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới (Ấn Độ,
Mianma, Philippin, Việt Nam, Thái Lan), có đặc điểm là hạt dài, thân cao, mềm, dễ đổ,
chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ ánh sáng; loài phụ Javancia
được trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia, có đặc điểm trung gian, hạt dài nhưng dày
và rộng hơn hạt của loài phụ Indica [4].
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa
Trên thế giới, trong cơ cấu sản xuất lương thực, lúa gạo chiếm 26,5%. Sản
lượng lúa đã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là
650 triệu tấn/năm mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau diện tích trồng lúa mỳ [4].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Gạo là nguồn lương thực chính của 2 tỷ người sống ở châu Á và hàng trăm
triệu người sống ở các châu lục khác. So sánh thành phần dinh dưỡng của một số
cây lương thực cho thấy, lúa gạo nghèo protein và tinh bột hơn lúa mỳ nhưng lại
giàu hơn về xenlulôzơ và tro [4].
Trong thành phần của gạo, tinh bột chiếm 68% - 70% khối lượng thô, bình
quân 8% - 9% protein, lipit từ 0,9% - 1,5%. Protein trong gạo chứa đầy đủ các loại
axit amin không thay thế, kể cả các axit amin giới hạn như lizin và treonin. Vì thế
hiệu suất hấp thụ cho người và động vật là rất cao. Ngoài ra, trong gạo còn chứa
một số chất khoáng và vitamin nhóm B. Từ gạo, người ta có thể chế biến ra nhiều
món ăn khác nhau. Giá trị kinh tế của lúa gạo không chỉ giới hạn ở chỗ là lương
thực của con người mà lúa gạo còn là nguồn nguyên liệu quý sản xuất tân dược và
nhiều ngành công nghiệp nhẹ: sản xuất bánh kẹo, rượu bia Những sản phẩm của
cây lúa như cám, thóc lép còn là thức ăn cho gia súc, gia cầm. Gạo là mặt hàng xuất
khẩu làm tăng thu nhập quốc dân, góp phần ổn định và đảm bảo an ninh lương thực
của nhân loại [4].
1.1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam
1.1.3.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới
Theo thống kê của FAO năm 2006, có 114 nước trồng lúa và phân bố ở tất cả
các châu lục trên thế giới, châu Phi có 41 nước, châu Á có 30 nước, Bắc Trung Mỹ
có 14 nước, Nam Mỹ có 13 nước, châu Âu có 11 nước và châu Đại Dương có 5
nước…Có 18 nước có diện tích trồng lúa trên 1.000.000 ha tập trung ở châu Á.
Diện tích lúa biến động và đạt khoảng 152.000 triệu ha, năng suất lúa trung bình 4,0
tấn/ha. Châu Á là khu vực có diện tích trồng lúa lớn nhất thế giới chiếm 90%, châu
Phi là 3,1%, Bắc Trung Mỹ là 1,3% Ấn Độ là nước có diện tích trồng lúa lớn nhất
với 44.790 triệu ha, ngược lại Jamaica là nước có diện tích trồng lúa thấp nhất với
24 ha. Năng suất lúa cao nhất đạt 9,45 tấn/ha tại Australia và thấp nhất là 0,9 tấn/ha
tại Iraq [59].
Sản lượng lúa năm 2009 đạt 678 triệu tấn, tăng 10 triệu tấn so với dự đoán

trước đây. Báo cáo mới nhất của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hiệp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
quốc (FAO) cho biết, thời tiết xấu đã ảnh hưởng tới vụ mùa ở châu Á làm sản lượng
lúa thế giới năm 2010 chỉ đạt 697,9 triệu tấn, giảm gần 6,5% so với dự báo trước
đó. Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) ước tính sản lượng gạo thế giới năm nay sẽ đạt
451,4 triệu tấn, thiếu 1,1 triệu tấn so với nhu cầu và là năm thiếu hụt đầu tiên trong
vòng 4 năm trở lại đây [58].
1.1.3.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam
Việt Nam là một trong mười quốc gia sản xuất gạo lớn nhất thế giới. Theo
thống kê của FAO năm 2008, Việt Nam có diện tích lúa khoảng 7,4 triệu ha, đứng
thứ 7 sau các nước có diện tích trồng nhiều nhất châu Á: Ấn Độ (gần 44,0 triệu ha),
Trung Quốc (29,5 triệu ha), Indonesia (xấp xỉ 12,3 triệu ha), Bangladesh (gần 11,7
triệu ha), Thái Lan (10,2 triệu ha), Myanmar (xấp xỉ 8,2 triệu ha). Việt Nam có năng
suất lúa trung bình 5,2 tấn/ha đứng thứ 24 trên thế giới sau: Ai Cập (9,7 tấn/ha), Úc
(9,5 tấn/ha), El Salvador (7,9 tấn/ha), đứng đầu khu vực Đông Nam Á và đứng thứ
tư trong khu vực châu Á sau Hàn Quốc (7,4 tấn/ha), Trung Quốc (6,6 tấn/ha), Nhật
Bản (6,5 tấn/ha). Mức tăng năng suất trong 8 năm qua là 0,98 tấn/ha, đứng thứ 12
trên thế giới và đứng đầu của 8 nước có diện tích nhiều ở châu Á. Về khả năng cải
thiện năng suất lúa trên thế giới, Việt Nam vượt trội trong khu vực Đông Nam Á
nhờ thủy lợi được cải thiện đáng kể và áp dụng nhanh các tiến bộ kỹ thuật về giống,
phân bón và bảo vệ thực vật [57].
Theo thống kê của FAO năm 2008, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng
năm đứng thứ 5 trên thế giới nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng thứ 2 (5,2 triệu
tấn) sau Thái Lan (9,0 triệu tấn), chiếm 18% sản lượng xuất khẩu gạo thế giới,
22,4% sản lượng xuất khẩu gạo của châu Á, mang lại lợi nhuận 1275,9 tỷ USD
năm 2006 [58].
Hiệp hội Lương thực Việt Nam (VFA) cho biết, tính đến hết ngày

25/11/2010, Việt Nam đã xuất khẩu được 5,6 triệu tấn gạo, đạt giá trị 2 tỷ 266 triệu
USD, tăng 33% về số lượng. Trong năm 2009, lượng gạo xuất khẩu đạt hơn 6 triệu
tấn các loại. Năm 2011 là năm khó khăn trong sản xuất nông nghiệp, thấy rõ nhất là
lạnh kéo dài ở khu vực miền Bắc và Bắc Trung Bộ, hạn ở khu vực các tỉnh miền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
Bắc, Tây Nguyên, đồng bằng sông Cửu Long và giá vật tư đầu vào tăng. Ảnh hưởng
do bão lụt gây ra khó dự báo trước. Nguy cơ dịch bệnh đối với cây lúa như: rầy nâu,
bệnh vàng lùn - lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen… vẫn còn cao. Tuy nhiên, sản lượng
của hầu hết nông sản theo hướng gia tăng. Đối với sản xuất lúa gạo, dự báo sản
lượng năm 2011 sẽ đạt 39 - 39,5 triệu tấn lúa, thấp hơn so với năm 2010 là năm
được mùa (39,8 triệu tấn). Nếu thời tiết thuận lợi, không loại trừ khả năng đạt 40
triệu tấn là đỉnh cao sản lượng lúa từ trước đến nay [55].
Sản lượng gạo xuất khẩu cả nước phụ thuộc vào sản lượng lúa ở đồng bằng
sông Cửu Long. Sản lượng lúa của vụ đông xuân ước đạt 10 triệu tấn lúa, đủ cung
cấp 3 triệu tấn gạo để xuất khẩu trong 6 tháng đầu năm 2011. Vụ hè thu và thu
đông, sẽ có thêm trên 10 triệu tấn lúa. Tổng cộng ở đồng bằng sông Cửu Long cả
năm sẽ đạt trên 20 triệu tấn lúa. Vì vậy, xuất khẩu gạo năm 2011 dự kiến đạt 6 - 6,5
triệu tấn, chiếm 20% - 22% thị phần trên thị trường gạo thế giới [56].
1.1.4. Đặc điểm sinh học của cây lúa nƣớc
1.1.4.1. Đặc điểm sinh học
Lúa thuộc cây thân thảo sinh sống hàng năm. Thời gian sinh trưởng của các
giống trong khoảng 60 - 250 ngày. Khi nảy mầm, phôi phát triển thành mầm rễ, bắt
đầu một chu kỳ mới của cây [4], [9].
Cây lúa bao gồm các bộ phận chính là: rễ, thân, lá, bông, hạt. Hệ rễ của lúa
thuộc loại rễ chùm. Thân lúa phát triển từ thân mầm, có hình ống tròn, được cấu tạo
bởi nhiều gióng rỗng và đốt đặc, được bẹ lá bao bọc cho đến lúc trổ bông. Lá lúa
hoàn chỉnh gồm các phần: bẹ, bản lá, tai lá và thìa lá. Hoa lúa là hoa lưỡng tính, có

khả năng tự thụ phấn tương đối nghiêm ngặt, ít có khả năng thụ phấn chéo [4], [9].
Chi Oryza có bộ nhiễm sắc thể cơ bản là 12. Trong số 23 loài lúa dại có 8
loài mang bộ nhiễm sắc thể tứ bội, còn lại đa số các loài lúa dại và lúa trồng hiện
nay có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n = 24) [9].
Lúa là loại cây trồng mẫn cảm với các điều kiện ngoại cảnh. Quá trình
sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lúa chịu ảnh hưởng lớn bởi các
yếu tố môi trường [9].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
1.1.4.2. Đặc điểm sinh thái
Các nhân tố sinh thái (nhiệt độ, ánh sáng, nước, đất) thường xuyên ảnh
hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Nhiệt độ là một trong những nhân
tố ảnh hưởng lên hầu hết các giai đoạn phát triển của cây lúa. Ở mỗi giai đoạn sinh
trưởng, cây lúa yêu cầu nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ thích hợp nhất là 28
0
- 32
0
C,
ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ dưới 13
0
C [4].
Ánh sáng tác động tới cây lúa ở hai mặt là cường độ và thời gian chiếu sáng.
Quang hợp của lúa được tiến hành thuận lợi ở 250 - 400 cal/cm
2
/ngày. Cường độ ánh
sáng trong ngày ảnh hưởng tới thời gian ra hoa, kết hạt ở lúa [4].
Nước là một yếu tố thiết yếu của lúa. Lúa cần nhiều nước hơn các cây trồng
khác. Để tạo ra 1g chất khô, cây lúa cần 628g nước. Lượng nước cần thiết cho cây

lúa trung bình 6 - 7 mm
3
/ngày trong mùa mưa và 8 - 9 mm
3
/ngày trong mùa khô [9].
Đất trồng tốt nhất đối với lúa là đất thịt, trung tính đến sét, có hàm lượng N,
P, K tổng số cao, pH = 4,5 - 7, độ mặn nhỏ hơn 0,5% tổng số muối tan [4], [34].
1.2. Lạnh và cơ chế chịu lạnh
Thực vật chỉ có thể sống được trong một giới hạn xác định của các điều kiện
sinh thái như: nóng, lạnh, phèn, mặn Ở ngoài giới hạn này, các yếu tố đó trở thành
bất lợi và có khả năng gây ra tác hại cho thực vật. Tùy theo loài và giống mà mức
độ thiệt hại có khác nhau: một số bị chết, một số khác bị tổn thương, nhưng một số
hoàn toàn không bị ảnh hưởng gì. Khả năng của thực vật ngăn ngừa thương tổn gọi
là tính chống chịu [3], [34].
1.2.1. Khái niệm về tính chịu lạnh của thực vật
Tính chịu lạnh của thực vật là khả năng của cây chịu được trong thời gian dài
sự tác động của nhiệt độ dương thấp (từ 1
0
C - 10
0
C). Cây xứ ôn đới chịu lạnh tốt,
cây vùng á nhiệt đới và vùng nhiệt đới chịu lạnh kém. Mức độ chịu lạnh của các
loài cây, các cơ quan và các giai đoạn phát triển là khác nhau. Do tác động của nhiệt
độ thấp đối với thực vật thay đổi rất nhiều nên việc nghiên cứu tính chịu lạnh của
thực vật là một vấn đề khó [2], [3].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
1.2.2. Tác động của lạnh lên thực vật

Tác động của lạnh lên thực vật và gây tổn thương tùy theo mức độ và
thời gian [2].
Tác động của lạnh ở nhiệt độ dưới 0
0
C chủ yếu là tác hại của nước ở dạng
tinh thể gây tổn thương đến nguyên sinh chất của tế bào. Tác động của lạnh ở nhiệt
độ trên 0
0
C gây ảnh hưởng đến một loạt chức năng sống của tế bào, thậm chí cấu
trúc tế bào cũng có thể bị tổn thương [3].
Lạnh gây tổn thương và chết ở thực vật là do độ nhớt chất nguyên sinh bị
thay đổi, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất. Ở nhiệt độ thấp, xảy ra hiện tượng
đông các chất mỡ và giảm các quá trình sinh hóa. Độ nhớt chất nguyên sinh tăng lên
làm chậm quá trình trao đổi chất, phân giải protein, kết hạt và đông kết chất nguyên
sinh, làm suy yếu mối liên kết giữa protein và diệp lục. Mặc dù cường độ hô hấp
tăng lên nhưng không bù lại được sự thiếu hụt năng lượng của cơ thể [3], [4].
Có thể nhận thấy, thực vật không có khả năng chống chịu lạnh dưới 10
0
C có
hiện tượng phân hủy diệp lục, lá cây đặc biệt là lá non mất màu xanh trở thành bạch
tạng. Lạnh làm tổn thương chức năng của bộ rễ, làm cho quá trình hút nước vào cây
và cung cấp nước lên thân, lá bị ngưng trệ, ngay cả khi rễ cây ngập trong nước (cây
lúa nước) lá vẫn bị héo khô [3], [4].
Giai đoạn sinh sản ở thực vật bao gồm quá trình phân hóa hoa, trổ bông, thụ
phấn, kết hạt là giai đoạn chịu tác động mạnh mẽ của nhiệt độ thấp. Ở giai đoạn cây
lúa trổ bông, nếu gặp nhiệt độ dưới 20
0
C thì kết quả thụ phấn sẽ giảm và tỷ lệ hạt lép
sẽ tăng lên đáng kể. Nếu lạnh hơn và thời gian kéo dài có thể gây bất thụ hoàn toàn
[3].

Đối với những giống chịu lạnh, ở mức độ phân tử, khi gặp lạnh, hoạt độ của các
enzyme cung cấp năng lượng như ATPase của tonoplast rất bền vững. Tính chất của hệ
thống màng nguyên sinh nói chung biến đổi dưới tác động của lạnh nhưng những biến
động đó không làm cho hoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ hoàn toàn [3].
Nhiều nghiên cứu tiến hành trên các đối tượng thực vật bằng nhiều phương
pháp (đo độ nhớt chất nguyên sinh, xác định hoạt tính của enzyme photphorylase)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
đếu cho rằng, bất cứ sự giảm nào về độ nhớt chất nguyên sinh đều làm tăng tính
chống chịu của tế bào với nhiệt độ thấp vì sự thay đổi các chất xảy ra chậm hơn [3].
1.2.3. Cơ chế chịu lạnh của thực vật và khả năng khắc phục
Héo và khô lá là dấu hiệu ngoài chung nhất của sự cảm lạnh ở cây ưa
nóng. Dưới tác dụng của lạnh, lá cây bị nhạt màu do diệp lục bị phá hủy (ở cây
lúa và nhiều cây khác như: mướp, đậu đũa ). Các cơ quan khác nhau có tính
chịu rét khác nhau. Thí dụ: ở lúa, lá chịu rét kém hơn thân và rễ [3].
Đã có khá nhiều công trình nghiên cứu cơ chế của tính chịu lạnh ở thực vật.
Các nghiên cứu đều cho thấy rằng, bất kỳ sự giảm nào về độ nhớt chất nguyên sinh
cũng làm tăng tính chống chịu của tế bào với nhiệt độ thấp. Khi gặp nhiệt độ thấp, tế
bào phải tạo ra và phân bố lại bên trong nguyên sinh chất các chất có khả năng bảo vệ
các vị trí nhạy cảm với lạnh và chống lại sự mất nước. Trong mô của các giống cây
chịu lạnh tích tụ nhiều đường hơn các giống chịu lạnh kém. Khuynh hướng của tế bào
trong quá trình thích nghi với lạnh là tích lũy các chất làm tăng áp suất thẩm thấu của
tế bào với các chất kém linh hoạt làm giảm quá trình sinh trưởng [3].
Cơ chế chịu lạnh đựoc tìm thấy ở nhiều loài và giống cây trồng ôn đới và hàn
đới chủ yếu là tăng cường áp suất thẩm thấu và hạn chế khả năng sinh tinh thể nước
đá khi gặp lạnh, đồng thời tăng cường sức bền của nguyên sinh chất, kể cả khi
nguyên sinh chất bị đóng băng [3].
Nhiệt độ thấp trước hết làm thay đổi hoạt động biểu hiện của một số gen, một

số loại protein nhanh chóng được sinh tổng hợp, nhưng vai trò của các protein này
còn đang được nghiên cứu. Trước hết, người ta thấy trong cây ngô non, cây
Arabidopsis quá trình sinh tổng hợp ABA gia tăng khi cây bị lạnh. Protease loại thiol
cũng được tạo ra nhiều hơn [3].
Thành phần lipit trong màng tế bào được nhiều tác giả đề cập đến trong
nghiên cứu tác động của lạnh ở thực vật và có kết luận chung là thành phần axit béo
không no càng cao thì khả năng chịu lạnh, đặc biệt là chịu băng giá càng tốt [3].
Gen liên quan tới các khả năng chịu băng giá được tập trung nghiên cứu
nhiều. Các tác giả tập trung thảo luận về thành phần của các axit béo không no

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
trong hệ thống màng tế bào có tác dụng bảo vệ chức năng màng trong điều kiện
nhiệt độ thấp dưới 0
0
C [3].
Theo Lê Trần Bình và Lê Thị Muội (1998), tính chịu lạnh ở quãng nhiệt độ
trên 0
0
C có liên quan đến hoạt động của hai cơ quan chính là bộ máy quang hợp –
lục lạp và chức năng hút nước của rễ. Các tác giả này cho rằng, bản chất của tính
chống chịu nằm trong bộ máy di truyền của thực vật. Các tác giả cũng đã phân lập
và xác định được 4 trình tự gen liên quan đến tính chịu lạnh của cây lúa trong giai
đoạn mạ, ký hiệu là: PBC122, PBC442, PBC591, PBC601. Các trình tự gen này đã
được công bố và công nhận quyền tác giả, hiện đang được lưu giữ tại ngân hàng dữ
liệu gen thế giới [3].
Như vậy, thực vật thích nghi với lạnh là nhờ một số cơ chế như: giảm độ
nhớt chất nguyên sinh khi gặp lạnh, tích lũy các hợp chất có khả năng bảo vệ tế
bào, giảm sinh trưởng, thay đổi hoạt tính enzyme và thành phần protein. Các

biểu hiện này là kết quả hoạt động của các gen liên quan đến tính chịu lạnh.
Cơ chế chống chịu lạnh hiện nay đã được nghiên cứu một cách chi tiết. Qua
các nghiên cứu, các tác giả nhận thấy rằng, số lượng hạt phấn giảm theo nghiệm
thức xử lý lạnh làm cho tỉ lệ bất thụ gia tăng. Những giống lúa chống chịu lạnh
thường sản sinh ra số lượng hạt phấn nhiều hơn so với giống đối chứng. Người ta
còn ghi nhận số lượng hạt phấn có tương quan thuận với chiều dài túi phấn và tương
quan với hiện tượng chống chịu lạnh. Như vậy, có thể nói rằng số lượng hạt phấn là
một yếu tố quan trọng trong cơ chế chống chịu lạnh ở thực vật [4].
Hiện tượng chống chịu lạnh là tính trạng di truyền số lượng và chưa có một
gen chủ lực nào được xác định. Người ta ước đoán rằng, số gen chống chịu lạnh có
thể là 4 gen hoặc nhiều hơn. Chúng liên kết rất chặt với gen Pr (tính trạng vỏ trấu
màu tím), Rc (tính trạng vỏ lụa hạt gạo màu nâu), d2 (tính trạng lùn), gh (tính trạng
vỏ trấu màu vàng), nl (neck leaf), và bc (tính trạng thân rạ giòn, dễ bẻ gãy = brittle)
trên nhiễm sắc thể số 3, 4, 5 và 7 [4].
1.2.4. Tác hại của lạnh và tính chịu lạnh ở lúa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
Lúa thuộc nhóm cây nhạy cảm với nhiệt độ lạnh ở hầu hết các giai đoạn sinh
trưởng và phát triển, nhất là đối với những giống có nguồn gốc nhiệt đới và cận
nhiệt đới. Những tổn thương do nhiệt độ lạnh gây ra có thể được quan sát ở nhiều
giai đoạn tăng trưởng khác nhau của cây lúa: hạt không nảy mầm, cây mạ kém phát
triển, hiện tượng cây lùn, cằn cỗi, hiện tượng biến đổi màu sắc, hiện tượng thoái hóa
đỉnh bông lúa, gia tăng tỉ lệ hạt lép và hiện tượng hạt chín bất bình thường [4].
Tác động của lạnh lên cây lúa rất rõ rệt. Ở nhiệt độ thấp dưới 10
0
C, nếu thời gian
rét kéo dài ở giai đoạn mạ hoặc sau khi cấy có thể gây chết hàng loạt với những
giống không chịu được lạnh. Ở giai đoạn cây lúa trổ bông, nếu gặp nhiệt độ dưới

20
0
C thì kết quả thụ phận sẽ giảm và tỷ lệ lép sẽ tăng lên đáng kể. Nếu lạnh hơn
và thời gian kéo dài có thể gây bất thụ hoàn toàn. Nhiệt độ dưới 15
0
C ức chế tổng
hợp chlorophyll, phân hủy lục lạp, sinh trưởng kém. Nếu nhiệt độ giảm xuống
dưới 10
0
C chức năng của rễ bị tổn thương, lá và cả thân bị khô héo, cây chết, mạ mũi
chông có thể ngừng sinh trưởng hoàn toàn [3].
1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá và nâng cao khả
năng chống chịu ở cây trồng
1.3.1. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá khả năng chống
chịu của cây trồng ở mức độ mô - tế bào
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đạt được những thành công nhất
định trong việc nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng. Nguyễn Hoàng Lộc
(1992) sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với tiền xử lý abscisic,
manitol và saccharose đã thu được các dòng mô thuốc lá SC1, SC2, SC3 có khả
năng chịu mất nước trên 90% trọng lượng tươi [18], [19]. Adkins và cs (1995) đã
chọn được dòng lúa chịu hạn từ mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105 với việc bổ
sung vào môi trường nuôi cấy PEG 8000 [35]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội và cs
(1995, 1998) đã nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo của các giống
lúa có nguồn gốc khác nhau [2], [3], [24]. Cùng hướng nghiên cứu chọn dòng chịu
lạnh, Lê Xuân Đắc (1998) đã thu được 1 dòng lúa duy trì khả năng chịu lạnh có
nhiều triển vọng làm giống khi xử lý mô sẹo 2 giống lúa C71 và TK90 ở nhiệt độ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12

1
0
C ± 0,5
0
C [8]. Mundy và cs (1998) tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa, đã nhận
thấy, ABA tăng khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa. Nồng độ ABA
thích hợp cho việc tiền xử lý mô sẹo lúa là 10
-5
M và thời gian xử lý là 5 - 7 ngày
[47]. Khi nghiên cứu, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn trong công tác chọn tạo
giống lúa, Hồ Hữu Nhị (2001) đã thu được 7000 cây từ 250 bao phấn, trong đó 350
cây có thời gian sinh trưởng cực ngắn (<100 ngày) [22]. Bằng phương pháp thổi
khô mô sẹo các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70, Đinh Thị Phòng (2001)
đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn làm nguyên
liệu cho chọn lọc [23]. Nguyễn Thị Tâm (2004), khi xử lý mô sẹo của các giống lúa
CR203, CS4, ML107, CN2, ĐH60 ở nhiệt độ cao (40
0
C - 42
0
C) đã tạo được 197
dòng mô có khả năng chịu nóng và 520 dòng cây xanh [26].
Hệ thống tế bào và mô nuôi cấy còn cho phép các nhà nghiên cứu tìm hiểu
và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu [3]. Nguyễn Thị Lang, Đặng
Minh Tâm (2003) đã tiến hành đánh giá khả năng chịu mặn của 12 giống lúa Pokali,
As 996, Nếp Áo Gia, Trắng Thái Lan, Trắng Điệp, Móng chim ròi, KDM105, Đốc
Phụng, Đốc Đỏ, Sóc Nâu, IR29 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Kết quả nghiên cứu
cho thấy, ở mức độ mô sẹo, 3 giống Sóc Nâu, Sóc Đỏ, Trắng Thái Lan có khả năng
chịu mặn cao hơn các giống còn lại [41]. Renata Pereira da Cruz và cs (2004) khi
nghiên cứu khả năng chịu lạnh ở giai đoạn nảy mầm của lúa đã chỉ ra rằng, kiểu gen
của Japonica chịu lạnh tốt hơn kiểu gen của Indica [50].

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp và tính chịu lạnh của cây trồng nói
chung và cây lúa nói riêng đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [38], [39], [40].
Song lĩnh vực chọn dòng chịu lạnh bằng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn ít
được công bố. Sự hoàn thiện kỹ thuật cơ bản và các điều kiện nuôi cấy sẽ tạo tiền đề cho
khả năng chọn lọc thành công các dòng tế bào chịu lạnh ở các đối tượng cây trồng
khác nhau, trong đó có cây lúa.
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu ở
cây trồng
Để nâng cao khả năng chống chịu ở cây trồng, các tác giả đã ứng dụng kỹ
thuật nuôi cấy in vitro để chọn các dòng có khả năng chống chịu tốt và duy trì dòng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
chống chịu đó để làm giống, cải thiện những giống gốc không có khả năng chống
chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như chịu nhiệt độ thấp [8], [38], chịu nóng
[26], chịu mặn [16], [32], [39], [41], chịu hạn [11], [13], [19], [23], [24]…
Một hướng nghiên cứu mới cũng được quan tâm nghiên cứu và thu được nhiều
thành công đáng kể là chuyển gen liên quan đến tính chống chịu vào cây trồng, sau đó
ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu cho cây.
Khả năng chống chịu với nhiệt độ cũng như khả năng chống chịu với các tác
động bất lợi của ngoại cảnh khác liên quan đến sự có mặt của các chất có khả năng điều
chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào như prolin, protein tan, glicinebetain, đường tan…
Một số công trình nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển
hóa các chất để có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Alia và cs (1998)
đã chuyển gen CodA mã hóa enzyme cholin oxidase vào arabidopsis, sau đó tiến hành
nuôi cấy in vitro thu được cây chuyển gen có sự tích lũy hàm lượng cao glycinebetain
trong hạt, nâng cao đáng kể khả năng chịu nóng trong suốt giai đoạn hút nước và nảy
mầm của hạt cũng như trong giai đoạn sinh trưởng của cây non [36]. Sakamoto và cs
(1999) bằng cách ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và nuôi cấy in vitro đã thu được cây lúa

chuyển gen có sự tích lũy nhiều glycinebetain [51]. Nakamura và cs (1997) đã chuyển
gen betA mã hóa cho 2 enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp glycinebetain vào cây
lúa, kết quả nhận được cây chuyển gen có hàm lượng glycinebetain tăng ở rễ và lá là 5,1
và 1,2 μmol/g khối lượng tươi [48]. Năm 2004, Honghong Hu và cs đã biểu hiện thành
công gen NAM, ATAF và CUC (viết tắt là NAC) giúp làm tăng tính chịu hạn và chịu mặn
ở cây lúa Zhonghan số 5 [44]. Benze Xiao và cs (2007) đã nghiên cứu chuyển gen LEA 3-
1 vào giống lúa Zhonghua 11. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các dòng lúa chuyển gen có
khả năng chịu mặn cao hơn so với đối chứng [37]. Qiuyun Wang và cs (2008) đã chuyển
gen OsDREB1F vào arabidopsis và lúa sau đó ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã tạo
ra được các dòng cây chuyển gen có khả năng chịu lạnh cao hơn so với đối chứng [49].
Ở Việt Nam, những năm gần đây cũng có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật nuôi cấy in vitro và chuyển gen để tạo các dòng cây có khả năng chống chịu
cao với các stress của môi trường như: chuyển gen kháng virus đốm thuốc lá, kháng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
thuốc trừ cỏ [12], chuyển gen nâng cao khả năng chịu mặn và chịu hạn ở lúa [25],
đậu tương [14]… Lê Tấn Đức và cs (2007) đã thành công khi chuyển gen kháng sâu
cryIA(b) và cryIA(c) vào cây cải ngọt và cây hông. Mẫu lá khi chuyển gen được
chuyển lên môi trường nuôi cấy in vitro và đã thu được 5 dòng cây hông và 2 dòng
cây cải ngọt chuyển gen được tái sinh [10]. Cao Lệ Quyên và cs (2009) đã nghiên
cứu phân lập và chuyển gen MtOs DREB2A điều khiển tính chịu hạn vào giống lúa
Chành trụi thông qua Agrobacterium [25].
1.4. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích hệ gen thực vật
1.4.1. Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)
Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) được Karl Mullis và cs mô tả
năm 1986. Đây là kỹ thuật nhân gen in vitro cho phép nhân bản nhanh một đoạn
ADN nào đó từ một lượng mẫu rất nhỏ ban đầu. Thực chất đây là sự tạo dòng in
vitro không cần sự hiện diện của tế bào, nhằm mục đích thu nhận một số lượng lớn

bản sao của một trình tự xác định.
Với độ nhạy rất cao, thao tác đơn giản, PCR được ứng dụng trên nhiều lĩnh
vực quan trọng trong nghiên cứu phân tích genome ở sinh vật với nhiều mục đích
khác nhau: Sản xuất mẫu dò dùng trong lai phân tử, ứng dụng kỹ thuật PCR xác
định trình tự axit nucleic, bằng phương pháp này cho phép xác định trực tiếp trình
tự ADN không qua tạo dòng, đánh giá cây chuyển gen, phân tích biến dị di truyền ở
cấp độ phân tử trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể [10], [12], [42].
Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật PCR là phải có một trình tự ADN nhất định để
từ đó tổng hợp các đoạn mồi. Tuy nhiên, hiện nay các nhà sinh học phân tử đã cải
tiến kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên mà không cần biết trước trình tự
ADN [53]. Đó là kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA).
1.4.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA)
Năm 1990, Welsh, Mc Clelland và Williams đồng thời xác định hiện tượng
đa hình ADN bằng các đoạn mồi có trình tự ADN tuỳ ý dựa trên phản ứng chuỗi
PCR. Kỹ thuật này khuyếch đại các đoạn ADN với việc sử dụng các đoạn mồi ngẫu
nhiên dài từ 8 - 12 nucleotit (kỹ thuật RAPD) [53], [54], không cần biết về trình tự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
nucleotit của đoạn ADN có thể nhân bản. Sự khác nhau về vị trí và số lượng các
đoạn ADN có thể ghép cặp bổ sung với primer chính là cơ sở của sự đa hình ADN
được nhân bản [53].
Kỹ thuật RAPD khác với PCR thông thường là primer có thể bám vào bất kỳ
vị trí nào có trình tự nucleotit bổ sung trên phân tử ADN genome. Với phần lớn
thực vật, mỗi đoạn mồi ngẫu nhiên tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm nhân bản. Sau khi điện
di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện sự khác nhau về phân đoạn ADN được nhân bản,
gọi là tính đa hình. Sản phẩm nhân bản được phân tích bằng điện di trên gel agarose
hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hoá
chất chuyên dụng. Tính đa hình được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của

một hoặc nhiều phân đoạn ADN nhân bản [53]. Phương pháp này đơn giản về
kỹ thuật, tiến hành nhanh chóng và chỉ cần một lượng nhỏ phân tử ADN hệ
gen. Với 4 loại nucleotit khác nhau, người ta có thể tạo ra hàng ngàn mồi ngẫu
nhiên có trình tự khác nhau, tuỳ vào đối tượng nghiên cứu là động vật, thực vật
hay vi sinh vật mà người ta sàng lọc bằng những mồi khác nhau. Nhiệt độ bắt
cặp mồi của phản ứng RAPD vào khoảng 35
0
- 45
0
C [21].
Từ khi ra đời, kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi trong phân tích đa
dạng di truyền cũng như lập các chỉ thị phân tử cho nhiều đối tượng khác nhau như:
đậu xanh [28], đậu tương [17], lúa nước [8], [26], [31], lúa cạn [1], [13], [30]…
Nguyễn Thị Tâm và cs (2008) đã tiến hành phản ứng RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên
thì có 6/10 mồi biểu hiện tính đa hình. Qua phân tích các phân đoạn ADN được
nhân bản so với giống gốc, các dòng lạc chọn lọc từ mô sẹo mất nước đã có những
thay đổi trong bộ gen và dòng D18 có sự sai khác nhiều nhất (0,2055) [27]. Cũng
nghiên cứu khả năng chịu hạn, Lò Thị Mai Thu và cs (2008) đã tiến hành nghiên
cứu sự đa dạng di truyền ở một số giống lúa cạn có nguồn gốc khác nhau bằng cách
sử dụng kỹ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên. Kết quả thu được cả 5 mồi đều thể
hiện tính đa hình, trong đó cao nhất là mồi M13 [30]. Năm 2010, Nguyễn Vũ Thanh
Thanh và cs cũng tiến hành phản ứng RAPD với 10 mồi trên 14 giống ngô nếp địa
phương. Hệ số tương đồng di truyền của 14 giống lúa trên dao động từ 0,68 - 0,90

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
và chia làm hai nhóm: nhóm I gồm các giống: TL, ÔL, TQ, ĐP, VN, CB, Slo, SL,
T26, SLV; nhóm II gồm: LC, SLT, YB, T4 [29].
Tóm lại, nghiên cứu, đánh giá và tăng cường khả năng chịu lạnh nhằm nâng

cao và ổn định sản lượng lúa trong điều kiện nhiệt độ thấp là một đòi hỏi thực tiễn
trong sản suất nông nghiệp. Hướng nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho
chọn dòng chống chịu bằng kỹ thuật nuôi cây mô - tế bào thực vật mới được quan
tâm nghiên cứu trong vài năm gần đây nhưng đã đạt được những kết quả nhất định.
Hiện nay, trong chọn giống người ta không chỉ quan tâm đến những tính
trạng hình thái, năng suất và chất lượng, mà còn quan tâm đến bản chất sinh học
phân tử của sự thay đổi các tính trạng. Một số kỹ thuật sinh học phân tử đã
được sử dụng để phân tích hệ gen, trong đó có kỹ thuật PCR và RAPD.