Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị
kinh tế cao. Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích
22 triệu ha [12].
Hạt lạc là một trong những nguồn thực phẩm chứa nhiều chất béo và
protein cần thiết cho khẩu phần ăn của con người. Ngoài ra, hạt lạc còn chứa
các vitamin nhóm B và một lượng hydratcacbon nhất định. Hạt lạc là nguyên
liệu chính để sản xuất dầu ăn, bánh kẹo, fomát... và là mặt hàng xuất khẩu có
giá trị. Các phụ phẩm của lạc (khô dầu, thân, lá) dùng làm thức ăn cho gia
súc hay phân bón đều tốt và rẻ tiền. Trồng lạc có tác dụng cải tạo đất và phù
hợp với cơ cấu chuyển đổi kinh tế nông nghiệp hiện nay [11], [12].
Ở Việt Nam, cây lạc đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu cây nông
nghiệp, đặc biệt ở những nơi khí hậu thường xuyên biến động và điều kiện
canh tác còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, việc tổng kết
kinh nghiệm thực tiễn và ứng dụng khoa học tiên tiến vào sản xuất đã góp
phần tăng năng suất lạc một cách đáng kể [15]. Năm 2005, năng suất bình
quân đạt 18 tạ/ha, sản lượng đạt 485,610 nghìn tấn, so với 1995 năng suất
mới chỉ là 13 tạ/ha. Tuy nhiên, sản xuất lạc ở nước ta vẫn còn nhiều yếu tố
hạn chế, một trong những nhân tố chính có ảnh hưởng đến năng suất và chất
lượng lạc là khô hạn [16]. Để hạn chế ảnh hưởng của hạn tới năng suất cây
trồng nói chung, cây lạc nói riêng, ngoài các biện pháp tưới tiêu hợp lý cần
sử dụng các giống có khả năng chịu hạn cao, đặc biệt ở những vùng đất
không chủ động nước. Vì vậy, nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống
lạc là rất cần thiết.
Kỹ thuật chọn dòng biến dị soma cho phép thu được những dòng tế
bào có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi trường [30],

[43]. Đây là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng đã được sử dụng ở nhiều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
nước trên thế giới và tạo ra những giống cây trồng mới có khả năng chống
chịu cao trong một thời gian rút ngắn so với các phương pháp truyền thống
[30], [51].
Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Đánh giá
khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ
các giống lạc L
08
, L
23
, L
24
, L
TB
, L
CB
, L
BK
bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc L
08
, L
23
, L
24
, L

TB
L
CB
, L
BK
ở
giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây non và ở mức độ mô sẹo.
- Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc L
08
, L
23
, L
24
,
L
TB
L
CB
, L
BK

3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh trong hạt tiềm sinh của các giống L
08
, L
23
,
L
24
, L

TB
L
CB
, L
BK

- Xác định ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của một số enzym và chất
tan tương ứng ở giai đoạn hạt nảy mầm.
- Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương pháp gây
hạn nhân tạo.
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc ở mức độ mô sẹo thông qua
xử lý bằng thổi khô.
- Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc L
08
, L
23
, L
24
,
L
TB
L
CB
, L
BK
bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro: Xác định ngưỡng chọn lọc, tái
sinh cây, tạo cây hoàn chỉnh, trồng ngoài đồng ruộng.
- Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá ADN genome một số dòng có nguồn
gốc từ mô sẹo chịu mất nước so với giống gốc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giá trị kinh tế, đặc điểm nông sinh học và tình hình sản xuất lạc trên
thế giới và ở Việt Nam
1.1.1. Giá trị kinh tế của cây lạc
Hạt lạc chiếm 40% – 58% lipit, 16% – 43% protein, 6% – 24% gluxit,
2,5% cellulose. Trong 100g lạc có 60 UI vitamin A, 300 UI vitamin B, một
lượng PP đủ dùng cho người lớn trong 1 ngày và cung cấp 578,6 calo [5].
Protein của lạc có đủ 8 loại axit amin không thay thế, đặc biệt trong hạt lạc có
chất lecithin (phosphattidyl choline) có tác dụng làm giảm lượng cholesterol
trong máu, chống hiện tượng xơ vữa mạch máu [9]. Thức ăn bằng lạc có thể
khắc phục tình trạng thiếu protein cho con người [8]. Dầu lạc là một hỗn hợp
glyxerin chứa 80% axit béo không no, có độ nhớt thấp, mùi thơm. Dầu lạc
được sử dụng trong y học, kỹ nghệ dầu máy, sản xuất xà phòng...[5]. Hạt lạc
là mặt hàng xuất khẩu có giá trị cao, mỗi năm nước ta xuất khẩu khoảng 80 –
120 ngàn tấn, chiếm 30%– 50% tổng sản lượng [11]. Các phụ phẩm của lạc
như khô dầu, thân lá dùng để chế biến thức ăn cho gia súc hay phân bón đều
có giá trị dinh dưỡng cao và rẻ tiền. Một kg khô dầu lạc chứa 400 gam
protein, 80 gam lipit [9], [11].
Trồng lạc còn có tác dụng chống sói mòn và cải tạo đất. Nhờ sự hoạt
động của vi khuẩn nốt sần mà sau một vụ lạc sẽ để lại trong đất từ 40 – 60 kg
N/ha [38]. Mặt khác, cây lạc có thời gian sinh trưởng ngắn (từ 90 – 125
ngày), nên có thể xen canh, gối vụ với các cây trồng khác làm tăng giá trị
kinh tế trên một đơn vị diện tích đất trồng.

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây lạc
Rễ lạc thuộc loại rễ cọc, có nhiều rễ phụ. Trên rễ lạc có nhiều nốt sần,
được tạo thành do vi khẩn Rhizobium sống cộng sinh, do vậy cây lạc có khả
năng cố định nitơ phân tử trong không khí thành đạm cung cấp cho cây và đất
trồng [38]. Thân chính của cây lạc thường chỉ cao khoảng 25cm - 50cm, lúc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
còn non thân lạc hình tròn, về già có cạnh và rỗng [12]. Lá lạc là loại lá kép
lông chim, có 4 lá chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược [38]. Hoa lạc mọc
thành chùm, có từ 2 – 15 hoa. Lạc là cây tự thụ phấn nghiêm ngặt, khi hoa nở
là đã tự thụ phấn xong [9]. Quả lạc có hình kén, dài 1 – 8 cm, rộng 0,5 – 2cm,
một đầu dính với tia, quả thắt ở giữa ngăn các hạt, vỏ quả cứng có gân mạng,
chứa từ 1 – 3 hạt; hạt được bọc trong vỏ lụa mỏng, hình trứng [11].
Về mặt sinh thái học, cây lạc chịu ảnh hưởng nhiều của các nhân tố
sinh thái như: Nhiệt độ, nước, độ ẩm, ánh sáng, đất và các chất khoáng [8],
[9], [15], [38].
Dựa vào thời gian sinh trưởng, cây lạc được chia làm hai loại: giống
chín sớm có thời sinh trưởng từ 90 – 125 ngày, giống chín muộn có thời gian
sinh trưởng từ 140 – 160 ngày. Dạng chín muộn trội hoàn toàn so với dạng
chín sớm [8].
1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam
Trong các cây lấy dầu, lạc có diện tích, sản lượng đứng thứ hai sau đỗ
tương và được trồng khắp các châu lục. Châu Á, là nơi có diện tích trồng, sản
lượng lạc cao nhất, chiếm trên 60% sản lượng lạc của thế giới. Châu Phi đứng
thứ hai chiếm 30%, các châu lục khác rất ít (châu Mỹ 5%, châu Âu 0,22%) [9].
Trong số các nước trồng lạc thì Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ là những
nước có sản lượng lạc hàng năm cao nhất (trên 1triệu tấn/năm). Một số nước
như Dimbabue, Camơrun (Châu Phi) có sản lượng lạc rất thấp, chỉ đạt 0,17
triệu tấn/năm [11].

Ấn Độ là quốc gia có diện tích trồng lạc đứng đầu thế giới (8,1 triệu
ha) song sản lượng hàng năm thấp, chỉ đạt 5,4 triệu tấn vì năng suất lạc chỉ
đạt 6,9 – 9,98 tạ/ha. Trung Quốc có diện tích trồng lạc chỉ hơn nửa Ấn Độ
(4,3 triệu ha) nhưng hàng năm đạt 11,89 triệu tấn, đứng đầu thế giới. Còn Mỹ
tuy có diện tích gieo trồng thấp (0,59 triệu ha) nhưng nhờ có các giống lạc
cao sản nên sản lượng hàng năm cao (đạt 1,8 triệu tấn/năm) đứng thứ 3 trên
thế giới [9], [11], [12].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
Trong 25 nước trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng ở vị trí thứ năm về
sản lượng lạc hàng năm. Trong các thập kỷ 60, 70, 80 của thế kỷ XX diện
tích, năng suất và sản lượng lạc của nước ta còn thấp. Đến thập kỷ 90 của thế
kỷ XX, diện tích, năng suất, sản lượng lạc của nước ta tăng nhanh, trong
vòng 10 năm năng suất lạc tăng gần 30% [12].
Ở Việt Nam cây lạc có mặt ở 59/61 tỉnh thành, chia thành 5 khu vực
chính: Vùng Trung du miền núi phía Bắc, với tổng diện tích 41.000 ha; Khu
vực Bắc Trung Bộ là vùng trọng điểm sản xuất lạc với 71.000 ha, đạt 68,7 –
93,4 nghìn tấn lạc/năm; Khu vực Nam Trung Bộ có khoảng 29.000 ha; Vùng
Cao nguyên Nam Bộ với 18.680 ha; và Vùng Đông Nam Bộ có 6.800 ha [38].
1.2. Tính chịu hạn ở thực vật
1.2.1. Hạn và các hình thức hạn ảnh hƣởng đến cây trồng
Hạn là tác động của môi trường gây nên sự mất nước của thực vật [18].
Có 3 hình thức hạn ảnh hưởng đến cây trồng là hạn đất, hạn không khí
và hạn tổ hợp [18].
Hạn đất xảy ra khi lượng nước trong đất thiếu nhiều không đủ cho rễ
hút để cung cấp cho cây. Vì thế, cây có thể bị héo và chết. Tuy nhiên, cũng
có những trường hợp đủ nước mà cây vẫn héo, nguyên nhân là do hạn sinh lý
gây nên. Hạn không khí thường xảy ra khi không khí môi trường có nhiệt độ
cao và độ ẩm thấp, ví dụ như gió nóng Israel, gió Lào ở miền Trung nước

ta...làm cho cây thoát hơi nước quá mạnh, vượt xa mức bình thường và dẫn
tới hiện tượng mất nước, do rễ hút vào không bù đủ lượng nước mất đi, làm
các bộ phận non của cây thiếu nước. Hạn tổ hợp là sự phối hợp thiếu nước
trong đất và trong không khí .
1.2.2. Tác hại của hạn lên thực vật
1.2.2.1. Tác hại của hạn lên thực vật
Thiếu nước sẽ gây nên các hậu quả rất lớn đối với hoạt động sống của
cây. Trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến
các chức năng sinh lý khác như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng và cuối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
cùng là ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của thực vật dẫn đến giảm
năng suất.
Khi gặp hạn trạng thái của chất nguyên sinh của tế bào thay đổi mạnh,
ảnh hưởng đến tính chất hoá lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ
thuỷ hoá của keo, thay đổi pH, độ nhớt, dẫn đến sự thay đổi vị trí các thành
phần cấu tạo nên chất nguyên sinh, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao
đổi chất bình thường của cơ thể [13]. Trong thời gian cây bị hạn, hàm lượng
nước tự do trong lá giảm xuống nhưng hàm lượng nước liên kết lại tăng lên.
Chất nguyên sinh của tế bào có tính đàn hồi lớn thì cây có khả năng chịu hạn
cao [42].
Hạn còn ảnh hưởng đến hô hấp. Trong thời gian khô hạn, ở những cây
trung sinh thường tăng cường hô hấp. Nhờ gia tăng hô hấp mà cây giữ được
độ ngậm nước của keo nguyên sinh chất [13]. Sự tăng cường quá trình thuỷ
phân khi gặp điều kiện khô hạn là nguyên nhân tăng cường hô hấp trong cây.
Khi mất nước ban đầu hô hấp tăng, nhưng sau đó giảm đột ngột, nếu tình
trạng thiếu nước kéo dài [42].
Thiếu nước ảnh hưởng đến quang hợp. Hạn hán đã ảnh hưởng xấu đến
quá trình hình thành diệp lục, phá hoại lạp thể nên hiệu suất quang hợp giảm

xuống nhanh chóng. Theo Buxigon, cây trúc đào khi bị hạn thì cường độ
quang hợp giảm 40% [42].
Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khoáng của hệ rễ, dẫn đến tình trạng
thiếu những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng
hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ thể thực vật [13]. Hạn ảnh hưởng
trực tiếp đến quá trình sinh trưởng các tế bào, đặc biệt là trong pha giãn của
tế bào, từ đó mà ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của toàn cây [42].
1.2.2.2 Ảnh hƣởng của hạn đến cây lạc
Trong mỗi thời kỳ sinh trưởng, cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn ở một
mức độ nhất định. Biểu hiện bề ngoài nhận thấy rõ rệt nhất khi cây lạc bị hạn
ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng là ở bộ lá. Khi độ ẩm đất giảm, lá lạc nhỏ và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
dày, màu lá từ xanh đậm chuyển dần sang xanh nhạt do diệp lục bị phá hủy
[15]. Trong điều kiện bị hạn tức thời, lá vẫn giữ nguyên kích thước nhưng
sức trương tế bào giảm, khí khổng khép lại, lá bị rũ xuống [8].
Thời kỳ trước ra hoa là thời kỳ cây lạc chịu được hạn lớn nhất, vì trong
giai đoạn này nhu cầu về nước của cây lạc không lớn lắm, độ ẩm thích hợp từ
60% - 65%. Bị hạn trong thời kỳ trước ra hoa ảnh hưởng đến tốc độ sinh
trưởng của cây lạc, làm cho quá trình phát triển bị chậm lại [38].
Ở giai đoạn ra hoa, thiếu nước sẽ làm giảm số hoa, tỷ lệ hoa có ích, các
đợt rộ không được hình thành, kéo dài thời gian ra hoa - chín của lạc, gây ảnh
hưởng đáng kể tới năng suất. Tuy nhiên, nếu được tưới kịp thời lượng hoa nở
hàng ngày có thể phục hồi nhanh chóng [8].
Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ
chất khô tích lũy cũng cao cho nên cần lượng nước lớn nhất. Nếu thiếu nước
trong giai đoạn này sẽ làm giảm số quả chắc, giảm trọng lượng hạt, dẫn đến
giảm năng suất [38].
1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và di truyền của tính chịu hạn ở thực vật

1.2.3.1. Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn
Nước có ý nghĩa quyết định đến đời sống của thực vật. Thiếu nước cây
sẽ chết non hoặc giảm sức sống, giảm năng suất. Do sự thiếu nước của môi
trường, nhiệt độ thấp hay nhiệt độ cao...có thể gây ra hiện tượng mất nước
của cây. Để đáp ứng sự thiếu hụt nước trong điều kiện cực đoan, cây bắt buộc
phải có những cơ chế thích ứng đặc biệt giúp cây duy trì sự tồn tại khi bị hạn.
Ở thực vật, khi đề cập cơ chế chịu hạn người ta thường chú ý đến vai
trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào.
Về vai trò của bộ rễ: Những cây chịu hạn có bộ rễ khoẻ, dài, mập, có
sức xuyên sâu giúp cây hút được nước ở tầng đất sâu. Bộ rễ lan rộng, có
nhiều rễ phụ và có nhiều mô thông khí, cùng với hệ mạch dẫn phát triển giúp
cho việc thu nhận và cung cấp nước tới các bộ phận khác của cây trong điều
kiện khó khăn về nước.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
Về khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: Khi tế bào bị mất nước dần
dần, các chất hòa tan sẽ được tích lũy trong tế bào chất (như: đường, axit hữu
cơ, axit amin, các ion chủ yếu là ion K
+
...), các chất này có tác dụng điều
chỉnh áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu
nhận được những phân tử nước ít ỏi còn trong đất. Bằng cơ chế như vậy, thực
vật có thể chịu được sự mất nước trong thời gian ngắn [18].
Ngoài ra, thực vật còn có khả năng chống chịu hạn bằng những biến
đổi về hình thái như lá cuộn lại thành ống, lá có nhiều lông, cu tin dày để
giảm thoát hơi nước [13].
1.2.3.2. Cơ sở sinh hóa và di truyền của tính chịu hạn
Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên
cứu đều cho rằng, khi cây gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hoạt độ enzyme,

hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K
+
, các loại đường, axit
hữu cơ,... giảm CO
2
, protein và axit nucleic [1], [6],[19], [31].
Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzyme trong điều kiện gây
hạn đã được nhiều tác giả quan tâm. Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên
cứu đặc tính hóa sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng,
hạn đã nhận xét rằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần
và hoạt độ protease, kìm hãm sự phân giải protein dự trữ [18]. Một số nghiên
cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đậu xanh, đậu tương...cho thấy, có mối
tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ enzyme α - amylase,
giữa hàm lượng protein và hoạt độ protease [17], [27], [35]...Đường tan là
một trong những chất tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Sự
tăng hoạt độ α - amylase sẽ làm tăng tăng hàm lượng đường tan do đó làm
tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây trồng [20], [31].
Những thay đổi hóa sinh khác do hạn gây ra cũng đã được nhiều tác
giả quan tâm nghiên cứu, trong đó có sự biến đổi hàm lượng axit amin
proline. Nghiên cứu khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương
ở vùng núi phía Bắc, tác giả Chu Hoàng Mậu và Cs (2005) đã nhận xét, khả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
năng chịu hạn của cây lúa cạn phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline
[25]. Xử lý hạn bằng dung dịch sorbitol 5% đối với một số dòng lúa tái sinh
từ mô sẹo chịu mất nước, tác giả Đinh Thị Phòng (2001) cho thấy, hàm lượng
proline của các dòng chọn lọc khi bị xử lý sorbitol tăng lên và vượt xa so với
đối chứng (không bị xử lý) [31].
Tính chống chịu là tính trạng đa gen, được biểu hiện khác nhau trong

các giai đoạn phát triển của cây. Trên thực tế vẫn chưa tìm được gen thực sự
quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu
hạn. Vì vậy nghiên cứu cơ chế phân tử của tính chịu hạn chủ yếu đi vào
hướng chính đó là nghiên cứu biểu hiện và chức năng của các chất và các gen
tương ứng liên quan đến khả năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động của stress.
Một trong những nhóm gen liên quan đến các điều kiện mất nước là các gen
mã hóa nhóm protein có tên gọi là LEA (Late embryogenesis abundant
protein). LEA không những đóng vai trò điều chỉnh quá trình mất nước sinh
lý khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nước bắt buộc do các điều kiện ngoại
cảnh bất lợi như hạn, nóng lạnh... Mức độ phiên mã của LEA được điều
khiển bởi ABA và độ mất nước của tế bào. Ngoài ra, những nhóm chất như
protein sốc nhiệt (HSP - heat shock protein), MGPT (molecular chaperone),
ubiquitin...cũng được đặc biệt quan tâm nghiên cứu [18].
Như vậy, cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp, nó không chỉ liên
quan đến đặc điểm hình thái giải phẫu của thực vật, mà còn liên quan đến những
thay đổi về thành phần hoá sinh trong tế bào, sự điểu chỉnh hoạt động của gen.
1.3. Một số thành tựu nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc đánh giá
khả năng chịu hạn và chọn dòng biến dị xoma
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi
trong lĩnh vực nghiên cứu về khả năng chống chịu của cây trồng như chịu
hạn, chịu muối, chịu nhôm [22], [24], [41].
Chu Hoàng Mậu, Ngô Thị Liêm, Nguyễn Thị Tâm (2006) tiến hành xử
lý thổi khô mô sẹo các giống lạc MĐ7, L
17
, L
14
, L
18
, ĐBG, đã nhận thấy mô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
sẹo của 5 giống lạc đều bị mất nước nhanh, khả năng chịu mất nước của các
giống có sự khác nhau rõ rệt, cao nhất là giống ĐBG và thấp nhất là L
18
[24].
Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1994) tiến hành đánh
giá khả năng chịu muối (NaCl) của các giống lúa CR203, Lốc, C8, Co ở mức
độ mô sẹo, sau khi chuyển vào môi trường có bổ sung NaCl 1% và 2%. Sau
12 tuần theo dõi cho thấy khả năng chịu muối của giống Co là cao nhất và
giống CR203 có khả năng chịu muối thấp nhất [40].
Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo in vitro, Nguyễn Văn Vinh, Lê Duy
Thành và cộng sự (1995) nghiên cứu khả năng chịu nhôm và axit của các
giống lúa: ĐC3, CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm Bầu, CR203, NN8, OM 861-
20, OM 296 và Tép lai, đã thu được các dòng mô sẹo của giống Pokaly và
Cườm có khả năng chịu được AlCl
3
ở 600ppm và pH là 2,71. Mô sẹo của
giống Tép lai, CR203 chịu được AlCl
3
ở 400ppm và pH 2,98 [41].
Tác giả Bùi Thu Thuỷ (2006) tiến hành thổi khô mô sẹo của 5 giống
lúa TM, CR 203, U17, KD18 và BT nhận thấy các giống lúa đều bị mất nước
nhanh khi xử lý bằng thổi khô. Khả năng chịu mất nước có sự khác nhau rõ
rệt, cao nhất là giống TM, thấp nhất là giống U17 [36].
Nguyễn Thị Tâm (2004), xử lý nhiệt độ cao ở giai đoạn mô sẹo của
một số giống lúa đã tạo được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 40
0
C,
42

0
C và 520 dòng cây xanh. Từ 33 dòng qua 5 thế hệ đã chọn được 2 dòng
nổi bật là HR128 với đặc điểm thấp cây, số hạt chắc/bông cao, hàm lượng
protein, đường tan, axit amin liên kết trong hạt cao, có khả năng chịu nóng,
cứng cây và dòng HR499 với khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, số hạt chắc/bông,
năng suất khóm, có khả năng chịu nóng cao hơn so với giống gốc [33].
Với sự hoàn thiện về kỹ thuật và điều kiện nuôi cấy đã mở ra nhiều
triển vọng cho việc nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn cho
nhiều đối tượng cây trồng. Sự ra đời của các giống lúa DR1, DR2 có khả
năng chịu hạn cao trong một thời gian ngắn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật là bằng chứng cho chọn tạo dòng chống chịu bằng kỹ thuật in vitro
[30].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
1.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) trong phân
tích hệ gen thực vật
Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân
đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams
và Cs (1990), Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng.
Thành phần và các bước của phản ứng RAPD dựa trên cơ sở của phản
ứng PCR, chỉ khác ở kích thước mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp
mồi của phản ứng RAPD vào khoảng 35
0
C- 45
0
C. Kỹ thuật RAPD có ưu
điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit. Mồi có thể bám vào
bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotit bổ sung trên phân tử ADN khuôn [21].
Do vậy, xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN mẫu là rất

lớn. Sự khác nhau về vị trí và số lượng các đoạn ADN có thể ghép cặp bổ
sung với mồi chính là cơ sở của sự đa hình về phổ băng ADN được nhân bản.
Sản phẩm được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide
và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hóa chất đặc trưng. Vì
vậy, tính đa hình thường được nhận ra là do sự có mặt hay vắng mặt của một
sản phẩm nhân bản từ một locus [48].
Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối
tượng khác nhau như đậu xanh, đậu tương, đu đủ, lạc, lúa, chuối...trong việc
đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [34], [47]
phân tích và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của
các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [10], [47]. Ngoài ra còn được ứng dụng
hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các
loài khác nhau...
Raina và Cs (2001) đã sử dụng kỹ thuật RAPD và SSR để phân tích sự
đa dạng hệ gen, xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc
dại [50]. Đánh giá sự đa dạng của một số dòng lạc trong tập đoàn giống
chống chịu bệnh gỉ sắt, sử dụng với 11 mồi ngẫu nhiên, tác giả Bùi Văn
Thắng, Đinh Thị Phòng đã thu được 66/109 phân đoạn ADN đa hình [34].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
Lê Xuân Đắc và CS (1999) sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích đa hình
và chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo
chịu mất nước [10]. Với 10 mồi ngẫu nhiên, Nguyễn Thị Tâm (2004) đã cho
thấy các dòng lúa chọn lọc tạo ra từ mô sẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4,
ML107 đã có những thay đổi ở mức độ phân tử [33]. Cũng bằng kỹ thuật
RAPD, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của
một số giống đậu xanh cho thấy

trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ có 3 mồi RA31,

RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động
từ 0,41 - 0,80 [32]. Bùi Thị Thu Thủy (2006) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để so
sánh hệ gen của các dòng lúa chọn lọc R
1
với giống gốc U17 cho thấy cả 5
mồi đều thể hiện tính đa hình, các dòng chọn lọc có mức độ khác biệt di
truyền so với giống gốc từ 0,18 - 0,40 [37].


















Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
Sử dụng 3 giống lạc (L
08
, L
23
, L
24
) thu hoạch ở vụ Thu Đông năm 2006
do Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam cung cấp và các giống lạc
địa phương (L
TB
L
CB
, L
BK
) do sở Nông nghiệp và PTNT các tỉnh Thái Bình,
Cao Bằng, Bắc Kạn cung cấp.
2.2. Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Hoá chất
Các chất kích thích sinh trưởng BAP; 2,4-D; NAA, hóa chất sử dụng
tách chiết ADN: Tris-base1M, BME14M, NaCl5M; SDS5%; EDTA0,5M;
Choloroform:isoamyl (24:1); STAB; isopropanol; Ethanol; TE (10mM
Tribase+1mM EDTA), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, proline
chuẩn, gelatin...
2.2.2. Thiết bị
Cân phân tích điện tử (Thụy Sĩ), máy ly tâm lạnh của hãng Hettich
(Đức), máy quang phổ Uvis Cintra 40 (Úc), máy đo pH, tủ sấy Cabrolite
(Anh), box cấy, máy điện di, máy PCR...
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Thí nghiệm nuôi cấy in vitro được thực hiện tại phòng Công nghệ Tế

bào- khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
- Thí nghiệm phân tích các chỉ tiêu hóa sinh, phân tử được thực hiện tại
phòng Di truyền học, Công nghệ gen, khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư
phạm - Đại học Thái Nguyên.
- Thí nghiệm nghiên cứu ngoài đồng ruộng được thực hiện tại phường
Tân Thịnh- Thành phố Thái Nguyên từ tháng 2/2008 đến 6/2008.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp hóa sinh
2.3.1.1. Phƣơng pháp phân tích hóa sinh ở giai đoạn hạt tiềm sinh
Xác định hàm lượng lipit: Dựa vào tính chất hòa tan của dung môi hữu cơ
để chiết lipit, dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether.
Cách làm: Mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi. Bóc vỏ lụa, nghiền
nhỏ, cân 0,05g mẫu cho vào tube. Sau đó cho 1,5ml petroleum ether, lắc nhẹ
10 phút, để qua đêm ở 4
o
C, ly tâm 20 phút với tốc độ 12.000 vòng/phút ở
4
o
C, bỏ dịch, lặp lại 3 lần như vậy. Sấy khô mẫu còn lại ở tube ở 70
o
C đến
khối lượng không đổi.
Hàm lượng lipit được tính bằng hiệu của khối lượng mẫu trước và sau
khi chiết theo công thức sau:
Hàm lượng lipit (%) =
%100x
A

BA 

Trong đó: A: Khối lượng mẫu trước khi chiết (mg)
B: Khối lượng mẫu sau khi chiết (mg)
Xác định hàm lượng protein: Hàm lượng protein tan xác định theo phương pháp
Lowry được mô tả trong tà i liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1998) [3].
Mẫu sau khi loại lipit được sử dụng chiết protein. Chiết protein bằng
dung dịch đệm photphat citrat (pH=10), để trong 24h ở 4
o
C, đem ly tâm 20
phút (12.000 vòng/phút), thu lấy dịch. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Dịch thu
được của mỗi lần chiết định mức bằng dung dịch đệm lên 10ml và đo hấp thụ
quang phổ trên máy UV ở bước sóng 750nm với thuốc thử folin.
Hàm lượng protein được tính theo công thức:
%100(%) 


m
HSPLa
X

Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô)
a: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml)
HSPL: Hệ số pha loãng
m: Khối lượng mẫu (mg)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
2.3.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua phân tích một số chỉ tiêu
hóa sinh ở giai đoạn hạt nảy mầm

(1) Chuẩn bị mẫu: Hạt lạc sau khi bóc vỏ gỗ được ngâm nước 2 giờ, sau đó ủ
ẩm bằng dung dịch MS pha loãng 10 lần chứa sorbitol 5%. Hạt nảy mầm sau
các khoảng thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày được lấy để
xác định hoạt độ enzyme amilase và hàm lượng đường tan, hoạt độ enzyme
protease và hàm lượng protein tan. Đối chứng là hạt lạc được ủ bằng dung
dịch MS pha loãng 10 lần không chứa sorbitol.
(2) Xác định hàm lượng đường tan bằng phương pháp vi phân tích
Xác định hàm lượng đường tan theo phương pháp vi phân tích được
mô tả trong tà i liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1998) [3].
- Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, đường khử kaliferixianua thành
kaliferoxianua. Với sự có mặt của gelatin, kaliferoxianua kết hợp với sắt
sunphat axit tạo thành phức chất màu xanh bền.
- Cách tiến hành: Hạt nảy mầm bóc vỏ lụa, cân khối lượng, chiết bằng nước
cất, ly tâm 12.000 vòng/phút, dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm. Đo
cường độ màu dung dịch trên máy so màu với bước sóng 585nm.
Hàm lượng đường tan được tính theo công thức :
X (%) =
m
HSPLba 
x 100%
Trong đó: X: Hàm lượng đường tan ( % khối lượng tươi)
a: Số đo trên máy (mg/ml)
b: Số ml dịch chiết
HSPL: Hệ số pha loãng
m: Khối lượng mẫu (mg)
(3) Xác định hoạt độ của enzyme α - amylase
Xác định hoạt độ của enzyme α - amylase theo phương pháp Heinkel
mô tả trong tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (1979) [7].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
- Nguyên tắc: Dựa vào tính chất hòa tan của enzyme α - amylase trong dung
dịch đệm photphat 0,2M (pH=6,8).
- Cách tiến hành: Hạt lạc nảy mầm, bóc vỏ lụa, cân khối lượng, nghiền nhỏ
trong đệm photphat 0,2M (pH=6,8), ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở
4
0
C, dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm phân tích hoạt độ
enzyme α - amylase được tiến hành trên ống thí nghiệm, ống kiểm tra. Sau đó
đo trên máy quang phổ ở bước sóng 560nm.
Công thức xác định hoạt độ enzyme α- amylase:
ĐVHĐ/mg =
m
xHSPLCC )21( 

Trong đó: C1: Lượng tinh bột còn lại của mẫu kiểm tra (mg/ml)
C2: Lượng tinh bột còn lại của mẫu thí nghiệm (mg/ml)
HSPL: Hệ số pha loãng
m: Khối lượng mẫu (mg)
Định tính hoạt độ enzyme α- amylase
Thành phần hỗn hợp dịch gồm thạch aga 2%, tinh bột 1%, H
2
O 100ml,
cho hỗn hợp dịch vào bình nón và đun cách thủy cho đến tan thạch, đổ vào
đĩa petri dày 4mm để nguội, đục lỗ. Nhỏ 100 µl dịch chiết chứa enzyme vào
mồi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzyme khuyếch tán, chuyển sang tủ ấm ở
30
0
C trong 24h. Sau đó nhuộm lugol trong 5 phút và tráng bằng NaCl 1N.
(4) Xác định hàm lượng protein tan

Hàm lượng protein tan được xác định như mô tả ở mục 2.3.1.1.
(5) Xác định hoạt độ enzyme protease
Hoạt độ enzyme protease xác định theo phương pháp Anson cải tiến
theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [26].
- Cách tiến hành: Hạt nảy mầm đã bóc vỏ lụa, nghiền nhỏ, chiết bằng đệm
photphat pH=6,5, li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4
0
C, dịch thu được
sử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm phân tích hoạt độ enzyme protease được
tiến hành trên ống thí nghiệm, ống kiểm tra, đo trên máy quang phổ ở bước
sóng 750nm. Hoạt độ enzyme được tính dựa trên đồ thị đường chuẩn xây
dựng bằng tyrozin.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
Hoạt độ protease được tính theo công thức:
ĐVHĐ/mg=
Txm
xHSPLxDkn )( 

Trong đó: n: Số đo trên máy ống kiểm tra(mg/ml)
k: Số đo trên máy ống thí nghiệm(mg/ml)
HSPL: Hệ số pha loãng
D: Số ml dịch chiết
T: Thời gian ủ enzyme với cơ chất
m: Khối lượng mẫu (mg)
Định tính hoạt độ enzyme protease: Tiến hành tương tự như định tính
hoạt độ α- amylase, cơ chất là gelatin 1%.
2.3.2. Phƣơng pháp sinh lý
Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non theo Lê

Trần Bình (1998) [2].
- Chuẩn bị mẫu: Hạt lạc nảy mầm gieo vào các chậu (kích thước 30cm x
30cm) chứa cát vàng đã rửa sạch mỗi chậu trồng 40 cây, 3 chậu cho mỗi
giống, thí nghiệm được lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc như
nhau. Thời gian đầu tưới nước cho đủ ẩm, khi cây lạc được 3 lá tiến hành gây
hạn nhân tạo.
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc thông qua xác định:
+ Chỉ số hạn tương đối (S): Chỉ số chịu hạn tương đối được xác định thông qua
tỉ lệ cây sống sót (%), khả năng giữ nước (%) của cây non trước và sau hạn 3
ngày, 5 ngày, 7 ngày. Chỉ số chịu hạn được xác định bằng diện tích đồ thị hình
sao gồm 6 trục mang các trị số tương ứng a, b, c, d, e, g của một giống.
Chỉ số chịu hạn tương đối được tính theo công thức:
S =
2
1
sin α (ab + bc + cd + de + eg + ga)
Trong đó: α

: % cây sống sau 3 ngày hạn; b: % khả năng giữ nước sau 3
ngày hạn; c: % cây sống sau 5 ngày hạn; d: % khả năng giữ nước sau 5 ngày
hạn; e: % cây sống sau 7 ngày hạn; g: % khả năng giữ nước sau 7 ngày hạn;
α: Góc tạo bởi hai trục mang trị số gần nhau và tính bằng 360/n; S: Chỉ số
chịu hạn tương đối của các giống lạc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
+ Khả năng giữ nước của cây lạc 3 lá trong điều kiện hạn được xác định theo
công thức:
W (%)=
kxl

xl
W
W
x
100%
Trong đó: W (%): Khả năng giữ nước của cây sau khi xử lý hạn.
W
xl
: Khối lượng tươi của cây xử lý(g)
W
kxl
: Khối lượng tươi của cây không xử lý(g)
- Xác định hàm lượng prolin
Đánh giá sự biến đổi hàm lượng axit amin proline ở thân lá và rễ cây non
3 lá trước và sau xử lý hạn nhân tạo. Hàm lượng proline được xác định theo
phương pháp của Bates và cộng sự (1973) 44.
Tách chiết proline: Nghiền 0,5 gam thân, lá cây lạc đã xử lý hạn ở
ngưỡng 1, 3, 5 ngày trong cốc và đũa thuỷ tinh bằng nitơ lỏng, thêm 10 ml
dung dịch axit sunfosalixilic 3%, li tâm 8000 vòng/phút. Thu dịch làm thí
nghiệm. Đo hấp phụ quang phổ ở bước sóng 520 nm.
Hàm lượng prolin được tính theo công thức:
X%=
%100x
m
AxHSPL

Trong đó: X: Hàm lượng prolin(%)
A: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml)
HSPL: Hệ số pha loãng
m: Khối lượng mẫu (mg)

2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
2.3.3.1. Tạo mô sẹo từ phôi lạc
Khử trùng hạt
Củ lạc được rửa sạch bằng nước máy, phơi khô, bóc vỏ gỗ, hạt lạc
được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cồn 70
0
trong thời gian 2 phút,
tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần. Thêm Javen 60% lắc đều trong
25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 2 – 3 lần.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
%100(%) x
W
WW
W
f
df
L


Tạo mô sẹo
Hạt lạc đã khử trùng đặt lên giấy thấm khử trùng bóc bỏ vỏ lụa, phôi
tách ra được cấy lên môi trường mô sẹo cơ bản bổ sung 2,4-D12mg/l,
saccharose 3%, agar 0,8%, pH từ 5,5 – 5,8. Nuôi trong tối một tuần, sau đó
đưa ra dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000lux, thời gian
chiếu sáng 12/24 giờ, nhiệt độ 25
0
C trong 3 ngày.
2.3.3.2. Xử lý bằng thổi khô

Mô sẹo sau khi để trong tối 10 ngày, được chuyển lên đĩa petri trải
giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của bàn cấy ở các
ngưỡng thời gian 3, 6, 9 giờ, sau đó được chuyển lên môi trường tái sinh cây.
Xác định độ mất nước của mô sẹo thông qua cân trọng lượng của mô
sẹo các giống trước và sau khi thổi khô. Độ mất nước của mô sẹo được tính
theo công thức:

Trong đó: W
L
: Độ mất nước (%);
W
f
: Trọng lượng mô tươi (mg)
W
d
: Trọng lượng mô khô (mg)
2.3.3.3. Tái sinh cây
Mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô được cấy lên môi trường tái sinh
cây có thành phần MS cơ bản, bổ sung BAP 2mg/l.
Tỷ lệ sống sót sau 3 tuần được tính theo công thức:
%100(%) x
N
N
S
T
sv
v


Trong đó: Sv: Tỷ lệ mô sống sót (%);

Ssv: Số mô sống sót;
N
T
: Tổng số mô xử lý.
Tỉ lệ tái sinh cây được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy, theo công thức :

%100(%) x
N
N
R
sv
r
c


Trong đó: R
c
: Khả năng tái sinh cây (%);
N
r
: Số mô tái sinh cây;
N
sv
: Số mô sống sót.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
2.3.3.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Cây tái sinh thu được sau đó chuyển lên môi trường ra rễ, có thành
phần MS cơ bản, bổ sung NAA 0,3mg/l. Mật độ cấy 6 chồi/bình, theo dõi khả

năng tạo rễ sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc
Khi cây con trong bình nuôi cấy đạt 3-4 lá, rễ dài, dùng panh lấy cây ra
khỏi bình cấy, rửa lớp thạch agar bám quanh gốc và rễ bằng nước sạch. Cấy
cây vào lỗ của miếng xốp. Đặt các miếng xốp vào khay chứa dung dịch MS
pha loãng 10 lần, đặt khay ở nơi có ánh sáng khuyếch tán và ít gió. Sau 2 -3
ngày chuyển ra đất và tiếp tục tưới bằng dung dịch MS pha loãng 10 lần.
2.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu trên đồng ruộng
Ngoài đồng ruộng, các dòng lạc của mỗi giống và giống gốc được
trồng thành từng dảnh riêng. Chế độ chăm sóc các dòng và giống gốc là như
nhau. Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc qua các giai đoạn phát
triển trong vụ xuân. Đánh giá đặc điểm nông học của các dòng qua các chỉ
tiêu: Chiều cao cây, số cành/cây, số quả/cây…Quả của mỗi dòng được đánh
dấu và thu hoạch riêng để gieo trồng cho vụ tiếp theo.
Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, sử dụng toán thống kê để xác định
trị số thống kê như trung bình mẫu (
X
), phương sai (
2
), độ lệch chuẩn (),
và sai số trung bình mẫu (
X
S
), hệ số biến động (Cv). Các số liệu được xử lý
trên máy vi tính theo tµi liÖu Nguyễn Hải Tuất vµ Ngô Kim Khôi (1996) [40].
2.3.5. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.5.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ lá lạc
- Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ lá lạc theo phương pháp
của Doyle J.J và J.L. Doyle [46].
- Xác định hàm lượng ADN trên máy quang phổ model 825-2A của hãng

Hewlett Packarrd.
- Kiểm tra chất lượng ADN thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
2.3.5.2. Phân tích tính đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD
Phản ứng RAPD được tiến hành với 10 mồi ngẫu nhiên, các mồi có trình
tự dài 10 nucleotit, thông tin về trình tự của các mồi được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
ARA42 5’GGAAGCTTGG3’ DTN19 5’GGAAGCCAAC3’
CUM43 5’CAATCGCCGT3’ OPE10 5’GGGAAGGACA3’
DTN05 5’TCGGCGATAG3’ OPM46 5’CCAGACCCTG3’
DTN13 5’ACTGAACGCC3’ USP31 5’AACCGACGGG3’
DTN15 5’GGAGTGGACA3’ UPH04 5’GGAAGTCGCC3’
Mỗi phản ứng PCR có 25 l dung dịch chứa 10mM buffer PCR 1X;
2,5 mM MgCl
2
; 25M mỗi loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 200 nM mồi;
0,125 đơn vị Taq polymerase và 10 ng ADN khuôn. Phản ứng PCR-RAPD
thực hiện trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình nhiệt:
Bước 1: 94
0
C trong 3 phút; Bước 2: 92
0
C trong 1 phút; Bước 3: 35
0
C trong 1
phút; Bước 4: 72
0

C trong 1 phút, từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì;
Bước 5: 72
0
C trong 10 phút; Bước 6: giữ ở 4
0
C. Điện di sản phẩm PCR trên
gel agarose 1,8%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.
2.2.5.3. Phân tích số liệu RAPD
Phân tích số liệu theo qui ước: 1 = phân đoạn ADN xuất hiện và 0 =
phân đoạn ADN không xuất hiện, khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn
mồi ngẫu nhiên. So sánh hệ số tương quan kiểu hình theo phương pháp:
Jaccard và phân nhóm UPGMA. Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trị tương
quan kiểu hình (r) cao nhất trong chương trình NTSYSpc 2.0. Hàm lượng
thông tin tính đa hình (Polymorphism information content = PIC) của mỗi
mồi xác định theo công thức: PIC
i
= 1 - P
ij
2
. Trong đó P
ij
là tần số của allen
thứ j của kiểu gen i được kiểm tra. Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình)
tới 1 (đa hình hoàn toàn).


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hàm lƣợng protein và lipit của các giống lạc nghiên cứu
Để đánh giá chất lượng hạt của các giống lạc nghiên cứu, chúng tôi
tiến hành phân tích hàm lượng protein và lipit trong hạt tiềm sinh ở các giống
lạc L
08
, L
23
, L
24
, L
TB
L
CB
, L
BK
, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng protein, lipit của các giống lạc nghiên cứu
(% khối lượng khô)
Giống Hàm lượng lipit Hàm lượng protein
L
24
45,72  0,02 30,86  0,03
L
23
43,86  0,01 29,84  0,04
L
08
49,65  0,01 31,22  0,01
L
TB

46,18 0,03 25,43 0,02
L
CB
48,68 0,04 24,21 0,01
L
BK
46,03 0,02 26,51 0,03

Bảng 3.1 cho thấy, hàm lượng protein trong hạt các giống lạc dao động
từ 24,21% đến 31,22%. Giống L
08
có hàm lượng protein cao nhất (31,22%),
thấp nhất là L
CB
(24,21%).
Hàm lượng lipit của 6 giống lạc dao động từ 43,86% đến 49,65%.
Giống có hàm lượng lipit cao nhất là L
08
(49,65%), tiếp đến là giống L
CB
(48,68%). Giống có hàm lượng lipit thấp nhất L
23
(43,86%).
Lipit là thành phần cấu tạo quan trọng của màng sinh học, nguồn
nguyên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể. Lipit trong lạc dễ tiêu hóa
không chứa cholesterol nên việc sử dụng chúng còn có tác dụng phòng và
chống một số bệnh xơ cứng động mạnh, bệnh chảy máu mũi. Do vậy, những
giống lạc có hàm lượng lipit cao có thể phát triển vùng trồng để làm nguyên
liệu sản xuất dầu lạc cung cấp cho đời sống con người.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
3.2. KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG LẠC L
24
L
23,
L
08,
L
TB,

L
CB,
L
BK
3.2.1. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L
23,
L
08,
L
TB,
L
CB,
L
BK
ở giai
đoạn hạt nảy mầm
3.2.1.1. Ảnh hƣởng của sorbitol 5% đến hoạt độ enzyme  - amylase của
các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn hạt nảy mầm

Khi hạt nảy mầm, enzyme  - amylase được tổng hợp và hoạt động
mạnh, giúp quá trình phân giải tinh bột diễn ra mạnh mẽ để tổng hợp các chất
hữu cơ cho sự hình thành cây non, làm cho hàm lượng đường tăng lên kéo
theo sự gia tăng áp suất thẩm thấu, dẫn đến tăng khả năng chống lại sự mất
nước của lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong
quá trình nảy mầm của hạt, đồng thời thúc đẩy quá trình sinh trưởng, phát
triển của mầm, đảm bảo cho cây non có thể sinh trưởng bình thường trong
điều kiện thiếu nước. Do đó việc khảo sát đặc điểm phản ứng của các giống
lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm là một trong những cơ sở để đánh giá tính chịu
hạn của cây lạc. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành đánh giá
tính chịu hạn của các giống lạc thông qua sự thay đổi hoạt độ  - amylase và
sự biến động hàm lượng đường tan trong điều kiện hạn sinh lý ở giai đoạn
nảy mầm.
Kết quả phân tích sự biến động hoạt độ của  - amylase ở giai đoạn hạt
nảy mầm khi xử lý dung dịch sorbitol 5% được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.1.
Kết quả cho thấy, hoạt độ của  - amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm
sau khi bị xử lý bởi sorbitol 5% biểu hiện khác nhau giữa các giống lạc và giữa
các ngày tuổi. Xu hướng chung của sự biến động này là hoạt độ của  - amylase
tăng từ giai đoạn 1 ngày tuổi và cao nhất ở 7 ngày tuổi sau đó giảm dần ở 9 ngày
tuổi. Trong đó, giống L
24
có hoạt độ của -amylase cao nhất so với các giống
còn lại. Ở các giai đoạn 1, 3, 5, 7, 9 ngày tuổi giống L
24
có hoạt độ enzyme
tương ứng là 0,45 ĐVHĐ/mg, 1,02 ĐVHĐ/mg, 2,13 ĐVHĐ/mg, 2,64

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
ĐVHĐ/mg, 1,82 ĐVHĐ/mg. Ở 7 ngày tuổi, giống L

24
có hoạt độ enzyme
amylase tăng 5,87 lần so với giai đoạn 1 ngày tuổi, tiếp đến là giống L
CB
(5,48
lần),

và thấp nhất là giống L
08
(tăng 4,53 lần) so với 1 ngày tuổi.
Bảng 3.2. Hoạt độ của  - amylase trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử
lý bởi sorbitol 5%
Giống
Hoạt độ của - amylase (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm)
1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày
L
24
ĐC
0,410,04 0,790,11 1,620,04 1,780,04 1,520,06
TN
0,450,04 1,020,24 2,130,04 2,640,05 1,820,09
% so ĐC 109,75 129,11 131,48 148,31 119,73
L
23
ĐC
0,38  0,01 0,710,04 1,420,02 1,620,02 1,580,05
TN
0,410,03 0,930,16 1,880,03 2,21 0,03 1,760,11
% so ĐC 107,89 130,99 132,39 136,42 111,39

L
08

ĐC
0,320,01 0,410,09 1,020,04 1,350,19 0,730,03
TN
0,390,07 0,520,02 1,31 0,04 1,770,07 0,940,07
% so ĐC 121,87 126,83 128,43 131,11 128,77
L
TB
ĐC
0,320,01 0,480,22 1,150,04 1,360,02 1,090,09
TN
0,390,07 0,590,03 1,470,04 1,790,03 1,380,06
% so ĐC 121,89 122,92 127,83 131,62 126,61
L
CB
ĐC
0,390,05 0,460,04 1,560,03 1,760,03 1,410,10
TN
0,440,12 0,580,16 2,060,03 2,410,03 1,670,13
% so ĐC 112,82 126,08 132,05 136,93 118,43
L
BK
ĐC
0,330,12 0,520,12 1,310,04 1,420,03 1,300,08
TN
0,410,13 0,630,04 1,650,05 1,870,04 1,650,12
% so ĐC 124,24 121,15 125,95 131,69 126,92
Kết quả phân tích ở bảng 3.2 đã chứng tỏ, sorbitol 5% ảnh hưởng đến

hoạt độ của  - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm của các giống lạc. Bùi Thị
Thu Thủy (2005), phân tích hoạt độ của  - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm của
một số giống lúa đã nhận thấy, những giống có khả năng chịu hạn đều có hoạt độ
 - amylase cao hơn các giống có khả năng chịu hạn kém [35]. Kết quả này cũng
phù hợp với những nghiên cứu công bố trên đối tượng lúa cạn, lạc [17], [27].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25

1

2

3

4
Hình 3.1. Định tính hoạt độ  - amylase của giống L
24
và L
TB

ở giai đoạn hạt
nảy mầm 1, 3, 5, 7 ngày
A - L
TB
ĐC B - L
24
ĐC C - L
TB
TN D - L

24
TN
3.2.1.2. Ảnh hƣởng của sorbitol 5% đến sự biến động hàm lƣợng đƣờng
tan của các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn hạt nảy mầm
Đường tan trong tế bào có vai trò trong việc điều chỉnh áp suất thẩm
thấu trong dịch bào khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Vì vậy, khảo sát
hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm để tìm mối liên quan với khả
năng chịu hạn của lạc là rất cần thiết. Kết quả xác định hàm lượng đường tan
trong giai đoạn hạt nảy mầm được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, ở cả mẫu thí nghiệm và đối chứng hàm
lượng đường tan đều tăng ở giai đoạn hạt nẩy mầm 1 ngày tuổi và tăng cao
nhất ở giai đoạn 7 ngày tuổi, bắt đầu giảm ở giai đoạn 9 ngày tuổi. Sự biến
động hàm lượng đường tan ở các giống lạc có sự khác nhau. Hàm lượng
đường ở các mẫu xử lý hạn luôn cao hơn so với đối chứng từ 3,72% -
32,94%. Ở giai đoạn 7 ngày tuổi, giống L
24
hàm lượng đường tan cao nhất
(7,99%) tăng 1,75 lần so với 3 ngày tuổi và tăng 32,94% so với đối chứng ở
giai đoạn 7 ngày tuổi. Giống L
08
có hàm lượng đường tan thấp nhất (đạt
5,29% tăng 28,40% so với đối chứng).
Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) phân tích sự biến động hàm lượng
đường ở 9 giống đậu xanh cho thấy, giống HB1 là giống chịu hạn nên có hàm
lượng đường tan cao nhất trong các giống nghiên cứu [32]. Kết quả nghiên
cứu của chúng tôi về hàm lượng đường tan trong giai đoạn nảy mầm của các
giống lạc có xử lý bởi sorbitol 5%, phù hợp với những nhận định trước đây