Nghiên cứu môi trường nhân giống In vitro Lan hoàng thảo (Dendrobium Sonia) và giá thể đưa cây ra ngoài tự nhiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM


TRẦN THANH HUYỀN




NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM SONIA)
VÀ GIÁ THỂ ĐƢA CÂY RA NGOÀI TỰ NHIÊN





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC






THÁI NGUYÊN, NĂM 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM


TRẦN THANH HUYỀN




NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM SONIA)
VÀ GIÁ THỂ ĐƢA CÂY RA NGOÀI TỰ NHIÊN


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN THỊ TÂM




THÁI NGUYÊN, NĂM 2012
i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ

của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hoàn thành, tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới:
PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều
kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Các thầy giáo, cô giáo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau đại học, trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều
kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
Các cán bộ, kỹ thuật viên phng Công nghệ tế bào thực vật –Trường Đạ i họ c
Sư phạ m – Đạ i họ c Thá i Nguyên đã nhiệ t tì nh hướ ng dẫ n , giúp đỡ và tạo mọi điề u
kiệ n cho tôi thự c hiệ n luậ n văn . Phng Công nghệ tế bào thực vật - Việ n Di truyề n
Nông nghiệ p Việt Nam đã cung cấp mẫu vật nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và
bạn vè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Thái Nguyên, tháng 8 năm 2012
Học viên



Trần Thanh Huyền






ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Vài nt v phân loi và đc đim của phong lan 3
1.1.1. Đc đim thc vt học ca họ lan 3
1.1.2. Đc đim thc vt học ca chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) 4
1.1.3. Đc dim thc vt học ca lan Dendrobium Sonia 4
1.2. Ứng dụng của k thuật nuôi cấy mô t bào thực vật trong công tc
nhân giố ng cây trồ ng 5
1.2.1. Cc hưng nghiên cu ng dng 5
1.2.2. Ưu thế củ a nhân giố ng in vitro 6
1.2.3. Cc phương thc nhân ging in vitro 6
1.2.4. Quy trì nh nhân giố ng in vitro 8
1.3. Mộ t số nghiên cứu nhân giố ng lan bằng k thuật nuôi cấy in vitro 9
1.3.1. Cc nghiên cu trong nưc 9
1.3.2. Cc nghiên cu ca nưc ngoài 11
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Vậ t liệ u 13
2.2. Phƣơng phá p nghiên cƣ́ u 14
2.2.1. Phương php pha môi trường và nuôi cấy 15
2.2.2. Nghiên cu môi trường nuôi cấy 16
2.2.3. Phương php ra cây 17
2.2.4. Phương php tính ton kết quả 18
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
3.1. So snh ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy MS và Phytamax tới sự
pht sinh chồi và to protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 19
3.2. Ảnh hƣởng của cc chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin
tới sự pht sinh chồi và to protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium
Sonia) 20
iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3.2.1. Ảnh hưởng ca BAP ti s pht sinh chồi và tạo protocorm lan
Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 20
3.2.2. Ảnh hưởng ca kinetin lên s pht sinh chồi và tạo protocorm ở lan
Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 23
3.3. Ảnh hƣởng của cc chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm auxin tới
sự pht sinh rễ lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 26
3.3.1. Ảnh hưởng ca chất kích thích sinh trưởng α-NAA đến s pht
sinh rễ ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 26
3.3.2. Ảnh hưởng ca chất kích thích sinh trưởng IAA đến s pht sinh rễ
ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 28
3.3.3. Ảnh hưởng ca chất kích thích sinh trưởng IBA đến s hnh thành
rễ củ a lan Hoà ng thả o (Dendrobium Sonia) 29
3.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp cc chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm
cytokinin và auxin đn sự sinh trƣởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium
Sonia) 33
3.4.1. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA
đến s sinh trưởng củ a lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 33
3.4.2. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA đến
s sinh trưởng củ a lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 34
3.4.3. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA đến
s sinh trưởng củ a lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 36
3.4.4. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và α-
NAA đến s sinh trưởng củ a lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 38
.3.4.5. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA
đến s sinh trưởng củ a lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 40
3.4.6. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA
đến s sinh trưởng củ a lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 41
3.5. Ảnh hƣởng của gi th đn sự sinh trƣởng của lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần cơ bản ca môi trường MS 13
Bảng 2.2. Thành phần cơ bản ca môi trường Phytamax 14
Bảng 3.1. So snh ảnh hưởng ca môi trường MS và Phytamax ti s pht sinh chồi
và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 19
Bảng 3.2. Ảnh hưởng ca BAP ti s pht sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hoàng
Thảo (Dendrobium Sonia) 22
Bảng 3.3. Ảnh hưởng ca kinetin ti s pht sinh chồi và tạo protocorm ở lan
Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 25
Bảng 3.4. Ảnh hưởng ca α-NAA ti s pht sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) 27
Bảng 3.5. Ảnh hưởng ca IAA ti s pht sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) 29
Bảng 3.6. Ảnh hưởng ca IBA ti s pht sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) 31
Bảng 3.7. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA ti s
sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 33
Bảng 3.8. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA ti s
sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 34
Bảng 3.9. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA ti s
sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 37
Bảng 3.10. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và α-NAA ti
s sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 39
Bảng 3.11. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA 40

Bảng 3.12. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA ti s
sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 42
Bảng 3.13. S pht trin ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) trên một s gi
th ngoài môi trường nuôi cấy 44


v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 5
Hình 3.1. So snh ảnh hưởng ca môi trường MS và Phytamax ti s pht sinh chồi
và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 20
Hình 3.2. Ảnh hưởng ca BAP ti s pht sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hoàng
Thảo (Dendrobium Sonia) 23
Hình 3.3. Ảnh hưởng ca kinetin ti s pht sinh chồi và tạo protocorm ở lan
Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 26
Hình 3.4. Ảnh hưởng ca cc chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin ti s
pht sinh rễ ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 32
Hình 3.5. Ảnh hưởng ca tổ hợp cc chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin
và cytokinin ti s sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 43
Hình 3.6. Hnh ảnh về s sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo trên một s gi th 45

vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA
ABA
BAP
IAA
IBA
KC
MS
RE
VW
α-naphthaleneacetic axit
Abscisic axit
Benzylamino purine
Indol axetic axit
Indol butyric axit
Knudson C
Murashige and Skoog
Robert Ernst
Vacin and Went

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
1. ĐT VẤN ĐỀ
Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thc vt đã trải qua hơn một trăm năm hnh
thành và pht trin, đem lại gi trị to ln cho loài người. Hiện nay, hầu hết cc cơ sở
nghiên cu ging cây trồng trên thế gii đều p dng công nghệ này vi cc mc
đích khc nhau.
Ở Việt Nam, kỹ thut nuôi cấy mô và tế bào thc vt đã được bắt đầu nghiên
cu và ng dng từ giữa những năm 70 ca thế kỷ XX. Những kết quả bưc đầu
trong nghiên cu và ng dng đã đạt kết quả khả quan đi vi một s đi tượng cây
trồng như chui, khoai tây, mía, lúa…, đc biệt là phong lan.
Việt Nam nằm trong khu vc nhiệt đi gió mùa, nóng ẩm mưa nhiều, là điều
kiện lý tưởng cho s sinh trưởng và pht trin ca hoa lan. Trong thế gii cc loài
hoa, hoa lan được ưa chuộng hơn cả. Hoa lan có đc đim là cấu hnh lạ, màu sắc
đẹp, độ bền hoa cao. Ngoài gi trị tinh thần thẩm mỹ, hoa lan còn có ý nghĩa ln trong
nền kinh tế quc dân. Loài hoa này từ lâu đã được con người thuần ho, sưu tầm, nhp
nội, thuần dưỡng cc ging ngoại và lai tạo đ tạo ra hàng nghn ging có màu sắc và
hương thơm như ý mun phc v nhu cầu ca con người.
Việt Nam có hàng trăm loài lan được trồng rộng rãi trên khắp đất nưc. Hoa
lan như một loại cây quan trọng trong chuyn dịch cơ cấu cây trồng trong nông
nghiệp đô thị và ven đô. Một s loại lan nhp nội đã nhanh chóng khẳng định ưu thế
ca nó và được pht trin vi quy mô đng k, trong s đó phải k đến lan Hoàng
Thảo lai (Dendrobium hybrids). Lan Hoàng Thảo lai hấp dẫn người tiêu dùng bởi
màu sắc và độ bền hoa, dễ trồng và đc biệt có gi trị kinh tế cao, cho thu nhp ln
vi ngành trồng hoa trong nưc.
Song song vi việc sưu tp, nhp nội cc ging lan Hoàng Thảo lai
(Dendrobium hybrids) th việc nghiên cu, hoàn thiện cc biện php kỹ thut đ tạo
điều kiện nâng cao năng suất, chất lượng là thc s cần thiết. Đồng thời cần nhân rộng

cc mô hnh trồng lan Hoàng Thảo lai (Dendrobium hybrids) tại miền Bắc Việt
Nam nhằm phc v nhu cầu ngày càng ln ca thị trường. Trong nhóm lan
Dendrobium thì Dendrobium Sonia (Dendrobium Gracia Lewis × Dendrobium
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Lady Constance) là loài ch lc đ trồng nhằm mc đích cắt cành. Chính v vy, đề
tài chọn Dendrobium Sonia là vt liệu nghiên cu.
Xuất pht từ yêu cầu thc tế khch quan đó và đ góp phần pht trin ngành
nuôi trồng lan Hoàng Thảo có hiệu quả, chúng tôi tiến hành nghiên cu đề tài:
“Nghiên cứ u môi trường nhân giống in vitro lan Hoàng Thảo (Dendrobium
Sonia) và giá thể đưa cây ra ngoài tự nhiên”
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xác định được môi trường ti ưu trong nhân ging in vitro lan Hoà ng Thảo
Dendrobium Sonia.
- Xác định được gi th thí ch hợ p đ đưa cây lan Hoàng Thảo Dendrobium
Sonia từ trong ố ng nghiệ m ra môi trườ ng t nhiên.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cu ảnh hưởng ca môi trường cơ bản MS và Phytamax đến s sinh
trưởng ca lan Hoàng Thảo
- Nghiên cứ u ảnh hưởng ca chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin
đến s pht sinh chồi và s sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo.
- Nghiên cứ u s ảnh hưởng ca chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin
đến pht sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh.
- Nghiên cứ u ả nh hưở ng củ a tổ hợ p cá c chấ t kích thí ch sinh trưở n g thuộ c
nhóm auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưở ng củ a lan Hoà ng Thả o.
- Nghiên cu tm ra loại gi th thích hợp nhất cho ra cây lan Hoàng Thảo (xơ
dừ a, tảo, than củ i …).

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VÀI NÉT VỀ PHÂN LOẠI VÀ ĐC ĐIỂM CỦA PHONG LAN
1.1.1. Đc đim thực vật học của họ lan
Họ lan (Orchidadeae) là họ phong phú, đa dạng và phc tạp, mọc ở nhiều môi
trường khc nhau và được chia làm 4 loại như sau:
Epiphytes: Phong lan bám vào cành hay thân cây
Teretrials: Địa lan mọc dưi đất
Lithophytes: Thạch lan mọc ở kẽ đ
Saprophytes: Hoại lan mọc trên lp rêu hoc gỗ mc.
Căn c vào cấu trúc, Pfitzer sắp xếp đa s lan tp trung vào hai nhóm: nhóm
đa thân (Sympodial) và nhóm đơn thân (Monopodial). Ngoài ra còn có một s ging
rất ít thuộc nhóm trung gian [6].
1.1.1.1. Rễ lan
Ở nhóm lan đa thân, rễ thường được hnh thành từ căn hành, nhóm đơn thân
th rễ mọc thẳng từ thân và thường xen kẽ vi l. Rễ trên không ca cc loài lan ph
sinh có một trc chính bao quanh bởi mô không cht, mô xp bao quanh gọi là mạc
(Velamen), cc tế bào khi khô chỉ cha không khí.
Khi sng ở đất, chúng thường có c giả, rễ to mp tương đi ít phân nhánh, nó
thuộc tổ chc có chất thịt. Cấu tạo ca rễ lan chia làm 3 tầng: tầng ngoài, tầng giữa
và tầng trong. Tầng ngoài là lp vỏ rễ, tc dng ch yếu là hút và giữ nưc. Tầng
giữa là thịt rễ, phần ln là tổ chc tế bào sng, cha rất nhiều nấm rễ cộng sinh.
Tầng trong là gân rễ có s liên kết tương đi dẻo dai [9].
1.1.1.2. Thân lan
Chiều cao thân ca lan cũng thường biến động rất ln từ 10 - 20cm, như vi

các loài Ascocentrum miniatum, Aecides multiflora và có th cao 3 - 4m như cc loài
Papilionantheteres, Archinis hoc khổng lồ như A campe, A. vanilla Thân thường
mang rễ và l. Ở nhóm đơn thân, rễ và l thường mọc theo hai chiều thẳng góc vi
nhau. Cành hoa cũng xuất hiện trên thân từ cc nch l, cành hoa thường mọc song
song vi l và thẳng góc vi rễ [9].
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.1.3. Lá lan
L ca lan là l đơn nguyên, dầy cng hay cũng có dạng mềm có gân ở giữa
nổi rõ, có loài l biến đổi thành vẩy hoc tiêu biến hoàn toàn. L mọc đơn độc hoc
xếp dày đc ở gc, hay xếp cch đều đn trên thân, c giả Hnh dạng l thay đổi
rất nhiều, từ loại l mọng nưc, nạc, dài hnh kim, hnh tr dài, tiết diện dài hay có
rãnh đến loại l hnh phiến mỏng, dài màu xanh bóng đm hay nhạt tuỳ theo vị trí
sng ca cây. Đc biệt rất hiếm loại l hnh tròn thuôn dài thành bẹ ôm lấy thân.
Phiến l trải rộng hay gấp lại theo cc gân vòng cung [9].
1.1.1.4. Hoa lan
Hoa lan thuộc hoa lưỡng tính rất hiếm gp loài đơn tính, bao hoa có dạng cnh
xếp thành hai vòng. Hoa lan có 3 cnh đài, thường có cùng màu sắc và kích thưc. Tuy
nhiên các loài lan khác nhau thì cnh đài có hnh dạng biến đổi rất khc nhau. Dạng
hnh tròn như cc ging Vanda, Ascocentrum, nhọn như Cattleya, xoắn như các loài
thuộc ging Laelia. Có khi hai l đài thấp nằm ở hai bên dính lại thành một như chi
Oncidium [1],[3].
1.1.2. Đc đim thực vậ t họ c củ a chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium)
Hoàng Thảo là những loài lan sng bm trên cây hay đ, mọc thành bi
nhiều hành giả. Cc giả hành có th phân thành cc đt như cây tre. Nhiều loài có
rãnh dọc theo giả hành. Rễ thuộc loại rễ chùm, có màu trắng và nhỏ hơn rễ ca một
s loài lan khc, rễ có khả năng ti sinh mạnh, khả năng hút nưc và dinh dưỡng tt.
Rễ lan Hoàng Thảo nhỏ, tp trung ở gc do đó cần giữ ẩm cho rễ.
Hoàng Thảo có thân dài, được tạo bởi cc đt, trên cc đt có bẹ l bao bọc,

mỗi đt có 1 mầm ng, mầm ng này có khả năng ti sinh tạo thành một c th mi.
Hoa ca lan Hoàng Thảo cũng mang đc trưng chung ca cc loài lan. Thuộc hoa
mẫu 3, có 6 cnh hoa, trong đó có 3 cnh đài, ở giữa là cnh môi. Màu sắc ca hoa
rất phong phú và độ bền dài. Cung hoa mọc ở đỉnh sinh trưởng ca cây. Một thân
có th có từ 1 - 4 cành hoa, mỗi cành hoa mang từ 5-16 hoa tùy theo ging, độ tuổi
ca cây và điều kiện chăm sóc. Hoa có khả năng đu quả rất cao [6].
1.1.3. Đc dim thực vật học của lan Dendrobium Sonia
Dendrobium Sonia là kế t quả củ a phé p lai giữ a Dendrobium Gracia Lewis và
Dendrobium Lady Constance. Dendrobium Sonia có cc đc đim như sau:
5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Rễ Dendrobium Sonia thuộc hệ rễ chù m , màu trắng, có một lp mô hút ẩm
dày bao quanh gồm những lp tế bào chết cha đầy không khí nên rễ nh lên màu
xm bạc. Rễ lan Dendrobium Sonia không chịu được lạnh nên rễ tậ p trung ở gố c.

Hình 1.1. Lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia)
Dendrobium Sonia thuộc nhóm đa thân dạng cộng tr , thân dà i, tạo bởi cc
đố t. Lá Dendrobium Sonia to, dày, nạc dài, màu xanh đm, mọc đố i xứ ng nhau, ôm
lấ y thân. Hoa mà u trắ ng tí m , tổ chc theo kiu tam phân (mẫu 3): 3 l đài, 3 cánh
hoa, 3 tâm bì. Tr hoa là bộ phn sinh dc ca hoa , có đồng thờ i cả cơ quan sinh
dc đc và ci nên được gọi là trc - hợ p - nhy. Hoa mọc thành chùm, cành hoa
dạng thẳng đng. Quả thuộc loại quả nang. Khi hạt chín, cc nang bung ra. Quả có
nhiề u hạ t. Một quả cha từ 10000 đến 100000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt nên kích
thưc rất nhỏ, phôi hạt chưa phân hóa.
1.2. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
TRONG CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG
1.2.1. Cc hƣớng nghiên cứu ứng dụng
Nhân giố ng in vitro là một trong những ng dng c hính ca công nghệ tế bào
thự c vậ t, sử dụ ng sự phá t triể n nhân tạ o và nhân cá c điể m sinh trưở ng hoặ c cá c mô

phân sinh củ a cây . Theo cá c công trì nh thí nghiệ m củ a Amato (1977), chỉ có đỉnh
sinh trưở ng củ a chồ i mớ i đả m bả o s ổn định về di truyền, tiế p đế n là mô phân sinh
vớ i kí ch thướ c nhỏ , kế t hợ p vớ i xử lý nhiệ t để là m sạ ch bệ nh là nguyên liệ u tố t cho
nhân giố ng.
Kỹ thut nhân nhanh được ng dng nhằm phc v cho cc mc đích chính
như: duy trì và nhân nhanh cá c kiể u gen quý hiế m , làm vt liệu cho công tc chọn
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

giố ng; duy trì và nhân nhanh cá c cá thể đầ u dò ng để cung cấ p hạ t giố ng cho cá c loạ i
cây trồ ng khá c nhau như cây lương thự c có củ , cây rau, cây cả nh ; nhân nhanh ở
điề u kiệ n vô trù ng cá ch ly tá i nhiễ m kế t hợ p vớ i việ c là m sạ ch bệ nh virut , rút ngắn
thờ i gian đưa cá c cây lai và cá c cây tự nhiên có đặ c điể m tố t ; bảo quản tt tp đoàn
giố ng vô tí nh về cá c loà i cây giao phấ n trong ngân hà ng gen [2], [16].
1.2.2. Ƣu thế củ a nhân giố ng in vitro
Hệ s nhân cao , rút ngắn thời gian đưa ging vào sản xuất . Từ mộ t cây trong
vòng 1-2 năm có thể tạ o thà nh hà ng triệ u cây . Nhân đượ c số lượ ng cây lớ n trong
mộ t diệ n tí ch nhỏ , trong 1m
2
có th đ 18000 cây [16], [18].
Làm sạch bệnh cây trồng và cch ly chúng vi nguồn bệnh , v vy đả m bả o
giố ng sạ ch bệ nh ; thuậ n tiệ n trong vậ n chuyể n và bả o quả n (cây giố ng giữ ở 4
0
C
trong hà ng thá ng vẫ n cho tỷ lệ số ng 95%). Đồng thời, có th sản xuất quanh năm
mà không phụ thuộ c và o mù a vụ , có tiềm năng công nghiệp ho cao [18].
1.2.3. Cc phƣơng thức nhân giống in vitro
1.2.3.1. Nuôi cấ y mô phân sinh hoặ c đỉnh sinh trưở ng
Theo Lê Trầ n Bì nh (1997), mô phân sinh nuôi cấ y là mẫ u vậ t nuôi cấ y đượ c
tch từ đỉnh sinh trưởng có kích thưc trong vòng 0,1mm tí nh từ chó p củ a chó p

đỉ nh sinh trưở ng . Tuy nhiên trong thự c tế việ c nuôi cấ y mẫ u vậ t như vậ y rấ t kh ó
thành công, ngườ i ta chỉ tiế n hà nh nuôi cấ y khi mụ c đí ch là là m sạ ch virut cho cây
trồ ng. Nuôi cấ y mô phân sinh hoặ c đỉnh sinh trưở ng đượ c tiế n hà nh phổ biế n nhấ t ở
cc đi tượng phong lan , dứ a, mía đỉnh sinh trưở ng đượ c tá ch vớ i kí ch thướ c 5-
10mm [2].
Trong nuôi cấ y mô phân sinh hoặ c đỉnh sinh trưở ng cầ n chú ý tớ i tương quan
giữ a độ lớ n chồ i , tỷ lệ sng và mc độ ổn định về mặ t di truyề n ca chồi, v thông
thườ ng nế u độ lớ n củ a chồ i t ăng thì tỷ lệ số ng và mứ c độ ổ n đị nh di truyề n tăng
nhưng hiệ u quả kinh tế giả m và ngượ c lạ i . Do vậ y phả i kế t hợ p giữ a cá c yế u tố để
tm ra phương php lấy mẫu ti ưu . Mộ t đỉ nh sinh trưở ng nuôi cấ y ở điề u kiệ n thí ch
hợp sẽ pht trin thành một hay nhiều chồi và cc chồi sẽ pht trin thành cây hoàn
chỉnh có rễ đầy đ . Nế u xé t về nguồ n gố c cá c cây tá i sinh từ nuôi cấ y nguyên liệ u
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ban đầ u là mô phân sinh hoặ c đỉ nh sinh trưở ng thì có ba khả năng: cây phá t triể n từ
chồ i đỉ nh (chồ i ngọ n); cây phá t t riể n từ chồ i ná ch phá ngủ ; cây phá t triể n từ chồ i
mớ i phá t sinh. Tuy nhiên trong thự c tế rấ t khó phân biệ t đượ c chồ i phá ngủ và chồ i
mớ i phá t sinh [12].
Có 2 phương thứ c hì nh thà nh cây tá i sinh từ nuôi cấ y mô phân sinh hoặ c đỉ nh
sinh trưở ng. Cây tá i sinh trự c tiế p từ chồ i đỉ nh hoặ c chồ i ná ch phá ngủ . Phương
thứ c nà y chủ yế u ở cá c đố i tượ ng 2 l mầm như : khoai tây, thuố c lá , cam, chanh,
hoa cú c, nhưng có cả cây 1 l mầm như da sợi , mía cây tá i sinh qua giai đoạ n
hnh thành dẻ hành (protocorm), ch yếu gp ở cc đi tượng một l mầm như :
phong lan, dứ a, hoa huệ Gầ n đây phương thứ c nà y cũ ng bắ t đầ u đượ c bắ t đầ u
đượ c á p dụ ng có kế t quả ở cá c cây ăn quả và cây lâm nghiệ p , trong đó có cây quý
như cà phê, to, lê, cây thông, bồ đề Tổ ng số có trên 30 chi khá c nhau đượ c nuôi
cấ y thà nh công [2].
1.2.3.2. Tái sinh cây hoàn chnh t các b phn khác ca cây
V tế bào thc vt có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh

trưở ng là bộ phậ n dễ nuôi cấ y thà nh công , cc bộ phn còn lại ca cơ th thc vt
đều có th thc hiện cho việ c nhân giố ng in vitro đượ c. Cc bộ phn đó là : đoạ n
thân ở cá c đố i tượ ng như ở thuố c lá , cam, chanh, ; mảnh l ở thuc l, cà chua, bắ p
cải ; cuố ng lá ở Nacissus; cc bộ phn ca hoa như súp lơ , lúa m và nhnh củ ở
hành tỏi [2].
1.2.3.3. Nhân giố ng qua giai đoạ n mô sẹ o
Trong khuôn khổ củ a mụ c đích nhân giố ng vô tí nh , nế u tá i sinh đượ c cây hoà n
chỉnh trc tiếp từ mẫu vt ban đầu th không những nhanh chóng thu được cây mà
cũng kh đồ ng đề u về mặ t di truyề n . Tuy nhiên, trong nhiề u trườ ng hợ p mô nuôi
cấ y không tá i sinh ngay mà phá t triể n thà nh khố i mô sẹ o . Tế bà o mô sẹ o khi cấ y
chuyể n nhiề u lầ n sẽ không ổ n đị nh về mặ t di truyề n . Do đó , nhấ t thiế t phả i sử dụ ng
mô sẹ o v ừa pht sinh (mô sẹ o sơ cấ p ) th mi thu được cây ti sinh đồng nhất . V
vậ y, ngườ i ta chỉ tiế n hà nh nhân giố ng qua giai đoạ n mô sẹ o đố i vớ i nhữ ng đố i
tượ ng khó tá i sinh cây trự c tiế p. Thông qua giai đoạ n mô sẹo có th thu được những
cây sạ ch virus [2].
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.4. Quy trì nh nhân giố ng in vitro
1.2.4.1. Chuẩ n bị cây là m vậ t liệ u gố c
V trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang nhữ ng đặ c tí nh và tí nh trạ ng củ a
cây mẹ ban đầ u nên trong giai đ oạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thn , cây mẹ
thườ ng là cây có nhiề u đặ c tí nh ưu việ t , khoẻ, có gi trị kinh tế cao. Sau đó , chọn cơ
quan để lấ y mẫ u thườ ng là mô non , đoạ n thân có chồ i ngủ , l non hoc hoa non
Mô chọ n đ nuôi cấy thường là mô có khả năng ti sinh cao trong môi trường nuôi
cấ y sạ ch bệ nh , giữ đượ c cá c đặ c tí nh sinh họ c quý củ a cây mẹ , ít nguy cơ biến dị .
Tuỳ theo điều kiện, giai đoạ n nà y có thể ké o dà i 3-6 thng [16].
1.2.4.2. Thiế t lậ p hệ thố ng cấ y vô trù ng
Là giai đoạn chuyn mẫu vt từ ngoài vào môi trường nuôi cấy đ tạo nguyên
liệ u sạ ch bệ nh cho nhân giố ng, giai đoạ n nà y đượ c tiế n hà nh theo cá c bướ c:

Khử trù ng bề mặ t mẫ u vậ t và chuẩ n bị cc môi trường nuôi cấy.
Cấ y mẫ u vậ t và o ố ng nghiệ m hoặ c bì nh nuôi cấ y có sẵ n môi trườ ng nhân tạ o
(giai đoạ n nà y là giai đoạ n cấ y mẫ u in vitro).
Cc mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn , nấ m, virus sẽ đượ c nuôi trong
phòng nuôi cấy vi điều kiện nhiệt độ nh sng phù hợp . Sau mộ t thờ i gian nhấ t
đị nh, từ mẫ u nuôi cấ y đã bắ t đầ u xuấ t hiệ n cá c cụ m tế bà o hoặ c cá c cơ quan hoặ c
cc phôi vô tính . Giai đoạ n nà y phụ thuộ c và o từ ng đố i tượ ng đem nhân giố ng ,
thông thườ ng ké o dà i từ 2-12 thng hoc ít nhất 4 lầ n cấ y chuyể n [16].
1.2.4.3. Nhân nhanh chồ i
Đây là giai đoạ n sả n xuấ t cây nhân giố ng quyế t đị nh hiệ u quả củ a quá trì nh
nuôi cấ y mô , cây đượ c nhân nhanh theo n hu cầ u củ a ngườ i nuôi cấ y . Khi mẫ u cấ y
sạch đã được tạo ra , từ đó nhậ n đượ c cá c cụ m chồ i và cá c phôi vô tí nh sinh trưở ng
tố t trong quá trì nh nuôi cấ y sẽ bướ c và o giai đoạ n sả n xuấ t . Ngườ i ta cầ n tạ o ra tố c
độ nhân nhanh cao nhấ t trong điề u kiệ n nuôi cấ y . Thành phần và điều kiện môi
trườ ng cầ n tố i ưu hoá để tạ o đượ c mụ c tiêu nhân nhanh . Đi vi môi trường nhân
chồ i, ngườ i ta sử dụ ng cá c chấ t kí ch thí ch sinh trưở ng thuộ c nhó m cytokinin (BAP,
kinetin) vớ i nồ ng độ khá c nhau tuỳ từ ng đố i tượ ng cây . Quy trình cấ y chuyể n để
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nhân nhanh chồ i thườ ng trong khoả ng 1-2 thng tuỳ loài cây . Tỷ lệ nhân nhanh
khoảng 2-8 lầ n sau mộ t lầ n cấ y chuyể n . Nhn chung giai đoạn này thường ko dài
10-36 thng. Giai đoạ n nhân nhanh chồ i từ mộ t và i chồ i ban đầ u không nên ké o dà i
qu lâu đ trnh s hnh thành biến dị sôma [16].
1.2.4.4. To rễ (to cây hoàn chnh)
Cc chồi hnh thành trong qu trnh nuôi cấy có thể phá t triể n rễ tự sinh, nhưng
thông thườ ng cá c chồ i nà y phả i cấ y chuyể n sang mộ t môi trườ ng khá c để kí ch thí ch
tạo rễ . Đi vi môi trường tạo rễ , ngườ i ta thườ ng sử dụ ng chấ t kí ch thí ch sinh
trưở ng thuộ c nhó m auxin như α-NAA, IAA, IBA. Thông thườ ng giai đoạ n nà y ké o
dài 2-8 tuầ n tuỳ đố i tượ ng. Khi cây có đủ cá c bộ phậ n thân, l, rễ vớ i kí ch thích nhấ t

đị nh đả m bả o cho sinh trưở ng , pht trin bnh thường ngoài t nhiên , ngườ i ta mớ i
tiế n hà nh giai đoạ n tiế p theo là đưa cây ra ngoà i môi trườ ng tự nhiên [16].
1.2.4.5. Chuyể n cây ra đấ t trồ ng
Đây là giai đoạ n đầ u cây đượ c chuyể n từ điề u kiệ n vô trù ng trong ố ng nghiệ m
ra ngoà i môi trườ ng tự nhiên . Giai đoạ n nà y quyế t đị nh khả năng ứ ng dụ ng củ a quy
trnh nhân ging in vitro. Đa số cá c loà i cây trồ ng chỉ sau khi chồ i đã ra rễ tạ o thà nh
cây hoà n chỉ nh vớ i kích thướ c nhấ t đị nh mớ i đượ c huấ n luyệ n và chuyể n ra ngoà i
vườ n ươm. Cây nuôi cấ y in vitro đượ c sinh trưở ng và phá t triể n trong nhữ ng điề u
kiệ n tố i ưu về nhiệ t độ , độ ẩ m, pH, dinh dưỡ ng V vy, trướ c khi đưa ra trồ ng ,
ngườ i ta cầ n huấ n luyệ n cây để thí ch nghi vớ i điề u kiệ n tự nhiên . Qu trnh thích
nghi vớ i điề u kiệ n bên ngoà i củ a cây ở giai đoạ n đầ u yêu cầ u cầ n đượ c chăm só c
đặ c biệ t. V vy, cây đượ c chuyể n từ môi trườ ng từ bã o hoà hơi nướ c sang vườ n
ươm vớ i nhữ ng điề u kiệ n khó khăn hơn , nên vườ n ươm cầ n phả i đá p ứ n g cá c yêu
cầ u: che cây non bằ ng nilon và có hệ thố ng phun sương cung cấ p độ ẩ m và là m má t
cây; gi th trồng cây có th là đất mùn , hoặ c cá c hỗ n hợ p nhân tạ o không chứ a đấ t ,
mùn cưa và bọt bin Giai đoạ n nà y đò i hỏ i 4-16 tuầ n [16].
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI
CẤY IN VITRO
1.3.1. Cc nghiên cứu trong nƣớc
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Ngày nay phương php nuôi cấy mô tế bào thc vt không chỉ được s dng
trong nghiên cứ u mà cò n đượ c á p dụ ng rộ ng rã i vào thc tiễn chọn ging, không chỉ
ở cây ngũ cc mà còn ở cây rau, cây ăn quả , và đc biệt là hoa cây cảnh.
Nuôi cấy mô và tế bào thc vt phc v nhân ging cây trồng đã trin khai
trên 20 năm ở nưc ta. Nhân ging thương mại quy mô ln đã đạt được ở một s
cây trồng như nhân nhanh chui, nhân nhanh khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh cc
ging mía nhp nội… Quy trnh công nghệ nhân nhanh ging chui và ging mía đã
được Bộ Nông nghiệp và Pht trin Nông thôn công nhn và p dng đ chuyn gen

khng sâu đc thân [2].
Hoàng Thị Giang và cộng s (2010) nghiên cu nhân ging in vitro và nuôi
trồng ging lan Hài P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng). Kết quả nghiên cu
cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổ
sung nưc dừa 150ml/l và chui chín 100g/l cho hệ s nhân cao nhất (4,3 lần). Bổ
sung α-NAA 0,4mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tt nhất. Cc kết
quả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao
3 - 4cm, có từ 3 - 4 lá, 4 - 5 rễ [4].
Phùng Văn Phê và cộng s (2010) nghiên cu kỹ thut nhân nhanh chồi in
vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Tc giả kết lun, môi
trường KC là phù hợp nhất đ nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro. Th chồi 8
tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ th chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất đ nhân
nhanh trong môi trường thích hợp KC, bổ sung BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l +
NAA 0,3mg/l + nưc dừa 100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + saccharose 20g/l
+ agar 7,0g/l + than hoạt tính 0,5g/l [11].
Nguyễn Thi Hà và cộng s (2003) nghiên cu s pht sinh c in vitro các
ging hoa Lilium spp. Trên đi tượng ging hoa Lily nhp từ Mỹ được cấy trên môi
trường MS cơ bản có bổ sung cc chất điều hòa sinh trưởng đã đưa ra được quy
trnh nhân ging c in vitro cc ging hoa Lilium spp [5].
Nghiên cu nhân nhanh in vitro ging lan Kim điệp (Dendrobium
chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tm ra được môi trường thích hợp cho
nảy mầm và pht sinh protocorm ca hạt là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l,
agar 8g/l, nưc dừa 15% và BAP 2,0mg/l. Môi trường nhân nhanh protocorm tt
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nhất là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nưc dừa 15% và BAP
2,0mg/l. Môi trường MS cơ bản, bổ sung saccharose 30g/l, agar 8,0g/l, than hoạt
tính 1,0g/l, nưc dừa 15%, BAP 2,0mg/l và NAA 1,0mg/l thích hợp nhất cho ti
sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng ca chồi in vitro. Môi trường MS cơ bản, bổ

sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nưc dừa 15% và NAA 1,0mg/l là thích hợp cho
tạo rễ ca chồi in vitro [13].
Nghiên cu môi trường nhân ging in vitro ging lan Dendrobium
fimbriatum Hook. (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng
định môi trường thích hợp cho nảy mầm và pht sinh protocorm ca hạt là môi
trường MS, bổ sung nưc dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; Môi trường
nhân nhanh protocorm tt nhất là môi trường Knud, bổ sung nưc dừa 100ml/l,
saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar 6,0g/l; Môi trường MS, bổ sung nưc dừa
100ml/l, saccharose 20g/l, chui chín 60g/l, agar 6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân
nhanh chồi in vitro; Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là môi trường RE, bổ sung
saccharose 10g/l, than hoạt tính 1,0g/l, agar 6,0g/l [14].
Nguyễn Quang Thạch và cộng s (2003) đã tiến hành nghiên cu xây dng
quy trnh nhân ging và nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp). Ging
lan Hồ Điệp được kh trùng bằng HgCl
2
, sau đó được cấy lên môi trường nhân
nhanh. Kết quả đã đưa ra được quy trnh nhân ging và nuôi trồng lan Hồ Điệp [15].
1.3.2. Các nghiên cứu của nƣớc ngoài
Wang (1997) đã nghiên cu s nở hoa ca ging lan Dendrobium candidum
được tạo ra bằng phương php nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy, việc bổ sung
spermidine, BAP, hoc s kết hợp ca NAA và BAP môi trường nuôi cấy có th
tăng khả năng tạo protocorm và chồi hoa trong vòng 3-6 thng vi tần s 31,6% -
45,8%. Tần s nở hoa tăng lên 82,8% trưc khi bổ sung ABA vào môi trường nuôi
cấy, sau đó chuyn protocorm vào môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP [37].
Xu, Liu và cộng s (2001) nghiên cu môi trường nuôi cấy in vitro ging lan
Dendrobium chrysotoxum và kết lun: phôi Dendrobium chrysotoxum có th nảy
mầm được trong điều kiện có hoc không có nh sng. Da trên môi trường MS, bổ
sung NAA 0,5mg/l, BAP 1mg/l cho hiệu quả nảy mầm cao [34].
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nghiên cu về môi trường nuôi cấy in vitro ging lan Dendrobium
macrostachyum, Pyati (2002) s dng môi trường MS cơ bản, bổ sung
BAP (2,22µM, 4,44µM, 8,88µM), Kinetin (2,32µM, 4,65µM, 9,29µM), 2,69µM
NAA và nưc dừa 5%, 10%, 15%) [19]. Tc giả nhn định rằng, môi trường MS có
bổ sung nưc dừa 15%, mt độ 6 chồi/bnh cấy cho hiệu quả ti ưu [27].
Cũng s dng môi trường MS cơ bản, Martin và cộng s (2005) bổ sung
kinetin 6,97µM hoc BAP 13,3µM, nưc dừa 15%, than hoạt tính 2,0g/l sẽ tạo điều
kiện cho s nảy chồi ca ging lan Dendrobium Sonia. Tỷ lệ sng ca cây con đạt
80% [24].
Nghiên cu về s cảm ng ra hoa ca ging lan Dendrobium Sonia trong
ng nghiệm, Tee (2008) đã kết lun: trong môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP
20μM kích thích s ra hoa và c chế s tạo rễ. Môi trường nuôi cấy vi hàm lượng
P cao và N thấp kích thích s ra hoa, trong khi môi trường nuôi cấy vi hàm lượng
P thấp và N cao lại thúc đẩy hnh thành ca chồi [33].
Năm 2009, Huang Yong nghiên cu bảo tồn ging lan Dendrobium
officinale, Dendrobium nobile và Dendrobium fimbriatum bằng phương php nuôi
cấy hạt ging in vitro. Kết quả nghiên cu cho thấy, hạt ging nảy mầm và sinh
trưởng tt trong môi trườ ng MS có bổ sung BAP 0,5mg/l, NAA 0,1mg/l + khoai tây
50g/l + chuichí n 50g/l + than hoạt tính 5g/l + saccharose 25g/l [22].
Nghiên cu về môi trường nuôi cấy in vitro ging lan Dendrobium nobile
var. Emma white, Sana Asghar và cộng s (2011) s dng BAP và kinetin có nồng
độ từ 0,5mg/l - 3,0mg/l, nưc dừa 50ml/l - 300ml/l. Nghiên cu cho thấy, môi
trường có bổ sung BAP 2,0mg/l cho hiệu quả tạo chồi cao nhất (4,33 chồi); kinetin
1,5mg/l cho hiệu quả chiều cao chồi cao nhất (2,45cm); IBA 2,0mg/l cho s lượng
rễ và chiều dài gc cao hơn so vi NAA 1,5mg/l [30].

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Giố ng lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) do phò ng Công nghệ tế bà o thự c
vậ t - Việ n Di truyề n Nông nghiệ p cung cấ p.
2.1.2. Hóa chất và thit bị
* Hóa chất
Cc chất kích thích sinh trưởng, đường saccharose, agar, than hoạt tính, nưc
dừa, khoai tây.
Nuôi cấy được tiến hành trên nền môi trường MS và môi trường Phytamax.
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản ca môi trường MS
STT
Thành phần
Nồng độ (mg/l)
MS1
1
CaCl
2
440
MS2
2
KH
2
PO
4
170

3
KNO
3
1900
4
MgSO
4
.7H
2
O
370
5
NH
4
NO
3
1650
MS3
6
H
3
BO
4
6,2
7
KI
0,83
8
MnSO
4

.4H
2
O
22,3
9
ZnSO
4
.7H
2
O
8,6
10
CoCl
2
.5H
2
O
0,025
11
CuSO
4
.5H
2
O
0,025
12
Na
2
MoO
4

.2H
2
O
0,25
MS4
13
FeSO
4
.7H
2
O
27,8
14
Na
2
EDTA
37,3
MS5
15
Glycine
2
16
Thiamine HCl
0,1
17
Pyridocine HCl
0,5
18
Nicotinic axit
0,5

19
Myo-inositol
100
(Nguồn: Lê Trần Bnh, 1997) [2].

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 2.2. Thành phần cơ bản ca môi trường Phytamax
STT
Thành phần
Nồng độ (mg/l)
1
Peptone
2000
2
Mes
1000
P1
3
CaCl
2
166
P2
4
KH
2
PO
4
85,5

5
KNO
3
950
6
MgSO
4
.7H
2
O
90,35
7
NH
4
NO
3
825
P3
8
H
3
BO
4
31
9
KI
0,415
10
MnSO
4

.4H
2
O
8,45
11
ZnSO
4
.7H
2
O
5,3
12
CoCl
2
.5H
2
O
0,0125
13
CuSO
4
.5H
2
O
0,0125
14
Na
2
MoO
4

.2H
2
O
0,125
P4
15
FeSO
4
.7H
2
O
27,8
16
Na
2
EDTA
37,26
P5
17
Thiamine HCl
0,1
18
Pyridocine HCl
0,5
19
Nicotinic axit
0,5
20
Myo-inositol
100

(Nguồn: Lê Trần Bnh, 1997) [2].
* Dụng cụ
Bnh tam gic, pipet, cc thy tinh định mc.
Bông, giấy làm nút, giấy thấm.
Bình tam giác 250ml.
Bộ đồ cấy gồm: dao cấy, que cấy, đĩa cấy…
Buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) ca hãng Nuarie, Mỹ.
Nồi kh trùng (Auto Clace) ca hãng ToMy, Nht bản.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quy trnh nghiên cu được tóm tắt theo sơ đồ sau:


15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm
2.2.1. Phƣơng php pha môi trƣờng và nuôi cấy
2.2.1.1. Pha môi trường nuôi cấy
Pha môi trường đc vi thành phần và nồng độ cc chất phù hợp. Môi trường
có đầy đ mui khong, cc chất hữu cơ, vitamin… Tất cả cc hóa chất phải được
tan đều, không kết ta. Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm gi đỡ không
quá rắn hay qu mềm đ khi cấy mẫu vt được dễ dàng. Kh trùng môi trường theo
phương php Pasteur.
Sau khi xc định công thc môi trường cần pha, tính th tích cc hóa chất
cần s dng trong môi trường nuôi cấy. Ví d pha một lít môi trường nhân phong
lan có công thc: MS, saccharose 30g/l, agar 8,0g/l, BAP 0,5mg/l, than hoạt tính
1,0g/l, nưc dừa 100ml/l th tiến hành theo cc bưc sau:
 Đong 100ml nưc dừa.
 Cân 50g khoai tây, nghiền nt.
 Đong 0,75l hỗn hợp nưc cất, nưc dừa, khoai tây, sau đó đun sôi.
 Dùng pipet hoc ng đong đ lấy cc dung dịch MS cho vào một cc thy
tinh sạch.
 Bổ sung BAP vào cc dung dịch trên.
 Cân saccharose 30g, agar 8,0g, than hoạt tính 1,0g.
Mẫu ging
Tạo protocorm
Tạo đa chồi
Tạo rễ
Tạo đa chồi
Cây hoàn chỉnh
Đưa cây ra môi trường t nhiên
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

 Khi nưc gần sôi (50-70
0
C) th đổ agar khuấy đều cho tan, sau đó cho
đường và than hoạt tính vào khuấy tan hết.
 Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở cc thy tinh khi nưc sôi.
 Định lượng hỗn hợp dung dịch trên bằng nưc cất cho đ 1 lít.
 Chuẩn độ pH ca hỗn hợp dung dịch trong khoảng 5,5 – 5,8.
 Chia đều hỗn hợp dung dịch nuôi cấy cho cc bnh tam gic, mỗi bnh
50ml môi trường. Sau đó nút bông và làm nắp bằng giấy, đy kín.
 Kh trùng trong nồi kh trùng ở nhiệt độ 120
0
C, p suất 1-1,2atm, trong
thời gian 20 phút. Trong qu trnh lấy môi trường ra khỏi nồi hấp th lắc nhẹ bnh
tam gic cha môi trường nuôi cấy đ than hoạt tính tan đều trong môi trường. Sau
khi hấp kh trùng xong đ môi trường 2-3 ngày th bắt đầu s dng.
2.2.1.2. Phương pháp nuôi cấy
Trưc khi tiến hành nuôi cấy, cần kh trùng box cấy bằng đèn UV trong thời
gian 30-60 phút, kh trùng bộ cấy bằng cch đt trên ngọn la đèn cồn, sau đó đ
nguội,
Cm chồi lan được lấy từ bnh ging ra, tch thành từng cm nhỏ đường
kính 0,5-1cm, cc cm chồi này được cấy bằng que cấy vào môi trường nhân ging.
B trí thí nghiệm vi cc công thc môi trường tùy từng mc đích nghiên cu. Bnh
nuôi cấy được đt trong nhà nuôi cấy vi cường độ nh sng 2000lux, thời gian
chiếu sng 10/24 giờ, nhiệt độ 25-27
0
C.
2.2.2. Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy
Đ tm ra môi trường nuôi cấy ti ưu cho nhân nhanh và tạo rễ lan
Dendrobium Sonia, chúng tôi b trí cc thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy.
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành nghiên cu s ảnh hưởng ca môi trường MS

cơ bả n và môi trườ ng Phytamax đế n sự sinh trưở ng và phá t triể n củ a lan
Dendrobium Sonia. Cc mô lan đượ c cấ y trên môi trườ ng MS và Phytamax chỉ bổ
sung saccharose 30g/l + agar 8,0g/l + khoai tây 50g/l + than hoạt tính 1,0g/l + nưc
dừa 100ml/l. Công thứ c thí nghiệ m đượ c tiế n hà nh trên 30 mô, lặ p lạ i 3 lầ n, kế t quả
đá nh giá sau 4 tuầ n, 8 tuầ n, 12 tuầ n. Sau 12 tuầ n, kế t quả đá nh giá sẽ đượ c sử dụ ng
vào cc công thc thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.1. Môi trường nhân giống
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Thăm dò ảnh hưởng ca nồng độ BAP và kinetin đến khả năng nhân chồ i
ca lan Dendrobium Sonia. Các mô lan được cấy lên môi trường nhân chồi trên nền
môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP vi nồng độ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l;
2,0mg/l; 2,5mg/l hoc kinetin vi nồng độ từ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l;
2,5mg/l. Mỗi công thc thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lp lại 3 lần. Kết quả
được đnh gi sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần nuôi cấy.
2.2.2.2. Môi trường to cây hoàn chnh (môi trường to rễ)
Những chồi nhân được có kích thưc từ 1,5 - 2,0cm được cấy chuyn sang
môi trường tạo rễ trên nền môi trường MS cơ bản, bổ sung chất kích thích sinh
trường α-NAA riêng rẽ, nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l;
IAA riêng rẽ có nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l; IBA riêng
rẽ có nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l.
Phi hợp BAP nồng độ 0,5mg/l vi α-NAA, IBA, IAA nồng độ từ 0,2mg/l
đến 0,8mg/l. Phi hợp kinetin nồng độ 2,0mg/l vi α-NAA, IBA, IAA nồng độ từ
0,2mg/l đến 0,8mg/l. Mỗi công thc thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lp lại 3
lần. Theo dõi s sinh trưởng, pht trin ca cây thông qua s pht sinh rễ, l, kích
thưc rễ, kích thưc l sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần nuôi cấy.
2.2.3. Phƣơng php ra cây
Khi cây con có rễ dài trung bnh từ 1,0cm đến 1,5cm, hoc l vi chiều dài
trung bnh từ 1,5cm đến 2,0cm, bộ rễ khỏe, l xanh tt được tiến hành huấn luyện

đưa cây trồng ngoài t nhiên bằng cch đ cc bnh cây ra nơi có nh sng khuếch
tán 2-3 ngày trưc khi đưa cây ra khỏi bnh.
Khả năng sng ca cây khi chuyn từ trong ng nghiệm ra vườn ươm quyết
định hiệu quả kinh tế ca phương php nhân ging in vitro. Do đó, một quy trnh ra
cây đạt hiu quả cao có ý nghĩa rất ln.
2.2.3.1. Đưa cây ra ngoài môi trường
Cc bnh cây được mở nút, cho nưc vào ngâm 10-15 phút, sau đó lắc nhẹ
cho thạch rời ra khỏi cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp cây ra khỏi bnh, c gắng đ
cây được nguyên vẹn không bị dp nt.
Ngâm cây trong chu nưc sạch, sau đó ra dưi vòi nưc chảy cho hết
thạch bm vào bộ rễ ca cây.