các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử.ppt

1
Trường ĐH Nông Lâm Huế
Khoa Sinh học
CÁC PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU SINH HỌC
PHÂN TỬ
Lớp: Nuôi Trồng Thủy Sản 46
Sinh viên thực hiện:
1. Cung Đình Đạt
2. Nguyễn Lương Mãn
3. Nguyễn Quốc Đạt A
4. Hoàng Văn Đại
5. Phạm Thị Hoài
6. Đỗ Viết Bi
7. Diệp Thị Vinh
2
Nội dung:
Khái niệm chung về sinh học phân tử
Phương pháp tách chiết acide nucleic
Phương pháp tách chiết ARN
Phương pháp điện di
Phương pháp ly tâm
Mẫu dò và các phương pháp đánh dấu
Phương pháp lai phân tử
Phương pháp sắc ký
Kỹ thuật Western blot
Phương pháp PCR
3
1
Khái niệm chung về sinh học phân tử
1. Định nghĩa:

Ta gặp các nội dung
của sinh học phân tử
trong nhiều môn
khoa học thuộc lĩnh
vực khoa học sự sống
đặc biệt là di truyền
học và sinh hóa học
Ta gặp các nội dung
của sinh học phân tử
trong nhiều môn
khoa học thuộc lĩnh
vực khoa học sự sống
đặc biệt là di truyền
học và sinh hóa học
Sinh học phân tử
(molecular
biology) là môn
khoa học nghiên
cứu giới sinh vật
hay các hiện tượng
sinh vật ở mức độ
phân tử.
tìm hiểu
liên hệ và tương tác
giữa các phân tử DNA,
RNA, quá trình tổng
hợp protein cũng như
tìm hiểu cơ chế điều
hòa những mối tương
tác này

tìm hiểu
liên hệ và tương tác
giữa các phân tử DNA,
RNA, quá trình tổng
hợp protein cũng như
tìm hiểu cơ chế điều
hòa những mối tương
tác này
4
1
Phương pháp tách chiết acide nucleic
Bước 1: Phá bỏ tế bào và màng nhân
Dùng máy nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy
cùng với enzyme protease. Kết quả là giải phóng
ADN ở trạng thái tự do vào môi trường
Bước 1: Phá bỏ tế bào và màng nhân
Dùng máy nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy
cùng với enzyme protease. Kết quả là giải phóng
ADN ở trạng thái tự do vào môi trường
Bước 3: kết tủa acide nucleic
Trong môi trường có nồng độ muối và ethanol cao ở nhiệt
độ thấp thì acide nucleic bị kết tủa. Dùng máy ly tâm để
thu nhận acide nucleic và làm tinh sạch chúng
Bước 2: Loại bỏ tạp chất
Mẫu được lắc mạnh trong hỗn hợp phenol và
chioroform. Sau đó dùng máy ly tâm tách protein
ra khỏi hỗn hợp.
5
Quy vtrinhf tách chiết ADN
MẪU

Mẫu mất hoạt tính enzyme
Quy trình tách chiết ADN
Dịch Bã ( bỏ đi)
Bã ( bỏ đi)
Dịch
Tủa ARN
Tủa ( acide nucleic tổng số
Dung dịch ADN
Cố định mẫu bằng N2
Nghiền với hỗn hợp phenol – tris SDS
Lọc
Để ở 4oC trong 24 giời
Lọc
Cho vào ngâm trong dd alcol 96o
+ acetat 1 M ở 24oC, trong 24 giời
Ly tâm 3000g/10’
NaCl 0,3 M + cetavlon ở 4oC,
trong 30’
Ly tâm 3000g/10’
Dịch ( bỏ đi)
6
Phương pháp tách chiết ARN
2
- Bước 1: Phá bỏ màng tế bào
Nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy, gây biến tính protein và chất khử làm
mất hoạt tính ARN-ase nội bào, sẽ tách các protein ra khỏi ARN.
- Bước 2: Tách protein ra khỏi hỗn hợp bằng cách xử lý phenol-
chlorofform và ly tâm.
- Bước 3: Kết tủa ARN bằng ethanol rồi thu nhận qua ly tâm.
7

Quy trình tách chiết ARN
Mẫu
Cố định mẫu bằng N2 lỏng
Mẫu mất hoạt tính ezyme
Nghiền với hỗn hợp chất tẩy
Lọc
Dịch Bã ( bỏ đi)
Phenol-chlorofrom
Ly tâm 3000g/10’
Dịch Tủa( bỏ đi)
cho vào ngâm trong dd
ancol 96o + axetat Na 1 M
ở 24oC, trong 24 giờ
Ly tâm 3000g/10’
Tủa ARN Dịch( bỏ đi)
8
Từ ARN thu được được nói trên, tiếp tục tách thành các loại ARN khác nhau
như sau:
Tủa ARN
NaCl 0,3%
Sắc ký cột oligo-T-celluase
mARN hấp thụ trên cột
rARN + Tarn không được hấp thụ
Phản hấp thụ
alcol96oC , ở 20oC, trong 2
giờ
mARN Kết tủa
Ly tâm 3000g/10’
Tủa
Dịch( bỏ đi)

NaCl, 4oC, 2 giờ
Dịch
Ly tâm 3000g/10’
Dịch tARN Tủa rARN
Điện di Điện di
Các loại tARN Các loại rARN
9
PHƯƠNG PHÁP ĐiỆN DI
3
Mục đích: Phân tích định tính và và thu nhận mẫu acid
nucleic
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của acide nucleic nói chung
và nucleotit nói riêng. Chúng đều mang điện tích âm và,
dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ chuyển về cực
dương, tuy nhiên khả năng di chuyển còn phụ thuộc nhiều
yếu tố khác nhau.
Công thức tính khả năng di chuyển:
Log U = Log Uo – Kr.C
Hiện nay có 2 phương pháp điện di: điện di cứng và điện di
ngang
10
Điện di gel agarose
- Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân
tách những đoạn có kích thước 0,5 – 20 kb.
- Điện di theo phương nằm ngang độ phân giải thay đổi khi
nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi.
- Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhận ethydium bromide. Chất
này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acide
và sẽ phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại.
Điện di trên gel agarose của DNA bộ gen tế bào.

11
Điện di trên gel polyarylamide
-
Điện di theo phương thẳng đứng.
Điện di theo phương thẳng đứng.
-
Độ phân giải cao.
Độ phân giải cao.
-
Phương pháp phát hiện : DNA – phóng xạ tự ghi xanh
Phương pháp phát hiện : DNA – phóng xạ tự ghi xanh
methylene , ethydium bromide, protein xanh coomassie,
methylene , ethydium bromide, protein xanh coomassie,
nhuộm nitrate bạc.
nhuộm nitrate bạc.
-
ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotit tổng hợp, xác định
ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotit tổng hợp, xác định
trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần bằng
trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần bằng
nhau, SDS-page ( phân tách protein).
nhau, SDS-page ( phân tách protein).
Độ nhạy của phương pháp nhuộm trên gel polyacrylamide biến tính
6%. Kích thước mỗi giếng là 5mm
2
.
12
PHƯƠNG PHÁP LY TÂM
4
- Ly tâm phân đoạn bằng CsCl là phương pháp đang được sử dụng

phổ biến hiện nay để nghiên cứu nhiều vần đề về acide nucleic.
- Siêu ly tâm trên một gradient liên tục CsCl.trong quá trình ly tâm
dd CsCl đậm đặc sẽ tự động hình thành 1 gradient tỷ trọng tăng dần
từ miệng tới đáy ống. Các nucleotide có tỷ trọng khác nhau sẻ tách
thành các lớp khác nhau trong ống nghiệm.
- Ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp ly tâm trên gradient
saccharose để phân tách một hỗn hợp có kích thước chênh lệch
nhau lớn.
13
14
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
5
Mục đích: tách acide nucleic.
- Sắc ký ái lực trên oli go-T-cellulose để tinh sạch
mARN
- Sắc ký lọc gel dùng để tách các acide nucleic và các
nucleotide tự do sau khi tạo mẫu.
- Sắc ký trao đổi ion trên cột để thu hồi các lượng rất
nhỏ ADN
- Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp có độ phân giải
rất cao được dùng để tinh sạch các oligonucleotide.
15
Tách các chất qua quá trình sắc ký.
16
PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
6
6.1 Khái niệm:
- Lai phân tử là sự bắt cặp trở lại của 2 mạch đơn phân tử
AND trong điều kiện nhiệt độ giảm từ từ, kết hợp với điều kiện
thí nghiệm thích hợp.Nếu trong điều kiện nhiệt độ giảm xuống

đột ngột thì sự bắt cặp không diễn ra.
6.2 Đặc điểm của lai phan tử:
- Đặc hiệu tuyệt đối: là sự bắt cặp chỉ xãy ra giữa 2 mạch có
trình tự hoàn toàn bổ sung nhau.
- Các trình tự bổ sung có thể là AND hoặc ARN dẫn đến sự
hình thành các phân tử AND-AND,ARN-ARN hoặc lai AND-
ARN.
6.3 Các yếu tố ảnh hưởng:
- Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ AND và thời gian phản
ứng, nhiệt độ, độ dài phân tử, lực ion trong môi trường….
17
Southern
blot
Southern
blot
Lai trong
pha rắn
Lai trong
pha rắn
Lai trong
pha lỏng
Lai trong
pha lỏng
Northern
blot
Northern
blot
Dot và slot
blot
Dot và slot

blot
Lai tại
chỗ
Lai tại
chỗ
CÁC KIỂU LAI
PHÂN TỬ
CÁC KIỂU LAI
PHÂN TỬ
18
Sơ đồ của kỷ thuật lai southern blot :
( Phân tích AND bằng kỹ thuật southern blot)
19
Trạng thái của các phân tử trong các pha rắn, lỏng và khí:
20
MẪU DÒ VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU
7
7.1.1 Khái niệm:
Mẫu dò là một bản sao của một trình tự xác định,
được đánh dấu để giúp dễ dàng nhận biết trong kỹ thuật
phân tử.
7.1 Mẫu dò:
7.1.2 Nhưỡng đặc tính cơ bản của mẫu dò:
-
Tính chuyên biệt: Mẫu dò là một bản sao nên chỉ có
thể sử dụng để lai với gel đó.
-
Độ nhạy: Mẫu dò là một phân tử đánh dấu nên ohair
dễ được phát hiện và định lượng.
7.1.3 Các tác nhân đánh dấu mâu dò:

-
Đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ.
-
Đánh dấu bằng phương pháp hóa học.
21
7.2 Các phương pháp đánh dấu.
7.2.1 Phương pháp Nick - translation
Nguyên tắc: sử dụng AND ase I để cắt phân tử AND ở
những vị trí khác nhau để tạo ra những lỗ thũng phân
bố ngẫu nhiên trên cả 2 mạch. Kết quả là tạo ra phân tử
AND được đánh dấu trên suốt chiều đà phân tử.
7.2.2 Phương pháp Random priming ( thiết lập mồi ngẫu
nhiên)
Mô tả phương pháp: Mẫu dò được gây biến tính bằng
nhiệt độ cao, sau đó làm lạnh đột ngột. Sau đó thêm vào
phản ứng 1 hỗn hợp các oligonucleotide nhân tạo.
Kết quả: mạch mới được tổng hợp cũng trở thành mạch
được đánh dấu.
7.2.3 phương pháp đánh dấu các oligonucleitide
Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch
đơn, sau đó được đánh dấu ở dầu 5’ nhờ ezyme T4-
polynucleotide kinase với sự có mặt của một nucleotide
đánh dấu.
22
Kỹ thuật Western blot
8
- Kỹ thuật SDS-PAGE
-Là kỹ thuật điện di trên polyacrylamide gel với
sự có mặt của SDS.
-Cho phép phân tách các phân tử protein có

khối lượng khác nhau.
-SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên
kết với mạch peptide.
-Các phân tử protein chuyển động trong điện
trường từ cực âm sang cực dương.
-Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân
tách riêng biệt các phân tử protein có khối
lượng phân tử khác nhau.
Phản ứng lai kháng nguyên-kháng thể:
- Có tính đặc hiệu rất cao.
- Dùng để phát hiện sự có mặt và tinh sạch protein.
- Kháng thể được sản xuất khi đưa kháng nguyên vào
động vật thí nghiệm và được tinh sạch từ máu động vật
sau khi gây nhiễm.
- Những kháng thể đa dòng có khả năng nhận biết một
số kháng nguyên.
- kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) chỉ tương
tác với một kháng nguyên nhất định.
- Kháng thể được đánh dấu bằng enzyme để phát hiện
protein đặc hiệu thông qua kỹ thuật Western blot
- Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng
nguyên trong kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết
enzyme gọi tắt là ELISA.
24
Kỹ thuật Western blot và ELISA dựa trên phản ứng liên kết kháng
nguyên-kháng thể:
PHƯƠNG PHÁP PCR
8
-Phương pháp PCR (polymerase chain reaction – phản
ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Millin và

cộng sự phát minh năm 1985. Đây là phương pháp tạo
dòng in vitro không cần sự có mặt của tế bào.
-Mục đích phương pháp: Để nhân DNA nhiều lần trong ống
nghiệm.
-Để thực hiện được phương pháp này cần có:
- Phân tử DNA cần nhân lên.
- Hai DNA mồi (primers), mỗi mồi gồm khoảng 20 đôi base,
hai mồi này gắn ở hai đầu của phân tử DNA cần nhân lên:
mồi ngược và mồi xuôi.
- 4 loại nucleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
- Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt
độ cao, enzym này được tách chiết từ loài vi khuẩn
Thermus aquaticus .