Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng của vi khuẩn cố định Nitơ phục vụ cho sản xuất chế phẩm vi sinh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




Ngô Thị Hà


NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH



LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC








Thái Nguyên - 2013
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


Ngô Thị Hà

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60420201


LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS TĂNG THỊ CHÍNH



Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu
1
MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp. Sản xuất nông nghiệp là lĩnh vực
sản xuất quan trọng nhất đối với sự phát triển của Việt Nam. Trong đó trồng
trọt giữ vai trò quan trọng nhất và một trong số những yếu tố gắn liền với
trồng trọt là phân bón nhằm nâng cao năng suất cây trồng cho mùa màng bội
thu. Theo thống kê của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, mỗi năm Việt
Nam sử dụng 2 triệu tấn phân urê, khoảng 600 nghìn tấn phân DAP và một
lƣợng tƣơng đƣơng các loại phân khác [18]. Tuy nhiên theo đánh giá của
Viện Dinh dƣỡng Quốc tế, phân bón chỉ đóng góp khoảng 30 – 35% tổng
trọng lƣợng cây trồng [19]. Do đó, nếu sử dụng phân bón hóa học không hợp
lý sẽ gây ô nhiễm môi trƣờng. Bên cạnh đó, các sản phẩm phân bón vi sinh

cũng có những ƣu điểm nhƣ: thân thiện với môi trƣờng, giúp cân bằng sinh
thái, không nguy hại đối với sức khỏe con ngƣời. Để hƣớng tới một nền nông
nghiệp xanh thân thiện môi trƣờng thì phân bón vi sinh là lựa chọn hàng đầu.
Nhƣng việc áp dụng các sản phẩm phân bón vi sinh vào nông nghiệp vẫn còn
gặp rất nhiều khó khăn: hiệu quả không tức thì, quy mô sản xuất vẫn chƣa đủ
đáp ứng, chất lƣợng sản phẩm chƣa ổn định. Vì vậy, nghiên cứu để hoàn thiện
và nâng cao chất lƣợng phân bón vi sinh là việc làm hết sức cần thiết. Trong
đó, việc tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là khâu đầu
tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm phân bón vi sinh.
Để góp phần phát triển nền nông nghiệp trong nƣớc đồng thời bảo vệ
môi trƣờng và hƣớng tới nghiên cứu loại phân bón cố định đạm tự nhiên, thân
thiện với môi trƣờng, giá thành phải chăng chúng tôi tiến hành thực hiện luận
văn tốt nghiệp với tên đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
lên sinh trưởng của vi khuẩn cố định nitơ tự do phục vụ cho sản xuất chế
phẩm vi sinh”.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
2
Nội dung nghiên cứu:
- Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ từ bộ giống của phòng
Vi sinh vật môi trƣờng.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng (nguồn cacbon, nồng độ
cacbon, nguồn nitơ và nồng độ CaCO
3
) lên khả năng sinh trƣởng và hoạt tính
cố định nitơ của chủng vi khuẩn cố định nitơ tuyển chọn.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy nhƣ nhiệt độ, pH, độ cấp
khí lên khả năng sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn cố
định nitơ tuyển chọn.
- Tiến hành thử nghiệm trên cây trồng trong phòng thí nghiệm.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Ý nghĩa khoa học:
+ Giúp học viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu
khoa học.
+ Biết đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý và
phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo cáo khoa học.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn cố định nitơ có hoạt tính cố định
nitơ cao để sản xuất phân hữu cơ vi sinh.
+ Từ các kết quả ban đầu của đề tài sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu
khoa học tiếp theo.



Số hóa bởi trung tâm học liệu
3
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cƣơng về vi khuẩn cố định nitơ tự do
Cố định nitrogen – đó là khả năng đồng hóa nitơ phân tử của một số vi
sinh vật và dùng nitrogen này để cấu tạo lên tất cả các hợp chất chứa nitrogen
của tế bào. Khả năng này có ở nhiều vi sinh vật sống tự do trong đất và trong
nƣớc: các loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus,
Aerobacter, vi khuẩn dinh dƣỡng quang năng, vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn
khử sulfat, một số Mycobabacterium, Proactinomyces, Actinomyces và nấm,
tảo lam (vi khuẩn lam – ND) v.v Ngoài ra khả năng cố định nitơ còn cả ở vi
khuẩn nốt sần (giống Rhizobium) sống cộng sinh trong rễ cây họ đậu có ý
nghĩa quan trọng nhất đối với việc làm giàu nitơ cho đất. Ngoài vi khuẩn nốt
sần thì các loài trong giống Azotobacter và Clostridium cũng có khả năng cố
định nitơ tự do.[2][3]
1.1.1. Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter)

Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitơ hoạt động nhất.
Trong số các loài Azotobacter đã đƣợc miêu tả thì các loài đƣợc nghiên cứu
nhiều hơn cả là Az. chroococcum, Az. agilis và Az. vinelandii. Az.
chroococcum là loài chủ yếu đối với đất đồng cỏ. Trong ao hồ thƣờng gặp Az.
agilis. Các loài nói trên khác nhau ở đặc điểm sinh trƣởng trên môi trƣờng
đặc, ở kích thƣớc, hình thái tế bào và một số đặc điểm sinh lý học. Az.
chroococcum tạo ra những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc lan, lúc đầu không màu,
sau đó biến thành màu nâu tối, thậm trí đến đen nhƣng không làm nhuộm màu
môi trƣờng khuẩn lạc. Đặc điểm của Az. vinelandii và Az. agilis có khuẩn lạc
trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng – lục hoặc lam – lục, sắc tố
khuếch tán vào môi trƣờng [9][10], [12].
Khi còn non tế bào của Azotobacter có khả năng di động, hình que đầu
tròn, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi, đồng chất, tế bào chất nhuộm màu

Số hóa bởi trung tâm học liệu
4
đồng đều. Chiều dài của tế bào thay đổi từ 2 – 3 μm đến 4 - 6μm. Các tế bào
của Az. agilis có kích thƣớc lớn nhất (5-6μm). Dần các tế bào hình que
chuyển thành hình cầu hay hình bầu dục lớn với đƣờng kính lên tới 4μm, hình
dạng không cố định. Khi có tiêm mao rụng đi và tế bào trở lên bất động, bọc
bao nhầy, tế bào chất xuất hiện cấu tạo dạng hạt, các tế bào tròn có thể phủ
lớp vỏ dày và chuyển thành kén. Hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến
đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của giống và điều kiện phát triển.[25]

Hình1.1. Azotobacter
Tất cả các loài Azotobacter đều sống dị dƣỡng. Để dùng nguồn cacbon,
chúng sử dụng nhiều nguồn hữu cơ khác nhau – monosaccarit, disaccarit, một
số polysaccarit nhiều rƣợu, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả các hợp chất
thơm. Nguồn nitơ đối với Azotobacter không chỉ là nitơ phân tử mà còn là
muối ammon, nitrat, nitrit, aminoaxit. Tùy thuộc vào các hợp chất chứa nitơ

có trong môi trƣờng mà quá trình cố định nitơ trong môi trƣờng sẽ bị ức chế
nhiều hay ít. Azotobacter có nhu cầu lớn đối với photpho và canxi. Để cố định
nitơ phân tử một cách mạnh mẽ chúng cần có molybden và bor. Azotobacter
nhận đƣợc năng lƣợng từ quá trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO
2
và
H
2
O.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
5
Phần lớn Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6 vì vậy không gặp
chúng ở đất chua. Đặc trƣng ở đất chua là loài Az. indicum. Chúng có thể phát
triển trong môi trƣờng có pH bằng 3.
Azotobacter cần có độ ẩm cao hơn so với nhiều vi khuẩn khác, vì vậy ít
gặp chúng ở vùng khô hạn.
Phần lớn các chủng Azotobacter phân lập đƣợc từ thiên nhiên có khả
năng cố định đƣợc trên 10mg N
2
khi tiêu thụ hết 1g các hợp chất cacbon. Một
số chủng Azotobacter trong những điều kiện thích hợp có khả năng đồng hoá
đƣợc đến 300 mg N
2
/1g hợp chất cacbon.
Nhiều nghiên cứu cho biết khi phát triển chung với một số vi khuẩn
khác Azotobacter sẽ có hoạt động cố định nitơ cao hơn so với nuôi cấy riêng
rẽ. Azotobacter sẽ đem một phần nitơ đồng hoá đƣợc đƣa vào môi trƣờng
dƣới dạng NH
4

+
, axit amin hoặc protein.
Sự phát triển và cố định nitơ của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh
hƣởng mật thiết của khu hệ các vi sinh vật đất. Bên cạnh các nhóm vi sinh vật
có ảnh hƣởng tốt đối với sự phát triển của Azotobacter (tổng hợp các chất
hoạt động sinh học, phân giải các thức ăn hữu cơ bền vững) còn có nhiều
nhóm vi sinh vật có khả năng làm ức chế sự phát triển của Azotobacter (cạnh
tranh thức ăn, sản sinh chất kháng sinh,…).
Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ giữa
Azotobacter và cây trồng. Azotobacter thƣờng xuyên có mặt trong vùng rễ cây
trồng với số lƣợng cao hơn nhiều so với ngoài vùng rễ. Số lƣợng của chúng
còn biến đổi phụ thuộc vào từng loại cây, từng giai đoạn phát triển của cây và
nhiều yếu tố sinh thái, địa lý khác. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng
Azotobacter không phát triển trên bề mặt rễ mà phát triển trong đất xung
quanh rễ.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
6
Azotobacter có tác dụng làm tăng nguồn thức ăn nitơ cho cây trồng.
Trung bình khi tiêu thụ hết 1g các chất sinh năng lƣợng, Azotobacter có khả
năng đồng hoá đƣợc khoảng 10-15 mg nitơ phân tử.
Phân bón vi sinh vật Azotobacter có thể đƣợc coi là phân bón vi sinh
vật đƣợc ứng dụng sớm nhất. Sau đó trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa
học đã khám phá ra Azotobacter không chỉ có khả năng cố định nitơ mà còn
có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất kích thích sinh trƣởng thực vật, một
số vitamin và hoạt chất ức chế sự sinh trƣởng của một số vi nấm gây bệnh
vùng rễ ở một số cây trồng.
Sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ tự do từ chủng vi khuẩn
Azotobacter đã đƣợc sản xuất tại Mỹ, Úc Nga và đƣợc sử dụng ở nhiều nơi
trên thế giới và đã mang lại hiệu quả kinh tế xã hội tƣơng đối cao. Ở Việt

Nam, sản phẩm phân bón vi sinh vật chứa vi khuẩn cố định nitơ tự do
(Azotobacter) đã đƣợc khảo nghiệm hiệu lực đối với cây trồng trên đồng
ruộng và đƣợc đƣa vào danh mục các loại phân bón đƣợc phép sử dụng tại
Việt Nam [26].
1.1.2. Vi khuẩn cố định nitơ kỵ khí Clostridium
Nhiều loại thuộc giống Clostridium có khả năng cố định nitơ không
khí: Cl. Pastuerianum, Cl. Butỷium, Cl. Acetobutylicum, Cl. Felsineum
Chúng thuộc một nhóm phân loại, nhƣng khác nhau về đặc điểm hình thái học
và sinh lý sinh hóa học. Cl. Pasteurianum có khả năng đồng hóa nitơ phân tử
mạnh mẽ nhất. Tế bào là loại trực khuẩn khá lớn, dài 1,5 - 8μm và rộng 0,8 –
1,3μm [7, 8]. Đây là nhóm dị dƣỡng hóa năng hữu cơ, các nguồn hữu cơ
chúng sử dụng: monosaccarit, disaccarit, một số polysaccarit nhiều rƣợu, các
axit hữu cơ trong đó bao gồm cả các hợp chất thơm.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
7
1.1.3. Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium
Trong các hệ thống cố định nitơ sinh học, cố định nitơ cộng sinh giữa
vi khuẩn nốt sần (Rhizobium) và cây họ đậu là quan trọng nhất, ƣớc tính đạt
trên 80 triệu tấn mỗi năm, tƣơng đƣơng với lƣợng phân đạm vô cơ trên toàn
thế giới sản xuất năm 1990. Trong hệ thống cố định nitơ sinh học này, mỗi
nốt sần là một nhà máy phân đạm mini, trong đó cây chủ vừa là chỗ trú ngụ
đồng thời cũng là nguồn cung cấp năng lƣợng cho quá trình cố định nitơ của
vi khuẩn và nhận lại lƣợng đạm từ quá trình cố định nitơ để cung cấp cho các
quá trình tổng hợp đạm trong thân, lá, hoa quả.[3]
Vi khuẩn Rhizobium tồn tại trong đất, có thể xâm nhập vào các lông hút
của rễ cây bộ đậu và kích tác tạo thành nốt sần nên còn đƣợc gọi là vi khuẩn
nốt sần. Giữa cây bộ đậu và vi khuẩn nốt sần hình thành mối quan hệ cộng
sinh nghĩa là quan hệ mà cả hai bên đều cần có nhau và dựa vào nhau để phát
triển, trong đó vi khuẩn nốt sần tổng hợp đạm từ nitơ trong không khí cung

cấp cho cây và ngƣợc lại cây trồng cung cấp các dƣỡng chất cần thiết để vi
khuẩn nốt sần tồn tại và sinh trƣởng.[5]
Hình dáng, kích thƣớc, màu sắc và vị trí của nốt sần trên cây rất khác
nhau, phản ánh tình trạng liên kết giữa vi khuẩn nốt sần và hiệu quả cố định
nitơ. Căn cứ vào hiệu quả cố định nitơ, hai loại nốt sần đƣợc phân biệt, đó là
nốt sần hữu hiệu và nốt sần vô hiệu.
Dựa vào số lƣợng, kích thƣớc và màu sắc thịt nốt sần, có thể đánh giá
đƣợc hiệu quả của quá trình cố định nitơ của cây lạc và chủng vi khuẩn tƣơng
ứng. Rễ cây có mật độ nốt sần hữu hiệu cao, chứng tỏ việc sử dụng phân vi
khuẩn nốt sần đã mang lại hiệu quả tốt. Số lƣợng và khối lƣợng nốt sần đƣợc
kiểm tra tốt nhất vào thời kì cây ra hoa rộ. Để đánh giá tác dụng của biện pháp
nhiễm vi khuẩn nốt sần và khả năng nhiễm của vi khuẩn đƣợc bón, cần kiểm
tra nốt sần ở thời kỳ cây 4-5 tuần tuổi.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
8
Vi khuẩn Rhizobium là loại trực khuẩn gram âm không sinh nha bào,
hiếu khí. Kích thƣớc tế bào dao động 0,5-1,2.2,0-3,5, khuẩn lạc thuộc nhóm
S, nhày lồi, màu trắng trong hoặc trắng đục, kích thƣớc khuẩn lạc dao động
2,3-4,5mm sau một tuần nuôi trên môi trƣờng thạch. Vi khuẩn Rhizobium có
tiên mao, có khả năng di động đƣợc, chúng thích hợp ở pH từ 6,5-7,5, nhiệt
độ 25-28
o
C, độ ẩm 50-70%. Khi già có một số loại tạo đƣợc nang xác, khuẩn
lạc sẽ chuyển sang màu nâu nhạt. Vi khuẩn Rhizobium gồm nhiều loài khác
nhau: Rh.leguminosarum, Rh.phaseoli, Rh.trifolii, Rh.japonicum, Rh.meliloti,
Rh.cicer, Rh.simplese, Rh.vigna, Rh.robinii, Rh.lotus,….
1.2. Quá trình cố định nitơ sinh học
Nitơ là nguyên tố trơ khó liên kết hóa học với các nguyên tố khác, nếu
không có chất xúc tác và các điều kiện đặc biệt khác, nó không ngừng bị

chuyển hóa trong một chu trình khép kín do tác động sinh học hay hóa học
khác nhau. Dƣới tác động của hoạt động hóa học hoặc sinh học, nitơ phân tử
chuyển thành đạm vô cơ, sau chuyển thành đạm thực vật hoặc động vật thông
qua quá trình chuyển hóa. Một phần đạm thực vật dƣới dạng tàn dƣ và một
phần đƣợc cây trồng sử dụng, một phần còn lại bị mất do rửa trôi và bay hơi
do hoạt động của vi sinh vật đất có khả năng phân giải đạm. Quá trình mất
đạm chịu ảnh hƣởng lớn bởi các chế độ canh tác.
Nitơ đồng thời cũng là yếu tố dinh dƣỡng vô cùng quan trọng không
chỉ với các sinh vật bậc cao mà cả với các sinh vật nhỏ bé mà mắt thƣờng
không nhìn thấy đƣợc. Trong tự nhiên nitơ phân tử tồn tại dƣới dạng khí
chiếm 78% thể tích không khí[17], song chất nitơ này lại không thể sử dụng
đƣợc làm nguồn dinh dƣỡng cho sinh vật. Để cây trồng có thể sử dụng nguồn
tài nguyên này làm chất dinh dƣỡng, nitơ không khí phải đƣợc chuyển hóa
thông qua quá trình cố định nitơ (cố định đạm), trong đó nitơ phân tử đƣợc
chuyển hóa thành amôni.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
9
Quá trình cố định nitơ có thế xảy ra nhờ các tác nhân vật lý, hóa học
hoặc sinh học, trong đó ngƣời ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm
sinh học vì hiệu quả và tính an toàn của nó đối với môi trƣờng.
Trong một thời gian, cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử là một bí
ẩn đầy hấp dẫn của tự nhiên. Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử
N
2
thành NH
3
có xúc tác của enzym nitrogenaza, khi có mặt của ATP[19]

N

2
+ AH
2
+ ATP NH
3
+ A + ADP + P
Năm 1992 các nhà khoa học đã hoàn thiện đƣợc cơ chế của quá trình cố định
nitơ phân tử nhƣ sau:
N = N NH=NH H
2
N-NH
2
NH
3
N
2
+ 8H
+
+ 8e
-
+ 16 Mg.ATP + 160 2NH
3
+ H
2
+ 16Mg.ADP +
16P
1.3. Đại cƣơng về phân bón vi sinh
1.3.1. Giới thiệu chung về phân bón vi sinh vật
Phân bón vi sinh là chế phẩm, có chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật
sống, có ích cho cây trồng đã đƣợc tuyển chọn, có sức lao động cao. Sử dụng

bón vào đất hoặc xử lý cho cây để cải thiện hoạt động của vi sinh vật trong đất
vùng rễ cây. Phân bón vi sinh giúp tăng cƣờng sự cung cấp các chất dinh
dƣỡng từ đất cho cây trồng, cung cấp chất điều hòa sinh trƣởng, các loại
enzym, vitamin có lợi cho các quá trình chuyển hóa vật chất, cung cấp kháng
sinh để giúp cho cây trồng có khả năng chống chịu các loại sâu bệnh hại, góp
phần nâng cao năng suất, chất lƣợng nông sản và tăng độ màu mỡ của đất [22].
Tại nhiều quốc gia trên thế giới, phân bón vi sinh vật đƣợc hiểu là các sản
phẩm chứa các vi sinh vật tồn tại dƣới dạng tế bào sinh dƣỡng hoặc tiềm sinh
thuộc các nhóm vi sinh vật có khả năng cố định nitơ, phân giải hợp chất
nitrogenaza
nitrogenaza


Số hóa bởi trung tâm học liệu
10
photpho khó tan và sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trƣởng thực vật.
Phân bón vi sinh vật là các sản phẩm, thông qua việc sử dụng chúng các vi
sinh vật chủ định đƣợc nhiễm vào đất và cây trồng. Theo Tiêu chuẩn Việt
Nam năm 1996 (TCVN 6169-1996), phân bón vi sinh vật đƣợc định nghĩa:
"Phân vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa các vi sinh vật sống, đã
đƣợc tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các
hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dƣỡng mà cây trồng có thể sử
dụng đƣợc (N, P, K, S, Fe ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao
năng suất và (hoặc) chất lƣợng nông sản. Phân vi sinh vật phải bảo đảm
không gây ảnh hƣởng xấu đến ngƣ, động, thực vật, môi trƣờng sinh thái và
chất lƣợng nông sản" [23].
Theo định nghĩa nêu trên phân bón vi sinh vật đƣợc hiểu nhƣ sau:
- Phân bón vi sinh vật phải là các sản phẩm chứa các vi sinh vật sống tồn
tại dƣới dạng tế bào sinh dƣỡng hoặc bào tử.
- Vi sinh vật chứa trong phân bón vi sinh vật phải là các vi sinh vật đã

đƣợc tuyển chọn, đánh giá có hoạt tính sinh học, có khả năng sinh trƣởng,
phát triển và thích nghi với điều kiện sống mà ở đó chúng đƣợc sử dụng.
- Mật độ vi sinh vật trong phân bón vi sinh vật là số lƣợng vi sinh vật
trong một đơn vị khối lƣợng hay thể tích. Ở Việt Nam mật độ vi sinh vật có
ích (vi sinh vật sống đã đƣợc tuyển chọn) chứa trong phân bón vi sinh vật
phải đảm bảo từ ≥10
8
CFU/gam (g) hoặc mililit (ml) phân bón vi sinh vật trên
nền cơ chất đã khử trùng hoặc 10
5
-10
6
CFU/g hoặc ml phân bón vi sinh vật
trên nền cơ chất không vô trùng.
- Vi sinh vật chứa trong phân bón vi sinh vật phải là các vi sinh vật có
khả năng tạo nên chất dinh dƣỡng mà cây trồng có thể sử dụng đƣợc từ không
khí, nƣớc, đất cũng nhƣ các nguồn khác nhƣ phân hữu cơ, quặng,…hoặc tạo
nên hoạt chất sinh học mà thông qua tác dụng của các chất này, năng suất và

Số hóa bởi trung tâm học liệu
11
chất lƣợng nông sản đƣợc gia tăng hoặc chỉ góp phần tăng năng suất hay cải
thiện chất lƣợng nông sản.
- Các vi sinh vật chứa trong phân bón vi sinh vật phải là những vi sinh
vật không có phản ứng phụ gây ảnh hƣởng xấu đến sức khoẻ ngƣời, động,
thực vật, môi trƣờng sinh thái và chất lƣợng nông sản.
Bảng 1.1. Danh mục một số giống vi sinh vật đang được sử dụng
trong sản xuất phân bón vi sinh vật ở Việt Nam [24][29]
TT
Giống VSV

Hoạt tính sinh học chính
Số loài sử dụng
trong sản xuất
1
Acetobacter
Cố định nitơ tự do
2
2
Achromobacter
Phân giải hợp chất photpho khó
tan
2
3
Acerobacter
Cố định nitơ tự do
2
4
Agrobacterium
Cố định nitơ tự do/ kích thích
sinh trƣởng thực vật

5
Anthrobacter
Kích thích sinh trƣởng thực vật
2
6
Aspergillus
Phân giải hợp chất photpho khó
tan
2

7
Azospirium
Cố định nitơ hội sinh
2
8
Azotobacter
Cố định nitơ tự do
4
9
Azotomonas
Cố định nitơ tự do
2
10
Bacillus
Cố định nitơ tự do
2
11
Bacillus
Phân giải hợp chất photpho khó
tan
4

Số hóa bởi trung tâm học liệu
12
12
Clostridium
Cố định nitơ tự do
3
13
Chlorobium

Cố định nitơ tự do

14
Frankia
Cố định nitơ cộng sinh

15
Flavobaterium
Kích thích sinh trƣởng thực vật
2
16
Klebsiella
Cố định nitơ tự do
2
17
Mthanobacterium
Cố định nitơ tự do
2
18
Pseudomonas
Cố định nitơ
2
19
Pseudomonas
Phân giải hợp chất photpho khó
tan
4
20
Penicillium
Phân giải hợp chất photpho khó

tan
2
21
Rhizobium/
Bradyrhizobium
Cố định nitơ cộng sinh
300
22
Rhodospirillum
Cố định nitơ
4
23
VaM
Cải tạo đất, kích thích sinh
trƣởng thực vật
6
24
Pisolithus
Cố định nitơ
6
25
Serratia
Phân giải hợp chất photpho khó
tan
2

1.3.2. Lịch sử phát triển của phân bón vi sinh
Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896
và đƣợc đặt tên là Nitragin. Sau đó phát triển sản xuất tại một số nƣớc khác
nhƣ ở Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển

Số hóa bởi trung tâm học liệu
13
(1914). Nitragin là loại phân đƣợc chế tạo bởi vi khuẩn Rhizobium do
Beijerink phân lập năm 1888 và đƣợc Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón
cho các loại cây thích hợp họ đậu. Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công
trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón
vi sinh cố định nitơ, trong thành phần còn đƣợc phối hợp thêm một số vi sinh
vật có ích khác nhƣ một số xạ khuẩn cố định nitơ sống tự do Frankia spp,
Azotobacter spp, các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium,
Pasterium, Beijerinkiaindica, các xạ khuẩn có khả năng giải xenluloza, hoặc
một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ photpho
và kali ở dạng khó hoà tan với số lƣợng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong
các quặng apatit, photphoric v.v chuyển chúng thành dạng dễ hoà tan, cây
trồng có thể hấp thụ đƣợc [25].
Ở Việt Nam, phân VSV cố định đạm cây họ đậu và phân VSV phân
giải lân đã đƣợc nghiên cứu từ năm 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin trên
nền chất mang than bùn mới đƣợc hoàn thiện. Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị
trong cả nƣớc tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật. Các nhà khoa học đã
phân lập đƣợc nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và một số VSV phân giải
lân [25].
1.3.3. Các loại phân bón vi sinh [25]
Phân bón vi sinh vật đƣợc chia thành nhiều dạng khác nhau tùy theo
công nghệ sản xuất, tính năng tác dụng của vi sinh vật chứa trong phân bón
hoặc thành phẩm các chất tạo nên sản phẩm phân bón.
- Phân bón vi sinh cố định nitơ (phân đạm vi sinh)
Nitơ là nguyên tố trơ khó liên kết hoá học với các nguyên tố khác, nếu
không có chất xúc tác và các điều kiện đặc biệt khác, nó không ngừng bị
chuyển hoá trong một chu trình khép kín do các tác động sinh học hay hoá
học khác nhau. Dƣới tác động của các hoạt động hoá học hoặc sinh học, nitơ

Số hóa bởi trung tâm học liệu
14
phân tử đƣợc chuyển hoá thành đạm vô cơ, sau chuyển hoá thành đạm thực
vật hoặc động vật thông qua quá trình đồng hoá. Một phần đạm thực vật dƣới
dạng tàn dƣ thực vật và một phần khác đƣợc ngƣời, động vật thải ra dƣới
dạng phân bã đƣợc trả lại cho đất. Đạm trong đất, một phần đƣợc cây trồng sử
dụng, số còn lại bị mất do thẩm lậu, rửa trôi hoặc bay hơi do hoạt động của
các vi sinh vật đất có khả năng phân giải đạm. Quá trình đất mất đạm chịu ảnh
hƣởng rất lớn bởi các chế độ canh tác.
Trong tự nhiên, nitơ phân tử tồn tại dƣới dạng khí chiếm tới 78,16% thể
tích không khí, song hợp chất nitơ này lại không sử dụng đƣợc làm nguồn
dinh dƣỡng cho vi sinh vật. Để cây trồng có thể sử dụng nguồn tài nguyên này
làm chất dinh dƣỡng, nitơ không khí phải đƣợc chuyển hoá thông qua quá
trình cố định nitơ (cố định đạm), trong đó nitơ phân tử đƣợc chuyển hoá thành
amon. Quá trình cố định nitơ có thể xảy ra nhờ các tác nhân vật lý, hoá học
hoặc sinh học, trong đó ngƣời ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm
sinh học vì hiệu quả và tính an toàn của nó đối với môi trƣờng.
Quá trình cố định đạm sinh học là quá trình đồng hoá nitơ của không
khí dƣới tác dụng của một số nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
enzym Nitrogenaza hay nói cách khác quá trình cố định nitơ phân tử là quá
trình khử N
2
thành NH
3
dƣới xúc tác của enzym nitrogenaza, khi có mặt của
ATP, trong đó nitrogenaza đƣợc cấu tạo bởi hai thành phần: Fe-protein có
trọng lƣợng phân tử lƣợng khoảng 6.10
4
và Mo-Fe-protein có trọng lƣợng

phân tử lƣợng khoảng 2,2.10
5
.
Căn cứ vào đặc điểm của các loại vi sinh vật và mối quan hệ của chúng
đối với cây trồng phân vi sinh vật cố định nitơ đƣợc chia thành các loại sau:
- Phân vi khuẩn nốt sần đƣợc sản xuất từ các chủng Rhizobium
- Phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh sản xuất từ vi khuẩn
Azospirillum

Số hóa bởi trung tâm học liệu
15
- Phân vi sinh vật cố định nitơ tự do từ các vi sinh vật sống tự do có khả
năng cố định nitơ (Azotobacter, Klebsiella, Pseudomonas,…)
- Phân vi sinh vật cố định nitơ từ tảo lam
Giúp ích cho rễ cây thêm đạm cho cây, cộng sinh với cây họ đậu
(papilionoideae) Phân bón vi sinh cố định đạm sống tự do nhƣ phân
Azotobacterin dùng để xử lý hạt giống, làm tăng năng suất 5% đến 10% so
với bình thƣờng. Ngoài ra còn có các vi khuẩn làm cố định đạm nhƣ tảo lam.
- Phân bón vi sinh phân giải hợp chất photpho khó tan (phân lân vi
sinh)
Vi sinh vật phân giải lân, vi sinh vật chuyển hoá lân (Phosphate
Sulubilizing Microorganisms –PSM) hay còn gọi là vi sinh vật huy động lân
(Phosphate mobilizing Microorganisms) là các vi sinh vật có khả năng chuyển
hoá hợp chất photpho khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Các
vi sinh vật phân giải hợp chất photpho khó tan đƣợc biết đến nay là các loài:
Pseudomonas, Micrococus, Bacillus, Flavobacterium, Oenicillium,
Aspergillus. Các vi sinh vật này không chỉ phân giải photphat canxi mà cả
photphat nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cả quặng photphat. Vi sinh
vật phân giải lân không chỉ gồm các vi sinh vật có khả năng chuyển hoá
photphat vô cơ, mà bao gồm các vi sinh vật có khả năng khoáng hoá các hợp

chất lân hữu cơ tạo nguồn lân dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng.
Cơ chế của quá trình phân giải photphat đến nay vẫn chƣa đƣợc hiểu
đầy đủ và còn nhiều tranh cãi. Sản sinh axit hữu cơ có thể là nguyên nhân chủ
yếu, song sinh tổng hợp CO
2
, H
2
S, axit hoặc kiềm cũng là các yếu tố đƣợc
nhiều nhà nghiên cứu đề cập đến. Trƣớc đây ngƣời ta phát hiện thấy nhiều vi
sinh vật trong quá trình phát triển đã làm giảm pH của quá trình nuôi cấy, sau
đó các nhà khoa học đã xác định đƣợc trong dịch nuôi cấy vi sinh vật có chứa
các axit hữu cơ nhƣ axit axetic, lactic, formic, glucolic, oxalic, succinic,
malic, citric,…Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học Liên Xô và Ấn Độ cho

Số hóa bởi trung tâm học liệu
16
thấy, lƣợng lân hữu hiệu trong đất tăng lên nếu đƣợc bón thêm các chất hữu
cơ và humat. Điều đó cho thấy axit hữu cơ sản sinh do vi sinh vật từ các chất
hữu cơ đã giúp cho việc phân giải photphat khó tan. Nghiên cứu đất ngƣời ta
cũng phát hiện các axit hữu cơ tƣơng tự đƣợc sản sinh từ vi sinh vật. Axit làm
giảm pH và qua đó trợ giúp cho việc tạo thành hợp chất bền vững với các
cation Ca
++
, Mg
+
, Fe
+++
, AL
+++
. Hợp chất này bền vững hơn các hợp chất chứa

photpho. Hiện tƣợng này xảy ra tƣơng tự trong việc phòng ngừa sợ cố định
photpho của phân lân vô cơ trong quá trình phong hoá.
Ở Liên Xô, ngƣời ta sử dụng “Phosphobactein”, một sản phẩm chứa vi
khuẩn Bacillus megtherium var.phosphaticum để nâng cao năng suất và chất
lƣợng cây trồng.Tƣơng tự ở Ấn Độ, sản phẩm vi sinh vật phân giải lân cũng
đƣợc nghiên cứu và ứng dụng. Các công trình nghiên cứu trên lúa mì, đại
mạch, ngô, rau quả đều cho thấy cây trồng có phản ứng tích cực với việc tẩm
nhiễm vi sinh vật phân giải lân, làm tăng năng suất và khả năng sử dụng
photpho của cây trồng đồng thời nâng cao chất lƣợng sản phẩm. Theo Gaur
(1992) nhiều kết quả nghiên cứu khoa học đã chứng minh ở Liên Xô năng
suất cây trồng tăng 5-10% và có trƣờng hợp tăng 30% khi sử dụng vi sinh vật
phân giải lân, hiệu quả này ở Ấn Độ tƣơng ứng là 10-20% hoặc tƣơng đƣơng
với bón 50kg P
2
O
5
/ha. Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada và Ấn Độ cho
thấy, vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế 50%-75% lƣợng lân cần bón
bằng quặng photphat có hàm lƣợng P
2
O
5
tổng số tƣơng đƣơng mà năng suất
cây trồng và chất lƣợng nông sản không thay đổi. Ngoài tác dụng phân giải
photphat khó tan, vi sinh vật phân giải lân còn có khả năng sản sinh ra các
chất kích thích sinh trƣởng thực vật giúp cây trồng phát triển và chống chịu
tốt hơn đối với điều kiện bất lợi của ngoại cảnh hoặc sinh tổng hợp chất
kháng sinh góp phần kìm hãm sự sinh trƣởng, phát triển của vi sinh vật gây
bệnh vùng rễ cây trồng [29].

Số hóa bởi trung tâm học liệu
17
Phân vi sinh vật phân giải lân đƣợc nghiên cứu và đƣa vào ứng dụng ở
Việt Nam ngày từ những năm 90 thế kỷ XX, trong đó vi sinh vật phân giải lân
sau khi nhân sinh khối đƣợc tẩm nhiễm vào chất mang, tạo chế phẩm vi sinh
vật phân giải lân hoặc phối trộn với cơ chất hữu cơ tạo thành phần phân lân
hữu cơ vi sinh vật. Hiệu lực của vi sinh vật trong việc cung cấp dinh dƣỡng
lân cho cà phê đƣợc Nguyễn Khả Hoà (1994) trên cơ sở sử dụng đồng vị đánh
dấu 32P, xác định tƣơng đƣơng bằng 34,3 kg P
2
O
5
/ha. Hiệu lực của phân lân
vi sinh đã đƣợc khảo nghiệm, đánh giá ở nhiều địa phƣơng với các đối tƣợng
cây trồng khác nhau cho thấy, phân vi sinh vật phân giải photphat khó tan có
thể nâng cao hiệu quả sử dụng phân lân khoảng 20-30% so với đối chứng,
đồng thời có tác dụng nâng cao năng suất cây trồng 5-15% tuỳ loại đất và cây
trồng. Nhiều thực nghiệm trong khuôn khổ đề tài KHCN 02.06 ở nhiều địa
phƣơng trong cả nƣớc đã xác định việc sử dụng vi sinh vật phân giải lân thay
thế 30-50% lƣợng phân lân cần bón bằng quặng photphorit với hàm lƣợng lân
tổng số tƣơng đƣơng không làm thay đổi năng suất cây trồng và chất lƣợng
nông sản. Sử dụng vi sinh vật phân giải lân có thể tăng 15% năng suất cây
trồng hoặc tiết kiệm 1/3 lƣợng lân cần bón [26][29].
Có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ có chứa lân photpho, phân
giải chất lân khó tan thành lân dễ tan để cây trồng có thể hấp thu đƣợc bình
thƣờng. Phân bón vi sinh vật phân giải lân có tác dụng cung cấp thêm lân (P)
cho cây trồng, kích thích hoạt động của các vi sinh vật khác trong đất, cung
cấp các chất điều hòa sinh trƣởng và nhất là cung cấp các chất kháng sinh
phòng chống sâu bệnh hại cây trồng.
- Phân bón vi sinh phân giải kali

Đây là phân hay chế phẩm có chứa các chủng VSV có khả năng phân
giải các hợp chất chứa kali nhƣ silicat thành các muối kali dễ tan trong cây,
góp phần tăng năng suất và phẩm chất nông sản. Nó còn cung cấp chất điều

Số hóa bởi trung tâm học liệu
18
hòa sinh trƣởng và chất kháng sinh cho cây trồng. Phối hợp với các VSV khác
trong đất để cải thiện tính chất đất.
- Phân bón vi sinh phân giải xenluloza
Đây là loại phân hay chế phẩm có chứa nhiều loại nấm và xạ khuẩn có
khả năng phân giải mạnh chất xenluloza. Có tác dụng chế biến phân rác, ủ
phân chuồng tăng cƣờng quá trình phân giải các xác bã thực vật trong đất
cung cấp các dƣỡng chất dễ tiêu cho cây trồng, cải thiện độ màu mỡ của đất.
- Phân vi sinh vật kích thích, điều hoà sinh trƣởng thực vật
Chứa các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học có
tác dụng điều hòa hoặc kích thích quá trình trao đổi chất của cây.
- Phân vi sinh vật chức năng.
Là một dạng của phân bón vi sinh vật ngoài khả năng tạo nên các chất
dinh dƣỡng cho đất, cây trồng, còn có thể ức chế kìm hãm sự phát sinh, phát
triển của một số bệnh vùng rễ cây trồng do vi khuẩn và vi nấm gây nên.
1.3.4. Một số điểm cần chú ý khi sử dụng phân vi sinh vật [27]
Phân vi sinh vật sản xuất ở nƣớc ta thƣờng có dạng bột màu nâu, đen,
vì phần lớn các nơi sản xuất đã dùng than bùn làm chất độn, chất mang vi
khuẩn.
Phân vi sinh vật sản xuất trong nƣớc thƣờng đƣợc sử dụng bằng cách
trộn với các hạt giống đã đƣợc vảy nƣớc để ẩm hạt trƣớc khi gieo 10 – 20
phút. Nồng độ sử dụng là 100 kg hạt giống trộn với 1 kg phân vi sinh vật.
Các chế phẩm vi sinh vật sản xuất trong nƣớc thƣờng không cất giữ
đƣợc lâu. Thƣờng sau từ 1 đến 6 tháng hoạt tính của các vi sinh vật trong chế
phẩm giảm mạnh. Vì vậy, khi sử dụng cần xem kỹ ngày sản xuất và thời gian

sử dụng đƣợc ghi trên bao bì.
Chế phẩm vi sinh vật là một vật liệu sống, vì vậy nếu cất giữ trong điều
kiện nhiệt độ cao hơn 30
o
C hoặc ở nơi có ánh nắng trực tiếp chiếu vào, thì

Số hóa bởi trung tâm học liệu
19
một số vi sinh vật bị chết. Do đó hiệu quả của chế phẩm bị giảm sút. Cần cất
giữ phân vi sinh vật ở nơi mát và không bị ánh nắng chiếu vào.
Phân vi sinh vật thƣờng chỉ phát huy tác dụng trong những điều kiện
đất đai và khí hậu thích hợp. Thƣờng chúng phát huy tốt ở các chân đất cao,
đối với các loại cây trồng cạn.
Phân bón là các chất hữu cơ hoặc vô cơ chứa các nguyên tố dinh dƣỡng
cần thiết cho cây trồng đƣợc bón vào đất hay hòa nƣớc phun, xử lý hạt giống,
rễ và cây con. Sử dụng phân bón phối hợp cân đối có thể hiểu là sự phối hợp
hài hoà giữa các thành tố trong hệ thống nông nghiệp với kĩ thuật bón phân để
cung cấp cân đối chất dinh dƣỡng cho cây trồng nhằm:
+ Đạt năng suất cây trồng mong muốn
+ Đạt chất lƣợng sản phẩm mong muốn
+ Tăng thu nhập cho ngƣời sản xuất
+ Hồi phục, làm tăng độ phì nhiêu của đất và bảo vệ môi trƣờng sống.
Bón phân cho cây trồng nhằm mang lại hiệu quả lớn, nhƣng cũng
chiếm phần khá cao trong chi phí của sản xuất nông nghiệp. Vậy bón phân
hợp lý vừa tiết kiệm đƣợc chi phí vừa mang lại hiệu quả của việc bón phân.
Bón phân hợp lý tức là sử dụng lƣợng phân bón thích hợp bón cho cây trồng,
đảm bảo tăng năng suất cây trồng với hiệu quả kinh tế cao nhất. Trong quá
trình bón phân, không đƣợc gây hậu quả xấu lên nông sản và môi trƣờng sinh
thái [12][15].
-Bón phân đúng loại: Hiện nay, phân bón có nhiều loại, mỗi loại lại có

những tác dụng riêng. Vậy cây cần phân gì thì bón đúng loại phân đó. Nếu
bón không đúng loại phân thì không những không đạt đƣợc hiệu quả mà còn
gây lãng phí tiền của, công sức. Bón đúng loại phân không chỉ căn cứ vào nhu
cầu của cây mà còn phải căn cứ vào đặc điểm, tính chất của từng loại đất.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
20
Thí dụ: Đất kiềm không nên bón các loại phân có tính kiềm. Đất chua
không bón các loại phân có tính axit.
-Bón phân đúng lúc: Không phải lúc nào, giai đoạn nào cây trồng cũng
cần phân bón. Vậy cần phải dựa vào đặc tính sinh trƣởng của từng loại cây
trồng để bón phân cho đúng lúc. Qua nghiên cứu ngƣời ta nhận thấy có giai
đoạn cây cần đạm hơn kali nhƣng lại có giai đoạn cây cần kali hơn đạm…
Thông thƣờng ngƣời ta bón phân làm nhiều đợt và bón vào lúc cây hoạt
động mạnh. Bón đúng lúc cây cần phân thì lƣợng phân không bị hao hụt mà
lại phát huy tốt hiệu quả.
Bón phân đúng đối tƣợng: Đối tƣợng chính của việc bón phân là cây
trồng. Nhƣng bón phân thế nào, mức độ hiệu quả của nó ra sao, thì không chỉ
quan tâm tới cây trồng, mà còn phải quan tâm tới nhiều vấn đề khác trong đó
có đất.
Đƣợc biết trong đất có vô vàn các loài sinh vật sinh sống. Nhƣng chiếm
số lƣợng lớn về thành phần các loài và số lƣợng các cá thể là các loài vi sinh
vật. Quá trình chu chuyển các chất phần lớn xảy ra trong đất và trên mặt đất.
Tất cả các xác chết của mọi loài sinh vật, kể cả thực vật cũng nhƣ động vật
đều đƣợc vi sinh vật phân huỷ, chuyển hoá qua hàng chuỗi các khâu trung
gian, để cuối cùng trở lại các nguyên tố vô cơ.
Các nguyên tố vô cơ này là chất dinh dƣỡng, là thức ăn cần thiết và tốt
cho cây. Vậy trong trƣờng hợp này thì việc bón phân nhằm vào đối tƣợng là
tập đoàn vi sinh vật. Trong quá trình bón phân nếu không quan tâm tới các
hoạt động sống trong đất sẽ làm thay đổi các tính chất của đất, nhất là các tính

chất sinh học, làm cho số lƣợng các loài sinh vật trong đất giảm, các hoạt
động trong đất suy yếu và có thể dẫn đến sự thoái hoá của đất.
Trong nông nghiệp, có những trƣờng hợp cây trồng sinh trƣởng và phát
triển tốt tạo nên nguồn thức ăn dồi dào cho sâu bệnh tích lũy và gây hại nặng.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
21
Càng bón nhiều phân, cây sinh trƣởng càng mạnh thì sâu bệnh lại phát sinh
nhiều hơn, gây hại nặng hơn. Trong những trƣờng hợp đó thì bón phân cần
nhằm đạt mục đích trên là ngăn ngừa sự tích luỹ và gây hại của sâu bệnh.
Qua các vấn đề nêu trên, chúng ta thấy đối tƣợng tác động của phân
bón không chỉ có cây trồng, tập đoàn vi sinh vật đất, mà còn có cả toàn bộ các
thành tố cấu thành nên hệ sinh thái nông nghiệp. Vậy khi bón phân cần căn cứ
vào nhiểu yếu tố, để đạt đƣợc hiệu quả cao và không gây cản trở cho các hoạt
động về sau.
- Bón phân đúng thời vụ: Thời tiết ảnh hƣởng khá lớn đến hiệu quả của
việc bón phân. Nó thƣờng xảy ra trong hai trƣờng hợp:
+ Bón phân vào ngày có mƣa lớn, nƣớc mƣa sẽ rửa trôi phân bón gây
lãng phí.
+ Bón phân vào ngày nắng gắt, thì nhiệt độ của không khí cùng với sự
tác động của các hạt phân bón có thể làm cháy lá, hỏng hoa, quả…
Cây trồng có nhiều loại, nhiều giống. Có loại một năm trồng 7 – 8 vụ,
có loại một năm chỉ trồng 1 – 2,… Nhu cầu dinh dƣỡng ở các vụ khác nhau,
do vậy cần phải lựa chọn đúng loại phân, dạng phân, thời vụ để bón sao cho
hợp lý và hiệu quả.
-Bón phân đúng cách: Có nhiều phƣơng pháp bón phân: bón vào hố,
bón vảo rãnh, bón rải trên mặt đất…
Có nhiều dạng bón phân: rắc bột, tủ vào gốc, pha với nƣớc để tƣới…
Có nhiều thời kỳ bón phân: bón lót, bón thúc đẻ nhánh, bón thúc ra hoa,
bón thúc đậu quả…

Bón đúng cách vừa thuận lợi vừa giảm sức lao động mà lại đem lại hiệu
quả cao.


Số hóa bởi trung tâm học liệu
22
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn cố định nitơ.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn cố định nitơ trong bộ giống của phòng Vi sinh vật
môi trƣờng, Viện Công nghệ môi trƣờng
2.3 Môi trƣờng sử dụng
Môi trƣờng Ashby (g/l)
- Đƣờng: 20
- KH
2
PO
4
: 0,2
- CaSO
4
: 0,2
- NaCl: 0,2
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2
- CaCO

3
: 5
- Agar: 20
- Nƣớc cất: 1
2.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Tủ sấy (ClassII Biohazard Safety Cabinet – Esco)
- Máy lắc (Shel lab)
- Tủ ấm (Binder)
- Nồi khử trùng (SA – 300VF)
- Máy đo quang phổ khả kiến.
- Cân phân tích.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
23
- Máy đo PH.
- Bếp đun.
- Các dụng cụ thí nghiệm khác nhƣ: ống nghiệm, đĩa pepti, ống đong, ống
pancol, phễu,…
2.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.5.1 Địa điểm nghiên cứu
Phòng vi sinh vật – Viện Công nghệ môi trƣờng – Viện Hàn Lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam
2.5.2 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 07/2012 đến tháng 07/2013
2.6 Phƣơng pháp phân tích
2.6.1 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật
- Phƣơng pháp pha loãng: lấy 1ml dịch mẫu cho vào cho vào ống
nghiệm đựng 9ml dịch nƣớc pha loãng đƣợc nồng độ 10
-1
lắc đều ống

nghiệm. Sau đó cho 1ml ở nồng độ 10
-1
cho vào 9ml dịch nƣớc pha loãng
đƣợc nồng độ 10
-2
lắc đều ống nghiệm. Tiếp tục hút 1ml ở nồng độ 10
-2
cho
vào ống nghiệm tiếp theo đƣợc nồng độ pha loãng 10
-3
. Tiến hành tƣơng tự
nhƣ vậy với các nồng độ pha loãng tiếp theo.
- Chuẩn bị môi trƣờng: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy đƣợc chuẩn bị
là môi trƣờng Ashby. Từ nồng độ pha loãng thích hợp, nhỏ 0,1ml dịch pha
loãng vào môi trƣờng thạch. Tiến hành trang đều mẫu và đƣợc ủ ở 30
0
C trong
24h để cho khuẩn lạc phát triển hoàn thiện. Số lƣợng tế bào đƣợc ƣớc lƣợng
thông qua đếm khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch, mỗi nồng độ pha loãng
đƣợc lặp lại 3 đĩa. Số khuẩn lạc trên đĩa thạch dao động 30-300 khuẩn lạc.
Kết quả chỉ ra rằng số khuẩn lạc hình thành trên ml( CFU/ml)