Nghiên cứu quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợ gỗ (ECHB1) vào bạch đàn urô (EUCALYPTUS UROPHYLLA) thông qua AGROVACTERIUM TUMEFACIENS

Số hóa bởi trung tâm học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


HOÀNG VŨ MINH



NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG
CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URÔ
(EUCALYPTUS UROPHYLLA) THÔNG QUA
AGROVACTERIUM TUMEFACIENS




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC







Số hóa bởi trung tâm học liệu

Thái Nguyên – 2013


Số hóa bởi trung tâm học liệu



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


HOÀNG VŨ MINH


NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG
CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URÔ
(EUCALYPTUS UROPHYLLA) THÔNG QUA
AGROVACTERIUM TUMEFACIENS


Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 0201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ

Số hóa bởi trung tâm học liệu


Thái Nguyên – 2013
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1 3
b (Eucalyptus urophylla) 3
3
4
1.1.3. Giá trị kinh tế 5
1.1.4. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam 6
1.2. EcHB1 và chu trình tổng hợp lignin ở thực vật 7
1.2.1. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật 7
1.2.2. EcHB1 – nhân tố phiên mã làm tăng chiều dài sợi gỗ 14
1.3. Ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật 15
1.3.1. Khái niệm chuyển gen 15
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 16
1.3.3. Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen 21
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1. Vật liệu nghiên cứu 27
2.1.1. Vật liệu 27
2.1.2. Hóa chất, thiết bị sử dụng 27
2.2. Phương pháp nghiên cứu 28
2.2.1. Tạo mẫu bạch đàn sạch in vitro 28
2.2.2. Ảnh hưởng của môi trường và các chất điều hòa sinh trưởng đến
khả năng tái sinh trực tiếp từ mô sẹo 29
2.2.3. Tạo vật liệu trước khi chuyển gen 32
2.2.4. Tạo dịch huyền phù 32
2.2.5. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy 33

Số hóa bởi trung tâm học liệu


2.2.6. Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen 33
2.2.7. Phương pháp tách chiết DNA ở thực vật 33
2.2.8. Phương pháp điện di DNA 35
2.2.9. Kiểm tra sự có mặt cuả gen EcHB1 bằng kỹ thuật PCR 36
2.3. Các công thức sử dụng trong xử lý số liệu 36
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Tạo mẫu bạch đàn urô in vitro 38
3.2. Ảnh hưởng của môi trường và các chất điều hòa sinh trưởng đến khả
năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo 40
3.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin đến khả
năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo 40
3.2.2. Ảnh hưởng của BAP kết hợp với chất điều hòa sinh trưởng nhóm
auxin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo 44
3.2.3. Ảnh hưởng của NAA và IBA tới khả năng ra rễ của chồi 48
3.2.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh 50
3.3. Kết quả chuyển gen EcHB1 vào bạch đàn thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens 51
3.3.1. Tạo dịch huyền phù 51
3.3.2. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy 51
3.3.3. Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Số hóa bởi trung tâm học liệu


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Bích Ngọc - Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện
thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi muốn bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Sơn - Phòng Công nghệ
ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, ủng hộ
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Phương Thảo và KS. Lê Hoàng
Đức - Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã cộng
tác giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn chủ nhiệm đề tài, TS. Trần Hồ Quang đã cho
phép tôi thực hiện một phần nội dung trong đề tài “Nghiên cứu tạo giống bạch
đàn lai biến đổi gen cho sợi gỗ dài” thuộc Chương trình Ứng dụng CNSH
trong Nông nghiệp, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn.
Trong quá trình làm luận văn tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của
toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN
ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm
ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ thuộc cơ sở đào tạo
Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiên cho
tôi hoàn thành khóa học.
Cuối cùng tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn bên tôi
động viện, quan tâm tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày 25 tháng 10 năm 2013

Học viên
Hoàng Vũ Minh


Số hóa bởi trung tâm học liệu




Số hóa bởi trung tâm học liệu


MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
CNSH Công nghệ sinh học
AS Acetosyringone
EST sequencing for Express Sequence Tag
CAD Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase
CCR Cinnamoyl CoA Reductase
BAP Benzyl Amino Purine
Kin Kinetin
IBA Indol-3-Butyric Acid
NAA Naphthyl Acetic Acid
MS Môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962)
LB Môi trường nuôi cấy Luria and Betani
Knop Môi trường Sachs & Knop (1860)
TDZ Thidiazuron
GUS β - Glucuronidase gene
kb kilo base
kDa kilo Dalton
OD Optical density – Mật độ quang học

PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp
NPT neomycin phosphotransferase
HPT hygromycin phosphotransferase
dNTP deoxynucleotide triphosphate



Số hóa bởi trung tâm học liệu


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Nồng độ BAP, kinetin và TDZ trong các công thức môi trường tái sinh
29
Bảng 2.2. Nồng độ BAP, NAA và IBA trong các công thức môi trường tái sinh 30
Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens 32
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR 36
Bảng 3.1. Kết quả tạo mẫu bạch đàn sau 7 ngày nuôi cấy 39
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng cytokinin đến khả năng
tái sinh 40
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và nhóm
auxin đến khả năng tái sinh chồi 45
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của NAA và IBA tới khả năng ra rễ của chồi 49
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo mô sẹo 50
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp 51
Bảng 3.7. Hiệu suất chuyển gen trong thí nghiệm 52



Số hóa bởi trung tâm học liệu

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng thời gian khử trùng với NaOCl 30% đến kết quả tạo
mẫu Bạch đàn sạch in vitro từ phôi hạt. 39
Biều đồ 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi 41
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 42
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 43
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của BAP và TDZ đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp
43
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của BAP và NAA tới khả năng tái sinh 46
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của BAP và IBA tới khả năng tái sinh 47
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của BAP, NAA và IBA đến khả năng tái sinh 47
Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo 50


Số hóa bởi trung tâm học liệu


DANH MỤC HÌNH ẢNH

4
Hình 1.2. Dạng hoa và quả của cây bạch đàn 5
Hình 1.3. Đơn vị cấu trúc của lignin 8
Hình 1.4. Sinh tổng hợp lignin ở thực vật 9
Hình 1.5. Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H(A) và cây không chuyển
gen(B) 13
Hình 1.6. Trình tự gen EcHB1 được tách dòng từ bạch đàn E. camaldulensis
14

Hình 1.7. Sơ đồ Ti-Plasmid 18
Hình 1.8. Quá trình chuyển T-DNA từ A. tumefaciens sang tế bào thực vật . 20
Hình 2.1. Cấu trúc vector pGWB2 chứa gen EcHB1 27
Hình 3.1. Thân mầm tái sinh chồi sau 5 tuần nuôi cấy 44
Hình 3.2. Thân mầm tái sinh sau 6 - 7 tuần nuôi cấy 48
Hình 3.3. Mẫu tái sinh chồi trên môi trường M3 51
Hình 3.4. Kết quả tái sinh và ra rễ. 53
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sảm phẩm. 54



1

Số hóa bởi trung tâm học liệu

MỞ ĐẦU
Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây sau
cellulose, chiếm khoảng 30% lượng cacbon hữu cơ trong sinh quyển và gần
35% lượng vật chất khô trong gỗ của các loài thực vật. Quá trình tổng hợp
lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá trình
tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn. Lignin giữ vai
trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân. Thêm vào
đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh dưỡng thông
qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự chắc
chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các nhân tố gây
bệnh. Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền. Bởi vậy, nó là nguyên liệu
thô tốt cho nhiều ứng dụng trong xây dựng, nội thất.
Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm
lượng lignin cao lại là một trở ngại. Việc phân hủy lignin trong quy trình sản
xuất bột gỗ bằng cách xử lý hóa học là một trong những biện pháp tốn kém

đối với điều kiện kinh tế và môi trường nước ta hiện nay. Vậy làm thế nào để
điều chỉnh được hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong xây
dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa - chống đổ) hay làm giảm/tăng hàm
lượng lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo lợi nhuận cho quá trình sản xuất
giấy/tạo vật liệu gỗ cho xây dựng, tương ứng.
Trong một số ần đây cho thấ EcHB1 vào
cây thuốc lá, sau 6 tuần sinh trưởng tại nhà kính cho thấy chiều dài sợi gỗ của
các dòng thuốc lá được chuyển gen EcHB1 dài hơn 20% và có sinh trưởng về
chiều cao hơn 50% so với đối chứng. Và khi sử dụng kỹ thuật microarray
kiểm tra biểu hiện của các gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
lignin như CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm ở các dòng bạch đàn
chuyển gen EcHB1 (Eucalyptus. grandis x E. urophylla
2

Số hóa bởi trung tâm học liệu

, tạo nguồn nguyên liệu tốt trong
công nghiệp sản xuất giấy.
Hiện nay, công nghệ gen là một trong những giải pháp tạo ra những
bước đột phá về năng suất, chất lượng cũng như tính chống chịu với điều kiện
bất lợi cho các đối tượng cây trồng nông,
ế
Agrobacterium tumefaciens
. Tuy nhiên, hiệu quả biến nạp gen
thông qua Agrobacterium phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn vật liệu
dùng để nuôi cấy, thời gian cảm ứng, khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn, nồng
độ chất chọn lọc, khả năng tái sinh cấy sau biến nạp gen
Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu ứng dụng vào thực tiễn, chúng
tôi thực hiện đề tài :"Nghiên cứu quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ
(EcHB1) vào bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) thông qua Agrobacterium

tumefaciens".
Mục tiêu của đề tài
+ Xây dựng quy trình chuyển gen cho bạch đàn urô thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
+ Tạo được dòng bạch đàn urô chuyển gen (EcHB1) tăng chiều dài sợi
gỗ thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Nội dung nghiên cứu
+ Xác định ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái
sinh của bạch đàn.
3

Số hóa bởi trung tâm học liệu

+ Chuyển gen EcHB1vào thân mầm và lá mầm bạch đàn urô thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
+ Phân tích cây bạch đàn urô chuyển gen EcHB1.
CHƢƠNG 1

1.1. b (Eucalyptus urophylla)
1.1.1.
urô Eucalyptus urophylla (E. urophylla)
thuộc (Myrtales (Myrtaceae
(Eucalyptus) (Hình 1.1).
E. urophylla có phân bố tự nhiên ở một số đảo thuộc phần cực Nam của
quần đảo Santo - Indonesia, bao gồm các đảo: Adonara, Alor, Flores,
Lomblen, Pantar Timor và Wetar. Tại đây E. urophylla xuất hiện theo dải
7
o
30' - 10
o

vĩ độ Nam. Giới hạn phía Đông và phía Tây của vùng phân bố
chưa xác định rõ ràng. Hiện nay người ta chấp nhận vùng phân bố của bạch
đàn này là từ 122 - 127
o
kinh Đông. Trong khu vực phân bố, bạch đàn E.
urophylla sống từ vùng bán sơn địa tới vùng núi, nhưng cũng thấy có hiện
tượng xuất hiện loài này ở vĩ độ thấp.
E. urophylla là loài có phân bố khá đặc biệt và đáng nhớ nhất về độ cao
và nhiệt độ. E. urophylla có phân bố theo độ cao lớn nhất trong các loài Bạch
đàn (79 - 2960 m trên mặt biển). Do thay đổi về độ cao nên biến động về
nhiệt độ cũng vì thế mà thay đổi khá lớn. Trên cùng một đảo với khoảng cách
không thấy xa nhau mà các quần thụ phải thích nghi với điều kiện nhiệt độ rất
khác nhau, từ 27 – 30
o
trên độ cao 400 m xuống 17 - 21
o
trên độ cao 1900 m.
Bạch đàn là nhóm cây được trồng rộng rãi ở nước ta (đặc biệt là các tỉnh
miền Trung và miền Nam). Đây cũng là cây trồng chủ yếu trên các đường nông
thôn, các bờ vùng, bờ thửa ở đồng bằng Bắc Bộ và đồng bằng sông Cửu Long.
Kết quả nghiên cứu và gây trồng nhiều năm qua cho thấy nhiều loài Bạch đàn
4

Số hóa bởi trung tâm học liệu

được nhập vào nước ta chỉ một số loài sinh trưởng nhanh và có khả năng thích
ứng lớn. Trong đó, đáng chú ý là các loài Bạch đàn urô (E. urophylla), Bạch
đàn tero (E. tereticornis) và Bạch đàn caman (E. camaldulensis), Bạch đàn liễu
(E. exserta). Ở những nơi thấp Bạch đàn E. urophylla có thể mọc lẫn với bạch
đàn E. alba [42].

1.1. Cây b
1.1.2.
ô là loài cây gỗ lớn, cao 40-50 m, thân thẳng, màu nâu
vàng, vỏ bong thành mảng, sau khi bong thân khá bóng. Cành non rủ xuống.
Lá đơn mọc cách. Lá hình ngọn giáo, nhọn dần về phía đầu, dài 15-30 cm,
rộng 2-4 cm, màu xanh lục thẫm. Cụm hoa dạng tán ở nách lá, mang 5-8 hoa.
Hoa có cuống nhỏ và ngắn, các cánh đài hợp lại thành nửa hình cầu ở phía
dưới, cánh tràng phía trên hợp lại thành nắp nụ hoa hình nón (operculum) và
nắp nụ hoa được coi là một đặc điểm phân loại của bạch đàn. Quả hình bán
cầu, rộng 0,5-0,7 cm, mở theo 4 van hình tam giác (Hình 1.2).
5

Số hóa bởi trung tâm học liệu


Hình 1.2. Dạng hoa và quả của cây bạch đàn
1.1.3. Giá trị kinh tế
Gỗ bạch đàn có tỷ trọng và độ cứng trung bình, dễ bị cong vênh, được
dùng vào xây dựng, trụ mỏ, nguyên liệu sản xuất giấy và đóng đồ dùng thông
thường. Với công nghệ chế biến hiện đại, gỗ được dùng làm gỗ xẻ, đóng đồ
gỗ xuất khẩu. Cây có tán và thân thẳng, hoa trắng đẹp nên có thể trồng làm
cây bóng mát. Bạch đàn còn dùng để làm ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng và
củi đun.
Trong công nghệ sản xuất giấy trên thế giới bột giấy có hiệu suất cao
chủ yếu được chế tạo bằng các loại gỗ mềm, một phần nhỏ sử dụng các loại
gỗ cứng. Nhưng để phù hợp với Việt Nam, các sản phẩm gỗ cứng như cây
bạch đàn đỏ (Eucalytus robusta), keo tai tượng (Acacia mangium) đã được
đưa vào nghiên cứu để sản xuất bột giấy [54]. Hai loại nguyên liệu này có tỷ
lệ lignin thấp (lignin có ảnh hưởng đến độ cứng của gỗ) nhưng chúng ưa khí

hậu nóng ẩm, đất tính acid, độ phì cao, thoát nước nên rất khó trong việc
trồng để sản xuất. Trong các loại bạch đàn, có bạch đàn urô phát triển rất
nhanh, thích hợp với đất ẩm như Việt Nam nhưng nó lại có lượng lignin cao
hơn so với các bạch đàn khác (không thích hợp cho sản xuất giấy) [7]. Do vậy
lợi dụng đặc tính phát triển mạnh và khả năng thích nghi, nên việc nghiên cứu
đặt ra là làm giảm lượng lignin trong bạch đàn urô để đưa vào sản xuất mang
lại hiệu suất và kinh tế cao.
6

Số hóa bởi trung tâm học liệu

1.1.4. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam
Bạch đàn bao gồm nhiều loài khác nhau và là cây trồng rừng phổ biến
trên thế giới. Ước tính có trên 10 triệu ha bạch đàn được trồng ở châu Á, Nam
Mỹ, Nam Âu, Úc và New Zealand. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla ST.
Blake) và Bạch đàn grandis (E. grandis) thuộc chi phụ Symphyomyrtus, họ
Sim (Myrtaceae), là những loài cây gỗ lớn, mọc nhanh, được trồng nhiều tại
các nước nhiệt đới có nhiệt độ trung bình từ 24 – 28
o
C.
Tại Việt Nam, bạch đàn được trồng tại các tỉnh thuộc vùng Tây Bắc,
Đông Bắc, vùng trung tâm, đồng bằng sông Hồng, Bắc Trung bộ và Tây
Nguyên. Gỗ bạch đàn được dùng làm nguyên liệu giấy (hiệu suất bột giấy
49,5%), ván dăm, ván sợi ép, trụ mỏ, gỗ lớn được dùng trong xây dựng, đóng
đồ mộc; gỗ nhỏ dùng làm gỗ củi. Tỷ trọng gỗ ở năm 6 tuổi là 488 kg m-3
[42], chiều dài sợi gỗ là 982,4 mm (cho phần gỗ mềm) và 110,46 mm (cho
phần gỗ cứng) [35]. Tính đến năm 2001 đã có khoảng 348000 ha bạch đàn
được trồng [2].
Bạch đàn urô là một trong những loài bạch đàn chính được trồng chủ yếu
ở Việt Nam [18]. Có nhiều nghiên cứu về tỷ trọng gỗ, hàm lượng cellulose,

hàm lượng lignin cho bạch đàn urô. Nguyễn Đức Kiên (2009) chỉ ra rằng các
tính trạng sinh trưởng và chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy
cho ngành công nghiệp. Các nghiên cứu đánh giá về sinh trưởng của bạch đàn
urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của bạch đàn tại Việt Nam
chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Braxin [47], [51], [18]. Vì
vậy, các chương trình chọn giống bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào
tăng sinh trưởng, đặc biệt ở các vùng sinh thái suy thoái, nghèo chất dinh
dưỡng, tỷ lệ sinh trưởng của bạch đàn vẫn tồn tại ở dạng sinh trưởng chậm so
với nhiều nước khác. Do vậy, các định hướng nghiên cứu làm tăng hiệu suất
bột giấy và tăng khả năng sinh trưởng của cây bạch đàn tại các vùng sinh thái
7

Số hóa bởi trung tâm học liệu

suy thoái và nghèo chất dinh dưỡng tại Việt Nam đã và đang được quan tâm
nghiên cứu.
1.2. EcHB1 và chu trình tổng hợp lignin ở thực vật
1.2.1. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật
1.2.1.1. Lignin
Lignin được tìm thấy trong hầu hết những cây có mạch. Chúng nằm xen
kẽ giữa các tế bào, bên trong tế bào và trong thành tế bào. Lignin có chức
năng điều khiển sự vận chuyển các chất trong thực vật (một phần tham gia
vào việc giữ vững cho thành tế bào, mặt khác tham gia điều chỉnh sự vận
chuyển của chất lỏng), cho phép cây lớn lên và cạnh tranh để giành ánh sáng
mặt trời.
Trong thiên nhiên, lignin có khả năng chống chịu lại sự thoái hóa và
được gắn kết với nhau một cách phức tạp nhờ những liên kết hóa học bền
vững. Nó thực sự không chỉ là một hợp chất mà bao gồm rất nhiều hợp chất.
Đó là những polymer ba chiều, phức tạp và vô định hình. Chúng có một cấu
trúc chung là một vòng benzen với một đuôi gồm 3 cacbon. Cấu trúc tự nhiên

của lignin quá phức tạp đến nỗi không một cấu trúc nào có thể được mô tả
một cách đầy đủ và ước tính trọng lượng phân tử của chúng khoảng 15000
kDa hoặc nhiều hơn [33].
Lignin là một polyphenol có mạng không gian mở. Thành phần thay đổi
theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu trúc gỗ. Lignin là các
phức hợp dị polymer thơm và hiếm, được tổng hợp từ ba loại đơn phân
hydroxycinnamyl alcohol. Ba loại đơn phân này phân biệt với nhau tùy thuộc
vào mức độ methoxyl hóa, với tên khoa học là: p-coumaryl M1H, coniferyl
M1G và sinapyl M1S alcohol (Hình 1.3) [50].
8

Số hóa bởi trung tâm học liệu


Hình 1.3. Đơn vị cấu trúc của lignin
Từ ba loại đơn phân này, các chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và
syringyl (S) phenylpropanoid được tạo ra. Các chất này sau đó sẽ kết hợp lại
để tạo ra phân tử lignin.
Mặc quá trình sinh tổng hợp các monolignol (đơn phân tạo ra lignin) đã
được xây dựng lại nhiều lần nhưng đến nay nó vẫn còn là vấn đề bàn cãi trong
các nhà khoa học. Tương tự vậy, thì các quá trình khử polymer hóa các
monolignol trong thành tế bào cũng vẫn là những chủ đề đang được nghiên
cứu và thảo luận.
9

Số hóa bởi trung tâm học liệu

1.2.1.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

Hình 1.4. Sinh tổng hợp lignin ở thực vật

Mạch gỗ là thành phần lớn nhất trong cấu tạo thô đại của gỗ nên dễ quan
sát nhất. Ở thực vật tầng xylem là nơi quá trình sinh tổng hợp lignin diễn ra
mạnh nhất [38], do vậy điều khiển hoạt động của các gen trong tầng xylem
với mục đích làm tăng hàm lượng và chất lượng lignin đòi hỏi phải sử dụng
promoter mạnh có khả năng biểu hiện đặc hiệu các gen thuộc tầng xylem.
Năm 1995, Feuillet và cộng sự lần đầu tiên phân lập thành công
promoter của gen mã hóa enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) từ
cây bạch đàn Eucalyptus gunii (EuCAD promoter). Promoter này co chiều dài
khoảng 2,5 kb. Để nghiên cứu hoạt động của promoter, các tác giả đã thiết kế
cấu trúc chuyển gen vào cây bạch dương trong đó gen GUS chịu sự điều
khiển của promoter này. Sau khi phân tích cây chuyển gen, các tác giả nhận
10

Số hóa bởi trung tâm học liệu

thấy rằng gen GUS biểu hiện chủ yếu ở phẩn xylem và các tế bào bó mạch.
Đây là nơi mà sự lignin hóa diễn ra mạnh nhất [35]. Các kết quả của nghiên
cứu này là nguyên liệu rất tốt cho đề tài của chúng tôi.
CAD là enzyme xúc tác cuối cùng trong con đường sinh tổng hợp lignin.
Năm 2002, tác giả Lauvergeat cho rằng sự biểu hiện của promoter EuCAD
trong các tế bào bó mạch là sự bảo tồn và phát triền của những thực vật hạt
kín (Vitis vinifara L.). Hơn nữa, việc loại bỏ một vài đoạn trình tự promoter
để phân tích sự biểu hiện của promoter này đã giúp xác đinh các vị trí cần
thiết ảnh hưởng tới tầng phát sinh gỗ [41].
Năm 2003, tác giả Lu đã tiến hành nghiên cứu sự hoạt động của
promoter GRP1.8 trong đối tượng cây thuốc lá. Kết quả nghiên cứu cho thấy
gen GUS biểu hiện rất mạnh trong tầng xylem của thân. Dựa trên những kết
quả đạt được tác giả đã tiếp tục thực hiện nghiên cứu sự biểu hiện của
promoter GRP1.8 bằng việc sử dụng cấu trúc promoter với gen mục tiêu 4CL1
và cấu trúc này được chuyển thành công vào cây thuốc lá. Kết quả cho thấy gen

4CL1 biểu hiện rất mạnh trong thân. Theo tác giả lượng enzyme 4CL1 tồn tại
trong thân được tạo ra tăng gấp 1 - 2 lần so với cây đối chứng chỉ chuyển gen
4CL1, tuy nhiên sự biểu hiện của gen 4CL1 lại hầu như không có tại các mô
khác như thuốc lá. Điều này càng khẳng định hơn nữa sự biểu hiện đặc hiệu
của promoter GRP1.8 trong tầng xylem của thân [36].
1.2.1.3. Enzyme cinnamoyl CoA reductase và vai trò trong quá trình sinh
tổng hợp lignin
Có thể nói rằng cinnamoyl CoA reductase là một trong hai enzyme quan
trọng ảnh hưởng tới sự hình thành các phân tử monolignol, tiền chất của
lignin, ở thực vật. Trong quá trình này, các phân tử cinnamoyl CoA ester, là
tiền chất của các phân tử monolignol, được hình thành từ chu trình sinh tổng
hợp các phenylpropanoid sau đó được chuyển hóa thành các phân tử
monolignol thông qua các phản ứng được xác tác bởi hai enzyme là
11

Số hóa bởi trung tâm học liệu

cinnamoyl CoA reductase (CCR) và cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD)
[50]. Trong đó CCR xúc tác cho các phản ứng tiêu thụ NAPDH chuyển hóa p-
coumaroyl CoA, feruloyl COA thành các dạng aldehyde tương ứng. Chính vì
CCR xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 3 dạng cơ chất khác nhau nên cho đến
nay các nhà khoa học vẫn đang đặt ra câu hỏi rằng liệu trong cây CCR tồn tại
ở các dạng isoform khác nhau hay chỉ duy nhất một dạng isoform có phổ xúc
tác rông với cả 3 loại cơ chất trên, ví dụ thực vật hạt kín là sinapoyl CoA [28].
Ở cây Arabidopsis các nhà khoa học đã phân lập được hai isoform của CCR
là AtCCR1 và AtCCR2, và tương tự như vậy ở cây ngô là ZmCCR1 và
ZmCCR2, mặc dù khi thực hiện các nghiên cứu chức năng thì chỉ một trong
hai dạng isoform này tham gia vào quá trình lignin. Ngay cả ở cây
Arabidopsis cũng tồn tại khoảng 8 dạng protein có trình tự giống với AtCCR1
với độ tương đồng khoảng 40 - 50%. Ở các loài cây khác như bạch đàn, bạch

dương, thuốc lá, mía đường và cây thông, chỉ duy nhất một gen mã hóa cho
enzyme CCR được xác đinh cho đến thời điểm hiện tại [28]. Do đó nếu ở thực
vật tồn tại các dang isoform khác nhau đặc hiệu cho từng cơ chất ở các dạng
tế bào khác nhau thì có thể các enzyme này được mã hóa bởi các gen tương
đồng rất thấp với CCR, và/hoặc các gen này chỉ được biểu hiện tam thời và
rất khó phát hiện [29].
Năm 1998, Piquemal và cộng sự đã chỉ ra rằng CCR giữ vai trò trong
việc điều tiết nguồn cacbon trong chu trình tổng hợp các loại monolignol.
Chính vì lý do này mà CCR được coi là bước tổng hợp đặc hiệu lignin đầu
tiên trong chu trình phenylpropanoid. Tuy nhiên ở trong tế bào thực vật, các
phân tử monolignol không chỉ dùng cho quá trình sinh tổng hợp lignin mà còn
được dùng để tổng hợp các phân tử lignan và cinnamaldehyde và các sản
phẩm có ngồn gốc monolignol. Hơn nữa, nếu quá trình sinh tổng hợp các
phân tử monolignol được thưc hiện đầy đủ và liên tục như giả thiết, ví dụ như
đối với quá trình đường phân và pentose phosphate, thì CCR sẽ không giữ
12

Số hóa bởi trung tâm học liệu

chức năng điều hòa. Tuy nhiên, ở các dòng cây đột biến làm giảm tối đa hoạt
động của CCR xuất hiện những dấu hiệu bất thường về sinh lý trong quá trình
sinh trưởng và ngay cả hoạt tính enzyme của các bước trong chu trình sinh
tổng hợp monolignol cũng bị giảm. Ví dụ, nếu hoạt tính của CCR bị ức chế
hoàn toàn thì sự tích lũy các phân tử cinnamoyl CoA ester tương ứng sẽ giảm
xuống do nguồn CoA bị giới hạn. Trong khi các phân tử cinnamoyl CoA ester
này sẽ bị giới hạn để tổng hợp nên thành tế bào đang ở trong trạng thái lignin
hóa, nguồn CoA giới hạn cũng sẽ kéo theo những ảnh hưởng đến các quá
trình sinh tổng hợp khác trong tế bào (trừ khi chu trình phenylpropanoid được
thay thế hoàn toàn). Vì vậy có thể xem rằng nguồn cacbon dùng cho chu trình
phenylpropanoid sẽ được sử dụng, hoặc là để tổng hợp phân tử trung gian

(bao gồm các phân tử CoA ester) hoặc là tổng hợp các sản phẩm cuối cùng.
Khi nguồn các phân tử monolignol giảm sẽ dẫn đến sự thay đổi đáng kể bộ
máy bó mạch, tuy nhiên những nhận định này vẫn còn đang được các nhà
khoa học tìm lời giải đáp. Khi chuyển đoạn đối mã (antisense) của gen CCR
vào cây thuốc lá thì các dòng cây chuyển CCR.H (p-coumaryl) gen xuất hiện
những thay đổi bất thường trong quá trình sinh trưởng và phát triển như lá
nhỏ, tròn dạng thìa và mầu sắc tối hơn so với cây không chuyển gen và các
dạng chuyển gen khác. Ở các dòng cây chuyển gen này hàm lượng lignin
cũng giảm đáng kể. Khi quan sát các lát cắt thân cho thấy nhiều yếu tốc mạch
bị đứt gẫy [29].

13

Số hóa bởi trung tâm học liệu


Hình 1.5. Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H(A) và cây không chuyển gen(B)
Thực hiện các thí nghiệm liên quan đến độ bền của thân cũng bị ảnh
hưởng do các thành phần bó mạch bị yếu bởi sự mất cân bằng hàm lượng
lignin. Những kết quả này cũng được khẳng định lại bởi các nghiên cứu trên
dạng đột biến irx4 (thiếu hụt enzyme CCR). Hàm lượng lignin ở các dạng đột
biến này giảm khoảng 50%. Thân cây rất mẫn cảm dưới tác động của các yếu
tố cơ học [41]. Năm 2001, Chabannes và cộng sự chỉ ra rằng khi hoạt tính
CCR giảm (khoảng 3% với dạng ban đầu), thì sự hình thành monolignol giảm
dẫn đến hàm lượng lignin giảm tối đa 50% so với cây không chuyển gen.
Trong đó thành phần giảm chủ yếu là signapyl và coniferyl.
Ở cây bạch đàn, đoạn gen mã hóa cho CCR mới chỉ được xác định đầy
đủ ở cây bạch đàn gunnii (Eucalyptus gunnii) và đã được đăng ký trên cơ sở
dữ liệu NCBI. Năm 2006, các nhà khoa học Pháp công bố tương đối chi tiết
đến hoạt động và chức năng của promoter của gen mã hóa cho enzyme CCR ở

cây bạch đàn. Kết quả chỉ ra rằng gen chỉ thị được điều khiển bởi promoter
này biểu hiện mạnh đặc biệt ở các tế bào đang trong giai đoạn lignin hóa.
Phân tích chi tiết hơn sự biểu hiện của gen mã hóa cho enzyme CCR trên cây
Arabidopsis cũng cho thấy quá trình lignin hóa của các tế bào tầng xylem diễn
ra rất giống nhau ở cả mô xylem sơ cấp và thứ cấp [29].
Những bằng chứng khoa học về vai trò của enzyme CCR đến hàm lượng
lignin và quá trình lignin hóa của các tế bào cho thấy đây là một enzyme quan
14

Số hóa bởi trung tâm học liệu

trong, tiềm năng và có ý nghĩa ứng dụng trong cải tạo giống lâm nghiệp theo
hướng làm tăng hay giảm lượng lignin trong cây.
1.2.2. EcHB1 – nhân tố phiên mã làm tăng chiều dài sợi gỗ
Tại Nhật Bản, Giáo sư Taku Demura (trưởng nhóm nghiên cứu của
RIKEN Bioengineering Research Program) là giáo sư đầu ngành trên thế giới
về lĩnh vực Hệ Phiên mã (Transcriptome) và hiện nay đang làm việc trong
lĩnh vực nghiên cứu quá trình hình thành xylem và gỗ của thực vật. Bằng cách
sử dụng hệ thống tế bào duy nhất của cây cúc và Arabidopsis (là hai loài có sự
biệt hóa tế bào ở tần suất cao), Demura đã phát hiện ra một số gen liên quan
đến quá trình hình thành xylem/gỗ và cuối cùng đã tìm được họ gen mã hóa
cho NAC domain transcription factors liên quan đến sự biệt hóa xylem [31],
[34], [39], [52], [53]. Phối hợp nghiên cứu với công ty giấy Oji, Tetsuya
Sonoda và cộng sự (2009) cũng đã thành công trong việc phân lập gen EcHB1
từ cây bạch đàn trắng (Accession # AB458829) (Hình 1.5).

Hình 1.6. Trình tự gen EcHB1 được tách dòng từ bạch đàn E. camaldulensis
Gen EcHB1 mã hóa nhân tố phiên mã loại II (HD-Zip class II
transcription factor) ở bạch đàn E. camaldulensis. Protein mã hoá bởi EcHB1
thuộc phân họ HD-Zip class II và có thể mang cả homeodomain và

leucinziper motif. Kết quả phân tích RT-PCR cho thấy gen này biểu hiện ở