Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng Baccillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trung bộ cánh cứng

ĐạI HọC THáI NGUYÊN
TRƯờNG ĐạI HọC KHOA HọC




PHùNG HUY TRọNG





NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM SINH HọC
MộT Số CHủNG Baccillus thuringiensis
SINH PROTEIN TINH THể DIệT CÔN TRùNG
Bộ CáNH CứNG






LUậN VĂN THạC Sĩ CÔNG NGHệ SINH HọC






THáI NGUYÊN - 2013

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số
liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố
trong công trình nghiên cứu khác.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013
Tác giả



Phùng Huy Trọng

ii


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc nhiều sự
giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng
cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó.
Trƣớc tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Ngô Đình Bính, ngƣời
thầy đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận
văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS. Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán
bộ phòng Di truyền vi sinh, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, các
giảng viên cùng các thầy cô giáo trƣờng Đại học Khoa học đã nhiệt tình giúp
đỡ tôi trong suốt thời thời gian học tập tại trƣờng và hoàn thành tốt luận văn
của mình.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những ngƣời đã luôn ủng
hộ tôi trong suốt thời gian qua!
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013
Học viên


Phùng Huy Trọng

iii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN v
MỞ ĐẦU 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cƣơng vê Bacillus thuringiensis 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis 3
1.1.2. Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái 5
1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus 6
1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7
1.1.5. Đặc điểm phân loại 8
1.1.6. Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng 13
1.1.7. Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis
14
1.1.8. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis 15
1.1.9. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng 17
1.1.10. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc
19
1.2. Tổng quan về gen cry3, Protein Cry3 và dƣới loài Bacillus thuringiensis

tenebrionis 20
1.2.1. Một số đặc điểm về gen cry3 20
1.2.2. Đặc điểm sinh hóa và huyết thanh học của Bacillus thuringiensis
subsp. tenebrionis 21
1.3. Tổng quan về côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) 22
1.4. Tách dòng gen 26
1.4.1. Khái niệm 26
1.4.2. Vectơ tách dòng 26
iv


PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28
2.1. Vật liệu 28
2.1.1. Sinh phẩm 28
2.1.2. Hoá chất và thiết bị 28
2.1.3. Môi trƣờng 29
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 31
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập 31
2.2.2. Phƣơng pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh 31
2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 32
2.2.4. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn Bt 33
2.2.5. Phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen cry3A 34
2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng gen cry3A 34
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen
cry3A có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh cứng. 38
3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 38
3.1.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis 39
3.2. Kết quả phân loại dƣới loài bằng phƣơng pháp huyết thanh 40
3.3. Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ 41

3.3.1. Xác định nồng độ bào tử 41
3.3.2. Thử hoạt tính sinh học với mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng Bt
phân lập 41
3.4. Sàng lọc gen cry3A ở các chủng Bt bằng phƣơng pháp PCR 43
3.5. Kết quả tách dòng gen và đọc trình tự gen cry3A 44
3.5.1. Kết quả tách dòng gen cry3A 44
3.5.2. Xác định trình tự đoạn gen cry3A 47
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51


v


BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN

STT
Viết tắt
Viết đầy đủ
1
Amp
Ampicillin
2
Bp
Base pair
3
Bt
Bacillus thuringiensis
4
Bt.t

Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis
5
DNA
Deoxyribonucleotide acid
6
E. coli
Escherichia coli
7
EDTA
Ethylene diamine tetra - acetic acid
8
LB
Môi trƣờng Lauria Betani
9
PCR
Polymerase chain reaction
10
SDS
Sodium dodecyl sulphate
11
Sol
Solution
12
TAE
Tris - Acetate - EDTA
13
X- gal
5 - Bromo - 4 Cloro - 3 indolyl ß - d galactoside
14
kDa

Kilo Dalton
15
dH
2
O
Deion water




vi


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào kháng nguyên tiên mao
H 9
Bảng 1.2. Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng 14
Bảng 1.3. Các điểm trình tự tham khảo của vectơ pGEM - T easy 27
Bảng 3.1. Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis trong các mẫu đất 39
Bảng 3.2 Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập 40
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính diệt âú trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành của
các chủng Bt sau 5 ngày thử nghiệm. 42

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis 5

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 6
Hình 1.3. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 18
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của protein Cry3A 21
Hình 1.5. Một số hình ảnh về côn trùng bộ cánh cứng 22
Hình 1.6. Ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành 23
Hình 1.7. Chu kỳ sống và phát triển của mọt thóc đỏ (Tribolium castaneum) . 25
Hình 1.8. Vectơ tách dòng pGEM - T easy 27
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trƣờng
MPA phân lập từ đất Nha Trang nuôi cấy ở 28
0
C sau 3 ngày 38
Hình 3.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập đƣợc khi nhuộm fushin
và soi dƣới kính hiển vi điện tử. 39
Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng ĐNT 9.5 phân lập với type huyết
thanh dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 41
Hình 3.4. Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành của
các chủng Bt phân lập…………………………………………………………43
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% 43
Hình 3.6. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA sau khi nuôi
cấy qua đêm. 44
Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ các dòng khuẩn lạc
ĐNT 9.5 trên agarose 1%. 46
Hình 3.8. Kết quả PCR DNA plasmid các dòng khuẩn lạc của chủng ĐNT 9.5
đã biến nạp băng mồi mồi đặc hiệu gen cry3A 47
Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn gen cry3A của chủng ĐNT9.5 với mã 2 trình
tự có mã số M37207.1 và EU 332160.1 49


1

MỞ ĐẦU

Côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) là bộ đƣợc biết đến với số lƣợng
loài lớn nhất và đã có trên 250.000 loài đã đƣợc mô tả. Trong đó, rất nhiều loài
thuộc bộ cánh cứng là những côn trùng gây hại nhƣ: Anomala, Tenebrio
molitar… Chúng phá hoại mùa màng, nông sản, làm giảm chất lƣợng nông sản
phẩm, và đặc biệt là lƣơng thực sau thu hoạch. Bên cạnh đó có nhiều loài côn
trùng thuộc bộ cánh cứng phá hại lâm sản làm thiệt hại rất lớn cho ngành công
nghiệp sản xuất gỗ: Anobiidae (họ mọt gỗ), Cerambycidae (họ xén tóc),
Bostrychidae (họ mọt dài)… Theo các báo cáo thống kê của nhiều nƣớc trên
thế giới thì côn trùng thuộc bộ cánh cứng đƣợc xếp vào một trong những loài
gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng nhất.
Có rất nhiều biện pháp hoá học và sinh học đƣợc áp dụng để khắc phục
tình trạng trên. Tuy nhiên các biện pháp hoá học lại thƣờng gây ra tính kháng
thuốc trên côn trùng, đồng thời thuốc hoá học còn gây ảnh hƣởng đến sức khỏe
cộng đồng, góp phần làm mất cân bằng sinh thái và ô nhiễm môi trƣờng. Vì
vậy, tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO), tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ
chức Môi trƣờng thế giới đã khuyến cáo hạn chế đến mức tối đa việc sử dụng
các hoá chất và tăng cƣờng sử dụng thuốc trừ sâu sinh học. Trong số các loại
thuốc trừ sâu sinh học đã và đang đƣợc sử dụng thì loại thuốc có nguồn gốc từ
vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là có hiệu quả diệt sâu cao nhất. Hiện nay
thuốc trừ sâu sinh học Bt chiếm hơn 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên
thế giới, và ngày càng đƣợc sử dụng một cách rộng rãi.
Thuốc trừ sâu sinh học Bt có rất nhiều ƣu điểm tuy nhiên nhƣợc điểm
vẫn chƣa khắc phục đƣợc của chế phẩm Bt là có phổ tác dụng hẹp - chỉ đặc
hiệu với một vài loài côn trùng. Bản chất của sự đặc hiệu này là do các gen mã
hóa protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào của vi khuẩn quyết định. Trong
số 70 nhóm gen cry đã đƣợc phát hiện thì gen cry3 là một trong số gen có thể
mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng, một loài côn trùng rất khó

2


tiêu diệt hiện nay. Việc nghiên cứu sâu về gen này là hết sức cần thiết. Xuất
phát từ mục đích này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng Bacillus thuringiensis
sinh protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng”.
Mục tiêu đề tài:
- Tuyển chọn đƣợc các chủng Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis có hoạt
tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành (Tribolium castaneum) cao.
- Xác định đƣợc trình tự gen cry3A từ các chủng Bt subsp. tenebrionis đã tuyển
chọn.
Nhiệm vụ của đề tài:
- Phân lập các chủng Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, mẫu lá ở Nha Trang
và Quảng Nam.
- Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành.
- Phát hiện gen cry3A bằng phƣơng pháp PCR.
- Tách dòng gen cry3A mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng.
- Xác định trình tự đoạn gen cry3A và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen
quốc tế.

3


PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đại cƣơng vê Bacillus thuringiensis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis
1.1.1.1. Trên thế giới
Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)
đƣợc coi là vi khuẩn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi
sinh vật gây bệnh cho côn trùng.
Năm 1870, Louis Pasteur đã phát hiện thấy một loại vi khuẩn gây bệnh ở
tằm và đặt tên là Bacillus bombycos.
Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa tiếp tục nghiên cứu về bệnh
ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi
khuẩn thuộc chi Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto.
Năm 1911, Berliner (ngƣời Đức) đã phân lập đƣợc một loại vi khuẩn gây
bệnh từ xác ấu trùng bƣớm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã
đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915.
Ngay từ những năm 20 của thế kỉ 20, Bt đã đƣợc đƣa vào thử nghiệm
trên đồng ruộng ở Châu Âu: Năm 1920, lần đầu tiên Bt đƣợc sử dụng để sản
xuất chế phẩm sinh học trừ sâu ở Đức. Ở Pháp, năm 1938 Bt đƣợc sử dụng để
diệt sâu hại lúa mỳ. Ở Mỹ, Bt đƣợc sử dụng vào năm 1950.
Năm 1970, các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc rằng Bt có khả năng
diệt đƣợc côn trùng thuộc bộ cánh vảy là do nội độc tố . Cũng chính thời điểm
này, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra chủng Btk HD1
có hoạt tính diệt sâu cao.
Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dƣới loài Bt subsp.

israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Phát hiện này đã
chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy
(Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera).
4


Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại đƣợc nâng lên khi Krieg và cộng sự
phát hiện ra dƣới loài Bt subsp. tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera).
Chủng này đƣợc phân lập từ bộ cánh cứng Tenebrio molitar.
Năm 1985, gen cry của Bt đƣợc chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến
năm 1995 các cây chuyển gen đầu tiên đã đƣợc đƣa vào sản xuất và ứng dụng.
Từ năm 1987-1992, ngƣời ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt
giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ
Hymenoptera.
Năm 1995, cây chuyển gen thƣơng phẩm đầu tiên đƣợc đƣa vào sản xuất,
từ đó mở ra một chƣơng mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp,
cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gen [1].
Năm 2003, Sakai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của Bt diệt tế bào
ung thƣ.
Năm 2005, Ohba M và Binh, N.D. đã phát hiện protein của 4 dƣới loài Bt
phân lập ở Việt Nam chống tế bào ung thƣ cổ tử cung của ngƣời [45].
Trên thế giới từ lúc phát hiện ra vi khuẩn Bt mang gen mã hóa tinh thể
protein diệt côn trùng, đã có rất nhiều nghiên cứu và ngày càng phát hiện ra
nhiều gen cry mới góp phần vào sự đa dạng của ngân hàng gen Bt thế giới.
1.1.1.2. Ở Việt Nam
Việt nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus
thuringensis (Bt) các nhà khoa học Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành tựu trong
nghiên cứu, sản xuất và đƣa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời
sống, góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho ngành nông, lâm nghiệp.

Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu Bt đƣợc ứng dụng đầu tiên tại Viện bảo vệ
thực vật năm 1971.
Năm 1973, Nguyễn Công Bình và cộng sự lần đầu tiên nghiên cứu sản
xuất chế phẩm Bt phòng thí nghiệm bằng phƣơng pháp lên men trên mấy lắc và
có chế phẩm diệt sâu rất tốt.
5


Năm 1973-1976, Bt đƣợc sản xuất chủ yếu trên môi trƣờng đặc với giá
thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác nhƣ: Bã khô lạc, bột
đậu tƣơng, bột cá, Các chủng sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này có nguồn gốc
chủ yếu từ Trung Quốc. Các chế phẩm này đã đƣợc sử dụng cho vùng trồng rau
ở ngoại thành Hà Nội và đã thu đƣợc các kết quả tốt đẹp. Năm 1982, Viện
Công nghiệp Thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phƣơng pháp lên men
chìm với dung tích nồi lên men là 5 m
3
.
Từ năm 1984-1993, việc sản xuất chế phẩm Bt đã giảm sút bởi vì các chế
phẩm Bt sản xuất ra có chất lƣợng không cao do vậy tốc độ tiêu thụ giảm.
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt đƣợc mở rộng hơn.
Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt nhƣ: Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công
nghiệp Thực phẩm Tuy vậy cho tới nay ở nƣớc ta vẫn chƣa có cơ sở sản xuất
thuốc trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp.
1.1.2. Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái
Bacillus thuringensis (Bt) là vi khuẩn đất, có khả năng diệt côn trùng,
đƣợc xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes.
Tế bào có dạng hình que, có kích thƣớc 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc
tạo thành chuỗi. Vi khuẩn Bt hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, bắt
màu Gram dƣơng, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế

bào.

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis
6


Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn
lạc nhăn, đƣờng kính có thể đạt tới 8-10 m. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn
lạc dạng trơn nhẵn.
Mỗi tế bào Bt khi trƣởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc
có bản chất protein có khả năng diệt côn trùng. Bào tử có dạng hình trụ hoặc
hình trứng, kích thƣớc 1,6-2 m. Bào tử đƣợc hình thành trong điều kiện môi
trƣờng bất lợi nhƣ nhiệt độ cao, môi trƣờng nghèo chất dinh dƣỡng… Khi gặp
điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dƣỡng.
Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng đƣợc tổng
hợp. Tinh thể có kích thƣớc 0,6-2 m, có hình dạng không cố định có thể là
hình lập phƣơng, hình lƣỡng tháp hoặc hình cầu. Tinh thể có thể chiếm tới 30%
trọng lƣợng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và
quan sát dƣới kính hiển vi nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử
thì bắt màu hồng nhạt [1, 3, 4].

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus
Các loài thuộc nhóm B. cereus gồm B. cereus, B. thuringiensis, B.
anthracis, B. mycoides, B. megaterium. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B.
weihenstephanensis và B. pseudomycoides [19]. Việc sinh ra protein tinh
thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là
một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại
Bào tử
Tinh thể

7


Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus
Đặc điểm
Bc
Bt
Bmy
Ba
Bme
Nhuộm Gram
+
(a)

+
+
+
+
Phản ứng catalase
+
+
+
+
+
Khả năng chuyển động
+/-
(b)

+/-
-

(c)

-
+/-
Phản ứng khử nitrate
+
+/
+
+
-
(d)

Phân hủy tyrosine
+
+
+/-
-
(d)

+/-
Kháng lysozyme
+
+
+
+
-
Phản ứng với lòng đỏ
trứng
+
+

+
+
-
Lên men glucose kị khí
+
+
+
+
-
Phản ứng V-P
+
+
+
+
-
Sinh Axít từ mannitol
-
-
-
-
+
Làm tan huyết
+
+
+
-
(d)

-
Sinh protein tinh thể

-
+
-
-
-
Chú thích:
a
+: 90-100% số chủng phản ứng dƣơng tính

b
+/-: 50-50% số chủng phản ứng dƣơng tính
c
-: 90-100% số chủng phản ứng âm tính
d
-: hầu hết các chủng phản ứng âm tính
Bc: Bacillus cereus
Bt: Bacillus thuringiensis
Bmy: Bacillus mycoides
Ba: Bacillus anthracis
Bme: Bacillus megaterium

1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Bt không lên men sinh axit trong môi trƣờng có chứa đƣờng arrabinose,
xylose, manitol, nhƣng tạo axit ở môi trƣờng có chứa đƣờng glucose. Có khả
năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển đƣợc ở môi trƣờng có
chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng
gà. Không có khả năng khử amin của phenylalamin, không sử dụng axit citric,
không khử muối sulphate.
8

Bt có khả năng sinh trƣởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45
0
C.
Nhiệt độ tối ƣu là 28 - 30
0
C. Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ƣu cho
sự phát triển của Bt là pH = 7. Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit
hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden - Meyerhoff - Panas [1].
1.1.5. Đặc điểm phân loại
Có rất nhiều phƣơng pháp phân loại Bacillus thuringiensis khác nhau.
- Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa
- Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên - H.
- Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các
thực khuẩn thể khác nhau.
- Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể.
- Phân loại theo loại hình enzyme lipase.
- Phân loại theo nguồn bệnh.
Tuy nhiên, các phƣơng pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn
chế. Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra một phƣơng pháp phân loại mới
cho Bt bằng phản ứng huyết thanh, mô tả 27 type huyết thanh chính có hoạt
tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động
vật, động vật chân khớp,… Phƣơng pháp phân loại theo type huyết thanh H
đƣợc sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. Phƣơng pháp phân
loại này, dựa trên phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi
khuẩn với kháng huyết thanh tƣơng ứng. Số lƣợng các type huyết thanh và các
chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập
đƣợc. Cho đến năm 2003, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 69 type huyết thanh bao
gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bacillus thuringiensis. Dƣới đây là bảng
phân loại theo type huyết thanh H đƣợc trung tâm quốc tế Bacillus

thuringiensis đặt tại viện Pasteur ở Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các
phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 [2].
9


Bảng 1.1. Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào
kháng nguyên tiên mao H
Kháng
nguyên H
Thứ huyết
thanh
Code
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu
1
Thuringiensis
THU
Berliner 1915; Heimpel & Angus 1958
2
Finitimus
FIN
Heimpel & Angus 1958
3a, 3c
Alesti
ALE
Toumanoff & Vago 195; Heimpel & Angus
1958
3a, 3b, 3c
Kurstaki
KUR
de Barjac & Lemille 1970

3a, 3d
Sumiyoshiensis
SUM
Ohba & Aizawa 1989
3a, 3d, 3e
Fukuokaensis
FUK
Ohba & Aizawa 1989
4a, 4b
Sotto
SOT
Ishiwata 1905 ; Heimpel & Angus 1958
4a, 4c
Kenyae
KEN
Bonnefoi & de Barjac 1963
5a, 5b
Galleriae
GAL
Shvetsova 1959; de Barjac & Bonnefoi
1962
5a, 5c
Canadensis
CAN
de Barjac & Bonnefoi 1972
6
Entomocidus
ENT
Heimpel & Angus 1958
7

Aizawai
AIZ
Bonnefoi & de Barjac 1963
8a, 8b
Morrisoni
MOR
Bonnefoi & de Barjac 1963
8a, 8c
Ostriniae
OST
Ren et al. 1975
8b, 8d
Nigeriensis
NIG
Weiser & Prasertphon 1984
9
Tolworthi
TOL
Norris 1964; de Barjac & Bonnefoi 1968
10a, 10b
Darmstadiensis
DAR
Krieg de Barjac & Bonnefoi 1968
10a, 10c
Londrina
LON
Arantes et al. (Không công bố)
10

Kháng
nguyên H
Thứ huyết
thanh
Code
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu
11a, 11b
Toumanoffi
TOU
Krieg 1969
11a, 11c
Kyushuensis
KYU
Ohba & Aizawa 1979
12
Thompsoni
THO
de Barjac & Thompson 1970
13
Pakistani
PAK
de Barjac, Cosmao Dumanoir, Shaik &
Viviani 1977
14
Israelensis
ISR
de Barjac 1978
15
Dakota
DAK

De Lucca, Simonson & Larson 1979
16
Indiana
IND
De Lucca, Simonson & Larson 1979
17
Tohokuensis
TOH
Ohba, Aizawa & Shimizu 1981
18a, 18b
kumamotoensis
KUM
Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981
18a, 18c
Yosoo
YOS
Lee, H. H et al. 1995
19
Tochigiensis
TOC
Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981
20a, 20b
Yunnanensis
YUN
Wan-Yu, Qi-Fang, Xue-Ping & You-Wei
1979
20a, 20c
pondicheriensis
PON
Rajagopalan et al. (Không công bố)

21
Colmeri
COL
De Lucca, Palmgren & de Barjac 1984
22
shandongiensis
SHA
Wang Ying et al. 1986
23
Japonensis
JAP
Ohba & Aizawa 1986
24a, 24b
Neoleonensis
NEO
Rodriguez-Padilla et al. 1988
24a, 24c
Novosibirsk
NOV
Burtseva, Kalmikova et al. 1995
25
Coreanensis
COR
Lee H. H et al. 1994
11


Kháng
nguyên H
Thứ huyết

thanh
Code
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu
26
Silo
SIL
de Barjac and Lecadet (Không công bố)
27
Mexicanensis
MEX
Rodriguez-Padilla and Galan-Wong (Không
công bố)
28a, 28b
Monterrey
MON
Rodriguez-Padilla et al. (Không công bố)
28a, 28c
Jegathesan
JEG
Seleena, Lee, H. L. & Lecadet 1995
29
Amagiensis
AMA
Ohba (Không công bố)
30
Medellin
MED
Orduz, Rojas, Correa, Montoya & de Barjac
1992
31

Toguchini
TOG
Hodirev (Không công bố)
32
Cameroun
CAM
Jacquemard 1990; Juarez-Perez et al. 1994
33
Leesis
LEE
Lee H. H et al. 1994
34
Konkukian
KON
Lee H. H et al. 1994
35
Seoulensis
SEO
Lee H. H et al. 1995
36
Malaysiensis
MAL
Ho (Không công bố)
37
andaluciensis
AND
Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez
1996
38
Oswaldocruzi

OSW
Rabinovitch et al. 1995
39
Brasiliensis
BRA
Rabinovitch et al. 1995
40
Huazhongensis
HUA
Dai Jingyuan et al. 1996
41
Sooncheon
SOO
Lee H. H et al. 1995
42
Jinghongiensis
JIN
Li Rong Sen et al. (in press)
12


Kháng
nguyên H
Thứ huyết
thanh
Code
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu
43
Guiyangiensis
GUI

Li Rong Sen et al. (in press)
44
Higo
HIG
Ohba et al. 1995
45
Roskildiensis
ROS
Hinrinschen, Hansen and Daamgaard
(Không công bố)
46
Chanpaisis
CHA
Chanpaisaeng (Không công bố)
47
Wratislaviensis
WRA
Lonc et al. 1997
48
Balearica
BAL
Caballero et al. (Không công bố)
49
Muju
MUJ
Seung Hwan Park et al.(Không công bố)
50
Navarrensis
NAV
Caballero et al. (Không công bố)

51
Xiaguangiensis
XIA
Jian Ping Yan (Không công bố)
52
Kim
KIM
Kim et al. (Không công bố)
53
Asturiensis
AST
Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez
1996
54
Poloniensis
POL
Damgaard et al. (Không công bố)
55
palmanyolensis
PAL
Santiago-Alvarez et al. (Không công bố )
56
Rongseni
RON
Li Rong Sen (in press)
57
Pirenaica
PIR
Caballero et al. (Không công bố)
58

Argentinensis
ARG
Campos-Dias et al. (Không công bố)
59
Iberica
IBE
Caballero et al. (Không công bố)
60
Pingluonsis
PIN
Li Rong Sen (in press)
13


Kháng
nguyên H
Thứ huyết
thanh
Code
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu
61
Sylvestriensis
SYL
Damgaard (Không công bố)
62
Zhaodongensis
ZHA
Li Rong Sen (in press)
63
Bolivia

BOL
Ferrộ-Manzanero et al. (Không công bố)
64
Azorensis
AZO
Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)
65
Pulsiensis
PUL
Khalique F. and Khalique A. (Không công
bố)
66
Graciosensis
GRA
Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)
67
Vazensis
VAZ
Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)
68
Thailandensis
THA
Chanpaisaeng et al. (Không công bố)
69
Pahangi
PAH
Seleena and Lee H. L. (Không công bố)

1.1.6. Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng
Kích thƣớc hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng 2,4 -

5,7 triệu bp. Trên thế giới ngƣời ta đã mô tả đƣợc bản đồ cấu trúc gen tự nhiên
của một số chủng Bacillus thuringiensis [10]. Hầu hết các chủng Bacillus
thuringiensis phân lập mang nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST), các
nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng [11]. Trong một
thời gian dài ngƣời ta cho rằng các protein tinh thể đƣợc mã hóa chung trên các
plasmid lớn. Khi sử dụng kĩ thuật lai DNA với các mẫu dò cho gen cry đã nhận
thấy chúng xuất hiện cả trên NST [12].
Từ những năm đầu thập kỉ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại
của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu ở các loài phụ Bt khác nhau. Các
phƣơng pháp xử lí plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng
14


minh rằng các gen mã hóa protein diệt côn trùng thƣờng nằm trên các plasmid
lớn có hệ số copy thấp. Theo điều tra của Carlton và Gonzalez thì plasmid có
mặt trong hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis số lƣợng plasmid dao động
từ 2 đến 12 trong các chủng nghiên cứu [13, 14]. Các thí nghiệm lai gen đã
cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen tổng hợp nhiều độc tố trong một tế
bào Bacillus thuringiensis.
1.1.7. Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ Bacillus
thuringiensis
Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, Bacillus thuringiensis có khả
năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (Crystal δ - endotoxin)
đƣợc mã hóa bởi các gen cry khác nhau, Cyt (Cytolysin) mã hóa bởi các gen
cyt và Vip (Vegetative insecticidal Protein) đƣợc mã hóa bởi các gen vip khác
nhau.
1.1.7.1. Gen cry
Gen cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau. Đây là gen độc tố quan
trọng nhất của vi khuẩn Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc
mà nó tạo ra. Tính đến năm 2013 thì ngƣời ta đã phát hiện đƣợc hơn 610 gen

cry khác nhau thuộc về 70 nhóm (từ cry1 - cry72). Mỗi nhóm gen lại có những
đặc điểm và đặc tính khác nhau [44].
Bảng 1.2. Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng
Gen
Hình dạng tinh
thể
Trọng lƣợng phân
tử protein (kDa)
Hoạt tính diệt côn trùng
cry1A - 1M

Lƣỡng tháp
130 - 138
Cánh vảy Lepidoptera
cry2A -cry2C
Cầu
69 - 71
Cánh vảy Lepidoptera/
Hai cánh Diptera
cry3A -cry3C
Lập phƣơng
73 - 74
Cánh cứng Coleoptera
cry4A-cry4D
Cầu
73 - 134
Hai cánh Diptera
cry5A-cry5E
Lƣỡng tháp
81

Nematode
cry8
Lập phƣơng
130
Cánh cứng
Các gen cry
còn lại
Đa dạng
35 - 129
Đa dạng
15


1.1.7.2. Gen cyt
Gen cyt mã hóa cho các độc tố Cyt cũng có bản chất protein và hình
thành thể vùi nhƣ độc tố gen cry, nhƣng tính tƣơng đồng axit amin giữa 2 độc
tố là không đáng kể.
Gen cyt bao gồm 45 gen thuộc 3 nhóm cyt khác nhau mã hóa protein gây
độc với côn trùng và động vật không xƣơng sống [44]. Nhóm gen cyt mã hóa
protein 27 kDa và có trong thể vùi lớn nhất (chiếm khoảng 40 - 50% tinh thể).
1.1.7.3. Gen vip
Gen vip mã hóa cho các độc tố Vip (Vegetative insecticidal protein). Độc
tố Vip đƣợc Estruch và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm 1996 bao gồm
Vip3A và Vip3B [1].
Độc tố Vip đã thu hút đƣợc sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học do
khả năng diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chƣa phát
hiện đƣợc côn trùng kháng độc tố này.
Theo thống kê của Neil Crickmore năm 2013 thì có 105 gen vip thuộc 4
nhóm khác nhau từ vip1- vip4 [44], gen vip3A mã hóa protein 88 kDa, protein
này có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon, Spodoptera

fugipera, Spodoptera exigua. Khi côn trùng mẫn cảm do ăn phải độc tố, Vip3A
là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa.
1.1.8. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis
Bt có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố.
Ngoại độc tố  ( - exotoxin)
Ngoại độc tố  ( - exotoxin)
Ngoại độc tố  ( - exotoxin)
Nội độc tố  ( - endotoxin)
Trong đó nội độc tố  có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất.
16


1.1.8.1. Ngoại độc tố 
Có khối lƣợng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong
nƣớc, tích tụ trong pha logarit của một vài loài phụ và đƣợc giải phóng ra môi
trƣờng khi tế bào tan rã.
Ngoại độc tố  có bản chất là một enzyme gọi là photpholipase hoặc
leucithinase, có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá. Tác dụng độc của ngoại
độc tố  có liên quan tới sự phân huỷ photpholipid ở mô của côn trùng. Nghiên
cứu này đƣợc phát hiện bởi Toumanoff năm 1953.
1.1.8.2.Ngoại độc tố 
Có trọng lƣợng phân tử thấp 707 - 850 kDa, là độc tố bền nhiệt, tan
trong nƣớc. Ngoại độc tố  có tác dụng kìm hãm nuclease và RNA-polymease
dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA. Ngoại độc tố  có phổ hoạt tính rộng, có
hoạt tính với côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ cánh cứng và côn
trùng thuộc bộ hai cánh.
Qua nghiên cứu Brian Federici và Dongwu cũng nhận thấy rằng chế
phẩm Bt nếu chỉ sử dụng ngoại độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20%
trong khi đó nếu bổ sung thêm nội độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng
lên tới 75%.

1.1.8.3. Ngoại độc tố 
Có trọng lƣợng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không
khí, có khả năng tan trong nƣớc. Độc tố này thuộc nhóm photpholipase, có tác
dụng lên photpholipid và giải phóng ra axit béo, rất mẫn cảm với nhiệt độ, ở
nhiệt độ từ 60
0
C trở lên trong vòng từ 10 - 15 phút đã bị vô hoạt.
1.1.8.4. Nội độc tố 
Có bản chất là một protein gồm 1180 gốc axit amin, các axit amin chủ
yếu là glutamine, asparagine, chiếm trên 20% tổng số axit amin trong phân tử
protein, đây cũng là một nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp. Lƣợng
cysteine nhỏ hơn 20% tổng axit amin quy định sự không hoà tan của tinh thể,
ngoài ra còn có các axit amin: Arginine, threonine, leucine, isoleucine.
17


Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác nhƣ: hydratcacbon,
tuy nhiên cũng có thể hydratcacbon chỉ là thành phần phụ đƣợc pha tạp trong
quá trình hình thành bào tử. Xét về thành phần hoá học thì nội độc tố  chứa
chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một
lƣợng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn. Tuy nhiên nguyên tố P hầu nhƣ không có.
Nội độc tố  có đặc điểm không hoà tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ
tan trong môi trƣờng có pH kiềm, không tan trong nƣớc, rất bền nhiệt. Khi đun
ở 65
0
C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 100
0
C trong 30 - 40
phút thì tinh thể bị mất tính độc. Mặc dù tinh thể độc có thể tan ở pH kiềm,
nhƣng không phải pH kiềm nào cũng thích hợp. Qua nghiên cứu ngƣời ta nhận

thấy rằng, pH quá cao hay quá thấp cũng đều ảnh hƣởng tới độc tính của tinh
thể. Tuy nhiên lúc mới tách ra khỏi bào tử, nó có thể hoà tan trong pH rất kiềm.
Sự tổng hợp tinh thể độc và bào tử xảy ra gần nhƣ đồng thời trong khoảng 3 giờ
sau pha cân bằng.
1.1.9. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng
Cơ chế tác động của protein tinh thể của Bacillus thuringiensis liên quan
tới sự hoà tan của tinh thể trong ruột giữa của côn trùng. Các tinh thể độc đều
đƣợc bắt nguồn từ một protein có khối lƣợng phân tử lớn khoảng 130-140 kDa,
đƣợc gọi là “tiền độc tố”. Tiền độc tố này phải đƣợc hoạt hoá thì mới gây ra
tính độc. Trong những điều kiện bình thƣờng thì protein tinh thể không bị hoà
tan, do vậy nó rất an toàn với ngƣời và động vật bậc cao. Tuy nhiên trong môi
trƣờng pH cao (khoảng 9,5), protein tinh thể sẽ bị hoà tan. Môi trƣờng pH này
thƣờng thấy trong ruột giữa của ấu trùng thuộc bộ cánh vảy. Với lý do này, Bt
đƣợc xem là một tác nhân diệt côn trùng có tính đặc hiệu cao [16].
Tinh thể độc gây độc lên côn trùng thông qua con đƣờng tiêu hoá. Nhờ
có hệ Enzyme protease và môi trƣờng pH kiềm ở ruột giữa của côn trùng mà
tinh thể độc sẽ bị hoà tan. Quá trình hoà tan này phụ thuộc vào pH của môi
trƣờng và thành phần cấu tạo của tinh thể. Khi tan nó sẽ tạo ra các mảnh độc có
khối lƣợng phân tử nhỏ. Các mảnh độc này sẽ gắn với các thụ thể có ở trên
màng biểu mô của tế bào ruột làm thủng tế bào. Kết quả là ruột bị tê liệt, ấu