Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus Monodon).

B GIÁO DC VÀ ÀO TO
IăHCăTHỄIăNGUYểN





HOẨNGăTHăTHUăYN



NGHIểNăCUăCăIMăCUăTRÚCă
MTăSăGENăTHUCăHăMINăDCHăTỌMăSÚă
(PENAEUS MONODON)






LUNăỄNăTINăSăSINHăHC

THÁI NGUYÊN - 2012


ii
LIăCAMăOAN
Tôi xin cam đoan tâ t ca các kt qu nghiên c u trong lun án là trung thc và
cha tng đc công b trong bt k công trình nào khác. Nê u sai tôi xin chi u tra ch
nhiê m hoa n toa n.

2
Tácăgiălun án


HoƠngăThăThuăYn


iii
MCăLC
LI CM N i
LIăCAMăOAN ii
MC LC iii
DANH MC CÁC KÝ HIU VÀ CÁC CH VIT TT vi
DANH MC CÁC BNG viii
DANH MC CÁC HÌNH ix
M U 1
1. t vn đ 1
2. Mc tiêu nghiên cu 2

3. Ni dung nghiên cu 2
Chng 1. TNG QUAN TÀI LIU 3
1.1. Tôm sú và các bnh thng gp  tôm sú 3
1.1.1. Gii thiu v tôm sú 3
1.1.2. Tình hình nuôi va di ch bê nh tôm sú  Viê t Nam 5
1.1.3. Các bnh thng gp  tôm sú 7
1.1.4. Phng pha p phòng và tr bnh  tôm sú 12
1.2. H min dch tôm sú 14
1.2.1. áp ng min dch t bào 15
1.2.2. áp ng min dch dch th 21
1.3. Nghiên c u gen va tiê m nng  ng du ng trong pho ng tri bê nh cho tôm su 23
1.3.1. Tình hình nghiên cu genome tôm sú trên th gii 23
1.3.2. Nghiên cu gen liên quan đê n kha nng miê n di ch  tôm su 24
1.3.3. Tiê m nng ng du ng cu a gen liên quan đê n miê n dich trong pho ng
tr bnh  tôm su 28
Chng 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP 32
2.1. Vt liu 32
2.1.1. Thu thp mu 32


iv
2.1.2. Hóa cht 32
2.1.3. Thit b 34
2.1.4. Các vi sinh vt đc s dng trong nghiên cu 34
2.2. Phng pháp nghiên cu 35
2.2.1. Tách chit RNA tng s 36
2.2.2. Tinh sch mRNA 37
2.2.3. Tng hp cDNA 38
2.2.4. Thit k mi phân lp mt s gen (cDNA) la chn 41
2.2.5. Khuch đi gen bng phn ng PCR 48

2.2.6. Tinh sch sn phm PCR 49
2.2.7. To dòng phân t sn phm PCR 49
2.2.8. Xác đnh trình t gen (cDNA) 50
2.2.9. Biu hin gen ALFPm3 50
2.2.10. Phân tích d liu trình t và x lý s liu 55
2.3. a đim nghiên cu 55
Chng 3. KT QU VÀ THO LUN 56
3.1. Rab7 - protein liên quan đê n c chê xâm nhiê m cu a virus 56
3.1.1. To dòng gen Rab7 t mu tôm sú Vit Nam 56
3.1.2. Xác đnh và phân tích trình t gen Rab7 58
3.2. Syntenin - protein liên quan đn con đ ng dâ n truyê n ti n hiê u 61
3.2.1. Phân lâ p đon 5‟-syntenin t mu tôm sú Vit Nam 62
3.2.2. To dòng gen syntenin hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 64
3.2.3. Xác đnh và phân tích trình t gen syntenin 65
3.3. Hemocyanin - protein có hot tính phenoloxidase 68
3.3.1. Phân lp đon 5‟-hemocyanin t mu tôm sú Vit Nam 69
3.3.2. To dòng gen hemocyanin hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 72
3.3.3. Phân tích trình t gen hemoccyanin 74
3.4. Ran - protein điê u khiê n th c ba o 76
3.4.1. To dòng mt phn đon gen Ran t mu tôm sú Vit Nam 77


v
3.4.2. Phân lp đon gen 3‟ và 5‟-Ran 78
3.4.3. To dòng gen Ran hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 82
3.4.4. Xác đnh và phân tích trình t gen Ran 83
3.5. Caspase - protein tham gia va o c chê apoptosis 84
3.5.1. To dòng gen caspase t mu tôm sú Vit Nam 85
3.5.2. Xác đnh và phân tích trình t gen caspase 86
3.6. H thng các protein kháng khun, kháng nm và kháng virus 90

3.6.1. Protein kha ng virus PmAV 90
3.6.2. Peptide kha ng khuâ n t ng t crustin (crustin - like antimicrobial
peptide) 94
3.6.3. Yê u tô kha ng khuâ n (ALF - antiliposaccharide factor) 99
3.7. Biê u hiê n yê u tô kha ng khuâ n tái t hp (rALFPm3) 105
3.7.1. To cu trúc vector biu hin gen 105
3.7.2. Xác đnh cu trúc gen ALFPm3 đc chuyn vào genome nm men 108
3.7.3. Xác đnh đon peptide ALFPm3 đc biu hin 109
3.7.4. Phân tích hot tính ca rALFPm3 111
KT LUN VÀ KIN NGH 113
1. Kt lun 113
2. Kin ngh 114
CỄCăCỌNGăTRỊNHăẩăCỌNGăB LIểNăQUANăN LUN ÁN 115
TÀI LIU THAM KHO
PH LC


vi
DANHăMCăCỄCăKụăHIUăVẨăCỄCăCHăVITăTT
Tăvitătt
NghaătingăVit
NghaătingăAnh
5‟UTR
Vùng 5‟ không dch mã
5‟ Untranslated region
3‟UTR
Vùng 3‟ không dch mã
3‟ Untranslated region
AAP
Mi neo

Abridged anchor primer
AFLP
a hình chiu dài DNA đc
khuch đi
Amplified fragment length
polymorphism
ALF
Yu t kháng khun
Anti-lipopolisaccharide factor
ALFPm
ALF dng 1  tôm sú
Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus
monodon isorform 1
ALFPm3
ALF dng 3  tôm sú
Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus
monodon isorform 3
AMP
Peptide kháng khun
Antimicrobial peptide
apoptosis
T bào cht theo chng trình
Programmed cell death
bp
Cp base
Base pair
B.megaterium
Bacillus megaterium
Bacillus megaterium
cDNA

DNA bô sung
Complement DNA
DP
Mi suy din
Degenerate primer
DNA
Axit deoxyribonucelic
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
Hn hp các nucleotide (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP)
Deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTPs
Hn hp các deoxynicleotide
(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
Dideoxyribonucleoside triphosphate
dsRNA
RNA si kép
Double stranded RNA
DEPC
Cht kh Rnase
Diethyl pyrocarbonate
E. aerogenes
Vi khun Enterobacter aerogenes
Enterobacter aerogenes
E. coli
Vi khun Escherichia coli
Escherichia coli
EDTA
Axit ethylenediaminetetraacetic

Ethylenediaminetetraacetic acid
EST
on trình t gen biu hin
Expressed sequence tag
GSP
Mi đc hiu gen
Gene specific primer


vii
kb
Kb
Kilo base
LB
Môi trng LB
Luria Bertani
mtDNA
DNA ty th
Mitochondrial DNA
mRNA
RNA thông tin
Messenger RNA
OD
Mt đ quang
Optical density
ORF
Khung đc m
Open reading frame
PCR
Phn ng chui polymerase

Polymerase chain reaction
PmAV
Gen kha ng virus  tôm su
Penaeus monodon antivrus
PmRab7
Rab7  tôm sú
Penaeus monodon Rab7
P. pastoris
Nm men Pichia pastoris
Pichia pastoris
3‟RACE
Khuch đi nhanh đu 3‟ cDNA
Rapid amplification of cDNA 3' ends
5‟RACE
Khuch đi nhanh đu 5‟ cDNA
Rapid amplification of cDNA 5' ends
rALFPm3
ALF tái t hp  tôm sú dng 3 t
tôm sú
Recombinant anti-lipopolisaccharide
factor Penaeus monodon 3
RNA
Axit ribonucleic
Ribonucleic acid
RNAi
RNA can thip
RNA interference
RNase
Enzyme phân hy RNA
Ribonuclease

RT
Enzyme phiên mã ngc
Reverse transcriptase
RT-PCR
PCR bng enzyme phiên mã ngc
Reverse transcriptase-PCR
siRNA
RNA can thip nh
Small interfering RNA
SNP
a hình các nucleotide đn
Single-nucleotide polymorphism
SSC
Dung di ch Natri citrate
Solution sodium citrate
TSV
Virus gây hi chng taura
Taura syndrome virus
UAP
Mi khuch đi chung
Universal amplication primer
UPM
Hn hp mi chung
Universal primer mix
v/p
vòng/phút
rotor/minute
WSSV
Virus gây bnh đm trng
White spot syndrome virus

YHV
Virus gây bnh đu vàng
Yellow head virus
YP
Môi trng YP
Yeast peptone
YPD
Môi trng YPD
Yeast peptone dextrose


viii
DANHăMCăCỄCăBNG


Bng 1.1. Thô ng kê ca c gen liên quan đê n hê miê n dich  tôm 26
Bng 2.1. Các thit b s dng trong nghiên cu 34
Bng 2.2. Trình t các mi s dng trong nghiên cu 47




ix
DANHăMCăCỄCăHỊNH

Hình 1.1. Hình nh tôm sú 3
Hình 1.2. Tôm sú nhim WSSV 10
Hình 1.3. Tôm sú nhim YHV 12
Hình 1.4. Tê ba o ma u tôm su 17
Hình 1.5. H thng hot hóa proPO và tng hp melanin 19

Hình 1.6. C ch đông máu  tôm 21
Hình 2.1. S đ phân lp gen 35
Hình 2.2. S đ thit k mi t gen đã bit trình t 42
Hình 2.3. S đ thit k mi t gen đã bit mt phn trình t đu 3‟ (Invitrogen) 42
Hình 2.4. S đ thit k mi t gen đã bit mt phn trình t đu 3‟ (Clontech) 43
Hình 2.5. S đ thit k mi khi bit mt phn trình t đu 5‟ ca gen 43
Hình 2.6. S đ thit k mi phân lp gen syntenin 44
Hình 2.7. S đ thit k mi phân lp gen hemocyanin 44
Hình 2.8. S đ thit k mi phân lp gen Ran 45
Hình 2.9. S đ thit k mi đ phân lp gen hoàn toàn mi  tôm sú 46
Hình 2.10. S đ thit mi khuch đi đon gen mã hóa peptide ALFPm3
trng thành 46
Hình 2.11. S đ biu hin ALFPm3 51
Hình 3.1. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen Rab7 57
Hình 3.2. Trình t gen và amino acid suy din ca Rab7 58
Hình 3.3. So sánh trình t nucleotide  gen Rab7 ca tôm sú Vit Nam vi
trình t đã công b 59
Hình 3.4. Mô phng cu trúc bc hai và phân tích các motif chc nng ca
protein Rab7 60
Hình 3.5. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon 5‟-syntenin 62
Hình 3.6. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca đon 5‟-syntenin 63
Hình 3.7. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen syntenin 64


x
Hình 3.8. Trình t gen và amino acid suy din ca syntenin 66
Hình 3.9. So sánh trình t amino acid ca protein syntenin gia các loài khác nhau 67
Hình 3.10. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon 5‟-hemocyanin 70
Hình 3.11. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca đon 5‟-hemocyanin 71
Hình 3.12. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen hemocyanin 72

Hình 3.13. Trình t gen và amino acid suy din ca hemocyanin 73
Hình 3.14. So sánh trình t amino acid ca protein hemocyanin gia các loài 75
Hình 3.15. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng mt phn đon
gen Ran 77
Hình 3.16. Trình t nucleotide và amino acid đon gen Ran 78
Hình 3.17. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon gen 3‟-Ran 79
Hình 3.18. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon gen 5‟-Ran 80
Hình 3.19. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca gen Ran 81
Hình 3.20. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen Ran 82
Hình 3.21. So sánh trình t amino acid ca protein Ran gia các loài khác nhau 83
Hình 3.22. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen caspase 86
Hình 3.23. Trình t nucleotide và amino acid ca caspase 87
Hình 3.24. So sánh trình t nucleotide ca gen caspase ca tôm sú Vit Nam

vi trình t đã công b 88
Hình 3.25. So sánh trình t amino acid suy din ca protein caspase tôm sú
vi các loài tôm khác nhau 90
Hình 3.26. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen PmAV 92
Hình 3.27. Trình t gen và amino acid suy din ca protein PmAV 93
Hình 3.28. So sánh trình t amino acid ca protein PmAV 94
Hình 3.29. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen mã hóa
peptide kha ng khuâ n tng t crustin 96
Hình 3.30. Trình t gen và amino acid suy din ca gen mã hóa peptide
kháng khun tng t crustin 96


xi
Hình 3.31. So sánh trình t amino acid ca peptide kha ng khuâ n t ng t
crustin  tôm 98
Hình 3.32. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen ALF 100

Hình 3.33. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca ALFPm 101
Hình 3.34. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca ALFPm3 102
Hình 3.35. So sánh trình t nucleotide ca gen ALFPm  tôm sú Vit Nam
vi trình t đã công b 102
Hình 3.36. So sánh trình t nucleotide ca gen ALFPm3  tôm sú Vit Nam
vi trình t đã công b 103
Hình 3.37. So sánh amino acid suy din ALF nhóm I 104
Hình 3.38. Mô hình cu trúc biu hin cDNA ca ALFPm3 106
Hình 3.39. Hình nh đin di to cu trúc biu hin gen ALFPm3 107
Hình 3.40. Xác đnh gen ALFPm3 trong genome nm men  các dòng nm men 108
Hình 3.41. OD
600nm
t bào nm men P. pastoris bin đi qua các ngày cm
ng biu hin 109
Hình 3.42. Hình nh đin di phân đon protein dch nuôi các dòng nm men
tái t hp sau 1 ngày cm ng biu hin 110
Hình 3.43. Hình nh đin di phân đon protein dch nuôi các dòng nm men
tái t hp sau 2 ngày cm ng biu hin 110
Hình 3.44. Hot tính ca rALFPm3 đi vi chng B. megaterium 111
Hình 3.45. Hot tính ca rALFPm3 đi vi chng E. aerogenes 112



1
MăU
1. tăvnăđ
Tôm sú là đng vt thy sn dùng làm thc phm mang li li nhun ln nh
xut khu ti nhiu nc trên th gii, trong đó có Vit Nam. Nhng nm đu thp
niên 90 ca th k XX, cùng vi s phát trin ca ngh nuôi tôm công nghip, “dch
bnh”  tôm cng bt đu xut hin và lan rng khp th gii. Tác nhân gây bnh

chính phi k đn là vi khun và virus. Hin nay, các nghiên cu cho thy vic gim
sút sn lng tôm nuôi liên quan đn bnh vi khun thng do các vi khun
thuc chi Vibrio spp. Trong đó, loài gây bnh ph bin nht là vi khun phát sáng
V. harvey. Các tác nhân gây bnh do virus bao gm virus gây bnh đu vàng
(Yellow head virus - YHV), virus gây bnh đm trng (White spot syndrome virus -
WSSV)… đc xem là các tác nhân gây bnh nghiêm trng nht và làm thit hi
đáng k đn ngh nuôi tôm.
Cho đn nay, nhng hiu bit c bn v s điu khin sinh trng, sinh sn và
đc bit là h thng min dch  tôm sú còn rt hn ch do thiu nhng thông tin v
genome và s biu hin gen ca chúng. Kích thc genome tôm sú là rt ln (khong
trên 2 t cp base = 2/3 b gen ngi), nên vic gii mã toàn b genome tôm sú đòi
hi nhiu thi gian và chi phí ln, c tính hàng chc triu đô la. Vì vy, mt trong
nhng hng nghiên cu đ c l a cho n là lp bn đ di truyn liên kt genome tôm
sú, lp bn đ di truyn t DNA v tinh, phân tích trình t đy đ genome ty th
(mtDNA), lp bn đ gen tôm sú bng gii mã EST/cDNA, nghiên cu và phân tích
các đon trình t gen biu hin (Express sequence tag - EST), la chn các ch th
phân t phc v công tác chn ging, nghiên cu cu trúc và chc nng ca các gen
liên quan.
Tôm sú không có h thng đáp ng min dch thích ng thc s (adaptive
immune system), thay vào đó chúng phát trin h thng bo v c th khác đc gi
là min dch t nhiên (innate immunity). Nhng nghiên cu v phn ng t bào và
dch th  tôm khi b nhim vi khun, virus đã đc các nhà khoa hc rt quan tâm,
đc bit là xác đnh và phân tích đc đim ca các gen tham gia vào quá trình đáp
ng min dch. Vic phát trin và ng dng rng rãi Công ngh sinh hc trong lnh
vc thy sn đa đóng vai trò quan trng trong gii thích các quá trình phát sinh


2
mm bnh, phát trin các phng thc chn đoán và phòng nga, nhm duy trì s
n đnh ca ngh nuôi tôm, kim soát hu qu dch bnh, hn ch thit hi do dch

bnh  tôm nuôi. Hin nay, đ x lỦ tác nhân gây bnh là vi khun, thuc kháng
sinh và hóa cht là phng pháp chính đc s dng. Tuy nhiên, hn ch ca
phng pháp này là chi phí mua thuc ln, tn d kháng sinh có th đe da đn sc
khe cng đng, nh hng đn môi trng, đng thi xut hin các mm bnh
kháng thuc và chúng có th lây nhim cho con ngi. Mt khác, đi vi các dch
bnh do virus khi đã xy ra thì cha có bin pháp nào tr bnh. n nay, nhng đáp
ng min dch ca tôm đi vi ngun bnh virus vn cha đc sáng t. Do đó,
vic nghiên cu c ch min dch ca tôm  mc đ phân t là cn thit đ đa ra
các gii pháp đúng đn trong phòng tr bnh cho tôm.
Trong nhng nm gn đây,  Vit Nam đã bc đu có các nghiên cu nhm
nâng cao cht lng ging và kim soát dch bnh  tôm. Các nghiên cu tp trung
phát hin bnh tôm và đa ra gii pháp phòng bnh cho tôm. Ngoài ra, mt vài cu
trúc protein tái t hp ca WSSV đã đc to ra trong pho ng thi nghiê m nhm mc
đích nghiên cu phòng tr bnh cho tôm. Tuy nhiên, các công trình nghiên cu v các
gen liên quan đn h min dch tôm sú còn ít đc bit đn. Do đó, đ góp phn làm
sáng t c ch phân t đáp ng min dch và to nguyên liu cho nghiên cu phòng
tr bnh  tôm sú, chúng tôi tin hành thc hin đ tài: “Nghiên cu đc đim cu
trúc mt s gen thuc h min dch tôm sú (Penaeus monodon)”.
2. Mcătiêuănghiênăcu
- Phân lp và xác đnh đc trình t mt s gen la chn liên quan đn h
min dch tôm sú, to vt liu nghiên cu góp phn làm sáng t c ch đáp ng
min dch và gii pháp trong phòng tr bnh cho tôm sú;
- Bc đu nghiên cu to peptide kháng khun rALFPm3.
3. Niădungănghiênăcu
- Phân lp mt s gen la chn liên quan đn h min dch tôm sú đc tin
hành theo 3 hng: các gen đã có thông tin trình t đc công b; các gen ch có
mt phn thông tin trình t; gen cha có thông tin v trình t.
- Thit k vector mang gen mã hóa peptide kháng khun, biu hin trong
nm men và bc đu phân tích hot tính ca peptide tái t hp.

3
Chng 1.ăTNGăQUANăTẨIăLIU
1.1. TỌMăSÚăVẨăCỄCăBNHăTHNGăGPăăTỌMăSÚ
1.1.1.ăGiiăthiuăvătômăsú
Tôm sú có tên khoa hc là Penaeus monodon do Fabricius mô t và đt tên
nm 1798. Ngoài ra, loài tôm này còn đc gi vi tên đa phng là tôm rong [11].
Tôm sú là mt trong s các loài tôm nuôi quan trng thuc h Penaeidae và đc
phân loi nh sau [38].
Gii: Animalia
Ngành: Arthropoda
Ngành ph: Crustatacea
Lp: Malacostraca
B: Decapoda
B ph: Natantia
Siêu h: Penaeoidea
H: Penaeidae
Chi: Penaeus
Loài: monodon
C th tôm sú có màu xanh đm, có nhng vân sc t trng đen  các đt
bng. Phn còn li ca thân bin đi t màu nâu sang màu xanh hoc đ (Hình 1.1).
Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thc ln (có th lên đn 330 mm
hoc ln hn v chiu dài c th) và là loài tôm thng mi quan trng [209].

Hình 1.1. Hình nh tôm sú [14]


4
Tôm sú có ngun gc t n  Dng, phía Tây Nam Thái Bình Dng và
đc nuôi ch yu  các nc châu Á [174]. Loài tôm này sng  ni cht đáy bùn

pha cát vi đ sâu t ven b đn 40m nc và đ mn t 5 - 34
0
/
00
. Tôm sú có kh
nng sinh trng nhanh, trong 3 - 4 tháng có th đt c trung bình 40 - 50 g. Tôm sú
trng thành ti đa đi vi con cái có chiu dài t 220 - 250 mm, trng lng đt t
100 - 300 g, con đc dài t 160 - 200 mm, trng lng đt t 80 - 200 g. Tôm sú có
tính n tp, thc n a thích là tht các loài nhuyn th, giun nhiu t và giáp xác.
V mt phân b,  nc ta tôm sú phân b t Bc vào Nam, t ven b đn vùng có
đ sâu 40 m, vùng phân b chính là vùng bin các tnh Trung b [11].
Tôm sú là loài giáp xác có v kitin bao bc bên ngoài c th nên s phát
trin ca chúng mang tính gián đon và đc trng bi s gia tng đt ngt v kích
thc và khi lng. Sau mi ln lt xác, c th tôm sú tng nhanh v kích thc.
Quá trình này tùy thuc vào môi trng nc, điu kin dinh dng và giai đon
phát trin ca cá th. Tôm sú thuc loài d hình phái tính, con cái có kích thc ln
hn con đc  cùng đ tui. Có th phân bit con đc và cái thông qua hình dng c
quan sinh dc bên ngoài. Tui thành thc sinh dc ca tôm đc và tôm cái trong t
nhiên là t tháng th tám tr đi [11].
Trong t nhiên, tôm sú sng trong môi trng nc mn, sinh trng ti
mùa sinh sn chúng tin vào gn b đ trng. Tôm cái đ trng nhiu hay ít là ph
thuc vào cht lng ca bung trng và trng lng ca c th. Sau khi trng
đc đ 14 - 15 gi,  nhit đ 27 - 28
0
C s n thành u trùng. u trùng theo các
làn sóng bin dt vào các vùng nc l. Trong môi trng này, u trùng (larvae)
tin sang thi k hu u trùng (postlarvae) ri tôm giô ng (juvenile) và bi ra bin,
tip tc chu trình sinh tr ng, phát trin và sinh sn ca chúng.  mi giai đon
trong chu k sinh trng, tôm phân b  nhng thy vc khác nhau nh vùng ca
sông, vùng bin ven b hay vùng bin khi và có tính sng trôi ni hay sng đáy

[11], [145], [174].
Tht tôm sú là mt loi thc phm thy sn rt có li cho sc khe con ngi
và đc a thích trên th gii cng nh  Vit Nam. Thc phm t tôm rt tt cho


5
sc khe do cha các protein nng lng thp, ít cht béo, có hàm lng selenium,
amino acid cao, ngoài ra còn là ngun cung cp các vitamin cho con ngi. Nhiu
vitamin  tôm rt cn thit cho làn da khe mnh, xng và rng nh B6, E, A, D
và B12 Hàm lng vitamin B12, axit béo omega-3 cao  tôm rt có li cho tim
mch, ngn chn s tc nghn mch máu và bo v chng li bnh Alzheimer. Các
nghiên cu trc đây cho rng: thc phm t tôm có cha cholesterol do đó nh
hng đn tim mch. Tuy nhiên, khi so sánh vi các thc phm khác nh trng thì
tôm có hàm lng cholesterol thp hn. Do đó, n tôm có th chng li bnh ri
lon nhp tim và huyt áp cao. Hàm lng các mui khoáng cao, đc bit là
selenium  tôm có vai trò cm ng tng hp và sa cha DNA, loi b các t bào
bt thng, c ch s sinh sn t bào ung th và gây nên s cht theo chng trình
(apoptosis) ca t bào. Ngoài ra, selenium còn tham gia vào các v trí hot đng ca
nhiu protein quan trng, bao gm c các enzyme chng oxy hóa [143], [231].
Tôm sú là loài đng vt thy sn đc khai thác t nhiên cng nh nuôi,
mang li li nhun rt ln nh xut khu ti nhiu nc trên th gii, trong đó có
các nc châu Á nh Thái Lan, Vit Nam, Hàn Quc, ài Loan, Malaysia,
Indonesia, n  [174]. Ngh nuôi tôm sú có u th rt ln đi vi các nc này
vì đây là ngun tài nguyên bn đa có th nuôi và khai thác lâu dài, có đóng góp ht
sc quan trng vào vn đ an toàn lng thc, xoá đói gim nghèo và phát trin
kinh t xã hi ca mi nc. Theo Hip hi Ch bin và Xut khu thy sn Vit
Nam (VASEP), nm 2010, din tích nuôi tôm sú c nc đt 613.718 ha, giá tr
xut khu tôm sú đt 1,45 t USD [16].
1.1.2. Tình hình nuôiăva ădi chăbê nhătôm sú ăVităNam
Nc ta có din tích mt nc ngt, l và bin khá ln, bao gm các sông,

sui, ao h và gn 3200 km b bin vi thành phn ging loài thy sn phong phú
là tim nng to ln đ phát trin nuôi trng thy sn. Tôm sú là đi tng nuôi ph
bin  các vùng nc l, mn trên toàn quc. Ngh nuôi tôm  nc ta là mt th
mnh ca thu sn, Vit Nam đã tr thành mt trong 5 quc gia xut khu tôm ln
nht th gii. Tôm sú Vit Nam đã đc xut khu sang hn 80 nc và vùng lãnh


6
th [201]. Duy trì s n đnh ca ngh nuôi tôm ph thuc rt nhiu vào ngun tôm
khe mnh và s kim soát dch bnh hiu qu. Mt trong nhng vn đ mà ngh
nuôi tôm sú  Vit Nam cng nh các nc khác trên th gii đang phi đi mt là
ngun tôm sú b m. Cho đn nay, nhiu nghiên cu đã đc tin hành nhng gia
hóa tôm sú vn còn nhiu khó khn, ngun tôm sú b m đa đ c gia ho a tha nh
công, tuy nhiên tôm bô me gia ho a câ p cho ca c tra i sa n xuâ t tôm giô ng cha đ c
nhiê u. Hàng nm, c tính có khong hn 10 t con tôm sú ging giai đon PL15
(postlarva 15 - tôm ging 15 ngày tui) đc sn xut t hàng nghìn tri sn xut
tôm ging [3]. S dng ngun tôm b m còn mang tính th đng, t nhiên, cng
vi nhng yu t khác do chính điu kin sn xut kinh doanh ti các tri sn xut
tôm ging chi phi thng dn đn cht lng tôm sú ging không đc đm bo,
có du hiu suy gim sinh trng, mang mm bnh và tim n nhiu ri ro ln cho
ngi nuôi tôm.
Theo thng kê ca B Thu Sn (1995), t nm 1993 - 1995 dch bnh tôm
sú đã làm thit hi hàng trm t đng. Trong nm 1994, tng din tích nuôi tôm sú
có dch bnh là 84.558 ha vi sn lng thit hi c tính là 5.225 tn, tr giá
khong 294 t đng. n nay, dch bnh vn tn ti và lây lan ngày càng rng gây
tn tht nghiêm trng. ng bng sông Cu Long b thit hi ln nht do tp trung
khong 87% din tích nuôi tôm sú ca c nc. Hin tng tôm cht hàng lot 
các tnh ven bin phía Nam t nm 1993 - 1994 đ c xác đnh  tôm sú có các loi
bnh chính là bnh đm trng và bnh đu vàng… [8], [10], [11].
Nc ta đã bc đu chú Ủ đn các nghiên cu nhm nâng cao cht lng

ging và kim soát dch bnh. Các nghiên cu bc đu tp trung nghiên cu đa
dng genome tôm sú [9], phát hin bnh tôm sú [3], [4], [13], đa ra gii pháp
phòng bnh cho tôm sú [2], nghiên cu mt vài protein cu trúc tái t hp ca
WSSV trong phòng thí nghim nhm mc đích phòng tr bnh cho tôm sú [1], [12],
[15]. ây là nhng hng nghiên cu phù hp và có trin vng, đt c s khoa hc,
k thut cho phép thc hin các nghiên cu nâng cao cht lng ca ging thy sn
có giá tr kinh t cao này.


7
1.1.3. Các bnhăthngăgpăătômăsú
1.1.3.1. Bnh do vi khun
Các vi khun liên quan đn bnh  tôm có th là ngun bnh trc tip hoc
gây bnh c hi. Bnh truyn nhim do vi khun  tôm có th gây cht, tn thng
kitin, hoi t, s đi màu ca mang, tng trng chm, lp biu bì lng lo, rut
trng, trng thái hôn mê và hp th thc n gim… Các vi khun gây bnh ch yu
 tôm nuôi là Vibrio, vi khun dng si, vi khun màng nhày, vi khun phân hy
chitin và vi khun kỦ sinh [103].
Các loài vi khun thuc chi Vibrio spp là ngun gây bnh chính  tôm, chúng
phân b rng rãi trong môi trng nc ngt, nc l và bin. Hn 20 loài thuc chi
này đã đc bit đn, mt s trong chúng là ngun bnh  ngi (V. cholerae, V.
parahaemolyticus và V. vulnificus) trong khi mt s loài là ngun bnh ca các đng
vt  nc bao gm tôm (V .harveyi, V. spendidus, V. penaecida, V. anguillarum, V.
parahaemolyticus, V. vulnificus). Phn ln các loài trong chi Vibrio spp đc cho là
ngun bnh c hi, mt s trong chúng có th là ngun bnh chính nh V. harveyi. V.
harvey là vi khun phát sáng đc tìm thy trên b mt c th và rut ca các sinh vt
sng  nc bin, nc l và cng tìm thy trong các ao nuôi tôm và đáy ao [95],
[189]. Tác nhân gây bnh hoi t gan ty là do Proteobacterium alpha. Các vi khun
si nh Leucothrix mucor, Thiothrix sp, Flexibacter sp, Flavobacterium, Cytophaga
sp có th gây bnh cho tôm  giai đon u trùng. Du hiu ca bnh là màu mang

thay đi, tiêu th thc n thâ p, sinh trng kém và t l cht cao. Bnh này xut hin
khi cht lng nc kém và  mt đ nhim cao có th dn đn s hoi t mô mang.
Các vi khun gây bnh phân hy v kitin bao gm: Benekea, Pseudomonas,
Aeromonas, chi vi khuâ n xon và vi khun kỦ sinh [103].
1.1.3.2. Bnh do nm và ký sinh trùng
n nay đã có khong 50 loài nm đc phân lâ p t môi trng nc l và
nc bin, mt s chúng là ngun gây bnh c hi cho tôm. Hu nh tt c các giai
đon u trùng tôm b nhim nm và tác nhân ph bin là Lagenidium callinectes và


8
Sero spp. Giai đon protozoae và mysis thng b nhim vi các triu trng bnh
nh hôn mê và gây cht do bào t nm và h si nhim vào các mô nh phn ph
và mang. Bnh nm  u trùng ph bin  ni m ging tôm. Gopalan và đtg
(1980) cho rng, Lagenidium marina và Siro para là tác nhân nhim  tôm sú [76],
chúng gây cht  u trùng tôm sú giai đon nauplii, zoea và mysis [163]. Bnh
mang đen và Fusariosis gây ra bi Fusarium spp có th gây nh hng tt c các
giai đon phát trin ca tôm penaeid. Fusarium spp (F. solani, F. moniliformae) là
các ngun bnh c hi có th dn đn t l cht cao (90%). Bnh đc cho là do các
ao nuôi có cht lng nc kém. Si nm đc phát hin  mô đng vt b nhim
bng s dng kính hin vi quang hc [103].
Mt s sinh vt kỦ sinh, đc bit là đng vt nguyên sinh có th nhim vào
tôm  các giai đon phát trin khác nhau. Các đng vt nguyên sinh cùng hi sinh
có th phát hin đc  mang, chân bi (periopod), các phn ph khác và các c
quan bên trong c th.  mc đ nhim cao, các đng vt nguyên sinh có th gây
tc nghn  mang (mang tr nên màu nâu) dn đn chng bing n, gim sinh
trng, vn đng và tng kh nng nhim các ngun bnh c hi khác. ng vt
nguyên sinh nh Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Anophrys, Acineta sp,
Agenophrys và Ephelota có th là các kỦ sinh trùng tác đng t bên ngoài. Các kỦ
sinh trùng nh Paranophrys spp và Parauronema sp có th gây cht cho tôm  giai

đon u trùng và u niên. Các kỦ sinh trùng này đi vào c th tôm qua vt thng
và xâm nhim vào máu, mang làm tng t l cht, đc bit trong trng hp có s
xâm nhim kt hp vi các kỦ sinh trùng khác nh Leptonmonas spp. Tôm b nhim
các kỦ sinh trùng này có th chn đoán bng kim tra đ đc ca máu, máu không
đông, lng t bào máu gim và s lng kỦ sinh trùng tng rt ln. Các đng vt
nguyên sinh kí sinh bên trong tôm thng tn ti di dng nhóm, chúng có 2 loi
vt ch là đng vt thân mm (giun đt) và giáp xác. Các nhóm đng vt nguyên
sinh đc phát hin  tôm bao gm: Nematopsis litopenaeus, Paraphioidina
scolecoide, Caphalobolus litopenaeus, Caphalobolus petiti và Caphalobolus stenai.
Các bào t trng thành và giao t đc tìm thy  thành rut và các khoang ca c


9
th. Các bnh do kỦ sinh trùng gây gim hp th thc n nhng dng nh ít nh
hng đn nuôi trng thy sn. Mt s kỦ sinh trùng khác nh Agmasoma spp,
Microsporidium spp có th xâm nhim vào c, tim, tuyn sinh dc, mang và gan
ty. Tôm b nhim dn đn các mô b m đc và un cong c th nhng không gây
cht tôm, tôm b bnh nh hng đn cht lng sn phm. Có th chn đoán bnh
này nh quan sát các bào t  mô c b nhim [103].
1.1.3.3. Bnh do virus
Virus là ngun bnh ph bin nht  bin, chúng hin din đn 10 t trong 1
lít nc bin và mt s trong chúng có th nhim vào nhiu sinh vt [74]. n nay,
các nhà khoa hc đã phát hin hn 20 loi virus nhim  tôm [126]. Trong s các
virus này, virus đc nghiên cu nhiu nht  tôm nuôi là WSSV, YHV và TSV,
chúng đc cho là các virus gây bnh nghiêm trng nht  tôm [59]. Tuy nhiên, có
rt ít hiu bit v các virus này  giáp xác hoang dã [34]. Trong đo , tôm su nhim
WSSV và YHV gây nên bnh nghiêm trng cho tôm nuôi, kt qu dn đn s thit
hi ln v kinh t.
Bnh đm trng gây ra bi virus gây hi chng đm trng (White spot
syndrome virus - WSSV) đc phát hin ln đu tiên  ài Loan nm 1992, tip

đn là Trung Quc, Nht Bn, Hàn Quc vào nm 1993. Do nuôi tôm thâm canh,
môi trng nuôi tôm không an toàn và s thng mi sn phm đông lnh trên toàn
th gii, WSSV nhanh chóng lan ra các vùng nuôi tôm  khu vc châu Á, châu Âu
và c châu M [64], [117]. Trong s các virus gây bnh  tôm sú, WSSV gây thit
hi ln nht và là mt vn đ ln mà ngành thy sn phi đi mt cho đn hin nay
[174].  tôm nuôi, nhim WSSV có th dn đn t l cht lên đn 100% trong vòng
3-10 ngày [97]. Ngoài h tôm penaeid, WSSV lây nhim mt lot các đng vt giáp
xác khác nh cá, tôm hùm, cua và thm chí đc phát hin  c côn trùng [64]. Tuy
nhiên, s lây nhim thng không gây cht cho các loài này và do đó chúng là đng
vt mang virus [124], [123], [221].


10

Hìnhă1.2.ăTômăsúănhimăWSSVă[119]
Các đng vt nhim bnh có du hiu kém n, chuyn đng chm, màu c
th chuyn t hng sang đ, thng có khuynh hng cp mé b, sau đó cht và
chìm xung đáy. Gan, ty thng có màu trng hoc hi vàng. c trng ca tôm
b nhim WSSV là các đm trng trên v kitin (Hình 1.2). Nhng đm trng này là
kt qu ca s vôi hóa, có kích thc t vài mm đn 1 cm hoc có th hn, v mng
lng lo có th bóc ra khi lp biu bì mt cách d dàng [2], [51].
Genome ca WSSV là DNA si đôi, vòng, siêu xon có kích thc khong
300 kb. Trong đó, chng phân lp t Thái Lan có kích thc nh nht 292967 bp,
genome ca WSSV  ài Loan có kích thc ln nht là 307287 bp, genome ca
WSSV phân lp t tôm sú  Trung Quc là 307107 bp. Genome WSSV phân lp t
Trung Quc, ài Loan và Thái Lan đã đc phân tích, nhng bin đi v trình t
nucleotide gia các virus đã đc công b [140]. Phân tích trình t ca DNA
genome tôm sú và so sánh vi d liu trình t đã ch ra rng WSSV không có s
tng đng vi bt k virus nào đã đc bit đn. WSSV đc xp vào mt h
virus mi (Nimarividae) và mt chi virus mi: Whispovirus [213].

WSSV có th đc truyn nhim theo c chiu ngang và chiu dc [66]. S
lây truyn này có th qua nc và thc n, các loi giáp xác hoang dã trong ao và do
tôm kho n con b nhim bnh đm trng [50], [100]. Các mô đông lnh cng có th
là nguyên nhân lây truyn bnh [63]. Sau đó s xâm nhim đc cho là ch yu
thông qua mang, nhng có th xy ra thông qua b mt khác ca c th [42], [50],
[51]. WSSV cng lây truyn theo chiu dc trc tip t m sang con cái, duy trì qua


11
giai đon u trùng, tôm ging và đã đc chng minh bng thc nghim mc dù s
xut hin ca WSSV  trng ca tôm vn cha đc rõ ràng [122], [158]. Kt qu
theo dõi tôm sú nuôi ti Vit Nam ca Bùi Quang T cho thy WSSV lan truyn theo
chiu ngang là chính [8]. Cho đn nay, không có loài tôm nào thuc h tôm he đc
bit là có kh nng kháng WSSV [117], [127]. Có nhiu phng pháp đ chn đoán
WSSV bao gm phng pháp mô hc và kính hin vi đc thc hin bng cách kim
tra phn mô nhum màu [117]; các phng pháp min dch da trên vic to ra
kháng th đn dòng và đa dòng đ chng li các kháng nguyên virus. Các kháng th
đn dòng và đa dòng [135], [242], phân tích min dch [147]. Bên cnh đó, các
phng pháp sinh hc phân t đc s dng ph bin nh phng pháp Dot blot
[62], [182], k thut lai phân t [42], [230], phng pháp PCR [117], [121].
Bê nh đâ u va ng gây ra do virus gây hô i ch ng đâ u va ng (Yellow head virus –
YHV) đc phát hin lâ n đu tiên  tôm sú ti Thái Lan nm 1990. Tôm nhim
YHV thng đc mô t vi màu vàng sáng  vùng đu ngc và c th thng
nht nht (Hình 1.3). Màu vàng ca vùng đu ngc là do triu trng bnh  gan ty
màu vàng [44]. YHV lan rng và nhanh trong các vùng nuôi tôm sú  Thái Lan.
Tôm b nhim YHV cht trong vòng vài gi và toàn b tôm nuôi có th b thit hi
trong vòng 3-5 ngày sau khi xut hin tôm nhim [72] vi s hoi t  c quan bch
huyt, mang, mô liên kt, t bào máu và c quan to máu [216]. C quan bch huyt
có th là đích đu tiên ca YHV da trên c s nghiên cu mô bnh và nghiên cu
th th YHV [24], [130]. Ngoài tôm sú, YHV gây bnh  tôm th chân trng

(Litopenaeus vannamei) và tôm xanh Thái Bình Dng (Penaeus stylirostris) [128],
tôm trng Thái Bình dng (Penaeus sytiferus) và Acete spp [67]. YHV có kích
thc rng 40-60nm, dài 150-200nm,  đu tròn có cha RNA si đn (+) khong
26 kb. Virus này thuc chi Okavirus, Roniviridae, Nidovirales [44], [228]. YHV tn
ti ít nht 3 bin th di truyn khác nhau [215], bin th đu tiên đc công b là
YHV phân lp  Thái Lan khác bit vi bin th virus kt hp vi mang (Gill
associated virus - GAV)  Úc khong 15% trình t nucleotide [53]. Kiu trung gian
th 3 ca YHV đc phát hin  Thái Lan và Vit Nam [103].


12

Hìnhă1.3.ăTômăsúănhimăYHVă[8]
Tôm nhim YHV có th đc chn đoán bng mô bnh hc nh quan sát s
xut hin khi hoi t ln và th vùi t bào cht  các mô ngoi bì và trung bì [35],
[44].  phát hin nhanh YHV, đã có mt s quy trình chn đoán đc thc hin
nh nhum [70], [71], dot blot [129], [148], k thut Western blot [147], k thut
RT - PCR [229] và mu dò gen [200]. Các k thut min dch cng đc s dng đ
phát hin s lây nhim, kháng th kháng YHV đc sn xut  Thái Lan [183],
[184] đ ng dng cho chn đoán mô bnh ca YHV và phát trin các test đ chn
đoán nhanh bnh này.
1.1.4. Phngăpha p phòng và tr bnhăătôm sú
Bnh truyn nhim là mt tr ngi chính cho s thành công, phát trin và là
nguyên nhân gây ra thit hi kinh t rt ln trong ngh nuôi trng thy sn. 
phòng bnh do vi khun  tôm trc khi nuôi th cn làm k công tác ci to ao,
phi có b cha lng đ x lỦ nc trc khi cp sang ao nuôi. Tôm ging th nuôi
phi đc kim dch, có cht lng tt và nuôi  mt đ thích hp, không nên nuôi
vi mt đ qúa cao dn đn tôm d nhim bnh. Vic qun lỦ môi trng tt, không
cho thc n d tha đ tránh hin tng to chim u th trong ao gây ra ô nhim
nn đáy to điu kin cho vi khun phát trin gây bnh. Trong quá trình nuôi cn ci

13
thin môi trng nuôi bng cách thng xuyên s dng các loi vôi mt cách hp
lỦ, s dng máy qut nc đ gom t các cht thi vào gia ao. Vic tng cng s
dng các loi ch phm sinh hc, b sung đng carbon xung ao to điu kin cho
vi khun có li phát trin mnh át ch vi khun gây bnh. Ngoài ra, cn tng cng
sc kho ca tôm bng cách b sung vitamin C vào thành phn thc n. Các vi
khun có li cng đc các nhà khoa hc nghiên cu ch bin trong thc n tôm có
tên gi là probiotics. Khi tôm b nhim bnh có th s dng các loi thuc kháng
sinh nh Furacin, Oxytetracycin… trn vào thc n cho n liên tc 7-10 ngày [8].
Phng pháp này có hn ch là chi phí mua thuc ln, d lng kháng sinh ln 
c th tôm nh hng đn môi trng, sc khe con ngi và xut hin các mm
bnh kháng thuc có th là ngun bnh lây nhim cho con ngi. Vì vy, cn phi
tìm ra mt cht mi có th thay th cho thuc kháng sinh đng thi chng li mm
bnh trên thy sn [238].
i vi các bnh do nm và kỦ sinh trùng cn phi s dng gii pháp phòng
và tr bnh tng hp. Trong các ao tri m ging, nuôi tôm, thc n ti sng có
nguy c nhim ngun bnh do vy cn phi đc kh trùng. áy ao phi thng
xuyên đc x lỦ bng các hóa cht đ dit ngun bnh trong phân trc khi nuôi.
Mt s hóa cht đã đc s dng nh formalin, xanh malachite và trelafan [8].
Hin nay, cha có phng pháp hiu qu đ x lỦ các bnh do virus gây ra.
Do vy, chin lc chính đ gim bnh  tôm là phòng tránh.  phòng bnh tôm
sú trc tiên phi kim nghim và chn con ging sch bnh trc khi th nuôi
bng các phng pháp khác nhau, trong đó PCR là phng pháp tng đi hiu
qu. Thêm vào đó ao nuôi tôm cn đc tháo cn nc và x lỦ bng hóa cht,
nc đc đa vào ao nuôi cng phi đc x lỦ bi các hóa cht cho phép đ loi
b các tác nhân có th gây bnh. Tip theo, ngi nuôi tôm phi chn mùa v thích
hp đ th tôm, tránh th tôm vào gia và cui mùa ma do nhit đ không khí và
lng nc thp. Ma ln có th là mt nguyên nhân đa nc cha đc x lỦ vào

14
ao nuôi. Hn ch không cho nc cha đc x lỦ vào ao nuôi đng ngha vi vic
hn ch đc tác nhân mang mm bnh cho tôm nh các loài giáp xác hoang dã.
ng thi trong quá trình nuôi, ao nuôi tôm cng phi x lỦ formol đnh k nhm
loi b nhng cá th b nhim virus đm trng ra khi qun đàn mt cách kp thi.
Vic nuôi tôm cn có các ao cha đ x lỦ vic lan tràn ngun bnh khi dch bnh
bt đu xy ra. Ngoài ra, trong quá trình nuôi tôm vic s dng mt ch đ n thích
hp cng góp phn to môi trng an toàn [2], [117].
Có nhiu bng chng cho rng tôm không có kh nng bo v c th khi tip
xúc ln đu tiên vi các tác nhân gây bnh mi xut hin. iu này ch ra tôm
không có h min dch thích ng. Tuy nhiên, mt s tôm vn có kh nng tn ti và
phát trin tng đi khi tip xúc vi tác nhân gây bnh [68]. Mt khác, tôm khe
mnh thng b nhim virus  mc đ thp [90], [215] và tôm tip xúc vi tác nhân
gây bnh virus đã đc chng minh có kh nng kháng khi tip xúc virus  ln tip
theo [212]. Do vy, mt trong ca c gii pháp đã đc nghiên cu s dng đ tng
cng kh nng min dch cho tôm là các cht chit xut t các loài sinh vt và các
cht kích thích min dch. Nhiu cht chit xut t các loài sinh vt khác nhau đc
kt hp trong ch đ n ca tôm trc và sau khi nhim WSSV, đã chng minh ci
thin kh nng min dch và làm gim t l t vong ca tôm b nhim WSSV. Các
cht đó là Fucoidan chit xut t to bin Sargassum polycystumwas [49], 2-
methylheptyl chit xut t lá Pongamia pinnata [164] và mt s cht khác chit xut
khác [29], [52]. Ngoài ra, ch đ n có các các cht kích thích min dch nh -1, 3-
glucan [40], [41], lipopolysaccharide [199], peptidoglycan [110] có kh nng kích
thích min dch bm sinh giúp tôm có kh nng sng sót cao hn khi nhim WSSV.
1.2. HăMINăDCHăTỌMăSÚ
ng vt không xng sng, trong đó có tôm ch phát trin h min dch t
nhiên (innate immunity) [88], [91]. H min dch t nhiên chia ra làm hai h thng
bo v chính: min dch t bào (cellular barriers) và min dch dch th (Humoral