Tạo dòng và biểu hiện enzyme trehalose synthase chịu nhiệt từ vi khuẩn meiothermus ruber phân lập từ suối nước nóng ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



THÁI THIÊN MINH




TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME
TREHALOSE SYNTHASE CHỊU NHIỆT TỪ
VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER
PHÂN LẬP TỪ SUỐI NƯỚC NÓNG Ở VIỆT NAM



Chuyên ngành: Vi sinh
Mã số: 60 42 40



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC






NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.ĐỖ MINH SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2011
Lời cảm ơn


Em xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến cô, cố PGS.TS Trần
Thu Hoa, đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn,
truyền đạt những kiến thức quí báu trong quá trình nghiên cứu
tại trường cho dù cô không có được sức khỏe tốt.
Em xin chân thành cảm ơn đến TS .Đỗ Minh Sĩ đã hướng
dẫn và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh đã tậ
n
tình chỉ dạy trong suốt thời gian học tập ở trường.
Xin gửi lời cảm ơn đến em Đỗ Xuân Hòa, đã giúp đỡ, hổ trợ
rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin gửi lời cảm ơn đến các em Tố Nhi, Hà Giang, Quang
Hữu, Bảo Quyên, Huyền Thanh và các em ở phòng thí nghiệm Vi
sinh công nghệ dược, trường Đại học Y dược tp Hồ Chí Minh đã
luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thờ
i gian thực
hiện luận văn.
Con xin cảm ơn Mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh
và ủng hộ trong suốt thời gian qua.

1







MỞ ĐẦU








2
Các vi sinh vật chịu nhiệt được xếp trong nhóm vi sinh vật cực đoan phân bố
nhiều ở các vùng suối nước nóng, các vùng địa nhiệt, miệng núi lửa Nhiệt độ cực
thuận nhất cho sự hoạt động của các vi sinh vật chịu nhiệt này là từ 50 – 80°C. Một
số vi sinh vật có thể hoạt động ở nhiệt độ 110°C hoặc cao hơn. Những enzyme của
những chủng vi khuẩn này được gọi là nh
ững enzyme chịu nhiệt. Các enzyme chịu
nhiệt này có những đặc tính về cấu trúc, chức năng khác thường cho sự chịu nhiệt
độ cao và hoạt động cực thuận của chúng. Vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn
chịu nhiệt này đồng thời tìm hiểu các enzyme chịu nhiệt của chúng sẽ mở ra một
hướng mới trong việc ứng dụng các enzyme này trong cách lĩnh vực sinh hóa, thực
phẩm và đặc biệt là trong lĩ
nh vực công nghệ sinh học phân tử.

Trehalose là một trong những loại đường có nhiều công dụng đối với cuộc
sống con người, đặc biệt đối với những người béo phì, những người mắc bệnh tiểu
đường… Trehalose hiện nay đang được sử dụng như một loại đường thay thế trong
công nghiệp sản xuất bánh kẹo, sữa…Trong khi đó việc tổng hợp trực tiếp trehalose
r
ất phức tạp. Do vậy việc tìm kiếm một phương pháp tổng hợp trehalose là hết sức
cần thiết.
Trehalose synthase là enzyme tổng hợp trehalose từ maltose. Trehalose
synthase được tìm thấy trong nhiều loại vi khuẩn, trong đó có vi khuẩn
Meiothermus ruber. Đây là một chủng vi khuẩn chịu nhiệt trung bình. Ở Việt Nam,
chúng được tìm thấy ở hầu hết trong các suối nước nóng có nhiệt độ trung bình từ
45-75
o
C. Phân lập chủng vi khuẩn này đồng thời tạo dòng đoạn gen mã hóa enzyme
Trehalose synthase chịu nhiệt của chúng không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có
ý nghĩa kinh tế xã hội. Vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tạo dòng và
biểu hiện enzyme trehalose synthase chịu nhiệt từ vi khuẩn Meiothermus ruber
phân lập từ vùng suối nước nóng ở Việt Nam”





3
NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

 Phân lập các chủng vi khuẩn chịu nhiệt Meiothermus ruber từ suối
nước nóng ở Bình Châu ( Bà Rịa - Vũng Tàu).
 Định danh chủng vi khuẩn này dựa vào trình tự gen 16S rRNA.
 Ly trích DNA bộ gen của chủng vi khuẩn Meiothermus ruber.

 Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Trehalose synthase.
 Tái tổ hợp đoạn gen này vào chủng E.coli và biểu hiện chủng
E.coli tái tổ hợp.

















vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày 10
Bảng 2.1. Thành phần gel tách polyacrylamide 12% 36
Bảng 2.2. Thành phần gel gom polyacrylamide 4.5% 37
Bảng 3.1. Bảng tổng hợp các trình tự blast trên NCBI 49

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Trehalose 7

Hình 1.2. Độ ngọt của đường trehalose so với maltose, glucose, sucrose 9
Hình 1.3. Độ hòa tan trong nước của trehalose so với sucrose 9
Hình 1.4. Sự phân bố các con đường sinh tổng hợp Trehalose trong tự nhiên 15
Hình 1.5. Các con đường tổng hợp Trehalose 16
Hình 1.6. Cơ chế sản xuất Trehalose từ tinh bột 19
Hình 2.1. Kích thước của thang MassRuler ladder Mix 28
Hình 2.2. Kích thước thang Multicolor Broad Range Protein Ladder 29
Hình 2.3. Vector Pjet1.2 blunt 33
Hình 2.4. Vector pET-22b 34
Hình 3.1. Khuẩn lạc (A) và hình dáng tế bào (B) vi khuẩn Meiothermus ruber 41
Hình 3.2. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR 42
Hình 3.3. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR colony các mẫu plasmid pJet-TreS
( 44
Hình 3.4. Vị trí cắt của Vsp 1 trên vector pJet1.2/blunt 42

Hình 3.5. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR các mẫu plasmid pET-TreS 46
Hình 3.6. Điện di trên gel agarose sản phẩm cắt plasmid pET-TreS 47
Hình 3.7. Vị trí các mồi giải trình tự 47

Hình 3.8. Điện di SDS-PAGE các dòng mang plasmid tái tổ hợp 50
Hình 3.9. Kết quả phân tích Western blot 51
Hình 3.10. Kết quả điện di SDS-PAGE plasmid pET-TreS với 2 chất cảm ứng 52
Hình 3.11. Kết quả điên di SDS-PAGE mẫu plasmid tái tổ hợp với các nồng độ
IPTG khác nhau 53

Hình 3.12. Điện di SDS-PAGE thời giam cảm ứng 54
Hình 3.13. Điện di SDS-PAGE vận tốc lắc cảm ứng 55
Hình 3.14. Điện di SDS-PAGE nhiệt độ cảm ứng 56
Hình 3.15. Điện di SDS-PAGE điều kiện cảm ứng tối ưu 57


v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT



BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp base pair (cặp base)
cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid
DNA Deoxyribonucleotide acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
LB Luria-Bertani
MCS Multiple coding sequence (vùng tạo dòng)
OD Optical density (mật độ quang)
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamid gel electrophoresis (điện di
trên gel polyacrylamide)
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase)
RE Restriction Enzym (enzym cắt giới hạn)

rpm Rotation per minute (vòng/ phút)
TreS Trehalose synthase









i


MỤC LỤC

Trang
Trang phụ bìa
MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN CHỊU NHIỆT 5
1.1.1. Sự phân bố của vi khuẩn chịu nhiệt 5
1.1.2. Phát sinh loài 5
1.1.3. Vi khuẩn Meiothermus ruber 6

1.2. TREHALOSE 6
1.2.1. Cấu trúc của Trehalose 6
1.2.2. Bản chất sinh học của trehalose 7
1.2.3. Đặc tính hóa học của trehalose 9
1.2.4. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể vi sinh vật 10
1.2.4.1. Là một nguồn dự trữ năng lượng và carbon 10
1.2.4.2. Là một chất ổn định và bảo vệ của các protein và màng 11
1.2.5. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể con người 12
1.2.5.1. Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon 12
1.2.5.2. Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose 13
1.2.5.3. Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng . 13
1.2.6. Con đường tổng hợp trehalose 14
1.2.7. Ứng dụng của trehalose 17
1.2.8. Sản xuất trehalose 18
1.2.9. Tình hình nghiên cứu enzyme trehalose synthase trên thế giới 19


ii
1.3. KỸ THUẬT TẠO DÒNG 21
1.3.1. Chọn và xử lý vector 21
1.3.2. Xử lý DNA cần tạo dòng 21
1.3.3. Tạo vector tái tổ hợp 21
1.3.4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 22
1.3.4.1. Hóa biến nạp 22
1.3.4.2. Điện biến nạp 22
1.3.5. Chọn lọc dòng tái tổ hợp: 22
Chương 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. VẬT LIỆU 25
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 25
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 25

2.1.3. Môi trường làm thuần và cấy chuyền vi khuẩn ưa nhiệt 25
2.1.4. Hóa chất dùng cho tách chiết DNA 26
2.1.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: 27
2.1.6. Mồi dùng cho giải trình tự 27
2.1.7. Hóa chất dùng cho các phản ứng cắt, nối DNA 27
2.1.8. Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose 27
2.1.9. Môi trường, hóa chất dùng cho biến nạp và biểu hiện 28
2.1.10. Hóa chất dùng cho điện di trên gel polyacrylamide 28
2.1.11. Hóa chất dùng cho tinh chế DNA từ thạch agarose 29
2.1.12. Hóa chất dùng cho tinh chế plasmid 29
2.1.13. Hóa chất dùng cho phương pháp Western blot 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP 30
2.2.1. Phương pháp thu mẫu 30
2.2.2 Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn Meiothermus ruber 30
2.2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn Meiothermus ruber 30
2.2.3.1. Khảo sát hình thái tế bào 30
2.2.3.2. Giải trình tự gen 31


iii
2.2.4. Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn 31
2.2.5. Phương pháp PCR 31
2.2.6. Phương pháp điện di trên gel agarose 32
2.2.7. Phương pháp tinh chế DNA từ thạch agarose 32
2.2.8. Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn 32
2.2.9. Phản ứng ghép nối đoạn DNA vào vector pJet1.2 blunt 33
2.2.10. Phản ứng nối đoạn DNA chèn vào vector pET-22b 33
2.2.11. Chuyển DNA vào E.coli bằng phương pháp hóa biến nạp 34
2.2.11.1. Nguyên tắc 34
2.2.11.2. Cách tiến hành 35

2.2.12. Ly trích DNA plasmid của E.coli theo phương pháp DNA-spin 35
2.2.13. Kiểm tra sản phẩm tạo dòng 35
2.2.14. Biểu hiện protein tái tổ hợp 36
2.2.15. Điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide ( SDS-PAGE) 36
2.2.15.1 Nguyên tắc 36
2.2.15.2. Cách tiến hành 36
2.2.16.Phân tích protein bằng phương pháp Western blot 38
2.1.16.1. Nguyên tắc 38
2.1.16.2. Cách tiến hành 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ BÀN LUẬN 40
3.1. PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER Từ SUỐI
NƯỚC NÓNG 41

3.2.THU NHẬN GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE TỪ
CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER 42

3.3.TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE VÀO
VECTOR pET- 22b 43

3.3.1. Chèn gen TreS vào pJet1.2 blunt 43
3.3.2. Chèn gen TreS vào pET-22b 44
3.4.BIỂU HIỆN TRÊN E.COLI BL21(DE3) 49


iv
3.4.1.Chọn lọc dòng 49
3.4.2. Kết quả Western blot 51
3.4.3. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu 51
3.4.3.1. Khảo sát chất cảm ứng 52

3.4.3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng 53
3.4.3.3. Khảo sát thời gian cảm ứng 54
3.4.3.4. Khảo sát vận tốc lắc cảm ứng 55
3.4.3.5. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng 56
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 58
4.1. Kết luận 59
4.2. Kiến nghị 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60
PHỤ LỤC 65

4




CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN






Tổng quan

5
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN CHỊU NHIỆT
1.1.1. Sự phân bố của vi khuẩn chịu nhiệt [33]
Các chủng vi sinh vật chịu nhiệt được định nghĩa là tất cả các loài có khả
năng phát triển ở nhiệt độ trên 55
o
C. Có thể chia làm 3 loại: các loài vi sinh vật chịu
nhiệt trung bình phát triển ở trên 65
o
C, chịu nhiệt độ cao ở trên 75
o
C và chịu nhiệt
cực đoan ở trên 90
o
C.
Những vi sinh vật này, chủ yếu là vi khuẩn và cổ khuẩn, được phân lập ở hầu

hết các môi trường trên cạn có chứa nước, các môi trường biển tự nhiên cũng như ở
các môi trường nhân tạo. Các môi trường trên cạn bao gồm các suối nước nóng và
các khu vực núi lửa phun khí SO
2
với 1 dãy pH rộng (0,5-9,0), độ mặn thấp (0,1-
0,5%) và trong các tầng địa nhiệt sâu. Còn trong môi trường biển tự nhiên chúng có
thể phân bố ở các nơi có nồng độ muối cao (3%) và dãy pH từ 5,0 đến 8,5 như các
hệ thống thủy nhiệt sâu, hệ thống núi lửa ngầm dưới đáy biển. Các môi trường nhân
tạo mà ở đó các vi sinh vật chịu nhiệt được tìm thấy bao gồm các bãi than đá đang
cháy âm ỉ, các dòng chảy nóng từ các nhà máy đị
a hạt nhân và địa nhiệt.
Số lượng các loài vi sinh vật chịu nhiệt đã được mô tả không ngừng gia tăng
trong những năm qua và cùng với đó là số lượng bản đồ gen hoàn thành kể từ khi
bắt đầu dự án giải trình tự gen trên thế giới. Chỉ riêng đối với các loài vi sinh vật
chịu nhiệt cực đoan, số được mô tả từ chỉ 2 loài vào năm 1972 đã tăng đến hơn 70
loài vào cuối năm 1999 và 14 dự án giải trình tự gen đã hoàn thành trong khi hơn 20
loài vẫn đang được tiếp tục.
1.1.2. Phát sinh loài [33]
Cho đến những năm 1960, các công cụ phân loại đã không xác định được các
mối quan hệ tiến hóa trong các nhóm vi sinh vật. Việc nghiên cứu hình thái học và
các bằng chứng hóa thạch đã không cho thấy một sự đóng góp sâu sắc đến sự phân
loại của các nhóm vi sinh vật. Và vì vậy, sự phân loại chính xác ở thời đi
ểm đó chỉ
có thể là sự khác nhau các nhóm vi sinh vật là prokaryote và eukaryote. Năm 1977,
Carl Woese đã đề xuất một cơ sở phân loại dựa trên phân tử rRNA16S ở prokayote
và kết quả là sự hình thành cây phát sinh loài prokayote và sự hình thành một nhóm
Tổng quan

6
vi sinh vật mới: cổ khuẩn. Và cho đến bây giờ, cây phát sinh loài được cấu tạo bởi

các trình tự rRNA 16S ở prokayote và rRNA 18S ở eukaryote đã phân sinh giới ra
làm 3 nhóm chính: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và sinh vật nhân thật
(Eukarya).
Các vi sinh vật chịu nhiệt và chịu nhiệt cực đoan được tìm thấy ở cả 2 nhóm
cổ khuẩn và vi khuẩn. Các vi sinh vật chịu nhiệt cực đoan chiếm vị trí cơ bản nhất
trong cây phát sinh loài. Ở vi khuẩn, chỉ 2 loài
Thermotoga và Aquifex là chịu nhiệt
cực đoan.
1.1.3. Vi khuẩn Meiothermus ruber
Vi khuẩn Meiothermus ruber là vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram âm, không
di động. Vi khuẩn này được phân lập ở hầu hết các suối nước nóng có nhiệt độ từ
40
o
C đến 75
o
C. Vi khuẩn Meiothermus ruber thuộc chi Meiothermus, họ
Thermaceace có chiều dài khoảng 3-6 μm, đường kính từ 0,5-0,8μm. Trình tự DNA
của chủng vi khuẩn này được nhận thấy là có sự tương đồng với chủng vi khuẩn
chịu nhiệt Thermus aquaticus [23].
1.2 . TREHALOSE
1.2.1. Cấu trúc của Trehalose [5]
Năm 1974, quan điểm hiện hành về vai trò của trehalose đã cho rằng
trehalose như là một kho dự trữ glucose, là một nguồn năng lượ
ng hoặc là để tổng
hợp của các thành phần tế bào. Kể từ đó, quan điểm về chức năng khác nhau của
đường khử đơn giản này đã mở rộng rất nhiều, hiện nay trehalose không chỉ đơn
giản là một hợp chất lưu trữ. Chẳng hạn ở một số sinh vật, nó có một vai trò cấu
trúc, hoặc là vận chuyển. Ttrong khi ở một số
sinh vật khác nó liên quan đến việc
truyền tín hiệu hoặc điều khiển, hoặc các chức năng để bảo vệ màng tế bào

và protein chống lại các tác động tiêu cực của stress, chẳng hạn như nhiệt, lạnh,
khô, và sự oxy hóa [13].
Trehalose còn được gọi là mycose hoặc tremalose là một đường đôi không
khử bao gồm hai phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1,1-glycosic. Mặc
dù trehalose có có thể có ba anomer đó là α,β-1,1 , β,
β-1,1 và α,α-1,1 nhưng chỉ loại
Tổng quan

7
trehalose α,α được phân lập và và sinh tổng hợp trong sinh vật sống. Vào năm 1832,
H.A.L. Wiggers phát hiện trehalose trong cựa của lúa mạch đen và năm 1859
Marcellin Berthelot cô lập nó từ manna trehala, một chất được tạo bởi mọt, và đặt
tên là trehalose.


Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Trehalose
1.2.2. Bản chất sinh học của trehalose [5], [31]
Trong tự nhiên, trehalose có thể được tìm thấy trong động vật, thực vật và vi
sinh vật. Trehalose khá phổ biến ở nấm men và nấm nơi nó tồn tại trong bào tử [6],
và các tế bào thực vật. Ví dụ, các bào tử và nang lớn của Dictyostelium mucoroides
đã được thấy có chứa tới 7% trehalose so với trọng lượng khô, và các bào tử nang
của Neurospora tetrasperma
có nhiều hơn 10% trehalose. Khi các bào tử nảy mầm,
trehalose nhanh chóng biến mất cho thấy đường này được dự trữ như một nguồn
carbon, hoặc nguồn năng lượng. Ngoài ra, trehalose cũng được tìm thấy ở một số
nấm khác, chẳng hạn như Lentinula edodes, Grifola fondosa, Pholiota
nameko…với hàm lượng trehalose từ 1% đến 17% (do đó nó cũng được gọi đường
nấm). Trehalose cũng có mặt ở nồng độ cao trong nấ
m men của bánh mì và bia.
Trong những sinh vật này, hàm lượng trehalose phụ thuộc vào tuổi của các tế bào,

cũng như giai đoạn tăng trưởng và tình trạng dinh dưỡng của chúng.
Nhiều loài địa y và tảo cũng chứa đường đôi này, mặc dù ở nồng độ thấp
hơn đáng kể so với trehalose tìm thấy trong nấm men. Trehalose cũng hiện diện
Tổng quan

8
trong nhiều loài thực vật bậc cao như trong hạt hướng dương, thực vật Selaginella
và tảo biển. ).
Trehalose cũng được tìm thấy ở một số loại vi khuẩn khác nhau như các loài
của Streptomyces chẳng hạn Streptomyces hygroscopicus, các loài mycobacteria
khác nhau bao gồm Mycobacterium smegmatis và Mycobacterium tuberculosis và
corynebacteria. Trong mycobacteria và corynebacteria, đường khử này đóng vai trò
như là một thành phần cấu trúc của vách tế bào. Ở vi khuẩn Propionibacterium
freudenreichii ssp, các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, hàm lượng NaCl,
O
2
…cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp trehalose [9]. Đối với vi khuẩn quang hợp
Rhodobacter sphaeroides trehalose được tích lũy như một chất bảo vệ chủ yếu trong
các đáp ứng với sự thay đổi của nồng độ muối [19]. Trehalose cũng có mặt trong
Escherichia coli [15] và một số vi khuẩn khác, chẳng hạn như Rhizobium sp,
Sulfdolobus acidocaldarius, Pimelobacter sp. R48, Arthrobacter sp. Q36. Trong
nhiều những sinh vật này, chức năng của trehalose vẫn chưa được biết rõ ràng. [6]
Trong thế giới động vật, trehalose l
ần đầu tiên được thấy trong côn trùng, nơi
mà nó hiện diện trong huyết tương và trong ấu trùng hay nhộng. Trong côn trùng
trưởng thành, hàm lượng trehalose giảm nhanh chóng trong các hoạt động cần năng
lượng, chẳng hạn như bay cho thấy một vai trò cho đường khử này như một nguồn
năng lượng glucose. Ngoài côn trùng, trehalose cũng đã được tìm thấy trong trứng
của giun tròn Ascaris lumbricoides, trong đó nó có thể chiếm đến 8% trọng lượng
khô, ở giun tròn trưởng thành và ấu trùng giun tròn Porrocae

với hàm lượng
trehalose cao đến 6% trọng lượng khô. Trehalose cũng phổ biến ở tôm, và ở các loại
côn trùng khác như châu chấu, cào cào, bướm, ong…
Đường này cũng có ở một số động vật không xương sống. Sự hiện diện đa
dạng của trehalose trong các vi sinh vật sống như vậy chứng tỏ sinh vật phân bố
rộng rãi của nó và cho thấy rằng nó đóng một vai trò quan trọng trong thế giới sinh
học.


Tổng quan

9
1.2.3. Đặc tính hóa học của trehalose [10]
Trehalose là một đường tự nhiên với chức năng tương tự như sucrose, nhưng
với sự ổn định hơn và vị ngọt nhẹ hơn. Vị ngọt tương đối của nó là 45% so với
sucrose. Quan trọng hơn, trehalose có tính chất tương tự chức năng sucrose và có
thể được sử dụng trong thực phẩm và sản phẩm nước giải khát kết hợp v
ới số lượng
lớn sucrose và các chất ngọt khác để tối ưu hóa vị ngọt qua đó hương vị của các sản
phẩm được đánh giá cao hơn.


Hình 1.2. Độ ngọt của đường trehalose so với maltose, glucose, sucrose [10]
Trehalose dễ dàng hòa tan trong nước. Độ hòa tan của nó thấp hơn ở nhiệt độ
thấp nhưng cao hơn ở nhiệt độ cao so với sucrose.

Hình 1.3. Độ hòa tan trong nước của trehalose so với sucrose [10]
Do cấu trúc hóa học độc đáo, trehalose ổn định ở nhiệt độ cao và ở dãy pH
rộng. Vì vậy, trehalose là một trong những loại đường ổn định nhất. Khi 4% dung
Tổng quan

10
dịch trehalose ở pH 3,5-10 được đun nóng ở 100°C trong 24 giờ, không có sự thoái
hóa của trehalose được quan sát trong mọi trường hợp. Vì là đường không khử nên
trehalose không tham gia phản ứng Maillard với hợp chất amin như amino acid
hoặc protein trong quá trình chế biến và lưu trữ. Và không giống như các đường
đôi khác, bao gồm sucrose, trehalose sẽ không dễ dàng bị thủy phân hóa thành
glucose. Trong các sản phẩm thực phẩm và nước giải khát, sự ổn định cao trehalose
cho phép các đặc tính sản phẩm gốc đượ
c giữ lại ngay cả sau khi xử lý nhiệt và lưu
trữ lâu dài. [31]
Bảng 1.1. Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày [16]

Loại thực phẩm
Hàm lượng đường
Trehalose (%)
Lượng thực phẩm tiêu
thụ mỗi ngày (g/ngày)
Kem 10 16
Nước ép hoa quả và rau 10-20 4.8
Mứt kẹo 7-20 10
Lớp phủ kem trên bánh
ngọt
5 0.1
Thóc, gạo 2 19
Các sản phẩm từ bột mỳ 2 14
Bánh quy, bánh ngọt 5-10 40
Sản phẩm từ cá 10 0.3
Hỗn hợp khác 10-20 1.8

1.2.4. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể vi sinh vật [5]
1.2.4.1. Là một nguồn dự trữ năng lượng và carbon
Như đã nói ở trên, hàm lượng trehalose có thể khác nhau rất nhiều trong các
tế bào nhất định tùy thuộc vào giai đoạn của tăng trưởng, tình trạng dinh dưỡng, và
các điều kiện môi trường hiện hành. Trong côn trùng, trehalose là đường có nhiều
Tổng quan

11
nhất trong huyết tương (80-90%) và các cơ ngực. Trehalose là phân tử tích trữ năng
lượng lớn carbohydrate được sử dụng bởi côn trùng cho các chuyến bay.
Trehalose cũng là một thành phần quan trọng trong bào tử nấm. Trong quá
trình nảy mầm sự thủy phân trehalose được xem như là một nguồn cacbon để tổng
hợp và nguồn glucose cho năng lượng.
Ở vi khuẩn E coli, trehalose cũng được xem là một nguồn carbon và năng
lượng duy nhất [30].
1.2.4.2. Là một ch
ất ổn định và bảo vệ của các protein và màng
Bảo vệ tế bào khỏi mất nước: Một số sinh vật có thể tồn tại trong tình trạng
mất nước gần như hoàn toàn, ngay cả khi 99% lượng nước của chúng mất đi. Các
sinh vật này gồm các sinh vật thông thường như các thực vật, các tế bào nấm men,
bào tử nấm, cũng như những động vật nhỏ như giun tròn, luân trùng, và các nang
củ
a tôm biển. Nghiên cứu gần đây trên những sinh vật này đã chứng minh cơ chế
cho phép chúng tồn tại tình trạng mất nước. Những sinh vật này thường chứa nồng
độ trehalose cao. Người ta đã thấy rằng khi các giun tròn Aphelenchus avenae từ từ
mất nước, nó chuyển đổi đến 20% trọng lượng khô của nó thành trehalose. Khả
năng của sinh vật này và những sinh vật khác tồn tại khi không có nước đã thể hiện
m
ột sự tương quan mạnh mẽ với sự tổng hợp của trehalose. Việc nuôi cấy ở giai
đoạn pha log của nấm men có nồng độ thấp của trehalose và rất dễ bị mất nước,

nhưng khi chúng bước vào giai đoạn tăng trưởng với sự gia tăng hàm lượng
trehalose chúng có thể tồn tại trong tình trạng mất nước.
Khi gấu nước (tardigrades) thiếu nước, lượng đường glucose trong cơ th
ể
chúng thay đổi thành trehalose khi chúng vào một trạng thái gọi là cryptobiosis -
một trạng thái mà ở đó chúng xem như đã chết. Tuy nhiên, khi chúng nhận được
nước, chúng sống lại và trở về trạng thái trao đổi chất của chúng. Người ta cũng cho
rằng lý do ấu trùng ngủ chironomid của Polypedilum vanderplanki và Artemia có
thể chịu được mất nước là vì chúng lưu trữ trehalose trong các tế bào của nó. Ngay
cả trong giới thực vật, Selaginella (đôi khi được gọi là thực vậ
t sống lại) như
Selaginella dophylla-lepi và Myrothammus flabellifolius, phát triển ở khu vực sa
Tổng quan

12
mạc, miền núi, có thể bị nứt và khô, nhưng sẽ chuyển sang màu xanh trở lại và phục
hồi sau một cơn mưa vì chức năng của trehalose.
Bảo vệ chống lại nhiệt: Một nghiên cứu invivo và invitro quan trọng cho
thấy trehalose bảo vệ tế bào từ nhiệt bằng cách ổn định các protein ở nhiệt độ
cao. Sử dụng hai loại protein nhạy cảm nhiệt độ khác nhau, các nhà khoa học cho
thấy các enzyme th
ể giữ lại hoạt động được tốt hơn trong quá trình sốc nhiệt trong
các tế bào sản xuất được trehalose. Trong khi đó, nghiên cứu về sự phát triển ở
nhiệt độ cao của vi khuẩn Salmonella enterica đã cho thấy một sự tích lũy ở nồng
độ cao hàm lượng trehalose, cụ thể các tế bào phát triển ở nhiệt độ 45
o
C thì hàm
lượng trehalose tạo ra cao gấp 5 lần so với các tế bào phát triển ở 30
o
C [8].

Bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân oxi hóa: Ảnh hưởng của các gốc oxy vào
các tế bào là phá hủy axit amin trong protein của tế bào và sự hiện diện của nồng độ
cao của trehalose trong các tế bào sẽ ngăn ngừa các tác động này. Các đột biến
khiếm khuyết trehalose cho thấy một một lượng protein bị hư hỏng cao hơn ngay cả
sau khi tiếp xúc chỉ thời gian ngắn với các tác nhân oxy hóa. [21]
Là một thành phần c
ấu trúc của các tế bào vi khuẩn: Trong mycobacteria
và corynebacteria, trehalose là thành phần cơ bản của lớp glycolipid thành tế bào
dưới dạng trehalose glycolipid. Tuy nhiên ngoài chức năng về cấu trúc, thì chức
năng của các lipid này vẫn chưa được biết rõ.
1.2.5. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể con người
1.2.5.1. Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon
Trehalose không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột nên khi
ăn lượng đường hòa tan trong máu không bị bi
ến động. Trong gan, hoạt lực của
enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn saccharose nhưng sẽ được bình thường hóa bởi sự
cung ứng trehalose. Như vậy, trehalose có vai trò khá tích cực trong việc phòng và
chữa bệnh tiểu đường xét về góc độ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của
lipoprotein trong máu. Vì thế trehalose hiện nay được dùng nhiều như một chất thấp
năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng bị bệnh tiểu
đường.
Một nghiên cứu của các nhà khoa học trên những người mắc bệnh tiểu
Tổng quan

13
đường, nếu mỗi ngày mỗi người ăn 8g trehalose, lượng đường trong máu sẽ giảm
nhanh trong 14 ngày. [16]
1.2.5.2. Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose
Trehalose có thể tăng cường sự hấp thụ canxi của tế bào và trehalose có thể
tác động ức chế lên sự phát triển của loãng xương. Những kết quả này xa hơn cho

thấy nếu uống sử dụng thực phẩm có chứa trehalose hàng ngày có thể hữu ích cho
cả hai quá trình chuyển hóa xươ
ng và phòng ngừa chứng loãng xương. [31]
Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già. Cơ chế
thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều có một kết luận
chung là do ba yếu tố sau:
 Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lên men, làm
giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi
 Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường
có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tán vào
tế
bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi.
 Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của
hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tế
bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu. Ngoài canxi,
Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie. Điều này thúc đẩy
quá trình phát triển xươ
ng, tăng cường hàm lượng canxi trong xương.
1.2.5.3. Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong
khoang miệng
Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liên cầu
khuẩn gây nên. Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng của người và động
vật. Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinh dưỡng thích hợp dễ lên
men, phát triển và gây bệnh. Vì thế nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa
hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinh dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có
thể ngăn ngừa được bệnh. Để xét ảnh hưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người
ta đã tiến hành thí nghiệm trên cơ thể chuột. Kết quả cho thấy nhóm chuột thí
Tổng quan

14

nghiệm (ăn đường Trehalose) bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng
(ăn saccharose).
Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi
trường Trehalose đã chứng tỏ cơ chế và khả năng phòng bệnh sâu răng của nó. Đó
là do Trehalose không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật trên phát
triển.
Ngoài ra Trehalose còn có khả năng chữa bệnh sâu răng. Vì thế ngày nay
trên thế giới người ta còn dùng Trehalose thay thế cho đường kính trong thành phầ
n
ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu
răng. [16]
1.2.6. Con đường tổng hợp trehalose [7], [12]
Có ít nhất năm con đường sinh tổng hợp được biết đến với trehalose ( hình
1.5). Các con đường đầu tiên được phát hiện khoảng 50 năm trước, là phân phối
rộng rãi nhất. Cơ chế này lần đầu tiên được mô tả trong nấm men (Cabib và Leloir,
1958) và từ đó đ
ã được chứng minh và nó đã được tìm thấy trong sinh vật nhân
thật, cổ khuẩn, nấm, côn trùng và thực vật. Nó bao gồm hai bước enzyme xúc tác
bởi synthase trehalose-6-phosphate (TPS) và trehalose-phosphatase (TPP). TPS xúc
tác chuyển glucose từ glucose-UDP và glucose-6-phosphate tạo thành trehalose-6-
phosphate (T6P) và UDP, trong khi enzyme TPP phosphoryl hóa khử T6P thành
trehalose và phosphate vô cơ.
Trong con đường sinh tổng hợp thứ hai, enzym trehalose synthase (TS)
isomer hóa liên kết α1-α4 của maltose thành một kết α1-α1, tạo thành trehalose.
Con đường thứ ba liên quan đến chuyển đổi maltodextrine
(maltooligosaccharides, glycogen và tinh bột) thành trehalose. Con đường này tồn
tại trong cổ ưa nhiệt
Sulfolobus. Những sinh vật này tổng hợp trehalose trong hai
bước enzyme xúc tác bởi enzym trehalose synthase maltooligosyl (Trey), được mã
hóa bởi các gen Trey, thúc đẩy sự glycosyl hóa các phân tử glucose cuối cùng vào

cuối chuỗi maltodextrins từ liên kết α1-α4 đến liên kết α1-α1 tạo thành
Tổng quan

15
maltooligosyltrehalose. Tiếp theo, enzyme maltooligosyl trehalose trehalohydrolase
(TreZ), được mã hóa bởi các gen treZ, xúc tác sự thủy phân tạo thành trehalose.
Trong con đường thứ tư, trehalose phosphorylase (TreP), hiện diện ở một số
nấm, xúc tác sự thủy phân thuận nghịch của trehalose với sự hiện diện của
phosphate vô cơ. Việc chuyển một phân tử glucose và một phosphate để tạo ra
glucose-1-phosphate và tạo ra các phân tử glucose khác. Tuy nhiên, không có sự
chắc chắn về sự tham gia của các enzyme TreP trong tổng hợp hoặc thoái hóa của
trehalose, vì các phản ứ
ng sinh tổng hợp chỉ được thể hiện trong ống nghiệm.

Hình 1.4. Sự phân bố các con đường sinh tổng hợp Trehalose trong tự
nhiên [7]
Một con đường sinh tổng hợp mới cho trehalose được tìm thấy trong các cổ
khuẩn chịu nhiệt cực đoan Thermococcus litoralis, và liên quan đến enzyme
trehalose glycosyltransferring synthase (TreT) xúc tác hình thành thuận nghịch của
trehalose từ ADP-glucose và glucose. Nó cũng có thể sử dụng UDP-glucose và
GDP glucose, mặc dù nó ít hiệu quả với các cơ chất khác.
Trehalose được phân hủy bởi enzyme trehalase (TreH) thành hai phân tử
glucose.
Tổng quan

16
Hình 1.5. Các con đường tổng hợp Trehalose [7]
Các trình tự hoàn chỉnh các gen mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp
trehalose được phân tích và đã cho thấy rằng các enzyme này phân bố rộng khắp
trong ba giới của sự sống và nhiều sinh vật có nhiều hơn một con đường để tổng

hợp trehalose (hình 1.4).

A Con đường TPS/TPP
UDP Glucose
+
Glucose 6-phosphate
Trehalose 6-phosphate Trehalose
Trehalose 6-
p
hosphate
synthase (TPS)
Tre
h
alose 6 phosphate
phosphatase (TPP)
B
Con đường TS
Maltose Trehalose
Trehalose synthase ( TS)
C
Con đường TreY/TreZ
Maltooligosaccharides
Tinh bột hoặc glycogen
maltooligosyltrehalose Trehalose
Maltooligosyl trehalose
synthase (Trey)
Maltooligosyl trehalos
e

trehalohydrolase (TreZ)

D Con đường TreP
Glucose 1-
p
hosphate
+
glucose
Trehalose
+
Pi
Trehalose phosphorylase
(TreP)
E Con đường TreT
ADP-Glucose
+
Glucose
Trehalose
+
ADP
Trehalose glycosyltransferring
synthase (TreT)
F
Con đường TreH
Trehalose
D-Glucose
+
D-Glucose
Trehalase( TreH)