TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CHITINASE TỪ NẤM TRICHODERMA

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


NGUYỄN BẢO HƯNG



TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CHITINASE
TỪ NẤM TRICHODERMA


CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ SỐ: 60.42.30




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC


2




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS NGUYỄN HOÀNG LỘC

Huế, 2010



LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.
Người cam kết
Nguyễn Bảo Hưng





3










Lời cảm ơn

Trong suốt quá trình làm việc, ngoài sự nổ lực của bản thân, em đã nhận
được sự giúp đở nhiệt tình của quý thầy cô, anh chị kỹ thuật viên ở Viện Tài
nguyên Môi trường và Công Nghệ Sinh Học, em xin chân thành cảm ơn.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành nhất đến thầy PGS.TS
Nguyễn Hoàng Lộc, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, giúp em
vững tin trên con đường mình đang đi.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân của
mình đã khích lệ, động viên tinh thần cho em trong suốt thời gian học tập và
làm việc.
Trong quá trình làm việc, bước đầu làm quen với chuyên môn có thể mắc
nhiều sai sót, em sẽ cố gắng hoàn thiện mình để ngày một trưởng thành hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Huế, tháng 11 năm 2010
Nguyễn Bảo Hưng

4

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục Lục
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Mở đầu
Chương 1. Tổng quan
1.1. Tổng quan về chitinase
1.1.1. Giới thiệu chitinase
1.1.2. Tình hình nghiên cứu chitinase

1.1.3. Khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật của
chitinase.
1.2. Tổng quan về nấm Trichoderma
1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma
1.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma
1.2.3. Khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng và cơ chế tác
động của nấm đối kháng Trichoderma
1.2.3.1. Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh
cây trồng
5

1.2.3.2. Cơ chế tác động của nấm Trichoderma lên các tác nhân gây bệnh
cây trồng
1.3. Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp
1.3.1. Giới thiệu chung
1.3.2. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme
1.4. Tình hình nghiên cứu về chitinase tái tổ hợp
1.5. Tạo dòng và biểu hiện gene trong E.coli
1.6. Tạo dòng và biểu hiện gen trong nấm men
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Xác định chủng Trichoderma sinh chitinase ngoại bào mạnh
2.2.2. Xác định hoạt tính chitinase
2.2.3. Tách chiết chitinase
2.2.4. Xác định khối lượng phân tử của chitinase
2.2.5. Định danh chủng nấm Trichoderma
2.2.5.1. Tách chiết genomic DNA
2.2.5.2. Tạo dòng trình tự ITS
2.2.5.3. Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase

2.2.6. Các phương pháp thống kê sinh học
Chương 3. Kết quả và thảo luận
3.1. Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma tiết chitinase ngoại bào mạnh
6

3.2. Xác định hoạt độ chitinase bằng phương pháp quang phổ
3.3. Xác định khối lượng phân tử của enzyme chtinase
3.4. Định danh chủng nấm
3.5. Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase
Chương 4. Kết luận
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

















7

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
CS: cộng sự
IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
BMV: brome mossaic virus
TMV: Tobacco mosaic virus
RT-PCR: reverse transcription-polymerase chain reaction
PCR: Polymerase Chain Reaction
















8

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Hình 3.1. Vòng phân giải chitin của các chủng nấmTrichoderma spp.
Hình 3.2. Điện di SDS và điện di cơ chất
Hình 3.3. Phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4

Hình 3.4. So sánh trình tự ITS của chủng SH16 với chủng ZJPH0810
Hình 3.5. Phản ứng PCR với cặp mồi C42R và C42F
Hình 3.6. So sánh trình tự các gen chitinase phân lập được và gen ech42.
Dấu
* thể hiện sự giống nhau trong trình tự của các gen.
Hình 3.7. Vector pYES2/NT A có mang gen chi42-SH16
Hình 3.8. Kiểm tra sự hiện diện của gen chi42-SH16 trong nấm men tái tổ
hợp
Hình 3.9. Hoạt tính chitinase tái tổ hợp theo thời gian cảm ứng
Danh mục bảng
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của Trichoderma trên môi
trường cảm ứng
Bảng 3.2.Hoạt độ chitinase của các chủng Trichoderma spp.






9

MỞ ĐẦU
Cây trồng nông nghiệp bao gồm các loại rau và ngũ cốc như: rau ăn lá, ăn
quả, củ, đậu đỗ, lúa, ngô, khoai, sắn… giữ vai trò quan trọng trong bữa ăn
hàng ngày của từng gia đình và là nguồn hàng xuất khẩu có giá trị. Tuy nhiên,
đây là loại cây trồng có những đặc điểm hình thái và sinh trưởng thuận lợi cho
các loại sâu và nấm bệnh sống ký sinh. Sức tàn phá của các loại sâu và nấm
bệnh này nhiều khi rất lớn, gây tổn thất nghiêm trọng về năng suất và chất
lượng của cây trồng [15].
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, vì thế thích hợp cho nhiều loại sâu

và nấm bệnh gây hại cây trồng nông nghiệp phát triển. Các loại nấm bệnh gây
hại thường gặp ở cây trồng như Rhizoctonia gây bệnh thối gốc (lở cổ rễ),
Fusarium gây bệnh héo rũ, thối khô, Alternaria gây bệnh đốm vòng… Để hạn
chế tác hại của nấm bệnh, một trong những phương pháp có hiệu quả là sử
dụng hóa chất và thuốc trừ sâu bệnh. Tuy nhiên, việc làm này gây tác hại lâu
dài với môi trường và sức khoẻ của cộng đồng [10]. Hiện nay, công nghệ sinh
học ngày càng phát triển đã mở ra một hướng đi mới trong việc ngăn ngừa tác
hại của sâu và bệnh hại cây trồng nhưng vẫn bảo vệ được môi trường như tạo
ra các cơ thể tái tổ hợp có khả năng kháng lại các loại sâu bệnh [74], [75].
Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen)
là một bộ phận quan trọng và là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ
sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh
học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng trong sự phát triển của
sinh học. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập và khuếch đại một
gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển
nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Cải thiện hoạt tính và khả năng tổng
hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi
[69], trong đó có tạo dòng và sản xuất chitinase [43], [64], [56].
10

Chitinase là một enzyme glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân chitin, có
trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật
không xương sống, thực vật và động vật có xương sống. Chitinase thực vật là
các enzyme xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh. Tuy nhiên, không phải
cây trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase
của chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh, vì vậy việc tạo ra một chủng sinh
vật có khả năng sản xuất enzyme này với lượng lớn và hoạt tính cao là có ý
nghĩa rất lớn [46].
Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen
chitinase trong Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiea và các loại vi

khuẩn khác đã được công bố, như nghiên cứu của Boer và cộng sự (2007) về
biểu hiệu gen chit33 và chit42 của Trichoderma harzianum trong E. coli [32],
biểu hiện gen chitinase của Serratia marcescens trong các chủng
Sinorhizobium fredii USDA191 và S. meliloti RCR2011 (Krishnan và cs
1999), biểu hiện gen chitinase của T. aureoviride trong nấm men S. cerevisiae
(Jinzhu và cs 2005)...
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tạo dòng và
biểu hiện gen chitinase từ nấm Trichoderma ” nhằm mục đích sản xuất
enzyme này với hiệu suất cao hơn các sinh vật truyền thống, từ đó áp dụng
vào sản xuất nông nghiệp phòng trừ nấm bệnh trên một số cây trồng kinh tế
như rau, quả hoặc các loại ngũ cốc.





11

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE
1.1.1. Giới thiệu chitinase
Chitinase (poly (1,4-N-acetyl-β-glucosaminide) glucanhydrolase) là
enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase thủy phân liên kết 1,4-N-acetyl-β-
glucosaminide (β-1,4-GlcNAc) của chitin. Chitinase được tạo ra từ nhiều sinh
vật, từ những loài có thành phần cấu trúc là chitin như nấm, côn trùng, giáp
xác, đến những loài không có chitin như vi khuẩn, thực vật... Ở những sinh
vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình
thái và phân chia tế bào. Các sinh vật khác tổng hợp chitinase với các mục
đích khác nhau. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo ra nguồn
carbon. Ở thực vật và động vật chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác

nhân gây bệnh như nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm [46].
Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó. Chitin là
polysaccharide được tạo thành nhờ liên kết β-1,4 của các đơn phân N-
acetylglucosamine, một trong những dạng polysaccharide phổ biến trong tự
nhiên. Chitin là thành phần chủ yếu trong cấu trúc bộ xương ngoài của các
loài côn trùng, vỏ giáp xác và thành tế bào nấm [46].
Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng và có chứa nitrogen.
Chitin không tan trong nước và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong hexa
fluro isopropanol, hexa fluroacetone... Hàm lượng nitrogen của chitin chiếm
từ 5-8%, khối lượng phân tử trung bình từ 1,03×10
6
-2,5×10
6
Da. Trong môi
trường base, chitin bị deacetyl tạo thành chitosan (-NHCOCH
3
→ -NH
2
) [50].



12

1.1.2. Tình hình nghiên cứu chitinase
Chitinase lần đầu tiên được mô tả bởi Bernad (1911) trong thí nghiệm
khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến chitinase và khả năng khuếch tán nhân tố
kháng nấm ở cây hoa phong lan [12]. Năm 1929, Karrer và Hofmann đã
nghiên cứu đặc tính của enzyme này trong ốc sên [38]. Sau này, những khảo
sát của Jeuniaux (1966) đã mở ra những hướng nghiên cứu mới về chitinase [34].

Năm 1991, Henrissat dựa trên sự tương đồng trình tự amino acid ở vùng
xúc tác đã phân loại nhóm protein glycosyl hydrolases thành hơn 50 họ trong
đó chitinase được chia thành hai họ 18 và 19 (gồm những enzyme thuộc EC
3.2.1.14 và EC 3.2.1.52) [35].
Năm 1993, Henrissat và Bairoch phân loại thêm những enzyme từ các loài
Flavobacterium, endo-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.96) vào họ 18.
Những protein này phân cắt liên kết β 1,4-N-GlcNAc thành các manosyl
glycoprotein. Các protein thuộc hai họ 18 và 19 hoàn toàn khác nhau về cơ
chế xúc tác, trình tự amino acid cũng như cấu trúc không gian do đó chúng
được cho là có nguồn gốc tiến hóa khác nhau. Hai họ này chứa cả
endochitinase và exochitinase [36].
Chitinase họ 18 bao gồm những chitinase từ thực vật (Arabidopsis, dưa
leo, cây họ đậu, thuốc lá...), nấm (Aphanocladium, Rhizopus,
Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia,
Streptomyces...), virus và động vật… Các chitinase họ 18 thủy phân các liên
kết GlcNAc-GlcNAc, GlcNAc-GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình
anomeric. Hoạt tính của các chitinase họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [36].
Ở Việt Nam, gần đây chitinase mới được quan tâm nghiên cứu do những
ứng dụng của nó trong việc xử lý môi trường và khả năng ức chế chống lại
nấm bệnh hại cây trồng. Một số công trình đã được công bố như: Nghiên cứu
13

chitinase và β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát
sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật [9]; Khảo sát hoạt tính các
hệ enzyme thủy phân chiết tách từ môi trường nuôi cấy Trichoderma sp. và
thử nghiệm ứng dụng chế biến phân hữu cơ vi sinh [13]. Tuy nhiên, nghiên
cứu về chitinase vẫn còn là vấn đề mới mẻ tại Việt Nam.

1.1.3. Khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật của
chitinase

Đặc tính sinh học của chitinase đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và
ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau. Nhiều công trình trên thế giới cho
thấy chitinase có khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật
[44], [51], [60].
Ở thực vật, việc sản xuất chitinase được xác định là một cơ chế bảo vệ cây
trồng trước những nhân tố gây bệnh. Đối với các tác nhân gây bệnh như nấm
hay côn trùng chứa chitin, phản ứng tự vệ chính của thực vật là tạo ra
chitinase. Hầu hết chitinase được tạo ra tại cơ quan bị nhiễm nấm hay côn
trùng [25].
Nhiều chitinase sinh ra khi bị nhiễm virus. Từ lá cây thuốc lá bị gây nhiễm
virus khảm thuốc lá, Legrand và cs (1987) đã tìm ra 2 chitinase P và Q [44].
Có tới 13 loại chitinase (6 loại chitinase acid và 7 loại chitinase base) được
phát hiện khi điện di mô lá cây thuốc lá bị nhiễm TMV và một trong số chúng
được tìm thấy từ những mô khỏe mạnh. Nghiên cứu của Metraux và cs (1988)
cho thấy dưa chuột bị nhiễm TMV cũng sinh ra chitinase [61]. Ở cây ngô,
BMV kích thích tiết ra chitinase có tên là PrmBa2 và PRm3, 4, 5 và 7.
Ở mô bị thương, nhiễm vi sinh vật và nhiễm nấm người ta cũng thấy có sự
xuất hiện chitinase. Theo nghiên cứu của Hedrick và cs (1988), trong tế bào
hạt đậu nuôi cấy huyền phù và trong đoạn trụ dưới mầm, chitinase được tổng
14

hợp sau khi được gây nhiễm với nấm bệnh [20]. Khi bị kích thích 10 lần trong
5 phút gen chitinase phiên mã rất nhanh chóng. Ở cây đậu Hà Lan sau khi bóc
sạch vỏ hạt bị nhiễm nấm, người ta đã thu được 2 loại chitinase. Hai loại
chitinase này tương ứng với những enzyme mà Bernasconi và cs (1987) tìm
thấy trong Parthenocissus bởi [51].
Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng chitinase có khả năng phân hủy thành
tế bào sợi nấm, ngăn cản sự nảy mầm và phát triển của sợi nấm trong điều
kiện phòng thí nghiệm. Nấm Trichoderma tiết ra ngoại bào enzyme chitinase
tấn công trực tiếp nhiều loài nấm gây bệnh như Rhizotonia solani, Fusarium

solani [59]. Hai enzyme CHIT42 và CHIT33 từ nấm T. harzianum là yếu tố
cơ bản trong quá trình đối kháng với các loại nấm khác. Hệ thống gen mã hóa
cho chitinase từ các loài Trichoderma đã được giải mã, tạo dòng và chuyển
vào cây trồng [60].
Theo Jollès và Muzzarelli (1999), các loài nấm mốc như Trichoderma,
Gliocladium... cho hàm lượng chitinase cao. Nấm Trichoderma khi ký sinh
trên nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của thành tế bào nấm
gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme β-1,4-N-acetylglucosaminidase và 4
enzym endochitinase. Robert và Selitrennikoff (1988) cũng đã nghiên cứu
hoạt tính kháng nấm của chitinase thực vật và chitinase vi khuẩn, các tác giả
cho rằng chitinase phân lập từ hạt cây lúa mì, lúa mạch và ngô có hoạt tính
phân cắt nội mạch phân tử cơ chất và ức chế sự kéo dài sợi nấm. Trái lại,
chitinase phân lập từ nấm men Saccharomyces marcescens, S. griseus và vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri có hoạt tính phân cắt cơ chất từ đầu không khử,
không ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm Tetranichus reesei và
Phycomyces blackesleeanus [59]. Tuy nhiên, theo Ordentlich và cs (1988),
khi có sự hiện diện của S. marcescens, bệnh do nấm Sclerotium rolfsii trên hạt
đậu phát triển chậm hơn. Shapira (1991) đã tạo dòng gen chitinase từ S.
15

marcescens và nhận thấy trong điều kiện nhà kính chitinase tạo ra có tác dụng
kìm hãm sự phát triển của bệnh do nấm S. rolfsii gây ra trên cây đậu và nấm
R. solani trên cây bông.

1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM TRICHODERMA
1.2.1. Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma
Khái niệm sử dụng nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây trồng
có từ những năm 1930, người đầu tiên đề xuất vấn đề này là Weinding
(Seiketov, 1982). Tác giả này đã đề nghị dùng nấm Trichoderma để trừ nấm
Rhizoctonia gây bệnh thối cây con mới mọc ở cam quýt. Weinding đã ghi

nhận rằng xử lý đất bằng nấm Trichoderma có thể bảo vệ được cây con mới
mọc từ hạt không bị bệnh. Từ đó, các nghiên cứu về nấm Trichoderma nhằm
sử dụng chúng để trừ bệnh hại cây trồng đã được tiến hành ở nhiều nước trên
thế giới. Cho đến nay, có khoảng 30 nước nghiên cứu sử dụng nấm
Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng như Nga, Mỹ, Anh, Pháp, Đức,
Hungary, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Malaysia [18].
Nhiều nước Châu Âu đã nghiên cứu sản xuất và sử dụng nấm Trichoderma
để phòng chống hơn 150 loài bệnh hại trên 40 loại cây trồng khác nhau [2].
Ở Việt Nam, nhóm nấm này đã được quan tâm nghiên cứu đầu tiên trong
việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng với sinh vật gây bệnh trên cây trồng.
Công việc này được bắt đầu từ năm 1987 tại Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ
thực vật, sau đó các nghiên cứu này cũng được tiến hành tại Đại học Nông
Nghiệp I Hà Nội [2]. Từ năm 1990, nguồn nấm Trichoderma bản địa đã được
phân lập để nghiên cứu cơ chế đối kháng, điều kiện ảnh hưởng đến sinh
trưởng phát triển của chúng. Những chủng nấm Trichoderma bản địa có hiệu
quả ức chế khá cao (67,8-85,5 %) đối với các nấm gây bệnh như Rhizoctonia
solani, Sclerotium rolfsii, Boytrytis cinerea, Aspergillus niger, Fusarium sp.
16

Nấm Trichoderma cho hiệu quả ức chế nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh héo
rũ gốc mốc trắng ở lạc và nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn trên ngô
tương ứng đạt hơn 90% và 42,2-45,3% (thí nghiệm ô nhỏ). Trong vụ đông,
nấm Trichoderma làm giảm 51,3-59,8 % cây ngô bị khô vằn (thí nghiệm ô
ruộng) [2].
Hiện nay, việc phân loại nấm Trichoderma vẫn chưa được thống nhất.
Theo Esposito và Silva (1998), Trichoderma thuộc lớp Ascomycetes, họ
Hypocreaceae và gồm 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum,
Satunisporum, Pachybarium và Hypocreanum. Theo Samuels (2004), nấm
Trichoderma thuộc lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae.
Theo Agrios (2001) thì nấm Trichoderma thuộc ngành phụ 4 Deuteromycota,

lớp Hyphomycotes, bộ Hyphales (Moniliales) [14]. Cho đến nay có ít nhất 33
loài Trichoderma đã được tìm thấy.

1.2.2. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma
Trichoderma là một loại nấm đất, chúng phát triển tốt trên các loại đất giàu
dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật. Do đó, Trichoderma có khả năng sử
dụng hỗn hợp carbon và nitrogen làm nguồn dinh dưỡng. Nguồn carbon và
năng lượng Trichoderma sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với
hỗn hợp polysaccharide, amino acid… Đặc biệt acid béo, methanol
methylamine và NH
3
là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi
cấy Trichoderma. Muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp vitamin cũng có ảnh
hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma. Tuy nhiên, muối
sodium chloride làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số loài
Trichoderma. Do vậy, trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma
không được có mặt của loại muối này [9].
Hầu hết các loài Trichoderma phát triển mạnh ở nhiệt độ 24-28
0
C, một số
17

loài phát triển tốt ở 35
0
C, thậm chí ở 40
0
C [11].
Theo Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự (2004), nhiệt độ ảnh hưởng đến lên
men sinh khối của Trichoderma, nhiệt độ thích hợp là 28-34
0

C, tối ưu là 30-
32
0
C. pH thích hợp để nấm Trichoderma phát triển là 5-6, khi pH > 6 sinh
trưởng của nấm sẽ yếu dần, pH < 4 sinh trưởng của nấm rất yếu [9].

1.2.3. Khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng và cơ chế tác
động của nấm đối kháng Trichoderma spp.
1.2.3.1. Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm gây
bệnh cây trồng
Nhóm nấm Trichoderma là một trong những nhóm nấm có khả năng đối
kháng với các vi sinh vật khác thông qua việc tiết ra các chất kháng sinh, men
rượu, các chất có hoạt tính sinh học cao tạo khả năng ức chế các nấm hại phát
sinh từ đất như Sclerotium, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia
gây bệnh trên các loại cây họ đậu, cây ăn trái, cây hòa thảo, cây công nghiệp
và cây hoa cảnh [2].
Với nguồn tài liệu chưa đầy đủ, Trần Thị Thuần (1996) đã thống kê được
khoảng 150 loài vi sinh vật (chủ yếu là nấm) gây bệnh trên gần 40 loại cây
trồng đã được nghiên cứu phòng trừ bằng nấm Trichoderma. Các nghiên cứu
này được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính, nhà lưới và
ngoài đồng ruộng [13].
Nhiều nghiên cứu trên đồng ruộng đã cho thấy hiệu quả trừ bệnh của nấm
Trichoderma. Ở Nam Mỹ, nấm T. harzianum có hiệu quả cao trong phòng trừ
các loài nấm Pythium spp., R. solani gây bệnh chết héo đậu đỗ và củ cải (Chet
và cs, 1981). Hiệu quả ức chế bệnh do R. solani gây trên khoai tây của nấm T.
harziamun đạt tới 89% tại Ấn Độ (Singh và cộng sự, 1995). Nấm T. viride
18

làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh thán thư (do C. truncatum gây ra) trên cây đậu
đũa ở Nigeria (Bankole và cộng sự, 1996). Cũng tại Ấn Độ, nấm T. viride có

thể ức chế sự phát triển của bệnh do R. solani gây ra trên khoai tây, hiệu quả
ức chế đạt tối đa là 83,4% (Singh và cộng sự, 1995) [13].
Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thiên Trang (2004) [6]
cho thấy các loài T. harzianum, T. minutisporum, T. koningii, T. viride và T.
asperellum phân lập tại một số điểm điều tra của tỉnh Đak Lak đều có tính đối
kháng với nấm bệnh hại cây như Fusarium solani, Fusarium sp1, Fusarium
sp2, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia sp1, Rhizoctonia sp2. Trong đó có T.
harzianum là loài có khả năng đối kháng mạnh nhất đối với một số loài nấm
bệnh.
Đỗ Tấn Dũng (2006) tiến hành khảo sát hiệu lực đối kháng của nấm T. viride
với bệnh héo rũ gốc mốc trắng hại đậu tương và cây lạc trong điều kiện thí
nghiệmnhận thấy nấm T. viride có thể sử dụng để phòng trừ bệnh héo rũ gốc
mốc trắng hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh rất cao, đạt tới 86,5%
(trên cây lạc) và 94,4% (trên cây đậu tương) [3].
Ngoài ra nấm Trichoderma còn có khả năng phòng trừ một số bệnh như T.
harzianum trừ bệnh mốc xám (Botrytis cinera), bệnh gỉ sắt (Puccinia
arachidis), bệnh thối hạch (Sclerotinia sclerotiorum) và bệnh đốm vòng
(Aternaria solani); T. viride phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc đen (A. niger),
bệnh thối đọt mía (Ceratocystis paradoxa) và bệnh héo cây mía (F.
moniliforme). Bên cạnh đó, nấm T. viride còn có tác dụng trong khống chế
sinh học với một số loại tuyến trùng như Meloidogyne và Heterodera. Nấm T.
viride có khả năng hạn chế tuyến trùng trong tự nhiên với cơ chế cạnh tranh
thức ăn và vị trí nơi chúng sinh sống [2].
Tóm lại, những kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà lưới, nhà
kính và ở ngoài đồng ruộng về hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đã
19

cho thấy nhóm nấm Trichoderma rất có triển vọng trong phòng trừ nhiều loại
bệnh hại cây trồng.

1.2.3.2. Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp. lên các tác nhân gây
bệnh cây trồng
Sự đối kháng của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng thông qua
nhiều cơ chế. Cơ chế thường xuyên nhất được đề xuất bao gồm khả năng ký
sinh, các sản phẩm kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào, cạnh tranh
dinh dưỡng và không gian [47], [54].
Weidling (1932) là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi của
Trichoderma. Khi dùng Trichoderma chống R. solani, Weidling và Emerson
(1946) đã phân lập được chất kết tinh từ chất trao đổi hữu cơ rất độc khi pha
loãng nhiều lần, chất này có tên là gliotoxin. Chất độc thứ hai do Brian và Mc
Growan (1944) công bố là viridin thu nhận từ T. viride. Tùy thuộc vào loài
nấm mà tạo ra các loại kháng sinh và enzyme khác nhau. Nấm T. viride sinh
ra các kháng sinh như viridin, trichodermin, xosukacylin, almatecin hoặc các
vitamin, cacbohydrate, nitrogen nhờ vậy làm đất tốt. Ngoài các kháng sinh,
nhiều nghiên cứu cho thấy Trichoderma còn có khả năng sinh ra các enzyme
phân hủy thành tế bào nấm gây bệnh như chitinase [18], [22], [38], β-1,3-
glucanase [50], protease [27], [34], mannase và hydrolase [45], [58].
Theo Nguyễn Đức Lượng và cs (2003), Trichoderma có thể đối kháng với
nhiều loại vi sinh vật nhờ nhiều cơ chế khác nhau như cạnh tranh dinh dưỡng
và không gian, ký sinh hoặc quấn lấy sợi nấm gây bệnh, tạo ra kháng sinh hay
tiết ra các enzyme hoặc quấn lấy sợi nấm gây bệnh tạo chitinase, β-1,3-
glucanase. Nhóm nghiên cứu đã chứng minh được rằng các chitinase và
cellulase của nấm T. harzianum có tác động phân hủy thành sợi nấm
Sclerotium rolfsii, sợi nấm nhăn nheo, đứt rạn và biến dạng. Theo các tác giả,
20

ngoài khả năng kiểm soát mầm bệnh thực vật Trichoderma còn có khả năng
cải tạo đất trồng làm tăng độ phì nhiêu cho đất nhờ khả năng phân giải một số
phân lân khó hòa tan do nhiều enzyme phân hủy ngoại bào như cellulase.
Dưới tác động của các enzyme, chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thu cho cây

trồng, tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt [31].

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP
1.3.1. Giới thiệu chung
Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sự
phát triển các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình
sinh học ở mức độ phân tử. Từ đó cho phép phân lập, phân tích và thao tác
trên các gen theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu biết sâu sắc các
lĩnh vực mới của sinh học như công nghệ sinh học, bào chế các loại thuốc
mới, y học phân tử và liệu pháp gen [8].
Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen
hay kỹ thuật gen…) là tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến
đổi và nghiên cứu các đoạn DNA. Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường
xuyên do mục tiêu của nó là kết hợp DNA từ hai nguồn xa nhau. Ví dụ: các
gen từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gen
người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn [7].
Mục đích việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sản phẩm
đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại. Sự biểu hiện
của các gen trong tế bào vi khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó cần phải thiết
kế các vector biểu hiện thích hợp cho phép gen ngoại lai biểu hiện ở mức độ
cao [49].
Ở Việt Nam, gần đây cũng có một số thành tựu nổi bật nghiên cứu về gen
như Nguyễn Quỳnh Anh và cs (2003) đã thành công trong việc tạo dòng và
21

biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP19 của virus WSSV gây hội chứng đốm
trắng ở tôm sú tại Việt Nam, góp phần trong việc giám sát, phòng ngừa dịch
bệnh do WSSV gây ra [1]. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã biểu hiện
thành công gen protease trung tính (nprC10) của chủng B. subtilis C10 trong
E. coli BL21 (DE3) sử dụng vector biểu hiện pET200/D-TOPO [49].

1.3.2. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme
Công nghệ DNA tái tổ hợp hiện nay có rất nhiều ứng dụng trong đời sống.
các ứng dụng này bao gồm sản xuất dược phẩm, các loại hóa chất khác và các
cây trồng nông nghiệp quan trọng…[7], trong đó có ứng dụng để sản xuất
enzyme tái tổ hợp như glucose oxidase [53], endochitinase [16], [56]
Vào những năm 1990, nhiều enzyme đã được sản xuất bởi công nghệ
DNA tái tổ hợp. Năm 1993, hơn 50% thị trường enzyme công nghiệp được
cung cấp bởi các quá trình tái tổ hợp [37], với doanh thu đạt 140 triệu USD
[65]. Phytase thực vật sản xuất bởi A. niger tái tổ hợp được sử dụng như một
loại thức ăn cho khoảng 50% tổng số lợn ở Hà Lan. Nhờ công nghệ DNA tái
tổ hợp mà việc sản xuất phytase ở A. niger đã tăng 1000 lần so với phương
pháp sản xuất truyền thống [33]. Hơn 60% các loại enzyme được sử dụng
trong các ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm và tinh bột là
các sản phẩm tái tổ hợp [24].
Năm 2002, có khoảng 140 protein được dùng để chữa bệnh có nguồn gốc
từ các quá trình tạo dòng và biểu hiện gen được thừa nhận ở Mỹ và châu Âu,
trong đó chủ yếu là các enzyme [17]. Protein không glycosyl hóa thường
được sản xuất bởi E. coli và nấm men, chúng góp phần tạo ra 40% protein trị
liệu trên thị trường. Protein glycosyl hóa được tổng hợp trong tế bào động vật
có vú. Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và các tế bào côn trùng nói chung không
có khả năng glycosyl hóa như tế bào động vật có vú. Tuy nhiên, hiện nay
22

nhiều chủng đã được biến đổi di truyền để sản xuất các protein được glycosyl
hóa như ở người [26].

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE TÁI TỔ HỢP
Từ lâu, gen chitinase của nhiều đối tượng sinh vật khác nhau như thực vật,
vi sinh vật, nấm… đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Việc tạo

dòng và biểu hiện gen này trong một đối tượng khác nhằm khai thác tối đa
hiệu suất của gen chitinase đã được nghĩ tới từ lâu. Các vật chủ thường được
các nhà nghiên cứu chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có khả năng
sinh trưởng và phát triển nhanh như E. coli, nấm men (Saccharomyces,
Pichia) [30], [64], [56].
Ping và cs (2008) đã tạo dòng, phân tích trình tự và biểu hiện gen
endochitinase của Trichoderma sp vào E. coli BL21, DNA và cDNA của gen
này sau khi phân tích trình tự có kích thước tương ứng là 1.476 và 1.275 bp,
trình tự cDNA sau đó được tạo dòng vào vector pET-28a+ và chuyển vào E.
coli BL21. Sau đó dòng E. coli mang vector pET biến nạp được phân lập,
nuôi 30
0
C để cảm ứng sinh enzyme. Băng enzyme được phát hiện bằng điện
di SDS-PAGE và phân tích hoạt tính đạt 70,2 U/mg protein. Quá trình tối ưu
sự biểu hiện của enzyme này cho thấy enzyme này hoạt động tốt ở pH 7 và
nhiệt độ 35
0
C, sự có mặt của các ion Mg
2+
, Fe
2+
làm tăng khả năng hoạt động
của enzyme này [56].
Một nghiên cứu khác của Shimosaka và cs (2001) đã tạo dòng và biểu hiện
2 gen chiA và chiB mã hóa cho 2 enzyme chitinase A và B (ChiA và ChiB)
được phân lập từ vi khuẩn Burkholderia gladioli CHB101 vào E. coli, 2
enzyme này có độ dài tương ứng là 343 và 307 amino acid và thuộc 2 họ 18
và 19 của nhóm enzyme thủy phân (glycosyl hydrolases) [61]. Một gen
chitinase dài 1.047 bp đã được phân lập từ hệ gen của Beauveria bassiana
23

BCC3653 bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi có trình tự cắt hạn chế của 2
enzyme 5’-EcoRI và 3’-HindIII. Sản phẩm PCR sau đó được tạo dòng và biểu
hiện bằng vector pSE420, plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào chủng E. coli
TOP10 và sử dụng IPTG để cảm ứng cho quá trình biểu hiện. Enzyme tái tổ hợp
sau đó được phân tích hoạt tính bằng phương pháp phân giải glycol chitin [64].
Ngoài các nghiên cứu đơn lẻ về chitinase tái tổ hợp thì một số nước quan
tâm nhiều đến vấn đề nông nghiệp có các chương trình riêng cho việc nghiên
cứu về enzyme này. Như ở Ai Cập, chính phủ đã giao cho nhóm Hamshary và
cs (2008 ) đã chủ trì chương trình sàng lọc gen chitinase từ các đối tượng như
B. thuringiensistenebrionis (tt4); B. thuringiensisisrae-lensis (NRRL HD-
522); B. thuringiensis Berliner ACCC 10061…Người ta đã sàng lọc được gen
này từ 66 mẫu phân lập, kết quả cho thấy trình tự gen phân lập được giống
96% so với chủng B. thuringiensis Hakam (mã số: ABK86590) và được đăng
ký trên GenBank với mã số EU734811 [30].
Bên cạnh việc phân lập gen chitinase từ những vi sinh vật có trong đất
hoặc trong các giá thể ở trên cạn, Các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã phân lập
gen này từ môi trường nước. Shimosaka và cs (2006) đã phân lập gen
chitinase từ chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila SUWA-9 trong nước hồ
Lake Suwa (Nagano Prefecture, Nhật Bản). Kết quả cho thấy gen này thuộc
nhóm endochitinase (chiA), có trình tự mã hóa 865 amino acid và có khối
lượng phân tử là 91,6 kDa thuộc họ 18 của nhóm glycosyl hydrolases,
enzyme này được biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3), Shimosaka và cs
(2006) không phân tích trình tự gen mã hóa cho protein mà trực tiếp phân tích
trình tự amino acid và so sánh với cơ sở dữ liệu protein. Kết quả cho thấy nó
giống 98% so với chủng A. caviae CB101 CHI1 (mã số AJ534329) và A.
hydrophila JP101 CHI92, giống 75% so với chủng Enterobacter sp. CHIA
(U35121)… tất cả đều thuộc họ 18 của nhóm glycosyl hydrolases [72].
24

Alias và cs (2009) biểu hiện và phân tích tính chất của một endochitinase
được phân lập từ Trichoderma virens UKM-1 trong E. coli BL21 (DE3), gen
này dài 1.690 bp mã hóa cho protein có 430 amino acid có khối lượng 42
kDa. Phân tích sự biểu hiện của enzyme này người ta thấy enzyme này hoạt
động tốt nhất ở pH 6.0 và nhiệt độ 50
0
C, enzyme này bền khi bảo quản trong
phạm vi pH 3.0 đến 6.0 và nhiệt độ 30 đến 60
0
C, ion Mg
2+
và Ca
2+
làm tăng
sự hoạt động của enzyme lên thêm 20% so với bình thường [16].
Một nghiên cứu khác tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ vi khuẩn sống
trong môi trường nước, nhưng ở công trình này Tsujibo và cs (1993) đã phân
lập gen từ vi sinh vật sống ở môi trường biển, gen chitinase của chủng
Alterromonas sp. mã số 0-7 đã được tạo dòng trong E. coli JM109 sử dụng
vector pUC18, ở nghiên cứu này enzyme không tiết trực tiếp ra môi trường
nuôi cấy mà tiết vào chu chất. Đoạn gen mã hóa cho enzyme tái tổ hợp dài
3.394 bp nằm giữa 2 enzyme cắt hạn chế SphI và HindIII, trình tự chỉ giống
33,4% so với chitinase A và 15,3% so với chitinase B của loài Seratia
marcescens [66]. Mã hóa cho protein dài 820 amino acid và có khối lượng
phân tử 87 kDa. Chitinase tái tổ hợp này có tính chất tương tự chitinase của
chủng Alterromonas sp. mã số 0-7.
Trong nông nghiệp, nấm bệnh hại cây là một vấn đề rất được quan tâm vì
nó ảnh hưởng đến cuộc sống của người dân cũng như an ninh lương thực của
quốc gia đó. Vấn đề sử dụng thuốc hóa học để trừ nấm bệnh đã và đang bị
phản đối do nó ảnh hưởng đến môi trường sống và con người (theo FAO,

2004). Vậy nên, việc nghiên cứu các sinh vật đối kháng với nấm bệnh hiện
nay được quan tâm nhiều hơn trước. Lin và cs (2004) đã phân lập được gen
chitinase của Bacillus thuringiensis có tính đối kháng cao với côn trùng gân
hại và tạo dòng vào E. coli [48]. Một nghiên cứu khác của Corona và cs
(2003) đã biểu hiện được gen Chitinase chiA74 của cùng đối tượng như trên,
25

vật chủ được sử dụng là E. coli DH5αF’. Enzyme tái tổ hợp có kích thước 676
amino acid và khối lượng là 74 kDa, trình tự amino acid này tương đồng 98%
với trình tự CHIB của Bacillus cereus, và 70% với trình tự CHIA71 của
Bacillus thuringiensis serovar Pakistani [23].
Chitinase sinh bởi Bacillus subtilis CHU26 được phân lập từ cánh đồng
khoai tây ở Đài Loan. Chủng này thể hiện hoạt tính chitinase ngoại bào mạnh
trên đĩa agar có bổ sung cơ chất chitin, cho thấy hoạt tính đối kháng với
nguồn bệnh thực vật Rhizoctonia solani. Gen mã hóa cho chitinase (chi18)
được tạo dòng từ thư viện hệ gen của B. subtilis CHU26. Gen chi18 bao gồm
khung đọc mở gồm 1.791 bp và mã hóa cho 595 amino acid với khối lượng
phân tử 64 kDa, gần vùng promoter chứa 1 trình tự lặp trực tiếp gồm 9 bp
(ATTGATGAA). Trình tự amino acid của chitinase từ B. subtilis CHU26 cho
thấy sự tương đồng là 62% so với B. circulans WL-12 và 81% so với B.
Licheniformis. Gen chi18 được chuyển vào vector pGEM3Z và pYEP352 để
hình thành plasmid tái tổ hợp pGCHI18 và pYCHI18. Hoạt tính chitinase có
thể được quan sát trên đĩa thạch có bổ sung chitin đối với các thể E. coli có
mang plasmid tái tổ hợp. Dịch nuôi cấy vô tế bào của E. coli chuyển gen có
mang pYCHI18 làm giảm hoạt tính gây bệnh củ R. solani hơn 90% trong
kiểm tra đối kháng trên các cây củ cải (Raphanus sativus Linn.) [74].
Plasmid pUC19 mang gen mã hóa cho họ gen chitinase 19 của
Streptomyces sp. J-13-3 được chuyển vào tế bào E. coli JM109. Chitinase tái
tổ hợp được tinh sạch từ dịch chiết tế bào nhờ sắc kí cột trên DEAE-
Sepharose, CM- Sepharose, Bio-Gel P-100. Dịch cuối cùng được điện di trên

gel polyacrylamide. Khối lượng phân tử của enzyme tinh sạch là 32 kDa.
Chitinase tái tổ hợp có khả năng thủy phân N-acetylglucosamine. Sự sinh
trưởng của nấm (200 µl dịch nuôi cấy) được xác định bởi độ hấp thụ quang ở