Nghiên cứu ảnh hưởng của tế bào đệm (Cell Co Culture) lên sự thành thục trứng và sự phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




NGUYỄN THỊ NHUNG




“NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TẾ BÀO ĐỆM
( CELL-CO-CULTURE) LÊN SỰ THÀNH THỤC TRỨNG
VÀ SỰ PHÁT TRIỂN PHÔI LỢN THỤ TINH ỐNG NGHIỆM ”



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


2

Lời cảm ơn!
Dân gian ta có câu, không thầy đố mày làm nên. Là một học trò còn
nhiều thiếu xót, kinh nghiệm chƣa nhiều, để hoàn thành đề tài này của mình,
tôi đã cần đến rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ tận tình của các thầy cô và bạn
bè đồng nghiệp
Trƣớc hết tôi không thể không kể đến sự hƣớng dẫn hết lòng của thầy
TS. Bùi Xuân Nguyên trƣởng phòng Công nghệ Phôi, ngƣời đã chỉ bảo tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Là một ngƣời thầy có trình độ
chuyên môn sâu, kiến thức rộng, tận tâm trong công việc và hết lòng vì các
học trò. Tôi thật lòng thán phục năng lực làm việc và sự say mê khoa học
trong con ngƣời của thầy. Trong thời gian đƣợc làm việc cùng thầy tôi cảm
thấy mình thật may mắn khi có đƣợc sự hƣớng dẫn và định hƣớng của thầy.
Sát cánh bên cạnh tôi là sự chỉ dẫn của cô TS. Nguyễn Thị Ƣớc, cô đã dạy
bảo và truyền đạt cho tôi rất nhiều những kinh nghiệm quý báu trong công
việc cũng nhƣ trong cuộc sống.
Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Văn Hạnh (Viện Công nghệ Sinh Học) đã
có những nhận xét thẳng thắn và quý báu để giúp tôi làm việc đƣợc tốt hơn
Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Việt Linh đã có những
góp ý đúng đắn để tôi hoàn thành luận văn của mình
Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng nghiệp phòng Công nghệ
Phôi đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua!
Hà Nội, 2012


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


3
Mục lục

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ
8
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
11
1. Tế bào và quá trình thành thục, thụ tinh của tế bào trứng lợn
12
1.1 Cấu tạo buồng trứng lợn.
12
1.2. Cấu tạo tế bào trứng.
13
1.3. Sự thành thục của tế bào trứng.
14
1.3.1. Sự thành thục nhân.
14
1.3.2. Sự thành thục tế bào chất.
15
1.3.3. Một số nhân tố điều hòa hoạt động của tế bào trứng.
16
1.4. Sự thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn.
16
2. Tình hình nuôi thành thục trứng và thụ tinh ống nghiệm ở lợn.
17
2.1. Nuôi thành thục trứng lợn.
17
2.2. Thụ tinh và phát triển phôi in vitro ở lợn.
19
3. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào đệm lên sự thành thục trứng và
phát triển phôi.

23
3.1. Tế bào màng vòi trứng, vai trò của tế bào màng vòi trứng lên sự
thành thục trứng và phát triển của phôi.
23
3.1.1. Tế bào màng trong vòi trứng
23
3.1.2. Vai trò của tế bào màng trong vòi trứng.
23
3.2. Ảnh hƣởng của nguyên bào sợi bào thai chuột (Fibroblast cells) lên
sự thành thục trứng và phát triển của phôi.
25
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
28
1. Nguyên vật liệu
29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


4
1.1. Đối tƣợng thí nghiệm.
29
1.2. Dụng cụ thí nghiệm.
29
1.3. Thiết bị thí nghiệm.
29
1.4. Hóa chất và môi trƣờng
29
2. Phƣơng pháp
32

2.1. Phƣơng pháp thu nhận buồng trứng.
32
2.2. Nuôi thành thục trứng invitro.
33
2.3. Nuôi thành thục trứng với môi trƣờng bổ sung nguyên bào sợi thai chuột.
33
2.4. Nuôi thành thục trứng với môi trƣờng bổ sung tế bào màng vòi trứng.
34
2.5. Quan sát hình thái, đánh giá mức độ thành thục của trứng.
35
2.6. Nhuộm và đánh giá các giai đoạn phát triển của trứng.
35
2.7. Phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm.
36
2.8. Đánh giá chất lƣợng và sự phát triên của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm.
36
2.9. Phƣơng pháp thống kê và xử lý số liệu.
36
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
37
1. Kết quả thu và phân loại trứng.
38
2. Kết quả nuôi thành thục trứng.
40
2.1. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào sợi bào thai chuột lên sự thành
thục trứng.
40
2. 2. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào màng trong vòi trứng (oviduct
cell) lên sự thành thục của trứng.
41

2.3. Ảnh hƣởng của co-culture cùng lúc với với tế bào sợi bào thai chuột
và tế bào màng trong vòi trứng lên sự thành thục của trứng.
43
3. Kết quả thụ tinh và phát triển phôi.
44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


5
3.1. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào sợi bào thai chuột lên sự phát
triển phôi thụ tinh ống nghiệm.
44
3.2. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào màng trong vòi trứng lên sự
phát triển phôi thụ tinh ống nghiệm.
46
3.3. Ảnh hƣởng của co-culture cùng lúc với với tế bào sợi bào thai chuột
và tế bào màng trong vòi trứng lên sƣ thụ tinh và phát triển phôi.
49
IV KET LUAN
54
TAI LIEU THAM KHAO
62


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


6
Danh mục các từ viết tắt.

Thụ tinh ống nghiệm
TTON
In vitro fertilization
IVF
Nuclear deoxyribonucleic acid
DNA
Luteinizing hormone
LH
Nhiễm sắc thể
NST
Nuclear ribonucleic acid
RNA
Maturation promoting factor
MPF
Follicle stimulating hormone
FSH
In vitro maturation
IVM
Maturation promoting factor
MPF
Cumulus oocyte complex
COC
Metaphase I
MI
Metaphase II
MII
Germinal vesicle
GV

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


7
Danh mục hình.
Hình 1: Thai chuột 14 ngày tuổi

Hình 2: Miếng cơ thai chuột

Hình 3: Tế bào sợi thai chuột sau 4 ngày nuôi

Hình 4: Tế bào sợi thai chuột sau 10 ngày nuôi

Hình 5: Vòi trứng lợn

Hình 6: Tế bào màng trong vòi trứng ngay sau khi thu

Hình 7: Các cụm tế bào màng trong vòi trứng sau nuôi 1 ngày

Hình 8: Một cụm tế bào màng trong vòi trứng điển hình

Hình 9: Buồng trứng lợn thu từ lò mổ

Hình 10: Trứng lợn ngay sau khi thu

Hình 11:Trứng lợn sau nuôi 22 giờ

Hình 12: Trứng lợn nuôi trong môi trƣờng bổ sung tế bào màng trong vòi trứng

Hình 13: Trứng thành thục sau khi tách cumulus (x1600)

Hình 14: Trứng giai đoạn bóng mầm

Hình 15: Trứng giai đoạn metaphase I

Hình 16: Giai đoạn metaphase II

Hình 17: Phôi giai đoạn 2 và 4 tế bào

Hình 18: Phôi 8 tế bào

Hình 19: Phôi dâu

Hình 20: Phôi nang



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


8
Danh mục bảng
Bảng 1: Kết quả thu và phân loại trứng ở các nang có kích
thƣớc > 3 mm
38
Bảng 2: Kết quả thu và phân loại trứng ở các nang có kích

thƣớc 2-3 mm.
39
Bảng 3: Ảnh hƣởng của tế bào sợi thai chuột lên tỉ lệ thành thục
của trứng lợn
41
Bảng 4: Ảnh hƣởng của tế bào màng trong vòi trứng lên chất
lƣợng trứng lợn sau nuôi.
42
Bảng 5: Ảnh hƣởng của việc bổ sung cả hai loại tế bào vào môi
trƣờng nuôi trứng lên tỉ lệ thành thục của trứng lợn.
43
Bảng 6.1: Ảnh hƣởng của tế bào sợi thai chuột lên chất lƣợng
phôi thu từ các nang > 3 mm
44
Bảng 6.2: Ảnh hƣởng của tế bào sợi thai chuột lên chất lƣợng
phôi thu từ các nang 2-3 mm
45
Bảng 7.1: Kết quả về sự phát triển của phôi lợn khi trứng nuôi
trong môi trƣờng IVM có bổ sung tế bào màng trong vòi trứng
(Đối với nang > 3 mm).
47
Bảng 7.2: Kết quả về sự phát triển của phôi lợn khi trứng nuôi
trong môi trƣờng IVM có bổ sung tế bào màng trong vòi trứng
(Đối với nang 2- 3 mm)
48
Bảng 8.1: Sự phát triển phôi khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi
trứng cả hai loại tế bào (nang > 3 mm)
49
Bảng 8.2: Sự phát triển phôi khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi
50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


9
trứng cả hai loại tế bào (nang 2-3 mm)

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kĩ thuật thụ tinh ống nghiệm (TTON) hay kĩ thuật IVF (in vitro
fertilization) giúp trứng và tinh trùng thụ tinh bên ngoài cơ thể là bƣớc đột
phá quan trọng trong ngành y học và sinh học. Cho đến nay, thụ tinh ống
nghiệm đƣợc áp dụng trên rất nhiều các loài động vật khác nhau và ở hầu hết
các nƣớc trên thế giới. Năm 1959 Chang và cộng sự đã tạo ra chú thỏ (động
vật có vú đầu tiên) bằng phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm. Tiếp theo đó là sự
thành công trên hàng loạt các đối tƣợng nhƣ cừu, chuột đồng, mèo, khỉ …
Ngày 25 tháng 7 năm 1978 em bé đầu tiên đƣợc ra đời bằng phƣơng
pháp TTON đã mở ra hi vọng cho hàng nghìn cặp vợ chồng hiếm muộn trên
khắp thế giới. Trong những năm đầu tiên các nhà khoa học đã phải thực hiện
khoảng 5000 chu kỳ để có hai trƣờng hợp em bé TTON ra đời. Sau 2 năm với
những cố gắng không nhỏ, em bé TTON đã đƣợc ra đời tại Pháp và Úc. Vào
thời gian đó, không ai có thể nghĩ rằng chỉ hơn 30 năm sau, 5 triệu em bé
TTON đã đƣợc sinh ra ở nhiều nƣớc trên thế giới. Giải Nobel Sinh lý và Y
học năm 2010 đƣợc trao cho TS Adward do công trình nghiên cứu thành công
kỹ thuật TTON trên ngƣời vào năm 1978 và đóng góp cho việc phát triển kỹ
thuật này trên toàn thế giới.
Nhằm mục đích cải thiện khả năng sinh sản của động vật cao sản, bảo
tồn đa dạng các loài động vật quý hiếm, tăng khả năng thụ thai và điều trị vô
sinh, kĩ thuật TTON trong những năm gần đây đã đƣợc quan tâm và đầu tƣ
nhiều hơn. Tại Việt Nam, công nghệ Phôi và TTON đã đƣợc bắt đầu nghiên
cứu tại Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam từ những năm 1978 – 1980 và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


10
đã đạt đƣợc nhiều thành công trên các đối tƣợng nhƣ thỏ (1978) trâu bò
( 1986, 2002). TTON đã đƣợc ứng dụng để điều trị vô sinh từ hơn 10 năm nay
mặc dù đi sau thế giới và với những nền tảng khoa học còn nhiều hạn chế,
việc phát triển TTON trên ngƣời ở Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành công
đáng khích lệ.
Lợn là động vật đƣợc quan tâm đặc biệt nhƣ một mô hình nghiên cứu y
học có đặc điểm di truyền của loài ngƣời. Buồng trứng của lợn có chứa số
lƣợng lớn (hơn 200.000) các nang trứng sơ cấp (primordial follicles). Trong
những năm đầu thập kỉ 1980 ngƣời ta đã thu đƣợc các phôi in vivo từ lợn và
các phôi này có thể nuôi, phát triển từ giai đoạn 4 tế bào đến giai đoạn phôi
nang (blastocyst). Sau đó những hiểu biết về đặc điểm phát triển của trứng đã
giúp hình thành các loại môi trƣờng nuôi trứng thành thục trong điều kiện in
vitro. Thụ tinh ống nghiệm trên đối tƣợng lợn đƣợc Chan và cộng sự công bố
đầu tiên vào năm 1986. Mặc dù tế bào trứng lợn trƣởng thành trong ống
nghiệm có thể thụ tinh với tinh trùng một cách dễ dàng trong điều kiện thích
hợp. Sự phát triển phôi lợn in vitro vẫn thu kém nhiều so với điều kiện in vivo
và những nguyên nhân cụ thể dẫn đến sự khác biệt này vẫn là một trong
những vấn đề cần đƣợc giải quyết.
Các kết quả nghiên cứu TTON lợn ở Việt Nam trong những năm gần
đây cho thấy do đặc điểm khá đặc trứng về phƣơng thức nuôi dƣỡng, đặc
điểm thời tiết, độ tuổi giết thịt… kết quả TTON từ nguồn trứng lợn thu ở Việt
Nam có khác biệt so với kết quả TTON ở một số nƣớc khác, việc tạo đƣợc
nguồn trứng chất lƣợng đảm bảo là một trong những chìa khóa then chốt
nhằm nâng cao hiệu quả TTON.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


11
Nghiên cứu của một số tác giả nƣớc ngoài cho thấy tế bào màng trong
vòi trứng (oviduct) có tác dụng khả quan tới chất lƣợng trứng thụ tinh và sự
phát triển của phôi lơn. Nagai và Moor (1990) cho biết việc bổ sung vào môi
trƣờng nuôi trứng lợn một lƣợng tế bào màng trong vòi trứng sẽ làm giảm 40-
50% tỉ lệ trứng thụ tinh đa tinh trùng. Kim và cộng sự (1996) đã chỉ ra rằng
nếu thêm vào tế bào nuôi trứng lợn từ 10- 30 % tế bào màng trong vòi trứng
sẽ làm tăng tỉ lệ trứng đƣợc thụ tinh bởi một tinh trùng mà không làm giảm
khả năng xâm nhập của tinh trùng. Heidari M và cộng sự (2011) cũng thông
báo kết quả sử dụng nguyên bào sợi làm tăng khả năng thành thục và thụ tinh
của trứng chuột.
Với mục đích tìm hiểu điều kiện tốt nhất cho sự thành thục của trứng và
sự phát triển của phôi lợn TTON, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Ảnh
hƣởng của các loại tế bào đệm lên sự thành thục trứng và sự phát triển
phôi lợn thụ tinh ống nghiệm”.
Đề tài thực hiện với các mục tiêu:
- Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của kích thƣớc nang tới chất lƣợng trứng và phôi
lợn.
- Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng riêng lẻ cũng nhƣ kết hợp của các loại tế bào đệm
(tế bào màng trong vòi trứng và tế bào nguyên bào sợi của bào thai chuột) lên
sự thành thục của trứng và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm.
- Đề xuất đƣợc chế độ sử dụng các loại tế bào này phù hợp với quy trình
TTON trên trứng lợn thu tại Việt Nam .

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12






PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


13
1. Tế bào và quá trình thành thục, thụ tinh của tế bào trứng lợn
1.1 Cấu tạo buồng trứng lợn.
Buồng trứng lợn có hình oval nằm phía sau dây chằng rộng và dính vào
dây chằng rộng bởi màng treo buồng trứng. Cấu tạo buồng trứng gồm 2 phần
chính là phần vỏ bao phủ bên ngoài và phần tủy bên trong. Buồng trứng đƣợc
nối với ống dẫn trứng để nhận các tế bào trứng khi chúng thành thục và tách
khỏi buồng trứng, chúng là con đƣờng vận chuyển tế bào trứng đến nơi thụ
tinh. Buồng trứng gồm có nhiều nang trứng, mỗi nang trứng có phần vỏ nang
bao bọc bên ngoài, bên trong là dịch nang trứng và một tế bào trứng.

Theo B. Cummings và cs, 2001 ở động vật có vú khi sinh ra tổng số
trứng có thể giải phóng đã đƣợc xác định. Ngoài ra khả năng sinh sản ở con
cái thƣờng bắt đầu từ lúc dậy thì và kết thúc ở tuổi mãn kinh. Quá trình sinh
trứng xảy ra trong cấu trúc đặc biệt trong vùng vỏ buồng trứng gọi là các nang
buồng trứng. Các nang buồng trứng bao gồm giao tử đang phát triển và các tế
bào nang có liên quan. Có ba giai đoạn trong sự phát triển nang: Giai đoạn
trƣớc khi rụng trứng, giai đoạn rụng trứng, giai đoạn sau rụng trứng.
Giai đoạn trƣớc rụng trứng: Trong quá trình phát triển phôi, tế bào
mầm sinh dục nguyên thủy (primordial germ cell) phát triển từ trung bì trong
niệu nang di cƣ đến buồng trứng, sau đó vào khoảng tuần thai thứ 8-10, tế bào
mầm nguyên thủy tiến hành nguyên phân nhiều lần và biệt hóa thành nang
nguyên thủy (primordial follicle). Nang nguyên thủy tiếp tục nhân lên thông
qua nguyên phân và khi đạt đến số lƣợng tối đa. Trƣớc khi sinh, các trứng sơ
cấp bƣớc vào giai đoạn cuối cùng của tổng hợp DNA và dừng lại vào
prophase I mãi cho đến một thời gian ngắn trƣớc khi rụng trứng. Giai đoạn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


14
sau tế bào trứng sơ cấp tiếp tục quá trình giảm phân và phát triển thành tế bào
trứng thứ cấp.
Giai đoạn rụng trứng: Các nang bào di chuyển từ phần vỏ sau ra bề mặt
buồng trứng và bị đẩy ra ngoại vi, hình thành một lớp bọc xoang dày khoảng
5-6 lớp tế bào. Một thời gian ngắn trƣớc khi trứng rụng nang trứng phồng và
nhô lên bề mặt buồng trứng, phần nang lồi ra ngoài buồng trứng bị biến đổi,
mạch máu teo lại thành nang căng mỏng tạo nên một dải hẹp tigma- một vùng
màu nhạt ở cực nang trứng thành thục lồi lên bề mặt buồng trứng báo trƣớc sự
vỡ nang trứng thành thục và sự rụng trứng xảy ra. Dƣới sự điều khiển của cơ
chế thần kinh- thể dịch, trứng thoát ra khỏi buồng trứng gọi là sự rụng trứng.

Khi trứng rụng, stigma bị phá vỡ, giải phóng trứng thứ cấp, tế bào hạt và tế
bào vỏ ở lại trong buồng trứng.
Giai đoạn sau khi trứng rụng: Sau khi trứng rụng, phần còn lại của nang
thƣờng tạo thành một cấu trúc là thể xuất huyết. Cấu trúc chuyển tiếp này
phát triển thành hoàng thể (corpus luteum). Nếu xảy ra sự thụ tinh, thể vàng
sẽ tồn tại và tiết progesterone. Nếu sự thụ tinh không xảy ra, thể vàng sẽ thoái
hóa sau 14 ngày và đƣợc thay thế bởi mô liên kết tạo nên corpus albicans sau
vài tháng.
1.2. Cấu tạo tế bào trứng.
Tế bào trứng có dạng hình tròn, đƣợc bao bọc bên ngoài bởi một lớp tế
bào cumulus (tế bào hạt), tiếp theo là lớp tế bào zona và lớp màng tế bào. Bên
trong lớp màng tế bào là khoảng không bào tƣơng và nguyên sinh chất bao
quanh vùng nhân (có chứa nhiễm sắc thể). Tế bào trứng đƣợc hình thành
trƣớc khi con cái đƣợc sinh ra, nó sẽ bƣớc vào chu kỳ giảm phân và dừng lại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


15
ở giai đoạn prophare I, hình thành tế bào trứng sơ cấp. Giai đoạn này đƣợc gọi
là giai đoạn túi mầm, bên trong tế bào trứng toàn bộ nhiễm sắc thể đƣợc bao
bọc bởi túi mầm và tế bào trứng dừng phát triển cho đến khi cơ thể đạt độ tuổi
thành thục sinh dục.
1.3. Sự thành thục của tế bào trứng.
Sự thành thục của tế bào trứng bao gồm sự thành thục nhân và sự thành
thục của tế bào chất. Sự thành thục của tế bào chất gắn liền và không thể tách
rời với sự thành thục của nhân (Schoevers và cs, 2005).
Ở lợn, khi nuôi trứng trong môi trƣờng invitro, trứng đƣợc thu từ các
nang có đƣờng kính < 0,7 mm không có khả năng tiếp tục quá trình phân bào
giảm nhiễm, các trứng thu từ nang có đƣờng kính 0,8 đến 1,6 mm có khả

năng thành thục trong môi trƣờng nuôi cấy ống nghiệm. Đối với trứng thu
đƣợc từ nang có kích thƣớc từ 2-3 mm cho tỉ lệ trứng thành thục cao. Trứng
đƣợc thu từ các nang khác nhau có sự khác nhau về hình thái và thành phần
sinh hóa do đó có quá trình trƣởng thành không đồng nhất (Foxcroft và
Hunter, 1985) thậm chí cả những nang có kích thƣớc tƣơng tự cũng thấy sự
khác biệt đáng kể trong dịch nang trứng về nồng độ steroid, lƣợng tế bào
granulosa và nồng độ LH.
1.3.1. Sự thành thục nhân:
Nhân là bào quan tối quan trọng của tế bào, nó chứa NST của tế bào, là
nơi diễn ra quá trình nhân đôi DNA và tổng hợp RNA. Sự thành thục của
nhân đƣợc diễn ra trong nhân và qua các giai đoạn phá vỡ túi mầm,
metaphase I, metaphase II và sự phóng noãn.
Prophase I: Giai đoạn bóng mầm hay pha trƣớc của phân bào giảm nhiễm
GVBD: Giai đoạn phá vỡ túi mầm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


16
Metaphase I, MetaphaseII: Kì giữa của giảm phân và xuất hiện thể cực thứ nhất
Pronucleus in G1: Giai đoạn tiền nhân, xuất hiện thể cực thứ 2.
Các tế bào trứng sau khi đƣợc sinh ra sẽ tiến hành giảm phân và dừng
lại ở giai đoạn Prophase I, hình thành lên tế bào trứng sơ cấp, giai đoạn này
đƣợc gọi là giai đoạn túi mầm (GV: germinal vesicle stage). Trong đó nhiễm
sắc thể đƣợc bao bọc bởi túi mầm và tế bào trứng dừng phát triển cho đến khi
cơ thể đạt độ tuổi thành thục sinh dục. Khi cơ thể đến độ tuổi thành thục sinh
dục, một hoặc vài tế bào trứng sơ cấp tiếp tục quá trình giảm phân và phát
triển thành trứng thứ cấp. Ở giai đoạn này thì màng nhân sẽ gấp lại, các lỗ
trên màng nhân biến mất, màng nhân cũng bị tiêu hủy. Quá trình này là quá
trình phá vỡ túi mầm (germinal vesicle breakdown – GVBD). Đây là bƣớc

khởi động đánh dấu sự tiếp tục của hoạt động giảm phân trong tế bào trứng.
Sau khi túi mầm bị vỡ thì NST sẽ đƣợc tiếp xúc với tế bào chất, NST bị cô
đặc lại, xuất hiện tâm động và bộ NST sẽ đƣợc phân bố trên thoi vô sắc. Giai
đoạn này đƣợc gọi là giai đoạn metaphase I (MI). Tiếp theo hai nửa cuả bộ
NST sẽ di chuyển về hai cực của tế bào (giai đoạn đoạn anphase I), thoi vô
sắc di chuyển ra rìa của tế bào vì vậy một trong hai tế bào giữ lại hầu hết tế
bào chất, tế bào còn lại chỉ chứa một phần vật liệu di truyền gọi là thể cực thứ
nhất (polar body – PB1). Ở lợn, các nang trứng trƣởng thành có kích thƣớc từ
2 đến 3 mm. Tế bào trứng ở giai đoạn Metaphase II có đƣờng kính khoảng
110- 120 µm. Đây là cơ sở cho việc chọn nang để thu trứng cho nuôi thành
thục trứng in vitro nhằm đạt đƣợc hiệu quả cao.
1.3.2. Sự thành thục tế bào chất.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


17
Sự thành thục tế bào chất là yếu tố đánh giá gián tiếp đến khả năng chín
và thụ tinh của trứng, sự phân chia tế bào và sự phát triển của phôi đến giai
đoạn phôi nang (blastocyst). Sự thay đổi hình thái, vị trí một số bào quan của
trứng có ý nghĩa quan trọng đến sự thành thục tế bào chất và chuẩn bị cho quá
trình phát triển tiếp theo của tế bào trứng. Trong đó, bộ máy Golgi đƣợc coi là
bộ phận quan trọng nhất nhằm đánh giá sự thành thục của tế bào chất. Trong
tế bào trứng, bộ máy Golgi sẽ đảm nhiệm việc hình thành các tế bào hạt và
màng trong suốt. Số lƣợng thể Golgi có trong trứng tăng theo đƣờng kính của
nang (Sosnowski và cs,2003).
1.3.3. Một số nhân tố điều hòa hoạt động của tế bào trứng.
Nhân tố phát động trứng thành thục (maturation promoting factor –
MPF) có tác dụng điều hòa sự phá vỡ túi mầm, sự cô đặc của NST khi tiếp
xúc với tế bào chất, giai đoạn MI, MII đã đƣợc chứng minh bởi Massui và

Markert vào năm 1971. MPF là một loại protein kinase có cấu trúc dị phân tử
kép. Hoạt tính kinase của MPF khởi động các phản ứng dẫn đến các quá trình
phá vỡ túi mầm, sự đóng xoắn của NST (Nurse, 1990). Mức độ đóng xoắn
phụ thuộc vào hoạt tính của MPF và thời gian tiếp xúc giữa chúng.
Hoạt tính của MPF đƣợc điều hòa bởi nhóm ức chế tế bào (cytostatic
factor – CSF) Endo và cộng sự, 2008. Trong đó Mos là thành phần quan
trọng của CSF có tác dụng ức chế sự phân hủy cyclin B, nhằm duy trì hoạt
tính của MPF đồng thời kích hoạt MAP kinase (mitogen activated protein
kinase). Sự hoạt hóa MAP kinase lại ức chế hoạt tính phân hủy protein của
ubiquitin và từ đó ức chế sự phân hủy cyclin B. Vì vậy sự bất hoạt CSF dẫn
tới quá trình phân hủy cyclin đƣợc thuận lợi, từ đó làm giảm hoạt tính của
MPF (Cibelli và cs, 2002).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


18
LH và FSH là hai loại hormone chủ yếu đảm nhiệm vai trò kích hoạt lại
quá trình giảm phân in vivo ở hầu hết các loài động vật có vú. Năm 2001.
S.K.Chaube và cộng sự đã chỉ ra rằng LH kết hợp với tế bào cumulus trong tổ
hợp trứng-cumulus để thúc đẩy sự thành thục của trứng.
Vai trò của Steroids: Gonadotropins kết hợp với steroid nhằm kích
thích quá trình phân bào giảm nhiễm trong tế bào trứng trƣởng thành và phát
triển thành cá thể ở hầu hết các loài động vật có vú. Ngoài ra Progesterone có
ảnh hƣởng đến hoạt động của LH, do đó nó đóng một vai trò cực kì quan
trọng trong quá trình trƣởng thành của tế bào trứng và sự phát triển của phôi.
1.4. Sự thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn.
Thụ tinh là quá trình hai tế bào sinh dục (trứng và tinh trùng) kết hợp
để tạo ra một cá thể mới mang các đặc tính di truyền của cả bố và mẹ. Khi
trứng thành thục, tại buồng trứng sẽ có hiện tƣợng phóng noãn và đƣợc loa

vòi trứng hứng. Khi thụ tinh, do đặc tính bơi ngƣợc dòng, tất cả các tinh trùng
đều cố gắng đến đƣợc vòi trứng để gặp noãn. Quá trình này thƣờng xảy ra ở
vị trí 1/3 vòi trứng. Trƣớc khi tinh trùng xâm nhập vào noãn thì tất cả các tinh
trùng đều vây quanh noãn, cùng tiết ra men hyalnua phá hủy làm mỏng vỏ
trứng. Sau đó chỉ có một tinh trùng có thể chui vào bên trong noãn. Khi tinh
trùng vào trong thì noãn tiết ra lớp albumin dày không cho các tinh trùng khác
chui vào nữa. Tất cả các tinh trùng khác bị gãy nát. Trong trƣờng hợp số
lƣợng tinh trùng quá ít thì sẽ gặp khó khăn trong việc làm thủng vỏ trứng do
vậy quá trình thụ thai cũng gặp nhiều khó khăn. Trên thực tế thì chỉ có đầu
tinh trùng là chui và đƣợc giữ ở trong noãn, phần đuôi và phần giữa của tinh
trùng bị gãy khi chui vào noãn và đƣợc để lại ở bên ngoài. Lúc này noãn cùng
với trung thể nhân của tinh trùng sẽ lớn lên nhanh để vài giờ sau nhân của tinh
trùng và noãn trở thành hai tiền nhân, chúng phát triển thành một tế bào có 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


19
NST. Bộ NST này chính là bộ mã di truyền để hình thành nên một cá thể. Quá
trình thụ tinh đƣợc hoàn tất và trứng bắt đầu phát triển theo bộ mã do gen của
NST ấn định. Sau khi thụ tinh, trứng di chuyển về tử cung và làm tổ gọi là sự
di trú.
2. Tình hình nuôi thành thục trứng và thụ tinh ống nghiệm ở lợn.
2.1. Nuôi thành thục trứng lợn.
Sự phát triển của trứng ở giai đoạn IVM ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát
triển của phôi ở giai đoạn sau. Ở bò, những tế bào trứng thành thục trong cơ
thể tạo thành nhiều phôi nang hơn so với những tế bào trứng đƣợc nuôi thành
thục trong ống nghiệm (Greve và cs,1987). Mặc dù không có nhiều so sánh
tƣơng tự nhƣ ở lợn nhƣng những tế bào trứng thành thục trong ống nghiệm
thƣờng cho tỉ lệ xâm nhập của tinh trùng thấp hơn, sự phát triển của tiền nhân

thƣờng không đồng pha, tốc độ phân chia chậm và tỉ lệ phân chia thƣờng thấp
(Laurincik và cs, 1994). Điều này chứng tỏ các điều kiện trong quá trình thụ
tinh ống nghiệm có thể không đáp ứng đầy đủ cho sự phát triển của trứng và
phôi lợn. Vì vậy những kích thích tổng hợp đƣợc bổ sung vào môi trƣờng
nuôi trứng IVM có thể cải thiện khả năng phát triển của trứng và phôi.
Hầu hết các môi trƣờng IVM trứng lợn đều đƣợc bổ sung gonadotropin,
đặc biệt là LH (Luteinizing hormone) hay FSH (Follicle-stimulating hormone)
và các yếu tố sinh trƣởng khác. Mattioli và cs (1991) tỉ lệ thành thục của
trứng tăng đáng kể khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi LH (76%) và FSH(86%).
Khi có mặt của Gonadotrophin và bổ sung yếu tố sinh trƣởng biểu bì
(epidermal growth factor-EGF) không ảnh hƣởng đến sự chín của nhân
(Coskun và Lin, 1994; Ding và Foxcroft, 1994). Tuy nhiên sự hình thành tiền
nhân đực tăng lên đáng kể khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi gonadotrophin và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


20
EGF (Epidermal growth factor) không ảnh hƣởng đến sự chín của nhân
(Coskun và Lin, 1994; Ding và Foxcroft,1994). Tuy nhiên, sự hình thành tiền
nhân tăng lên đáng kể khi có mặt của gonadotrophin và EGF (Ding vaf
Foxcroft, 1994) cho thấy những ảnh hƣởng có lợi của việc bổ sung các yếu tố
sinh trƣởng đã cải thiện khả năng chín của tế bào chất.
Thông thƣờng tế bào trứng có đủ 3 lớp tế bào cumulus bao quanh sẽ
đƣợc lựa chọn cho kỹ thuật IVM. Những tế bào này là một nguyên tố đặc biệt
quan trọng của khối tế bào trứng-cumulus (COC), khối tế bào này hỗ trợ cho
sự chín của nhân và tế bào chất cần thiết cho sự hình thành tiền nhân và khả
năng phát triển ở giai đoạn sau. Ở hầu hết động vật có vú tế bào trứng đƣợc
bao quanh bởi khối tế bào cumulus lúc trứng rụng. Ở chuột thành phần chủ
yếu ở khối tế bào cumulus là hyaluronic axit (HA; Salustri và cs, 1989) với số

lƣợng HA đƣợc tổng hợp có liên quan chặt chẽ với mức độ giãn nở (Chen và
cs,1990). Yếu tố sinh trƣởng biểu bì có thể làm tăng sự thành thục của nhân
của cả những trứng lấy từ nang trứng nhỏ (<4mm) và những nang trứng lớn
(6-7mm). Sự có mặt của các tế bào cumulus trong quá trình nuôi trứng thành
thục ảnh hƣởng đáng kể đến tỉ lệ thành thục của nhân (MII) lƣợng gluthathion
trong tế bào (GSH), tỉ lệ xâm nhập của tinh trùng, sự hình thành tiền nhân và
hoạt động của histione H1 kinaza (Yamauchi và Nagai, 1999). Nhƣ vậy tế bào
cumulus đóng một vai trò quan trọng trong việc kích thích sự thành thục của
trứng, tuy nhiên sự thành thục của nhân không phản ánh sự thành thục của tế
bào chất. Trƣớc đây, nhiều môi trƣờng IVM đƣợc áp dụng để nuôi cấy tế bào
trứng lợn đã làm cho nhân thành thục đến giai đoạn MII, mặc dù có những
hiện tƣợng nhƣ vỡ túi mầm (Germinal Vesicle Breakdown), thể cực nhô ra …
nhƣng lại không có hiện tƣợng thành thục tế bào chất (không hình thành tiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


21
nhân sau khi thụ tinh). Do đó hình thái của trứng trƣớc và sau khi nuôi là yếu
tố đƣợc dùng để đánh giá chất lƣợng trứng đƣa vào thụ tinh ống nghiệm.
Có thể nuôi thành thục tế bào trứng lợn trong nhiều loại môi trƣờng
nuôi cấy khác nhau có chứa huyết thanh thai dê (FCS) hay dịch nang trứng
(FF) và các thành phần bổ sung khác nhƣ gonadotrophin và các yếu tố sinh
trƣởng (Coskun và Lin, 1994; Ding và Foxcroft, 1994; McCauley và cs,2001,
Prochazka và cs, 2000). Nhìn chung, quá trình nuôi thành thục tế bào trứng có
thể chia làm hai khía cạnh, sự thành thục của nhân và sự thành thục của tế bào
chất. Thành thục nhân là một thuật ngữ để chỉ sự hồi phục quá trình phân bảo
giảm nhiễm và những chuyển biến đến giai đoạn MII. Thành thục tế bào chất
là một thuật ngữ rộng hơn liên quan đến các sự kiện thành thục khác không
liên quan trực tiếp đến quá trình phân bào giảm nhiễm nhƣng liên quan tối

những yếu tố khác để chuẩn bị cho tế bào trứng thụ tinh và phát triển trƣớc
khi làm tổ.
2.2. Thụ tinh và phát triển phôi in vitro.
Thụ tinh trong ống nghiệm là một phƣơng pháp hỗ trợ sinh sản mà tinh
trùng và trứng đƣợc kết hợp ở ngoài cơ thể. Nếu hiện tƣợng thụ tinh xảy ra, sẽ
tạo thành phôi, sau đó phôi đƣợc chuyển vào buồng tử cung của con cái. Phôi
sẽ bắt đầu hiện tƣợng làm tổ và phát triển thành thai nhi nhƣ quá trình thụ thai
bình thƣờng.
Ở ngƣời, đã có những thành công vƣợt bậc trong kĩ thuật thụ tinh ống
nghiệm. Năm 1978 đứa trẻ đầu tiên chào đời bằng phƣơng pháp thụ tinh trong
ống nghiệm (IVF) là một dấu ấn quan trọng và trở thành biểu tƣợng của niềm
hy vọng của hàng triệu cặp vợ chồng hiếm muộn. Việc ra đời của kĩ thuật IVF
(In Vitro Fertilisation) là một bƣớc đột phá vô cùng quan trọng trong ngành

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


22
sinh học và y học. Từ đó đến nay đã có hơn 4 triệu đứa trẻ ra đời trên khắp thế
giới (Uỷ ban Nobel cho biết).
Ở các loài động vật, quá trình thụ tinh trong ống nghiệm có thể sử dụng
nhiều loại môi trƣờng khác nhau và nguồn tinh trùng có thể là tinh tƣơi hoặc
tinh đông lạnh. Tỉ lệ thụ tinh và chất lƣợng phôi phụ thuộc lớn vào chất lƣợng
tinh trùng (Xu và cs, 1996). Bảo quản tinh trùng là một giải pháp hữu ích để
bảo quản lâu dài những vật liệu di truyền có giá trị và cho phép tạo ra phôi có
giá trị di truyền mong muốn thông qua kĩ thuật thụ tinh ống nghiệm. Ngoài ra
thành phần của môi trƣờng thụ tinh, môi trƣờng nuôi cấy, các loại phân tử,
nồng độ tinh trùng, mật độ nuôi, sự có mặt của các nhân tố kích thích cũng
đƣợc coi là có ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình thụ tinh (Abeydeera, 2001).
Mori và cs (2000) đã chỉ ra rằng GJC đóng một trai trò quan trọng trong việc

điều tiết quá trình vận chuyển GSH tạo ra trong các tế bào cumulus vào trong
tế bào trứng và liên quan trực tiếp tới sự hình thành tiền nhân đực. Điều này
đã chứng minh vai trò quan trọng của tế bào cumulus trong việc cải thiện khả
năng thành thục của tế bào chất.
Mặc dù đã có nhiều cải thiện đáng kể về khả năng hình thành tiền nhân
đực của tế bào trứng sau thụ tinh, nhƣng tỉ lệ đa tinh trùng vẫn là một trong
những cản trở ảnh hƣởng đến chất lƣợng phôi lợn.
Kĩ thuật IVM và IVF thƣờng gặp phải hai hạn chế chính khi tỉ lệ hình
thành tiền nhân kém (MPN) và hiện tƣợng đa tinh trùng. Đã có nhiều cải tiến
trong quá trình nuôi cấy trứng nhƣ bổ xung dịch nang trứng, nuôi cấy kết hợp
với các loại tế bào somatic của nang trứng, bổ xung EGF hay cysteine đã cải
thiện đáng kể tỉ lệ thành thục của tế bào chất, tăng khả năng hình thành tiền
nhân (Abeydeera,2001; Day và cs,2000). Năm 1993, Yoshida và cs đã chứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


23
minh việc bổ sung cysteine làm tăng nồng độ GSH trong tế bào trứng từ đó
làm tăng tỉ lệ hình thành tiền nhân. Năm 1998 Abeydeera và cs cũng tiến hành
nuôi trứng với tế bào somatics của nang trứng, từ đó làm tăng nồng độ GSH
trong tế bào trứng. Sự tổng hợp GSH là yếu tố tiên quyết giúp cho quá trình
co lại của các sợi nhiễm sắc trong nhân tinh trùng và sự hình thành tiền nhân
đực ở chuột (Perreault và cs, 1998). Năm 1995, Funashahi và cs chứng minh
rằng lƣợng GSH có trong tế bào trứng bị ảnh hƣởng bởi sự có mặt của các tế
bào cumulus trong quá trình nuôi cấy và cách mà các tế bào cumulus vận
chuyển các chất cần thiết vào trong tế bào trứng là thông qua các kẽ hở thông
tin (gap junction communication: GJC; Coskun và Lin, 1994; Gilula và cs,
1978). Nhƣ vậy đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc chứng minh
vai trò quan trọng của lớp tế bào cumulus trong việc nâng cao tỉ lệ chín của tế

bào chất.
Hầu hết các loại môi trƣờng IVF lợn đều đƣợc bổ sung caffein nhằm
làm tăng khả năng xâm nhập của tinh trùng. Trong một nghiên cứu gần đây,
Funahashi và cs (2000) đã tiến hành kiểm tra ảnh hƣởng của 3 chất: caffein,
peptide thúc đẩy sự thụ tinh (FPP) và adenosine lên sự thụ tinh của tế bào
trứng thành thục đƣợc nuôi trong ống nghiệm. Kết quả chỉ ra rằng với môi
trƣờng có bổ sung caffein cho tỉ lệ tinh trùng xâm nhập vào trứng là cao nhất
(98%) so với môi trƣờng bổ sung FPP(75%) và môi trƣờng bổ sung adenosine
(71%). Tuy nhiên hầu hết các tế bào trứng đều bị đa tinh trùng khi có mặt của
caffein (87%), trong khi đó ở môi trƣờng có bổ sung FPP và adenosine cho tỉ lệ
này khá thấp (25% và 21%). Vì vậy việc bổ sung adonosine vào môi trƣờng nuôi
cấy thay cho caffein là một trong những phƣơng pháp đƣợc áp dụng hợp lí.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


24
Trong thập kỉ qua, việc pha chế nhiều loại môi trƣờng nuôi cấy khác
nhau trong thụ tinh ống nghiệm đã đƣợc quan tâm đặc biệt. Thông dụng nhất
là môi trƣờngWhitten (mWM;Becmann và Day,1993), môi trƣờng NCSU23
(Petters và Wells,1993), môi trƣờng ISU (Youngs và ca,1993) và môi trƣờng
nuôi cấy phôi Beltsville 3 (BECM-3;Dobrinksky và cs,1996) đã làm tăng tỉ lệ
phát triển đến giai đoạn phôi nang lên đến 70%. Tuy nhiên mức độ thành
công phụ thuộc vào loại môi trƣờng và chất lƣợng của nguồn trứng lợn đƣợc
sử dụng trong các thí nghiệm.
Một hệ thống IVF lí tƣởng phải có tỉ lệ 1 tinh trùng thụ tinh cho 1 trứng
cao (>80%) và tỉ lệ đa tinh trùng thấp (<10). Tuy nhiên một trong những khó
khăn trong quá trình thụ tinh ống nghiệm ở lợn đó là tỉ lệ xâm nhập của đa
tinh trùng thƣờng khá cao. Quá trình thụ tinh trong cơ thể lợn (in vivo)
thƣờng xảy ra sau khi trứng rụng một vài giờ, và ở hầu hết các trƣờng hợp chỉ

có một tinh trùng thụ tinh cho một trứng. Tuy nhiên quá trình thụ tinh ống
nghiệm, trứng thƣờng đƣợc tiếp xúc với một lƣợng tinh trùng dƣ thừa trong
thời gian dài hơn và đây là một trong những nguyên nhân làm tỉ lệ đa tinh
trùng cao hơn so với quá trình thụ tinh xảy ra trong cơ thể động vật. Năm
1993, Hunter đã chỉ ra rằng tỉ lệ giữa tinh trùng: trứng tại thời điểm xâm nhập
của tinh trùng qua màng trứng có liên quan chặt chẽ với tỉ lệ đa tinh trùng. Về
mặt lý thuyết thì ta có thể giảm tỉ lệ đa tinh trùng bằng cách giảm số lƣợng
tinh trùng trong các giọt IVF, tuy nhiên ở hầu hết các trƣờng hợp, những điều
chỉnh nhƣ thế thƣờng đi kèm với tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào tế bào
trứng thấp.
Vì vậy các nhà khoa học đã tiến hành nhiều nghiên cứu khác nhau để
tìm ra môi trƣờng nuôi cũng nhƣ môi trƣờng thụ tinh trong ống nghiệm tối ƣu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


25
cho sự phát triển của trứng và phôi. Trong đó có phƣơng pháp bổ sung vào
môi trƣờng nuôi trứng tế bào đệm (cell-co-culture) mà phổ biến nhất là tế bào
màng lót ống dẫn trứng và tế bào cơ thai chuột.
3. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào đệm lên sự thành thục trứng và
phát triển phôi.
3.1. Tế bào màng vòi trứng, vai trò của tế bào màng trong vòi trứng
(oviduct cell) lên sự thành thục trứng và phát triển của phôi.
3.1.1. Tế bào màng trong vòi trứng.
Tế bào oviduct là tế bào niêm mạc vòi trứng hay tế bào màng lót vòi trứng.
Trong cơ thể động vật có vú, tế bào này có tác dụng hỗ trợ quá trình bơi ngƣợc
dòng của tinh trùng đồng thời giúp trứng và phôi di chuyển về phía tử cung.
Ngoài ra, trong nhiều nghiên cứu, nó có tác dụng tiết ra một số chất tƣơng tác
với tế bào trứng hoặc tinh trùng thúc đẩy sự phát triển của trứng, tăng tỉ lệ tạo

tiền nhân đực, giảm tỉ lệ đa tinh trùng và giúp cho sự phát triển của phôi.
Năm 2003 Kidson và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của
tế bào màng trong vòi trứng lên quá trình thành thục của trứng, sự thụ tinh và
sự phát triển của phôi lợn đƣợc nuôi trong ống nghiệm. Kết quả cho biết
không có sự khác biệt giữa nhóm đối chứng và nhóm có bổ sung tế bào màng
trong vòi trứng về tỉ lệ xâm nhập của tinh trùng và tỉ lệ tạo thành tiền nhân. Ở
lô bổ sung tế bào màng trong vòi trứng có ít phôi nang đƣợc hình thành hơn
nhƣng với những phôi nang đã đƣợc hình thành thì chất lƣợng phôi đƣợc cải
thiện đáng kể so với lô đối chứng
3.1.2. Vai trò của tế bào màng trong vòi trứng.
Nhƣ đã đề cập ở trƣớc, trong quá trình thụ tinh ống nghiệm các tế bào
trứng lợn thành thục và rụng trong cơ thể thƣờng ít bị hiện tƣợng đa tinh trùng