kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM










KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





KIỂM TRA MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH VẬT GÂY
BỆNH TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN SẴN




Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : ĐỖ NGOC CƯỜNG
MSSV: 0811110005 Lớp: 08CSH2




TP. Hồ Chí Minh, 2011

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp là kết quả nghiên cứu của riêng
tôi, không sao chép của ai. Nội dung khóa luận tốt nghiệp có tham khảo và sử
dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các
trang web theo danh mục tài liệu tham khảo của khóa luận tốt nghiêp.

Tác giả khóa luận



ĐỖ NGỌC CƯỜNG

ii

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Mục lục ii
Danh mục các từ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii
CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 1
1.3 Nội dung 1
1.4 Phạm vi nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN 3
2.1 Khái quát về ngộ độc thực phẩm 3
2.1.1 Các tác nhân gây ngộ độc 4
2.1.2 Tác hại 6
2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên Thế Giới và Việt Nam 7
2.3 Giới thiệu một số vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm chế biến 9
2.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí 9
2.3.2 Coliforms 9
2.3.3 Escherichia coli 13

2.3.4 Tổng nấm men, nấm mốc 18
CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT GÂY
BỆNH TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN SẴN 22
3.1 Thời gian thực hiện khóa luận 22
3.2 Vật liệu 22
3.2.1 Hóa chất – môi trường 22
3.2.2 Dụng cụ 22
iii

3.2.3 Thiết bị 23
3.3 Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm 23
3.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm 24
3.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 27
3.4.1 Phương pháp đổ đĩa 27
3.5 Định lượng tổng số Coliforms 31
3.5.1 Phương pháp đổ đĩa 31
3.5.2 Phương pháp MPN 35
3.6 Xác định E.coli trong thực phẩm 38
3.6.1 Định tính E.coli trong thực phẩm 38
3.6.2 Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 42
3.6.3 Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp MPN 45
3.6.4 Xác đinh E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp ELISA 48
3.7 Xác định tổng nấm men, nấm mốc trong thực phẩm 51
3.7.1 Nguyên tắc 51
3.7.2 Ý nghĩa 52
3.7.3 Môi trường và hóa chất 52
3.7.4 Quy trình phân tích định tính nấm mốc 52
3.7.5 Quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc 53
CHƯƠNG 4 : ĐÁNH GIÁ VÀ THẢO LUẬN 56
4.1 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm tổng vi sinh vật hiếu khí 56

4.2 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm Coliforms 56
4.3 Đánh giá và thảo luận về kiemr nghiệm E.coli 57
4.3.1 Kiểm nghiệm theo phương pháp định tính, phương pháp MPN
và phương pháp đếm khuẩn lạc 57
4.3.2 Kiểm nghiệm theo phương pháp ELISA 58
4.3.3 Thảo luận về khả năng sinh Indol trong nghiệp pháp IMViC
phát hiện E.coli 59
iv

4.3.4 Thảo luận về thử nghiệm Merthy Red trong nghiệp pháp IMViC
phát hiện E.coli 62
4.3.5 Thảo luận về thử nghiệm Voges – Prokauer trong nghiệp pháp
IMViC phát hiện E.coli 63
4.3.6 Thảo luận về thử nghiệm citrate trong nghiệp pháp IMViC phát
hiện E.coli 65
4.4 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm tổng nấm men, nấm mốc 67
4.4.1 Quy trình phân tích định tính nấm mốc 67
4.4.2 Quy trình phân tích định lượng tổng nấm men, nấm mốc 67
CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69
5.1 Kết luận 69
5.2 Kiến nghị 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

 BGBL : Brilliant Green Bile Lactose broth
 BPW : Buffer Pepton Water
 CFU : Colony Forming Unit
 DG18 : Dichloran Glycerol Agar
 DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar
 EC : Escherichia coli Broth
 EMB : Eosine Methylene Blue Agar
 E.coli : Escherichia coli
 EIA : Enzyme Immuno Assay
 ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay
 LSB :
Lauryl Sulphate Broth

 LST : Lactose Trypton Laurl Sulphate Broth
 MPN : Most Probable Number
 MR : Methyl red
 PCA : Plate Count Agar
 SPW : Saline


eptone Water
 TSA : Tryptone Soya Agar
 VP : Voges – Proskauer
 VRB : Violet Red Bile Agar






vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Báo cáo thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2000 – 2008 8
Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và
lá mơ 12
Bảng 2.3 : Chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm 12
Bảng 2.4 : Giới hạn cho phép Coliforms trong thực phẩm 13
Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá 41

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 2.1: Vi khuẩn lên men lactose 11
Hình 2.2 : Coliforms chịu nhiệt lên men đường lactose 11
Hình 2.3 : Escherichia coli 13
Hình 2.4: Khuẩn lạc và tế bào nấm men 20
Hình 2.5: Khuẩn lạc và hệ sợi nấm mốc 20
Hình 3.1 : Pha loãng mẫu 26
Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí 29
Hình 3.3 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí 30
Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms 33
Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliforms 34
Hình 3.6 Khẳng định Coliforms 34
Hình 3.7 : Khẳng định Coliforms 37
Hình 3.8: Kết quả khẳng định coliform trên môi trường BGBL 37
Hình 3.9 : Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB 40
Hình 3.10: Nghiệm pháp IMViC 41
Hình 3.11: Dạng bánh kẹp gồm kháng thể bắt – kháng nguyên – thể tiếp

hợp chứa kháng thể 50
Hình 3.12: Tổng quát quá trình phát hiện E.coli bằng phương pháp ELISA 51
Hình 4.1: Indol + và Indol - 61
Hình 4.2 : Thử nghiệm MR 63




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 1 MSSV: 0811110005
CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong thời đại đất nước phát triển và hội nhập như ngày nay, cuộc sống của con
người ngày càng được nâng cao và nhu cầu về ăn uống càng phải được cải thiện. Tuy
nhiên, cuộc sống của họ ngày càng bận rộn và hối hả, nên thời gian dành cho việc tự
nấu nướng cho các bữa ăn trong gia đình ngày càng hạn chế, vì thế những suất ăn
nhanh, cơm tiệm, các thức ăn chế biến sẵn là giải pháp mà rất nhiều người lựa chọn. Từ
đó cho các thực phẩm được chế biến sẵn đóng vai trò quan trọng trong xã hội, vừa đáp
ứng nhu cầu nhanh gọn vừa tiết kiệm được thời gian. Tuy nhiên, về mặt vệ sinh thì
không có gì đảm bảo được. Vì mọi người không thể kiểm soát quá trình chế biến và nếu
sản phẩm chế biến có vấn đề thực sự thì cũng không có cách nào nhận biết. Từ đó dẫn
đến một số vấn đề về sức khỏe ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình làm việc và thậm chí
còn gây tử vong, đó là hậu quả của ngộ độc thực phẩm.
Vấn đề kiểm soát mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được quan tâm
nhiều hơn. Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm không phải là một việc dễ dàng
mà cần phải có đủ khả năng chuyên môn về lý thuyết cũng như thực hành. Để góp phần
đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm cũng như đưa ra những khuyến cáo cho
mọi người, tôi tiến hành thực hiện khóa luận “Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây

bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn”. Hy vọng sau đề tài tốt nghiệp này sẽ giúp tôi
hiểu rõ hơn về ngộ độc thực phẩm và góp phần phản ánh hiện trạng vệ sinh an toàn
thực phẩm của một số thực phẩm được chế biến sẵn.
1.2 Mục tiêu của đề tài
 Đánh gía mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm của một số loại thực phẩm được chế
biến sẵn
 Đưa ra một số đề nghị cho mọi người
1.3 Nội dung
 Phân tích và đánh giá dựa trên một số chỉ tiêu vi sinh: Tổng vi sinh vật hiếu khí;
Coliforms; Escherichia coli; Tổng nấm men,nấm mốc.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 2 MSSV: 0811110005
1.4 Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình phân tích bốn chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực
phẩm chế biến sẵn
 Tổng số vi sinh vật hiếu khí
 Coliforms
 Escherichia coli
 Tổng nấm men, nấm mốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 3 MSSV: 0811110005
CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN
2.1 Khái quát về ngộ độc thực phẩm
Hiện nay có rất nhiều vụ ngộ độc hay các bệnh gây ra do thực phẩm, mặc dù có
các luật về an toàn vệ sinh thực phẩm đã được ban hành và ngày càng chặt chẻ và được
sự quan tâm của công đồng.
Cho đến nay vẫn còn có những cách hiểu và phân biệt không thống nhất về khái
niệm các bệnh gây ra do thực phẩm hay ngộ độc thực phẩm. Song để phân biệt hai vấn
đề này thông thường dựa vào các khái niệm như sau:
- Ngộ độc thực phẩm là các biểu hiện bệnh xuất hiện sau khi tiêu thụ thực phẩm
có chứa số lượng lớn vi sinh vật, chúng nhân lên nhanh trong quá trình chế biến hay
bảo quản. Các vi sinh vật có thể hiện diện một số lượng rất ít ban đầu trong thực phẩm
hay nhiễm vào do sự tiếp xúc trong quá trình chế biến.
- Các bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm do tiêu thụ những thức ăn chứa các vi sinh
vật hay sản phẩm của chúng, không phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít, do đó không
phụ thuộc vào sự chế biến hay bảo quản.

Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm thường có các biểu hiện như tiêu chảy, chóng
mặt, nôn mữa, đau nhức người, sốt, đau đầu. Các biểu hiện bệnh lý này phụ thuộc vào
từng loài vi sinh vật gây nên. Mức độ nguy hiểm và triệu chứng của bệnh có thể gây
nên do độc tố của chúng tiết vào thực phẩm hay do chính tế bào của chúng gây nên.
Ngộ độc thực phẩm dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có trong
thực phẩm. Bệnh do ngộ độc thực phẩm được chia làm hai nhóm:
- Bệnh gây ra do chất độc
- Bệnh gây ra do nhiễm trùng
Bệnh gây ra do chất độc, có thể do vi sinh vật tạo ra hoặc do hóa chất trong quá
trình sản xuất nguyên liệu thực phẩm tạo nên. Các chất độc này có trong thực phẩm
trước khi người tiêu dùng ăn phải.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 4 MSSV: 0811110005
Bệnh do nhiễm trùng là trong thực phẩm có vi khuẩn gây bệnh. Vi khuẩn này vào
cơ thể người bằng con đường tiêu hóa và tác động đến cơ thể do sự hiện diện của nó
hoặc do các chất độc của chúng tạo ra.
2.1.1 Các tác nhân gây ngộ độc
Ngộ độc thực phẩm hay còn gọi là trúng độc thực phẩm là do ăn trúng thức ăn có
chứa độc tố, thường xảy ra một cách đột ngột và hàng loạt. có những biểu hiện cấp tính
như nôn mửa, tiêu chảy.
Thực phẩm rất dễ bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học, các chất độc hại hóa học,
độc hại,vật lý. Chúng có thể gây ngộ độc và nguy hiểm tới sức khỏe người tiêu dùng.
Có ba nguyên nhân chính gây ngộ độc hay gặp, đó là do hóa chất bảo quản thực phẩm
(thuốc trừ sâu, hóa chất chống sâu mọt ), do hóa chất dùng trong trong chế biến thực
phẩm (ví dụ phẩm màu trong các loại bánh, xôi, rượu ) và do các vi sinh vật và tác
nhân vật lý.
2.1.1.1 Các tác nhân vật lý
- Mảnh kim loại,

- Xương, tóc …
- Vật lạ gỗ, kim loại, đá sạn…
- Chất phóng xạ
- Các mảnh thuỷ tinh
Và các vật lạ khác lẫn vào thực phẩm cũng gây nguy hại đáng kể như gãy răng,
hóc xương, tổn thương niêm mạc dạ dày, miệng…
2.1.1.2 Các tác nhân hoá học
 Các chất ô nhiễm trong công nghiệp và môi trường như: các dioxin, các chất
phóng xạ, các kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, asen, cadimi…)
 Các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp: thuốc bảo vệ thực vật, động vật,
thuốc thú y, chất tăng trưởng, phân bón, thuốc trừ giun sán và chất hun khói.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 5 MSSV: 0811110005
 Các chất phụ gia sử dụng không đúng qui định: các chất tạo màu, tạo mùi, tạo
ngọt, tăng độ kết dính, ổn định, chất bảo quản, chất chống ôxy hóa, chất tẩy rửa… và
các hợp chất không mong muốn trong vật liệu bao gói, chứa đựng thực phẩm.
 Các chất độc hại tạo ra trong quá trình chế biến thịt hun khói, dầu mỡ bị cháy
khét, các hợp chất tạo ra do phản ứng hóa học trong thực phẩm, sự sản sinh độc tố
trong quá trình bảo quản, dự trữ bị nhiễm nấm mốc (độc tố vi nấm) hay biến chất ôi
hỏng.
 Các độc tố tự nhiên có sẵn trong thực phẩm như mầm khoai tây, sắn, đậu mèo,
măng, nấm độc, cá nóc, cá cóc…
 Các chất gây dị ứng trong một số hải sản, nhộng tôm…
2.1.1.3 Các tác nhân sinh học
 Vi khuẩn có ở mọi nơi xung quanh chúng ta. Phân nước thải, rác bụi, thực phẩm
tươi sống là ổ chứa của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Mặt khác, trong không khí và
ngay ở trên cơ thể người (đặc biệt là ở bàn tay), ở miệng, ở đường hô hấp, đường tiêu
hóa, bộ phận sinh dục, tiết niệu cũng có rất nhiều loaị vi khuẩn. Thức ăn chín để ở nhiệt

độ bình thường là môi trường tốt cho vi khuẩn trong không khí xâm nhập và phát triển
rất nhanh, đặc biệt các thức ăn còn thừa sau các bữa ăn chỉ cần một vài giờ là số lượng
vi khuẩn có thể sinh sản đạt đến mức gây ngộ độc thực phẩm.
 Nấm mốc thường gặp trong môi trường sống, nhất là ở trong các loại ngũ cốc,
quả hạt có dầu dự trữ trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở nước ta. Nấm mốc gây hư
hỏng thực phẩm, một số loại còn sản sinh ra các độc tố nguy hiểm như Aflatoxin.
Aflatoxin là độc tố vi nấm do nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản
sinh ra trong ngô, đậu và lạc, Aflatoxin là tác nhân có thể gây ung thư gan.
 Ký sinh trùng thường gặp trong thực phẩm là giun sán. Người ăn phải thịt có ấu
trùng sán dây trong thịt bò (sán dây bò), trong thịt lợn (thịt lợn gạo) chưa nấu chín, khi
vào cơ thể thì ấu trùng sẽ phát triển thành sán trưởng thành ký sinh ở đường tiêu hóa và
gây rối loạn tiêu hóa. Khi ăn cá nước ngọt như cá diếc, cá rô, cá chép, cá trôi… có nang
trùng sán lá gan nhỏ chưa nấu chín thì nang trùng chuyển tới ống mật, lên gan và phát
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 6 MSSV: 0811110005
triển ở gan thành sán trưởng thành gây tổn thương gan mật. Nếu ăn phải tôm, cua có
nang trùng sán lá phổi chưa nấu chín hoặc uống nước có nang trùng thì chúng sẽ xuyên
qua thành ruột và qua cơ hoành lên phổi, phát triển thành sán trưởng thành gây viêm
phế quản, đau ngực, ho khạc ra máu nguy hiểm. Bệnh do giun sán cũng bởi tập quán ăn
thịt tái, nem làm từ thịt sống, ăn tiết canh có ấu trùng gây nhiễm độc, dị ứng, sốt cao,
liệt cơ hô hấp có thể dẫn đến tử vong.
2.1.2 Tác hại
Sự có mặt của các tác nhân này trong thực phẩm cho thấy thực phẩm có thể không
an toàn đối với người sử dụng. Thực phẩm rất dễ bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học,
tác nhân hóa học, tác nhân vật lý có thể gây ngộ độc nguy hiểm và ảnh hưởng tới sức
khỏe người tiêu dùng. Có 3 nguyên nhân chính gây ngộ độc hay gặp, đó là do hóa chất
bảo quản thực phẩm ( chất chống mối, kiến, sâu bọ…), do hóa chất dùng trong trong
chế biến thực phẩm ( phẩm màu trong thực phẩm) và do các vi sinh vật và tác nhân vật

lý.
Biểu hiện của tác hại do thực phẩm nhiễm bẩn:
- Nhiễm độc tiềm ẩn: là sự nhiễm các chất độc hại dưới ngưỡng có thể gây ra các triệu
chứng cấp tính, bán cấp tính; có thể bị nhiễm liên tục hoặc không liên tục; có thể sau
một thời gian không biết trước sẽ có: ung thư, các rối loạn chức năng không rõ nguyên
nhân, vô sinh
- Bệnh mạn tính: là bệnh mắc phải, có biểu hiện phát bệnh lặp lại thường xuyên hoặc
theo chu kỳ; có thể do di chứng của ngộ độc cấp hoặc do hậu quả của nhiễm độc tiềm
ẩn tới liều gây bệnh; có thể trở thành bệnh khó chữa hoặc không chữa khỏi.
- Bệnh bán cấp tính (ngộ độc thức ăn): các rối loạn tiêu hóa hoặc thần kinh nhẹ, hoặc
các triệu chứng cấp tính, có thể tự chữa khỏi hoặc tự khỏi.
- Bệnh cấp tính (ngộ độc thức ăn): các triệu chứng trước đây tương đối điển hình và
bệnh nhân cần đến sự can thiệp của bác sĩ.
+ Biểu hiện rối loạn tiêu hóa: nôn, ỉa chảy (gồm cả ỉa ra máu), đau bụng.
+ Biểu hiện rối loạn thần kinh: rối loạn cảm giác, nhức đầu, mệt lả, hôn mê, liệt chi.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 7 MSSV: 0811110005
+ Các rối loạn chức năng khác: thay đổi huyết áp, bí tiểu
- Thời gian lành bệnh (đến khi hết triệu chứng nhưng bệnh nhân chưa thể sinh hoạt và
làm việc một các bình thường).
+ Với người mắc bệnh bán cấp và cấp tính : 02 ngày – 01 tháng
+ Với người mắc bệnh mạn tính: không khỏi hẳn và thỉnh thoảng tái phát.
- Thời gian phục hồi sức khỏe (đã có thể sinh hoat và làm việc một cách bình thường):
tuỳ theo nguyên nhân, tình trạng sức khỏe và độ tuổi, thường là:
+ Với người bình thường bị mắc bệnh bán cấp và cấp tính: 01 – 04 tuần với người lớn
và trẻ độ tuổi học đường: 01 tháng đến vài tháng với trẻ dưới 7 tuổi và người già.
+ Với người mắc bệnh mạn tính bị tái phát: 01 – 02 tuần trong trường hợp bệnh tái phát
có thể chữa được; không xác định được trong trừơng hợp đã thành bệnh nặng.

- Tử vong là hậu quả của ngộ độc cấp rất nặng, ngộ độc cấp không được cứ chữa kịp
thời hoặc hậu quả của nhiễm độc tiềm ẩn kéo dài đã dẫn đến bệnh hiểm nghèo không
cứu chữa được.
2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên Thế Giới và Việt Nam
Ở các nước phát triển có tới 10% dân số bị ngộ độc thực phẩm và mắc bệnh truyền
qua thực phẩm mỗi năm; với các nước kém phát triển tỷ lệ này cao hơn nhiều. Nhiều
nước có quy định báo cáo nhưng chỉ đạt 1% số ca bị ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc thực
phẩm ở Mỹ chiếm 5% dân số/năm (>10 triệu người/năm), trung bình 175ca/100.000
dân, mỗi năm chết 5.000 người; ở Anh : 190ca/100.000 dân; ở Nhật : 20-40 ca/100.000
dân, ở Úc là 4,2 triệu ca/năm
Thực trạng vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta rất đáng báo động. Ngộ
độc thực phẩm cấp tính trong những năm qua vẫn có chiều hướng gia tăng cả về số vụ
và quy mô mắc. Tỷ lệ mắc/100.000 dân trung bình từ năm 2001 – 2005 là 5,48. Có
nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm trong toàn quốc như thực phẩm ô
nhiễm, môi trường ô nhiễm; thực phẩm có độc; điều kiện sản xuất, chế biến thực phẩm
không bảo đảm an toàn, nhận thức – hành vi đúng về phòng chống ngộ độc thực phẩm
của cộng đồng còn nhiều hạn chế…
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 8 MSSV: 0811110005
Ở Việt Nam, trung bình mỗi năm có 202,2 vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với
5.525,1 người mắc và 55,2 người chết. Số vụ ngộ độc xảy ra nhiều nhất là từ tháng 4 –
7 và tháng 9 – 11. Tỷ lệ mắc ngộ độc trung bình là 7,14/100.000 dân, tỷ lệ chết là
0,06/100.000 dân/năm. Hàng năm có khoảng ba triệu trường hợp nhiễm độc, gây thiệt
hại hơn 200 triệu USD. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật
42,2%, do hoá chất 24,9%, do độc tố tự nhiên 25,2%.

Trong những năm gần đây, khi nền kinh tế nước ta chuyển sang cơ chế thị trường,
các loại thực phẩm chế biến sẵn ngày càng nhiều, đặc biệt là dịch vụ thức ăn nhanh và

thức ăn đường phố ngày càng phát triển. Các dịch vụ này thuận tiện cho người tiêu
dùng nhưng cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm.
Thống kê tình hình ngộ độc trong những năm gần đây cho thấy số vụ và mức độ
ngày càng gia tăng. Cụ thể tình hình từ năm 2000-2008 trên địa bàn cả nước ( bảng 2.1)
Bảng 2.1 Báo cáo thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2000 – 2008
Kết quả điều tra
Năm
Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người)
2000 213 4.233 59
2001 245 3.901 63
2002 218 4.9641 71
2003 238 6.428 37
2004 145 3.584 41
2005 144 4.304 53
2006 165 7.135 57
2007 247 7.329 55
2008 205 7.828 61
Trung bình/năm 202,2 ( 247-144) 5.525,1 (7.828 – 3.584)

55,2 (71 – 31)
Tổng cộng 1.820 49.726 497
(Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, bộ Y tế)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 9 MSSV: 0811110005
2.3 Giới thiệu một số vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm chế biến
2.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí
2.3.1.1 Định nghĩa
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong

điều kiện có sự hiện diện của oxy (O
2
) phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện
trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.
2.3.1.2 Nguyên tắc
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu
khí ở 30
0
C/72 giờ ± 6 giờ hoặc 37
0
C/48 giờ ± 6 giờ.
Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường
thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối
phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị
hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực
phẩm
2.3.2 Coliforms
2.3.2.1 Giới thiệu
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng
trong thực phẩm. Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế
biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫu môi trường
dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.
2.3.2.2 Nguồn gốc
Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae và
Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm thấy trong phân
người. (Gedreich 978).
Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xuyên xét nghiệm vi khuẩn
trong nước ở London. Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phương tiện truyền
thống để đếm vi khuẩn (Hutchison và Ridgway 1977).
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 10 MSSV: 0811110005
Đầu thập niên 1900 ( Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của Coliforms như
là dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản xuất khí
đốt với việc giới thiệu ống Durham ( Durham năm 1983) thì khái niệm về vi khuẩn
Coliforms và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nước Anh năm 1901.
Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn
Coliforms.
Năm 1909 Macconkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms.
Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coli được đem ra sản
xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer nhằm xác
định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978).
Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm IMViC
(Indole, Methyl đỏ, Voges-Proskauer và muối của acid Citric). Việc thử nghiệm cho
thấy sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coliform phân, các dạng vi khuẩn trong đất và
trung gian, và nó được sử dụng cho đến ngày hôm nay.
2.3.2.3 Đặc điểm
Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có phản ứng oxidase
âm tính và thể hiện hoạt tính của β – galactosidase. Vi khuẩn này có khả năng phát triển
trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương
tự, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37
o
C trong 24 – 48 giờ.
Coliforms gồm bốn chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli,
Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy,1991). Chúng thường có mặt
trong đường ruột động vật có vú. ( ví dụ: Escherichia coli phổ biến trong đất trên cơ thể
người).
Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter
freundii ( hình 2.1) có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường ( nước giàu chất

dinh dưỡng, đất và động vật) cũng như trơn nước uống có nồng độ các chất dinh dưỡng
tương đối cao.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 11 MSSV: 0811110005

Citrobacter freundii Escherichia cloacae
Hình 2.1: Vi khuẩn lên men lactose
[9]
Coliforms chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 45
o
C , nó bao gồm
Escherichia và loài Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter ( hình 2.2).

Enterobacter Citrobacter Klebsiella
Hình 2.2 : Coliforms chịu nhiệt lên men đường lactose
[9]

2.3.2.4 Hiện diện
Vi khuẩn Coliforms hiện diện khắp nơi, kể cả trong đất, da, thực phẩm, nước sông,
ao hồ, rau cải
Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinh khiết
của nước hay rau (bảng 2.2). Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy. Vì vi
khuẩn Coliforms vẫn có khả năng sống sót trong nước uống. Sự hiện diện của
Coliforms trong nước không hẳn là nước bị nhiễm phân.
Coliforms chịu nhiệt từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như nước thải công
nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 12 MSSV: 0811110005
Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá
mơ
[10]

Loại rau và vi
khuẩn
Trước khi rửa Sau khi rửa Giảm
Rau ngổ
Tổng số vi khuẩn
Coliforms

3.300.000
89.000

37.000
2.300

99%
97%
Lá mơ
Tổng số vi khuẩn
Coliforms

190.000
24.000

160.000
4.800

16%
80%

Sự có mặt của Coliforms trong môi trường chứng tỏ môi trường đó nhiễm bẩn có
nguồn gốc từ phân. Ở Việt Nam đã có một số chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm (bảng
2.3) và giới hạn của chúng có trong thực phẩm ( bảng 2.4)
Bảng 2.3 : Chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm
[10]

Tiêu chuẩn Thực phẩm Coliforms
TCVN5289/92 Cá fillet, tôm , mực
TCVN4381/92 Tôm vỏ đông lạnh
TCVN5835/94 Tôm thịt IQF
TCVN2644/93 Mực đông lạnh



10
2
cfu/g
TCVN5649/92 Hàng khô
TCVN5526/91 Mực cá khô tẩm vị 10 cfu/g
TCVN6175/9 Nước mắm 10 cfu/ml

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 13 MSSV: 0811110005
Bảng 2.4 : Giới hạn cho phép Coliforms trong thực phẩm

[10]

Thực phẩm
Giới hạn cho phép CFU/g hay CFU/ml
thực phẩm
Sản phẩm từ thịt: pate, xúc xích… 50
Sản phẩm chế biến: tôm, cá, mực… 10
Thủy sản khô sơ chế: cá khô 10
2

Trứng 10
2

Sản phẩm từ trứng 10
Sữa 10
Sản phẩm từ ngũ cốc, xử lý nhiệt trước
khi dùng ( bột, miếng, mì), dùng trực
10
3


Nước giải khát không cồn 10
Nước khoáng đóng chai 0

2.3.3 Escherichia coli
2.3.3.1 Định nghĩa
Escherichia coli (thường được viết tắt là E. coli)
là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong
đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và
động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình

tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột.
Sự có mặt của E.coli trong nước ngầm là một chỉ thị
thường gặp cho ô nhiễm phân. E.coli thuộc họ vi


Hình 2
.3 : Escherichia coli
[8]

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 14 MSSV: 0811110005
khuẩn Enterrobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các
nghiên cứu về vi khuẩn( hình 2.3)
2.3.3.2 Nguồn gốc
- Năm 1885 Escherichia coli được Bucher tìm ra và đến năm 1886 tại Munchen,
một bác sĩ nhi khoa tên Theodor Escherich nghiên cứu đầy đủ. E.coli thường sống
trong ruột già, trong tiếng LaTinh ruột già là colum. Vì tôn trọng nhà khoa học nên
người ta lấy tên ông ghép vào chữ ruột già theo ngữ pháp sở hữu cách tiếng La Tinh
nên vi khuẩn này có tên Escherichia coli.
- Vi khuẩn do Escherich phát hiện trong tả lót của trẻ em được công bố với tên gọi
đầu tiên là Bacterium coli commune. Bốn năm sau vi khuẩn này được giới chuyên
môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khai phá.
- Năm 1895 người ta gọi bằng tên Bacillus coli.
- Năm 1896 gọi thành Bacterium coli.
- Năm 1991 vi khuẩn được thống nhất toàn cầu là Escherichia coli.
2.3.3.3 Hình thái, cấu trúc
Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào,
không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có capsul.

Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn. Một số dòng có lông bám (pili).
2.3.3.4 Phân loại
Hiện nay các nhà khoa học tìm ra được 5 nhóm E.coli khác nhau.
 Enteroaggregative (EAggE.C)
 Enterohemorrhagic (E HEC)
 Enteroinrasire (EIEC)
 Enteropathogenic (EPEC)
 Enterotoxigenic (ETEC)
2.3.3.5 Đặc điểm nuôi cấy
E.coli là trực khuẩn hiếu khí tùy nghi, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5-40
0
C,
nhiệt độ thích hợp là 37
0
C trong 24 giờ, pH thích hợp là 7,3 - 7,4 nhưng có thể phát
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 15 MSSV: 0811110005
triển ở pH từ 5,5 – 8. Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy
thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản.
- Trên môi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy ở 37
0
C trong 24 giờ nuôi cấy,
vi khuẩn E.coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng
xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi
trường có mùi hôi
- Trên môi trường thạch thường: ủ ở 37
0
C trong 24 giờ vi khuẩn phát triển hình

thành những khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi
đường khính 2-3mm. nếu nuối lâu hơn, khuẩn lạc chuyển màu gần như màu nâu nhạt
và mọc mộng ra. Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M (Mucoid) và dạng R
(Rough).
- Trên môi trường thạch máu : sau 24 giờ nuôi cấy ở 37
0
C, vi khuẩn E.coli hình
thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sang, kích thước từ 1-2 mm, có thể có
hoặc không có dung huyết tùy thuộc vào chủng.
- Trên môi trường thạch peptone: sau 18 – 24 giờ ủ trong tủ ấm 37
0
C, vi khuẩn
mọc thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu xám, kích thước trung bình, mặt khuẩn lạc
hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng bóng.
- Trên môi trường thạch MacConkey: sau khi nuôi cấy 24 giờ ở tủ ấm 37
0
C, hình
thành khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển
màu môi trường.
- Trên môi trường Endo: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37
0
C, vi khuẩn hình thành khuẩn
lạc màu đỏ mận chính, có hoặc không có màu ánh kim.
- Trên môi trường EMB: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37
0
C, vi khuẩn hình thành khuẩn
lạc màu tím đen có ánh kim.
- Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37
0
C vi

khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S ( Smooth), màu vàng chanh.
2.3.3.6 Đặc tính sinh hóa
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 16 MSSV: 0811110005
Nhiệt độ thích hợp là 37 - 38
0
C, pH: 7,2 – 7,4. Khuẩn lạc thay đổi theo môi trường
nuôi cấy: trong môi trường NA: khuẩn lạc tròn, ẩm ướt, mặt láng, có nếp nhăn. Trong
môi trường EMB: khuẩn lạc có màu thâm tím hoặc đen. Môi trường MacConkey:
khuẩn lạc màu đỏ mận chín.
Đặc tính lên men các loại đường. E.coli gồm những trực khuẩn di động hoặc
không di động, có khả năng lên men sinh hơi các loại đường Glucoza, Fructoza,
Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza. Lên men không chắc chắn với
các loại đường Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó vi khuẩn Salmonella thì không
có đặc tính này, đây là đặc tính quan trọng để phân biệt vi khuẩn E.coli và Salmonella.
2.3.3.7 Đặc điểm kháng nguyên và độc tố
E.coli gồm 4 loại kháng nguyên : O (kháng nguyên thân), H (kháng nguyên tiêu
mao),K ( kháng nguyên màng tế bào), F .
- Kháng nguyên O ( kháng nguyên thân) là kháng nguyên của thành tế bào. Cấu tạo
bởi lipopoly saccharit. Đặt tính kháng nguyên O như sau:
 Chịu được nhiệt không bị hủy khi đun nóng 100
0
C trong 2 giờ.
 Kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
 Bị hủy bởi focmol 5%.
 Có tính độc, chỉ cần 1/20mg đủ giết chết chuột trong 24 giờ.
- Kháng nguyên H (kháng nguyên tiên mao). Được cấu tạo bởi protein và có các tính
chất sau:

 Không chịu nhiệt.
 Bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
 Bị hủy bởi các protease.
 Không bị hủy bởi focmol 5%.
- Kháng nguyên K( kháng nguyên màng tế bào). Loại này chỉ có ở một số loại vi
khuẩn đường ruột. được cấu tạo bởi Polysaccharit và Protein.
- Kháng nguyên F ( kháng nguyên ) chức năng của kháng nguyên này là giúp vi
khuẩn bám giữ vào giá thể ( màng nhày của đường tiêu hóa) hay còn gọi là bám dính.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 17 MSSV: 0811110005
Đây là khả năng đặc biệt quan trọng, giúp vi khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quá
trình gây bệnh.
Độc tố của E.coli gồm: nội độc tố gây tiêu chảy và ngoại độc tố gây tan huyết và
phù thủng.
Độc tố của E.coli: loại E.coli có giáp mô gây ngộ độ mạnh hơn loại không có giáp
mô. Nội độc tố đường ruột gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt. cả hai loại này
đều gây tiêu chảy. Loại chịu nhiệt ST ( Thermostable): gồm các lại STa, STa. Loại
không chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1,LT2. Những dòng E.coli sản
sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh khác nhau thường gặp nhất là các type
O6H16, O8H9, O78H2, O157.
2.3.3.8 Cơ chế gây bệnh
Cơ chế gây ngộ độc: khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm theo
độc tố của chúng.
 Ngoại độc tố: phá huỷ thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại
tử và gây nhiễm độc thần kinh.
 Nội độc tố: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc thần kinh
và biểu hiện nhiều triệu chứng khác.
E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và F41.Yếu

tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotyp.
Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của E.coli.
E.coli là vi khuẩn môi trường, nơi nào cũng có. Bình thường, vi khuẩn không gây
tác hại trên ký chủ (103 CFU/g phân). Khi mật số tăng lên cao (106- 109CFU/g phân)
thì nó sẽ trở nên gây bệnh.
Tính bám dính: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể heo chủ yếu qua đường miệng. Ở
dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn. Khi đến ruột,
E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc ruột và tác động
lên nhung mao ruột.