tổng quan về các vi sinh vật chỉ thị và các biện pháp kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGỆ SINH HỌC















KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




CHUYÊN NGHÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ NGHÀNH : C73



GVHD : KS. PHẠM MINH NHỰT
SVTH : LÊ NGỌC BÍCH VƯƠNG
LỚP : 07CSH

MSSV : 207111073





TP. Hồ Chí Minh, thng 07 năm 2010

Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

1
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH

LỜI CẢM ƠN


Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại Học Kỹ Thuật Công
Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, Khoa Môi Trường & Công Nghệ Sinh Học và quý thầy
cô đã tạo điều kiện cho em được học tập, trang bị rất nhiều kiến thức chuyên môn
trong lĩnh vực đã chọn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến KS. Phạm Minh Nhựt và những người
đã trực tiếp chỉ dạy, góp ý để có thể hoàn thành Khóa luận này.
Con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người thân đã tận tình giúp
đỡ con về mặt vật chất cũng như tinh thần để con có điều kiện học tập, trang bị
kiến thức hành trang vào đời cũng như góp một phần nhỏ bé của mình cho công
cuộc xây dựng và phát triển đất nước.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè tôi, những người đã tạo điều kiện, động
viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp này.
Vì thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không tránh khỏi những

thiếu sót. Em kính mong quý Thầy Cô thông cảm và chỉ dạy, góp ý thêm để sau này
ra trường em có thể đảm nhiệm công việc chuyên môn tốt hơn.
Một lần nữa Em xin chân thành cảm ơn !
TP. Hồ Chí Minh tháng 07 năm 2010
Sinh viên

LÊ NGỌC BÍCH VƯƠNG
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

2
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
MỤC LỤC
TRANG BÌA
NHIỆM VỤ KHOÁ LUẬN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH SÁCH CÁC BẢNG
DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích 1
1.3. Nội dung nghiên cứu 1
CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu vi sinh vật chỉ thị 2
2.1.1. Khái niệm vi sinh vật chỉ thị 2
2.1.2. Các tiêu chí lựa chọn một vi sinh vật chỉ thị 2
2.1.3. Chỉ thị an toàn thực phẩm 3
2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng 4

2.1.5. Ý nghĩa của vi sinh vật chỉ thị 5
a. Vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình 5
b. Vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình 6
c. Vi sinh vật ưa lạnh 6
2.1.6. Các vi sinh vật chỉ thị điển hình 6
2.1.6.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí 6
a. Giới thiệu 6
b. Định nghĩa 6
c. Nguyên tắc 6
2.1.4.2. Coliform tổng số 7
a. Giới thiệu 7
b. Nguồn gốc 7
c. Đặc điểm 8
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

3
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
d. Hiện diện 9
2.1.4.3. Escherichia Coli 11
a. Giói thiệu 11
b. Nguồn gốc 12
c. Phân loại 12
d.Đặc điểm và phân bố 13
e. Đặc điểm sinh hóa và nuôi cấy 13
f. Yếu tố kháng nguyên 14
g. Tính chất gây bệnh 15
h. Nguyên nhân 16
i. Biện pháp phòng ngừa 16
2.1.4.4. Faecal Streptococcus 16

a. Giới thiệu 16
b.Phân loại 17
c.Đặc điểm 17
2.1.4.5. Enterococcus 18
a. Giới thiệu 18
b. Phân loại 18
c. Đặc điểm 19
d. Tăng trưởng 19
e. Triệu chứng 19
f. Biên pháp 19





2.1.4.6. Bifidobacterium 20
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

4
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
a.Đặc diểm hình thái và yaau cầu tăng trưởng 20
b. Phân loại 20
c. Phân bố 20
2.1.4.7. Staphylocococcus aureus 21
a. Giới thiệu 21
b. Phân loại khoa học 22
c. Phân bố và hình dạng tế bào 22
d.Đặc điểm sinh hóa và điều kiện sinh trưởng 23
e. Các yếu tố độc lực 24

f. Khả năng gây bệnh 24
f.1. Gây ngộ độc thực phẩm 24
f.2 Triệu chứng 25
f.3. Điều trị 25
f.4. Phòng bệnh 25
2.1.4.8. Clostridium 26
a. Giới thiệu 26
b. Phân loại 26
c. Đặc điểm 26
d. Cấu trúc tế bào phân tử 27
d.1. cấu trúc tế bào 27
d.2. Cấu trúc phân tử 28
e. Cơ chế gây bệnh 28
e.1 Yếu tố độc lực 28
e.2. Cơ chế gây bệnh 28
f. Thực phẩm truyền nhiễm 29
g. Triệu chứng và biện pháp phòng ngừa 29
2.1.4.9. Bacillus cereus 30
a. Giới thiệu 30
b. Phân loại 30
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

5
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
c. Đặc tính và phân bố 31
d. Tính chất sinh hóa 31
e. Có chế gây bệnh 31
e.1 Độc tố 31
e.2. Cơ chế 32

f. Triệu chúng và biện pháp phòng ngừa 32
2.1.4.10. Streptocococcus faecalis 32
a. Giới thiệu 32
b. Đặc điểm và phân bố 33
c. Cấu trúc tế bào 33
d. Triệu chứng và biện pháp phòng ngừa 34
CHƯƠNG III. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM -35
3.1. Các phương pháp truyền thống 35
3.1.1. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp 35
a. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu 35
b. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang 36
3.1.2. Định lượng coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 38
3.1.2.1. Nguyên tắc 38
3.1.2.2. Môi trường và hóa chất 38
3.1.2.3. Quy trình phân tích 39
a. Chuẩn bị mẫu 39
b. Cấy mẫu và đổ môi trường 39
c. Đọc kết quả 39
d. Khẳng định 40
e. Cách tính kết quả 40
3.1.3. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa 41
3.1.3.1. Nguyên tắc 41
3.1.3.2. Môi trường và thiết bị nuôi cấy 41
a. Môi trường 41
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

6
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
b. Thiết bị 42

3.1.3.3. Quy trình phân tích 42
a. Chuẩn bị mẫu 42
b. Đỗ đĩa 42
c. Nuôi ủ 42
d. Đọc kết quả 42
3.1.4. Phương pháp màng lọc sinh học 44
3.1.5. Phương pháp MPN (phương pháp tối khả) 44
3.1.5.1. Nguyên tắc 44
3.1.5.2. Sơ đồ quy trình kiểm nghiệm 45
3.2. Các phương pháp hiện đại 47
3.2.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 47
3.2.2. Phương pháp ELISA (Enzyme – linked ImmunoSorbent Assay) 50
3.2.3. Phương thức lai phân tử 50
3.2.4. Phương pháp PCR 51
CHƯƠNG IV. KIỂM SOÁT VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
4.1. Kiểm soát vệ sinh nhà xưởng 54
4.1.1. Mục đích 54
4.1.2. Phương pháp vật lý và hóa học được sử dụng cho việc kiểm soát vi sinh
vật bằng vệ sinh thiết bị chế biến thực 55
4.1.2.1. Clo – Thuốc tẩy rửa 55
4.1.2.2. Iodophore 56
4.1.2.3. Hợp nhất Amoni 56
4.1.2.4. H
2
O
2
57
4.2. Kiểm soát bằng phương pháp vật lý 57
4.2.1. Phương pháp ly tâm 57
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

7
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
4.2.2. Phương pháp lọc 57
4.2.3. Phương pháp cắt 58
4.2.4. Phương pháp rửa 59
4.3. Kiểm soát bằng phương pháp nhiệt (đốt nóng) 59
4.3.1. Mục đích 59
4.3.2. Các nhân tố ảnh hưởng 60
4.3.3. Chế biến thực phẩm ở nhiệt độ thấp 60
4.3.4. Chế biến thực phẩm ở nhiệt độ cao (tăng nhiệt) 61
4.3.5. Chế biến thực phẩm bằng lò vi sóng 61
4.4. Kiểm soát bằng phương pháp giảm độ ẩm 61
4.4.1. Mục đích 61
4.4.1.1. Giảm nước 61
4.4.1.2. Đông khô 62
4.4.1.3. Sấy khô 62
4.4.1.4. Hun khói 62
4.5. Kiểm soát vi sinh vật bằng phương pháp acid hữu cơ và pH thấp 62
4.5.1. Mục đích 62
4.5.1.1. Acid axetic 63
4.5.1.2. Acid propionic 63
4.5.1.3. Acid lactic 63
4.5.1.4. Acid citric 63
4.5.1.5. Acid Sorbic 64
4.5.1.6. Acid benzoic 64
4.6. Kiểm soát bằng chất bảo quản kháng sinh 65
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

8
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
4.6.1 .Mục đích 65
4.6.1.1. Nitrite (NaNO
2
và KNO
2
) 65
4.6.1.2. Lưu huỳnh dioxide (SO
2
) và Sulfite (SO
3
) 65
4.6.1.3. H
2
O
2
66
4.6.1.4. Epoxit (Ethylene oxide, propylene oxide) 66
4.6.1.5. Butylated hydroxyanisol (BHA), hydroxytolunene butylated (BHT) và t-
butyl 66
4.6.1.6. Chitosan 67
4.6.1.7. Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) 67
4.6.1.8. Lysozyme 67
4.6.1.9. Monolaurin (Glycerol Monolaurate) 68
4.6.1.10. Kháng sinh (tetracycline, natamycin và tylosin) 68
4.6.1.11. Hun khói 68
4.6.1.12. Gia vị 69
4.7. Kiểm soát bằng cách chiếu xa 69

4.7.1. Mục đích 69
4.7.1.1. Liều chiếu xạ 69
4.7.1.2. Một số loại chiếu xạ 70
4.7.1.3. Bức xạ tia cực tím 71
4.7.1.4. Bức xạ ion hóa 71
CHƯƠNG V. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
5.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 72
5.2. Vật liệu nghiên cứu 72
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

9
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
5.3. Dụng cụ và hóa chất 72
5.3.1. Dụng cụ và thiết bị 72
5.3.1.1. Dụng cu 72
5.3.1.2. Thiết bị 73
5.3.2. Hóa chất 73
5.4. Bố trí thí nghiệm 74
5.4.1. Nội dung thực hiện 74
5.4.2. Quy trình phân tích 75
5.4.3. Thuyết minh quy trình 76
5.4.4. Kết quả thí nghiệm 77
5.4.4.1. Kết quả cảm quan 77
5.4.4.2. Kết quả đánh giá mức độ ô nhiễm Coliform 77
CHƯƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79
6.1. Kết luận 79
6.2. Kiến nghị 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

10
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH











DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1. Mối quan hệ giữa vi sinh vật gây hư hỏng và thực phẩm 3
Bảng 2.2. Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá mơ
10
Bảng 2.3. Chỉ tiêu của coliform trong thực phẩm 10

Bảng 2.4. Giới hạn cho phép coliform trong thực phẩm 11
Bảng 2.5. Các độc tố gây hại cho người và động vật 28






Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

11
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH






DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 2.1. Mối quan giữa vi sinh vật chỉ thị và mầm bệnh 4
Hình 2.2. Vi khuẩn lên men lactose 9
Hình 2.3. Coliform chịu nhiệt lên men đường lactose 9
Hình 2.4. Escherichia coli 12
Hình 2.5. E.coli O157:H7 15
Hình 2.6. Streptococcus 17
Hình 2.7. Enterococcus 18
Hình 2.8 . Bifidobacterium 20
Hình 2.9. Bifidobacterium 21
Hình 2.10. Staphylococcus aureus 21

Hình 2.11. Staphylococcus 22
Hình 2.12. Clostridium 26
Hình 2.13. Cấu trúc phân tử 28
Hình 2.14. Cơ chế gây bệnh của độc tố Toxin 29
Hình 2.15. Bacillus cereus 30
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

12
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
Hình 2.16. Cấu trúc sinh hóa của Bacillus cereus 31
Hình 2.17. Streptococcus 32
Hình 3.1. Cách đếm tế bào trong buồng đếm hồng cầu 36
Hình 3.2. Pha loãng mẫu 37
Hình 3.3. Cấy vào môi trường 37
Hình 3.4. Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRB 39
Hình 3.5. Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL 40
Hình 3.6. Tổng số vi sinh vật hiếu khí 42
Hình 3.7. Màng lọc 44
Hình 3.8. Các bộ phận của thiết bị lọc vi sinh vật 44
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình kiểm nghiệm 45
Hình 5.1. Nội dung tiến hành 74
Hình5.2. Khuẩn lạc đặc trưng của Coliform 76
Hình5.3. Sinh hơi trong môi trường BGBL 77
Hình 5.4. Kết quả thực nghiệm 77

Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

13
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU
1.1 Đặc vấn đề:
Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề được quan tâm ngày
càng sâu sắc trên phậm vi mỗi quốc gia và quốc tế, bởi vì sự liên quan trực tiếp của
nó ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng con người, sự duy trì nòi giống, cũng như
quá trình phân phối kinh tế quốc tế.
Gần đây ở trong nước và trên thế giơí càng hối thúc các nhà hoachj định thế
giới mạnh tay hơn nữa trong quá trình an toàn vệ sinh thực phẩm. Để đảm bảo cho
người tiêu dùng an toàn về vấn đề thực phẩm, thì đầu tiên người tiêu dùng cần đảm
bảo vệ sinh cá nhân cho chính bản thân mình.
Để góp phần cho việc bảo đảm thực phẩm sạch tốt, việc kiểm soát vi sinh vật
trong thực phẩm cũng là điều cần thiết và cấp bách. Việc kiểm tra vi sinh vật gây
bệnh trong thực phẩm góp phần giúp cho người tiêu dùng an tâm với các sản phẩm
mình chon lựa hơn. Để tìm hiểu vi sinh vật chỉ thị cho thực phẩm và biện pháp kiểm
soát vi sinh vật, tôi xin trình bày những nghiên cứu mà mình đã học hỏi và tìm hiểu.
1.2 Mục đích khóa luận:
Đánh giá mức độ nhiễm tạp của vi sinh vật trong thực phẩm, biện pháp kiểm
soát mức độ an toàn của vi sinh vật chỉ thị trong thực phẩm.
1.3 Nội dung khóa luận:
- Tổng quan các ci sinh vật chỉ thị trong thực phẩm.
- Phương pháp kiểm tra các vi sinh vật trong thực phẩm và biện pháp kiểm
soát.

Chương II. TỔNG QUAN
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

14
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
2.1. Giới thiệu về vi sinh vật chỉ thị
2.1.1. Khái niệm vi sinh vật chỉ thị
Vi sinh vật chỉ thị là những đối tượng sinh vật có yêu cầu nhất định về điều
kiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy, cũng như khả
năng chống chịu một hàm lượng nhất định các yếu tố độc hại trong môi trường
sống và do đó sự hiện diện của chúng biểu thị một tình trạng về kiều kiện sinh thái
của môi trường sống nằm trong giới hạn nhu cầu và khả năng chống chịu của đối
tượng sinh vật đó.
2.1.2. Các tiêu chí lựa chọn một vi sinh vật chỉ thị
- Chúng có mặt ở hiện tại và dễ phát hiện trong tất cả thực phẩm có chất
lượng (hoặc không có chất lượng) để được đánh giá.
- Sự tăng trưởng và số lượng của chúng cần phải có xu hướng tiêu cực tương
quan với chất lượng.
- Chúng cần phải dễ dàng phát hiện, liệt kê và có sự khác biệt rõ ràng với các
vi sinh vật khác.
- Chúng cần được liệt kê trong một thời gian ngắn, thời gian lý tưởng là trong
vòng một ngày.
- Sự tăng trưởng của chúng không bị gây ảnh hưởng bất lợi do các thành
phần khác của thực phẩm.



Bảng 2.1: Mối quan hệ giữa vi sinh vật gây hư hỏng và thực phẩm.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

15
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
Vi sinh vật Sản phẩm
Acetobacter spp Bia tươi
Bacillus spp Bột bánh mì
Byssochlamys spp Trái cây đóng hộp
Clostridium spp Pho – mat rắn
Flat – bào tử Rau chua đóng hộp
Geotrichum spp Trái cây đóng hộp
Vi khuẩn acid lactic Bia, rượu vang
Lactococcus lactic Sữa
Leuconostoc mesenteroides Mía đường (Trong quá trình lọc)
Pectinatus cerevisiiphilus Bia
“Pseudomonas putrefaciens” Bơ
Nấm men Nước ép trái cây
Zygosaccharomyces bailii Mayonnaise, salad đóng gói
Nhóm vi sinh vật là nguyên nhân của sự hư hỏng, số lượng của nó được nhận
biết bằng cách chọn lọc nuôi cấy. Các tổng thể của vi sinh vật đánh giá chất lượng
của các sản phẩm, trong bảng 2.1 nêu lên sự tăng trưởng và số lượng của các vi sinh
vật trong thực phẩm.
2.1.3. Chỉ thị về an toàn thực phẩm
Vi sinh vật chỉ thị nhằm đánh giá mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm và các hệ
thống chất lượng. Để đáp ứng các chỉ tiêu quan trọng nó cần các yếu tố sau:
- Dễ dàng nhận biết và nhanh chóng phát hiện.
- Dễ phân biệt với các nhóm vsv khác trong thực phẩm.
- Sự hiện diện của vi sinh vật là tác nhân gây nên mầm bệnh trong thực phẩm.
- Tỷ lệ nhu cầu tăng trưởng và phát triển của mầm bệnh trong thực phẩm đó.
- Loại trừ mầm bệnh có mặt trong thực phẩm.

Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

16
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH

Hình 2.1: Mối quan giữa vi sinh vật chỉ thị và mầm bệnh.
Các tiêu chí này áp dụng cho hầu hết các vi sinh vật trong thực phẩm có tác
nhân gây bệnh bất kể có nguồn gốc thực phẩm nào. Tuy nhiên tác nhân gây bệnh
được quan tâm có nguồn gốc từ đường ruột, để phát hiện sự ô nhiễm phân của
nguồn nước và sự hiện diện của tác nhân gây bệnh đường ruột.
2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng
- Tốc độ hấp thu và bài tiết: Đây là đặc tính quan trọng trong quá trình đánh giá
ô nhiễm. Đối với những chất có thể bài tiết nhanh chỉ có thể phát hiện được ở
nồng độ cao trong cơ thể sinh vật ngay sau khi chất đó được thải ra môi
trường.
- Đặc điểm sinh lý: Bao gồm quá trình trao đổi chất, lượng mỡ dự trữ, khả năng
bắt mồi, khả năng sinh sản… Những sinh vật có quá trình trao đổi chất mạnh
hơn (cá) thì có khả năng tích tụ nhanh hơn ngay cả trong điều kiện nguồn thức
ăn bị hạn chế.
- Tuổi và kích thước: Đây là yếu tố ảnh hưởng lớn đến kết quả đánh giá đặc biệt
đối với cá. Chúng có mối quan hệ chặc chẽ với các chất tích tụ trong cơ thể.
- Anh hưởng của các chất:
+ Những enzyme khử độc ảnh hưởng đến sự hấp thụ và bài tiết của các chất.
Chỉ thị
Mầm bệnh
Số lượng
Thời gian
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

17
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
+ Sự thay đổi mật độ hấp thụ của các chất.
+ Sự thay đổi đặc tính bên trong của sinh vật sẽ ảnh hưởng đến khả năng hấp
thụ và bài tiết.
+ Sự bài tiết của các chất tạo nên những hợp chất phứt tạp hơn.
- Sự biến đổi của môi trường: Sự thay đổi nhiệt độ, độ cứng, độ mặn, độ đục…
+ Nhiệt độ: Không ảnh hưởng đến độ tan của rất nhiều chất mà còn ảnh
hưởng đến khả năng tích tụ của sinh vật.
+ Nước cứng: Làm giảm tính độc của một số kim loại nặng trong môi trường.
+ Độ mặn và độ đục: Là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến mức độ hấp thụ
của các sinh vật, đặc biệt ở những vùng cửa sông.
- Dinh dưỡng: Một trong số các nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến nồng độ kim
loại nặng tích tụ trong cơ thể sinh vật nhất là những sinh vật hấp thụ qua thức
ăn.
2.1.5. Ý nghĩa của các vi sinh vật chỉ thị
Vi sinh vật chỉ thi vệ sinh thực phẩm có ý nghĩa rất lớn trong việc đánh giá an
toàn về vi sinh và chất lượng thực phẩm.
a. Vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình
Tổng lượng vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình cho biết lượng vi sinh vật
hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình mà nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm bị
nhiễm. Khi đó người quản lý và sản xuất thực phẩm phải kiểm tra lại điều kiện vệ
sinh trong sản xuất, điều kiện bảo quản và phân phối.
Thực phẩm bị phân hủy trong 1 gam chứa khoảng 10
6
đến 10
8
tế bào visinh vật
hiếu khí.

b. Vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình
Tổng lượng vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình cho biết khả năng thực phẩm
nhiễm Clotridium.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

18
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
c. Vi sinh vật ưa lạnh
Tổng lượng vi sinh vật ưa lạnh cho biết trước khoảng thời gian cần thiết để bảo
quản lạnh nhằm đảm bảo sự an toàn thực phẩm.
2.1.6. Các vi sinh vật chỉ thị điển hình
2.1.6.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí
a. Giới thiệu
- Chỉ số này còn có tên gọi khác là: số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên đĩa,
tổng số vi sinh vật sống.
- Chỉ tiêu này được dùng để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản
phẩm. Từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự
đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm.
b. Định nghĩa
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O
2
). Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện
trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.
c. Nguyên tắc
- Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện
hiếu khí ở 30oC/72h ± 6h hoặc 37oC/48h ± 6h.
Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi
trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc

là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới
dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị
khối lượng thực phẩm.
2.1.4.2. Coliform tổng số
a. Giới thiệu
Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: Số lượng hiện diện của chúng
trong thực phẩm. Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

19
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫu môi
trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.
b. Nguồn gốc
Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae
và Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm thấy trong phân
của con người. (Geldreich 1978)
Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xuyên xét nghiệm vi
khuẩn trong nước ở London. Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phương
tiện truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchinson và Ridgway 1977).
Đầu thập niên 1900 (Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của coliform
như là một dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi
sản xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham (Durham năm 1893) thì khái niệm về
vi khuẩn Coliform và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nước Anh năm
1901.
Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn
coliform.
Năm 1909 MacConkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn coliform.
Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn coli được đem ra

sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer
nhằm xác định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978).
Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm
IMVIC (Indole, Methyl đỏ, voges – Proskauer và muối của acid Citric). Việc thử
nghiệm cho thấy sự khác biệt của các dạng vi khuẩn coliform phân, các dạng vi
khuẩn trong đất và trung gian, và nó được sử dụng cho đến ngày hôm nay.
c.Đặc điểm
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

20
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
Vi khuẩn coliform là những trực khuẩn gram âm, không hình thành bào tử, có
phản ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của - galactosidase. Vi khuẩn này có
khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt
khác có tính ức chế tương tự, có thể lên men lactose (với -galactosidase) cho việc
sản xuất acid và sinh hơi khi ủ ở 35 – 37
o
C trong vòng 24 - 48 giờ ở 36 ± 2
o
C.
Coliforms gồm 4 chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella,
Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy, 1991). Chúng thường có mặt trong
đường ruột của động vật có vú. (ví dụ: Escherichia coli phổ biến trong đất, trên cơ
thể người,…).
Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter
freundii có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường (nước giàu chất dinh
dưỡng, đất và thực vật) cũng như trong nước uống có nồng độ có các chất dinh
dưỡng tương đối cao.

Hình 2.2
Hình 2.2: Vi khuẩn lên men lactose
Coliform chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 45
o
C, nó bao
gồm Escherichia và loài Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter.

Citrobacter freundii
Escherichia cloacae
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

21
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH

Hình 2.3. Coliform chịu nhiệt lên men đường lactose
d. Hiện diện
Vi khuẩn coliform hiện diện ở khắp nơi, kể cả trong đất, da, nước sông, nước
ao, rau cải,…
Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinh
khiết của nước hay rau. Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy.Vì vi khuẩn
coliform vẫn có khả năng sống sót trong nước ấm, Sự hiện diện của coliform trong
nước không hẳn là nước bị nhiễm phân.
Coliform chịu nhiệt xuất hiện từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như
nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất.
Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá
mơ.
Loại rau và vi
khuẩn
Trước khi rửa Sau khi rửa Giảm

Rau ngổ
Tổng số vi khuẩn
Coliform

3.300.000
89.000

37.000
2.300

99%
97%
Lá mơ
Tổng số vi khuẩn
Coliform

190.000
24.000

160.000
4.800

16%
80%

Sự có mặt của coliform trong môi trường chứng tỏ môi trường đó nhiễm bẫn
có nguồn gốc từ phân.
Bảng 2.3. Chỉ tiêu của coliform trong thực phẩm
Tiêu chuẩn Thực phẩm Coliform
TCVN5289/92 Cá fillet, tôm, mực

Enterobacter Citrobacter Kiebsiella
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

22
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
TCVN4381/92 Tôm vỏ đông lạnh
TCVN4380/92 Tôm thịt đông lạnh
TCVN4546/94 Tôm mũ ni đông lạnh
TCVN5835/94 Tôm thịt IQF
TCVN2644/93 Mực đông lạnh


200/g
TCVN5649/92 Hàng khô
TCVN5526/91 Mực cá khô tẩm vị 10/g
TCVN6175/9 Nước mắm 10/ml

Bảng 2.4 Giới hạn cho phép coliform trong thực phẩm

Thực phẩm Giới hạn cho phép CFU/g hay CFU/ml
thực phẩm
Sản phẩm từ thịt: pate, xúc xích,… 50
Sản phẩm chế biến: tôm, cá, mực,… 10
Thủy sản khô sơ chế: Cá khô 10
2

Trứng 10
2

Sản phẩm từ trứng 10
Sữa 10
Sản phẩm từ ngũ cốc, xử lý nhiệt trước
khi dùng(bột, miến, mì), dùng trực tiếp
(bánh bột).
10
3

10
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

23
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
Nước giải khát không cồn 10
Nước khoáng đóng chai 0
2.1.4.3. Escherichia Coli:
a. Giới thiệu:
- Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) là một trong những vi khuẩn
sống ký sinh trong đường ruột của động vật.
- Vi khuẩn E. coli cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần
của khuẩn lạc. Sự có mặt của vi khuẩn trong nước là một chỉ thị thường gặp cho ô
nhiễm phân.
- Vi khuẩn này được dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân, bởi vì nó thường
tạo khuẩn lạc trên thành ruột và nó không gây nguy hiểm cho sức khỏe.
b. Nguồn gốc:
- Năm 1885 Escherichia coli được Buchner tìm ra và đến năm 1886 tại
Munchen, một bác sĩ nhi khoa tên Theodor Escherich nghiên cứu đầy đủ. E.coli
thường sống trong ruột già, trong tiếng LaTinh ruột già là colum. Vì tôn trọng nhà
khoa học nên người ta lấy tên ông ghép vào chữ ruột già theo ngữ pháp sở hữu

cách tiếng La Tinh nên vi khuẩn này coa tên Escherichia coli.
- Vi khuẩn do Escherich phát hiện trong tả lót của trẻ em được công bố với tên
gọi đầu tiên là Bacterium coli commune. 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên
môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá.
- Năm 1895 người ta lại gọi bằng tên Bacillus coli.
- Năm 1896 gọi thành Bacterium coli.
- Năm 1991 vi khuẩn được thống nhất toàn cầu
là Escherichia coli.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: Ks. Phạm Minh Nhựt

24
SVTH: Lê Ngọc Bích Vương
07CSH
c. Phân loại khoa học:
- Giới: Bacteria.
- Ngành: Proteobacteria.


- Lớp: Gamma Proterobacteria.
- Bộ: Enterobacteriales.
- Họ: Enterobacteriaceae.
- Chi: Escherichia.
- Loài: E.coli
d. Đặc điểm hình thái và phân bố:
- Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, được đặc trưng bởi tính chất
enzyme –galctosidase và -Glucoronidase,là loài trực khuẩn hình que, kích thước (1.1
– 1.5) x (2 - 6)ìm, có độ dài 3 ìm di chuyển bằng lông và roi, vi khuẩn gram âm và
yếm khí tùy tiện. Không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp là 35 – 37
o
C, pH thích

hợp 6.4 – 7.5 (tối ưu nhất là 7.2 – 7.4), sinh sản trong khoảng 5 – 12
o
C, sinh sản
mạnh ở 5
o
C. Nó phát triển ở nhiệt độ 44 – 45
o
C trên môi trường tổng hợp, lên men
đường lactose và mannital có sinh hơi và sinh acid, sinh endol từ triptophan.
- Escherichia coli là một trong số thành viên của nhóm vi khuẩn Coliform được
sử dụng để chỉ ra nguồn phân. Chúng được xếp vào loại có tính kháng nguyên, chủ
yếu là kháng nguyên loại O và H. Tuy nhiên, chúng không sinh oxidase hoặc thủy
phân ure và một số không sinh hơi, có thể phát triển ở 37
o
C.
- Chúng phân bố ở khắp nơi trong môi trường đặc biệt trong thực phẩm, nước
và ruột già.
e. Đặc điểm sinh hóa và nuôi cấy:
Hình 2.4: Escherichia coli