ứng dụng kỹ thuật pcr công nghệ sinh học

MÔN: SINH HỌC PHÂN
MÔN: SINH HỌC PHÂN
TỬ
TỬ
GVHD:
GVHD:
NGUYỄN THỊ DUY KHOA
NGUYỄN THỊ DUY KHOA
GVHD:
GVHD:
NGUYỄN THỊ DUY KHOA
NGUYỄN THỊ DUY KHOA
I. KHÁI NIỆM
I. KHÁI NIỆM

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction

PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng khuếch đại
gen".

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch
đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các
sinh vật sống như E. coli hay nấm men.

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận
dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác
định huyết thống
II.
II.

LỊCH SỬ
LỊCH SỬ
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis
phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào
tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm
khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển
một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một
cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme
DNA polymerase
III. THỰC NGHIỆM
III. THỰC NGHIỆM
PCR
PCR

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác
định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần
của gen.

PCR cần rất nhiều thành phần.
- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại
- Cặp mồi(primer),
- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của
DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-
polymerase để xây dựng DNA mới.
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-
polymerase
III. THỰC NGHIỆM PCR
III. THỰC NGHIỆM PCR

PCR machine
chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun
nóng và làm nguội trong ống
phản ứng ở nhiệt độ chính xác
cho mỗi phản ứng. Để
ngăn ngừa sự bay hơi của
hỗn hợp phản ứng, phần nắp
đậy của máy PCR cũng được
đun nóng, trường hợp lượng
dung dịch phản ứng quá ít,
người ta cho một lớp dầu
(natural oil) lên trên bề mặt
hỗn hợp phản ứng. Năm
2004, giá máy khoảng 2500
USD Phản ứng PCR được
thực hiện trong
III.1 Đoạn mồi
Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá
50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi,
chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base
(bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay
nucleotides)
III.2 Quy trình
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước:
- Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước
này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi
DNA.
- Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống
để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi.

- Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó
bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này
gọi là kéo dài
IV. Những ứng dụng của PCR
IV. Những ứng dụng của PCR



Vân tay di truyền

Kiểm tra huyết thống

Chuẩn đoán bệnh di truyền

Tách dòng gen

Gây đột biến điểm

Phân tích mẫu DNA cổ

Xác định gen của các đột biến

So sánh mức độ biểu hiện của gen
Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time
Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time
trong xét nghiệm bệnh tôm
trong xét nghiệm bệnh tôm
Việc xét nghiệm bệnh tôm
bằng hệ thống PCR Real-time

được tiến hành theo qui trình
khép kín.
Trước tiên, mẫu tôm Post
được nghiền nhuyễn trong một
dung dịch tách chiết gen di
truyền (DNA).
Sau đó, hỗn hợp này
được đưa qua nồi hấp cách thủy
trong vòng 10 phút nhằm làm sốc
nhiệt để trích ly DNA.
Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong
xét nghiệm bệnh tôm
Hỗn hợp dung dịch và tôm post
nghiền nhuyễn lại trải qua công đoạn
làm lạnh nhanh, cho vào tủ đông ở
nhiệt độ (-200C) trong vòng 15 phút.
Hỗn hợp tiếp tục được đưa vào
máy ly tâm khoảng 5 phút, với tốc độ
780.000 vòng/h để loại tạp chất.
Phần cặn bã và chất hữu cơ bị
lắng xuống đáy. Phần dung dịch còn lại
có chứa DNA.
Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong
xét nghiệm bệnh tôm
Dùng thiết bị chuyên
dụng lấy khoảng 2 µl (microlít)
dung dịch này cho vào một ống
có chứa hóa chất gọi là ống
phản ứng.
Ống phản ứng được đặt

vào máy lưu nhiệt trong vòng 2
tiếng đồng hồ. Tại đây sẽ diễn
ra quá trình phản ứng nhân bản
DNA.
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR
KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT
KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT
PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS
PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS
D7S820 NGƯỜI VIỆT NAM
D7S820 NGƯỜI VIỆT NAM
1. Nguyên liệu
1. Nguyên liệu
:
:
- Máu tươi của những người khoẻ mạnh không có cùng
quan hệ huyết thống do Viện Quân y 108 cung cấp.
- Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN (hãng Sigma);
hoá chất dùng cho quá trình PCR đối với locus D7S820 (mồi
đặc hiệu cho locus D7S820 của hãng Pharmacia-Thuỵ Điển;
Taq ADN polymeraza-của Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn
trùng Trung ương); hoá chất dùng cho điện di và nhuộm băng
ADN (của các hãng Promega, Pharmacia, Sigma, MERCK).
I. Phương pháp nghiên cứu
2. Phương pháp:
a. Tách ADN:
ADN từ máu được tách chiết theo phương pháp chuẩn dùng
phenol và chloroform để tinh sạch. Kết quả tách chiết thu được
ADN có độ tinh sạch khá cao với OD trung bình 1,75 và hàm

lượng >50ng/ml
b. Kỹ thuật PCR:
Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi và
tổng hợp. Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn mồi
khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC. Sản phẩm PCR
sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm ethidium
bromide (25mg/ml).
2. Phương pháp:
c. Kỹ thuật điện di:
Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR
đã được kiểm tra trên gel agaroza 2% sau
đó được điện di trên gel polyacrylamide
6% sử dụng ure 7M. Băng ADN được phát
hiện bằng phương pháp nhuộm bạc của
Bassam, 1991.
d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang
alen
* Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alen
quan sát được của các mẫu khác nhau trên bản điện di,
chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và
đánh số alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ
băng ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến băng
ADN có trọng lượng phân tử cao nhất). Việc đánh số ở
đây chỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định
được có ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu
chưa có thang alen chuẩn để so sánh.
d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang
alen
* Xây dựng thang alen: Trong quá trình
đánh số, chúng tôi đồng thời chọn ra những

mẫu mang những alen khác nhau tập hợp
lại để tạo thang alen. Thang alen được tạo
bằng phương pháp trộn mẫu.
* Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các
alen đã khảo sát được theo quy ước quốc
tế. Alen của locus D7S820 được ký hiệu từ
6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi
alen.
II. Kết quả
1. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi quá
trình PCR :
ở tất cả các điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ
50oC đến 58oC đều có sự hình thành sản
phẩm PCR thể hiện ở sự có mặt của các
băng ADN trên bản gel agaroza.
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR ở một số mẫu trên gel
agaroza theo điều kiện nhiệt độ gắn mồi 58oC
2. Kết quả chọn lọc alen và tạo
thang alen :
Thang alen chuẩn của locus D7S820 với 7 alen khác
nhau được phân tách bằng kỹ thuật điện trên gel PA
biến tính
Xác định quan hệ huyết thống:
Xác định quan hệ huyết thống:
Đạt chính xác 99,9%
Đạt chính xác 99,9%
GS Lê Đình Lương và các cộng sự đã tự bỏ tiền
túi để nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trong
việc xác định quan hệ huyết thống
Đến năm 2000, với đề tài "Xác định nhanh, chính

xác các đặc trưng cá thể ở người bằng kỹ thuật
PCR"
Với các mẫu máu, tóc, nước bọt ở các cá thể
khác nhau, dùng PCR có thể tìm ra các tính trạng
chung ở các cá thể có cùng huyết thống
Hiện nay, để xác định huyết thống, thế
giới thường dùng từ 8-14 gen. Phòng thí
nghiệm của chúng tôi đã đưa vào ứng dụng
thường xuyên hàng ngày 13 gen. Vì với
mỗi trường hợp cụ thể, cần sử dụng những
gien khác nhau và với mỗi trường hợp chỉ
dùng từ 8-14 gien là đủ
CÁC CÁCH LẤY MẪU

Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm bông: Mẫu lấy ở đây
không phải là nước bọt mà là các tế bào má từ bên trong
miệng

Việc lấy mẫu máu khô