Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loại sâm mới Panaxsp. thu ở phong thổ Lai Châu

Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
o0o

ĐỖ MINH THÀNH


NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA LOẠI
SÂM MỚI PANAXSP. THU Ở PHONG THỔ LAI CHÂU


Ngành: Sinh học thực nghiệm
Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Phan Kế Long
Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam

Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


MỞ ĐẦU
Nhân sâm được dùng trong y học phương Đông hàng ngàn năm nay.
Người Trung Quốc đã sử dụng nhân sâm từ hàng ngàn năm trước như một
thứ dược liệu vô cùng chân quý chỉ có các vua chúa và các quan lớn mới có
loại thảo dược này. Tác dụng của nhân sâm được đề cập trong các trước tác
của Shi You (khoảng những năm 48-33 TCN) hay Shanghan Lun (khoảng
những năm 200 SCN).
Chi Nhân sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì
(Araliaceae) gồm 15 loài [14], tất cả đều có giá trị làm thuốc, một số loài
thuộc chi Panax L. (Araliaceae) được sử dụng làm giá trị cao như Nhân
sâm (Panax ginseng), Tam thất (Panax notoginseng). Ở Việt Nam, có một
số loài thuộc chi này như Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus), Tam thất
hoang (Panax stipuleanatus) và Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) [11].
Các loài Panax bipinnatifidus thường phân bổ chủ yếu ở Trung Quốc, Ấn
Độ và Nepal. Các loài này đang trong tình trạng nguy cấp, vốn hiếm gặp
trong tự nhiên lại bị săn tìm ráo riết để thu hái nên đang bị đe dọa tuyệt
chủng. Ở Việt Nam sâm Ngọc Linh đã được xác định là một cây thuốc quý
do có chứa nhiều thành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất
khoáng vi lượng trong củ, lá và rễ hơn hẳn những loại sâm khác [16]. Do
vùng phân bố hạn chế và việc khai thác quá mức đã khiến sâm Ngọc Linh
rơi vào nhóm đe dọa và loài này đã bị coi như tuyệt chủng ngoài tự nhiên
và hiện chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảo tồn tại một số
vườn trồng tại các khu bảo tồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum, vì vậy
việc nghiên cứu bảo tồn loài sâm này hết sức cấp bách. Cho đến nay sâm

Ngọc Linh vẫn được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố trên núi Ngọc
Linh thuộc địa phân hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum với độ cao trên
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1500m so với mặt biển [11], tuy nhiên Zhu và cộng sự [58] đã ghi nhận
Panax vietnamensis có phân bố ở Vân Nam, Trung Quốc nên chúng tôi đặt
khả năng loài này có thể phân bố ở các tỉnh vùng núi phía bắc của Việt
Nam. Năm 2012, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phê duyệt đề
tài thuộc 7 hướng KHCN ưu tiên cấp Viện KHCNVN “Nghiên cứu phân
loại, phân bố và thành phần hóa học của cây Sâm mọc ở Lai Châu” mã số
VAST 04.07/12-13 do Tiến sĩ Phan Kế Long làm chủ nhiệm với mục đích
xác định tên khoa học và phân bố của loài sâm mọc tự nhiên ở Lai Châu và
thành phần hóa học chủ yếu của nó. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp
phân tích di truyền để định loại các mẫu sâm này dựa trên cơ sở so sánh
trình tự ITS – rDNA, là vùng gen mang nhiều biến dị có khả năng bộc lộ
quan hệ giữa những loài có nguồn gốc tiến hóa gần gũi [56].
Trên có sở dự án trên, chúng tôi đã tiến hành Luận văn này được
thực hiện trên cơ sở phân tích một số mẫu vật thu được trong đợt điều tra
khảo sát ở huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu của dự án trên với với tiêu đề:
“Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loại sâm mới Panax sp. ở huyện
Phong Thổ tỉnh Lai Châu”
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu đặc điểm sâm Panax sp. (Araliaceae) ở huyện Phong
Thổ tỉnh Lai Châu dựa trên cơ sở so sánh trình tự ITS – rDNA, là vùng
gen mang nhiều biến dị có khả năng bộc lộ quan hệ giữa những loài có
nguồn gốc tiến hóa gần gũi.

Nội dung nghiên cứu
- Thu thập mẫu Sâm mới Panax sp. từ huyện Phong Thổ tỉnh Lai
Châu
- Tách DNA tổng số của các mẫu, nhân bản vùng gen ITS – rDNA.
- Giải trình tự gen ITS – rDNA.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Phân tích số liệu: so sánh, phân tích các trình tự DNA của các mẫu
thu được và so sánh với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài trong
chi Panax

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Các nghiên cứu về chi sâm Panax và Sâm Ngọc Linh
1.1.1. Giới thiệu về chi sâm Panax
Chi Nhân sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì
(Araliaceae). Toàn bộ chi Sâm (Panax L.) trên thế giới hiện đã biết chắc
chắn có 11 loài và 1 dưới loài (thứ -var.). Sự phân bố của chi Panax L. trên
thế giới cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng
núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam
Canada (có 2 loài P. quinquefolius và P. trifoliatus) [12, 42, 43]. Vùng
Đông Bắc Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều
Tiên và Nhật Bản) có 2 loài là P. ginseng và P. japonica. Trung tâm phân
bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây- Nam của Trung Quốc lan toả
xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới
kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có
tới 7 loài và dưới loài (thứ) mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng là P.

notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P. pseudoginseng (không tìm thấy trong
hoang dại, nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết
quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung tâm
phân bố của chi Sâm (Panax L.) của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P.
notoginseng; P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía
Nam của chi Panax L. là loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) ở Miền
Trung của Việt Nam, tại 14
0
15
’
vĩ độ Bắc.

Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên










Hình 1.1: Nhân sâm Việt Nam – Panax vietnamensis
1.1.2. Hiện trạng của loài Sâm Việt Nam hiện nay
Ở Việt nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5

loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (P.notoginseng) và Nhân
sâm (P.ginseng) [12]. Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P.
stipuleanatus Tsai et Feng) và đặc biệt là Sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis
Ha et Grushv.) là loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam, có phân bố tự
nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum), Huyện
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc
Linh, độ cao trên 1500m. Tuy nhiên hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm
ngoài tự nhiên, do tình trạng khai thác kiệt quệ trong nhiều năm cộng với
việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng tự nhiên cũng bị thu hẹp. Hiện
tại, sâm Ngọc Linh đã được đưa vào danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh
sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (nghị
định 32/2006/NĐ-CP ngày 31.03.2006 về quản lý thực vật rừng, động vật
rừng nguy cấp quí hiếm). Hiện nay sâm Ngọc Linh chỉ còn tập trung tại 2
điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon
Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh
Quảng Nam) với tổng diện tích trồng khoảng 10 hecta.
1.1.3. Tầm quan trọng và giá trị của cây Sâm
1.1.3.1. Tầm quan trọng và giá trị của cây Sâm trên Thế giới
Về mặt kinh tế, doanh thu hàng năm từ sâm vào khoảng 98 triệu
USD và tăng trưởng ở mức 26%/năm [57]. Tập đoàn Sâm Hàn Quốc
(KGC) đã có kinh nghiệm sản xuất hồng sâm hơn 100 năm, tính riêng năm
2004 doanh thu từ các sản phẩm nhân sâm đã mang về cho tập đoàn
khoảng 305 tỷ Won ($290 triệu USD), trong đó 70% là mỹ phẩm. Cùng

năm đó, xuất khẩu sản phẩm từ nhân sâm đạt 55 triệu USD, thị trường chủ
yếu là Hồng Kông và Trung Quốc đại lục (27 triệu USD) [35]. Virginia và
Tây Virginia là nơi xuất khẩu sâm lớn nhất của Mỹ, chiếm khoảng 18%
trong tổng số 27200 kg sản lượng sâm hàng năm của toàn quốc. Trong 3
năm (2004-2006) ngành nông nghiệp Mỹ chứng nhận việc xuất khẩu hàng
năm tương ứng đạt 1800 kg, 2270 kg và 1633 kg đem lại gần 1 triệu USD
[35].
1.1.3.2. Tầm quan trọng và giá trị của cây Sâm ở Việt Nam
Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số
loài của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong
phạm vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như
Nhân sâm (Panax ginseng); Giả nhân sâm (P. pseudoginseng); Tây dương
sâm (P. quiquefolius); Tam thất (P. notoginseng) [5,17] và sâm Ngọc Linh
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

(P. vietnamensis Ha et Grushv.). Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng
chiến chống Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm
vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc như một thứ thần
dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm
nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu
vết thương.
Theo quan điểm hoá phân loại và dược lý học, những công trình
nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi
Panax thành 2 nhóm chính:
- Nhóm 1 gồm các loài có giá trị, hiện đã được phát triển trồng trọt gồm:
Nhân sâm (Panax ginseng), sâm Mỹ (P. quinquefolius) và Tam thất (P.

notoginseng), có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển và
chứa các saponin có khung thuộc nhóm dammaran.
- Nhóm 2 gồm các loài mọc hoang như P. japonicus, P. zingiberensis, P.
stipuleanatus với bộ phận thân rễ dưới đất rất phát triển theo hướng nắm
ngang, chứa saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean.
Tuy nhiên, hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài
Panax trồng trọt thuộc nhóm 1 lại cao hơn rất nhiều.
Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu
quả, đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm
Ngọc Linh có 52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác
định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh
với nhóm sâm trồng có giá trị trên thế giới như Nhân sâm (Panax ginseng),
Sâm Mỹ (P. quinquefolius) và Tam thất (P. notoginseng) thì thành phần
saponin của sâm Ngọc Linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượng
lại cao hơn nhiều. Điều này càng khẳng định Sâm ngọc linh là một loài độc
đáo về thành phần hoá học [7].
1.2. Sâm Ngọc Linh
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Sâm Ngọc Linh là một loại cây thân thảo, sống nhiều năm, cao đến
1m. Thân rễ mập có đường kính 3,5cm, không có rễ phụ dầy dự trữ, đôi khi
ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 5cm.
Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1-4 thân. Thân nhẵn cao 40-80 cm,
rỗng, có 3 mặt hơi tròn có những rãnh nhỏ theo chiều dọc. Lá mọc vòng,
thường có 4 (ít khi 3, 5, 6). Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài

7- 12cm (ít khi 15 cm). Lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi
mác, dài 8- 14 cm, rộng 3- 5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn
kéo 1,5- 2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít
khi 8- 11) cặp dọc theo gân chính và gân bên ở mặt trên của lá chét có
nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn. Cụm hoa dài 25
cm, gấp 1,5- 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc ở tậ
cùng, đôi khi có thêm 1- 4 tán phụ hoặc một hoa đơn độc. Tán hoa chính
đường kính 2,5- 4 cm, có 50- 120 hoa. Hoa mầu vàng lục nhạt, đường kính
hoa nở 3- 4 mm. Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có 2 ô, 2 vòi (chiếm
20%). Quả khi chín màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả. Quả
1 hạt hình thân, quả 2 hạt hình cầu hơi dẹt dài 7- 10 mm rộng 4- 6 mm
(Hình 1.2) [1].
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Hình 1.2. Sâm Ngọc Linh
Mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ
20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm
chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu
là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu tháng 1
hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần
lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây
nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9.
Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở
đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ
vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây

sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo (sau 3
năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5
năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm
[62].
1.2.2. Đặc điểm phân bố
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Cây sâm được phát hiện ở độ cao từ 1.200m trở lên (có tài liệu cho
biết cao độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1.500m), đạt mật độ cao
nhất ở khoảng từ 1.700-2.000m dưới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có
hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam là có cây sâm này. Sâm mọc tập trung
dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.578m với lớp đất vàng đỏ
trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh
còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh, tuy những nghiên cứu thực địa
mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước
Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng
Nam, Đắc Glây thuộc Kontum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng
cũng rất có thể có loại sâm này [62].
1.2.3. Thành phần hóa học
Từ 1974 đến 1990. Nguyễn Thời Nhâm và cộng sự đã ghiên cứu
nhân sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng),
nhân sâm Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax
quinquefollium) [1]. Kết quả có thể tóm tắt như sau:
Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong
Panax vietnamensis (PV) 15 vết saponin có giá trị Rf và mầu sắc tương
ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng. Chi tiết hơn nữa trong

PV có hàm lượng cao chất saponin kiểu damarane (7,58%), trong đó
saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 3,32% và một lượng nhỏ saponin của
axit oleanolic. Do đặc điểm này, Tanaka xếp nhân sâm Việt Nam vào
nhóm B- (Trước đây chỉ có nhân sâm triều Tiên và nhân sâm Hoa Kỳ được
xếp vào nhóm này) [1]. Điều này trái lại với qui luật chung là thông
thường các cây hân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng
saponin của axit oleanolic và lượng nhóm saponin damarane.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được một hàm
lượng lớn majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax
(chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4,34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit
và ocotillol saponin cao nhất có trong cây Panax. Ocotillol saponin đã trở
thành một hợp chất cần được chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân
loại hóa học cho các cây Panax vì nó có thể ảnh hưởng đế một số tác dụng
mang tính đặc thù của Panax Việt Nam.
Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn là làm cho
nhân sâm Việt Nam khác với nhân sâm Triều Tiên, vì cho tới nay người ta
chưa tìm thấy ocotillol trong nhân sâm Triều Tiên.
Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân sâm Việt Nam
có hàm lượng saponin, damarane cao nhất (12- 15%) so với nhân sâm
khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26%
trong nhân sâm Triều Tiên [1].
Ngoài những saponin nói trên, trong nhân sâm Việt Nam còn chứa
các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi
lượng [1].

1.2.4. Tác dụng dược lý
Từ 1978 đến 1984, nhiều tác giả đã nghiên cứu tác dụng dược lý của
nhân sâm Việt Nam:
Về độc tính đã nghiên cứu thấy với liều 34 g/kg thể trọng của bột
chiết toàn phần rễ củ Nhân sâm Việt Nam và với liều 10,6 g/kg thể trọng
của saponin toàn phần của rễ củ Nhân sâm Việt Nam đều không gây trên
súc vật thí nghiệm những triệu chứng nào ngộ độc cả.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Những thí nghiệm tác dụng trên thần kinh trung ương, tác dụng tăng
lực, tăng sức bền của cơ thể, trên nội tiết sinh dục, trên hệ tim mạch… đều
cho những kết quả hay gần tương đương với khi thí nghiệm Nhân sâm
Triều Tiên. Tuy nhiên Nhân sâm Việt Nam không gây tăng huyết áp như
nhân sâm Triều Tiên. Tác dụng này làm tác dụng Nhân sâm Việt Nam
giống tam thất hơn.
Mặc dù theo báo cáo của trung tâm nghiên cứu sâm Việt Nam,
những kết quả nghiên cứu về hóa học và dược lý nói trên được những nhà
nghiên cứu nước ngoài, đặc biệt Nhật Bản chú ý, nhưng chúng tôi cũng ghi
lại đây một số khác biệt giữa cách đánh giá của hai nền y học cổ truyền dân
tộc với các nhà y dược hiện đại: Theo những nhà y học cổ truyền, khi nếm
vị nhân sâm Triều Tiên, nhất là khi nếm củ sâm, trước hết phải thấy vị ngọt
(tiền cam, hậu khổ, hậu cam, cam) khi đang mệt, ngậm một miếng sâm
trong miệng một lúc, thấy hết mệt liền, trong người thấy khoan khoái. Còn
Nhân sâm Việt Nam ta, khi nếm thì đầu tiên thấy đắng, sau vẫn thấy đắng,
đắng (tiền khổ, hậu khổ, hậu khổ khổ). Hãm hay sắc củ nhân sâm Việt Nam
rồi ta ngậm hay uống hầu như không thấy cảm giác khoan khoái. Đó là một

điều mà các nhà khoa học hiện đại cần tìm cho ra: Do cách chế biến chưa
đúng hay các hoạt chất trong củ nhân sâm của ta hiện còn bị một thứ men
nào che lấp, không cho thể hiện ngay như củ nhân sâm Triều Tiên. Hiện
nay các nhà bào chế phải phối hợp nhân sâm Việt Nam với một vị thuốc
khác để sử dụng được phần tác dụng tốt của nhân sâm Việt Nam, đồng thời
che lấp những nguyên nhân cản trở mà chúng ta chưa tìm ra được [1].



1.3. Một số phƣơng pháp phân loại thực vật
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hiện nay, phương pháp phân loại thực vật đều dựa trên nguyên tắc
chung đó là những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất
giống nhau, thực vật càng gần nhau tính chất giống nhau càng nhiều. Sự
giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá , một
số phương pháp thường được sử dụng như:
1.3.1. Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)
Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì
cơ quan này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dưỡng khi điều kiện môi
trường thay đổi. Những thực vật càng gần nhau càng có nhiều đặc điểm
chung về hình thái. Đây là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được
dùng phổ biến [10], hạn chế của phương pháp này đã được ghi nhận trên
một số taxa, thực tế nhiều loài khác nhau nhưng có hình thái rất giống nhau
và ngược lại. Phương pháp phân loại hình thái thực sự gặp khó khăn khi
phân loại ở các đơn vị taxon dưới loài [2].

Phân loại học truyền thống sử dụng chủ yếu các đặc điểm hình thái
nhưng các tính trạng hình thái thường biến đổi rất phức tạp, nên đôi khi
việc xác định sự tương đồng là rất khó. Hiện tượng tiến hoá hội tụ, tiến hoá
song song và tiến hoá ngược dẫn đến các đặc điểm tương tự giữa các loài
có họ hàng rất xa nhau, nghĩa là các đặc điểm giống nhau do tiến hoá độc
lập từ các nguồn gốc khác nhau để thích nghi với điều kiện môi trường
giống nhau là khá phổ biến trong sinh giới. Việc phân biệt đặc điểm tương
đồng với đặc điểm tương tự trong hệ thống học truyền thống là không dễ
dàng, nhất là ở các bậc phân loại thấp. Ngoài ra, việc so sánh trực tiếp giữa
các bậc phân loại cao là rất khó, vì nhiều đặc điểm không còn khả năng xác
định được sự tương đồng. Vì vậy hệ thống học truyền thống phải sử dụng
các đặc điểm, các khoá định loại riêng cho những nhóm sinh vật nhất định.
Ưu điểm lớn nhất của hệ thống học truyền thống là có lịch sử phát triển lâu
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

dài và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật tương đối đầy đủ,
tiện lợi trong nghiên cứu ứng dụng. Nhưng hệ thống học truyền thống có
nhược điểm là thiếu tính thống nhất, phải sử dụng nhiều tiêu chuần và
nhiều khoá phân loại khác nhau, nên bị hạn chế khi nghiên cứu các biến đổi
tiến hoá nhỏ, khó xác định chính xác mối quan hệ giữa các nhóm sinh vật ở
bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [2].
1.3.2. Phương pháp giải phẫu so sánh
Đến thế kỷ XIX, nhờ sự phát triển của kính hiển vi mà giải phẫu học
thực vật có điều kiện phát triển. Ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài,
các nhà phân loại học còn sử dụng cả những đặc điểm hình thái giải phẫu
hay vi hình thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc bên trong cơ

thể, của mô, của tế bào, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại. Việc sử
dụng phương pháp này đã nhận được các kết quả nghiên cứu chính xác và
khách quan cho phân loại thực vật. Các đặc điểm giải phẫu so sánh cho
phép xác lập mối quan hệ gần gũi không những của các nhóm lớn, mà cả
của các bậc taxon nhỏ, có thể xây dựng được những tiêu chuẩn phân loại
cho các chi, các loài thuộc họ Labiaceae [39].
Phương pháp giải phẫu so sánh không đòi hỏi kỹ thuật quá phức tạp
nhưng cho kết quả khá chính xác. Đối với các loài cây gỗ thường sử dụng
đặc điểm giải phẫu thân gỗ để định loại, ngược lại các loài thân thảo
thường sử dụng đặc điểm cấu trúc của biểu bì. Phương pháp này được sử
dụng để định loại gỗ và các thanh gỗ thành phẩm dùng để xuất khẩu.
1.3.3. Phương pháp hóa học
Có nhiều phương pháp phân tích hoá học khác nhau được sử dụng
trong nghiên cứu và kiểm định nhất là đối với mẫu cây chứa các nhóm chất
có hoạt tính sinh học, các cây chứa tinh dầu (Trầm hương, Xá xị, Pơ mu )
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc
kí khí - khối phổ… đặc điểm chung của phương pháp hóa học là cho kết
quả nhanh, chính xác và có thể cho các thông số về cấu trúc hoá học. Ưu
điểm của phương pháp này là yêu cầu về tính nguyên vẹn của mẫu vật
không cao. Trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng nhiều. Ở
nước ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ
sở[40].
1.3.4. Phương pháp phân loại học phân tử
Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự khác biệt

các cấu trúc phân tử để đạt được các thông tin về mối quan hệ tiến hoá giữa
các loài. Kết quả của một phân tích hệ thống phân tử được thể hiện bằng
cây phát sinh loài. Phương pháp phân loại phân tử ra đời vào những năm
1960 với các nghiên cứu của Emile và công sự (1999), Zuckerkandl ,
Emanuel Margoliash , Linus Pauling và Walter M. Fitch. Những nghiên
cứu hệ thống học phân tử được thực hiện đầu tiên của tác giả Charles G.
Sibley (nghiên cứu về chim), Herbert và cộng sự (nghiên cứu về lưỡng cư)
và Morris Goodman (nghiên cứu về linh trưởng) [30,44,45,46] được phát
triển tiếp bởi các nhà nghiên cứu Allan C. Wilson, Robert K. Selander,
John C. Avise và đã thu được những thành công lớn, làm sáng tỏ nhiều vấn
đề trong phân loại và tiến hoá [20,22,24,29]. Phân loại học phân tử được sử
dụng ban đầu là phân tử protein, với kỹ thuật điện di protein. Mặc dù khi
thực hiện cách này đã không đem lại nhiều hiệu quả xong đã thúc đẩy sự
phát triển của phân loại học phân tử. Giai đoạn từ 1974 – 1986, phân loại
học phân tử chuyển sang sử dụng các đặc điểm của vật chất di truyền
(DNA) với kỹ thuật ứng dụng lai DNA – DNA, tiếp đến là các kỹ thuật
phân tích bằng enzyme giới hạn và cuối cùng là kỹ thuật đọc trình tự DNA
[20,23].
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyên lý của phân loại học phân tử: Phân loại học phân tử dựa trên
nguyên lý mỗi sinh vật sống đều mang các phân tử DNA, RNA và protein,
các sinh vật có họ hàng gần gũi sẽ có mức độ tương đồng cao trong cấu
trúc phân tử những chất này, ngược lại những sinh vật có họ hàng xa nhau
sẽ cho thấy những đặc điểm cấu trúc khác nhau. Hiện nay, các phân tử có
tính bảo thủ như DNA ty thể, DNA lục lạp đang được sử dụng nhiều nhất

cho phân loại và được coi là tích luỹ các đột biến theo thời gian. Thêm vào
đó nếu coi tốc độ đột biến không đổi, chúng ta sẽ tạo ra được một đồng hồ
phân tử cho biết thời gian diễn ra các đột biến, nói cách khác chúng ta có
thể ước lượng được thời gian hình thành loài. Mặc dù phân loại học phân tử
là phương pháp phân loại sử dụng đặc điểm cấu trúc của các phân tử để xây
dựng hệ thống phát sinh chủng loại, tuy nhiên mãi cho đến những thập kỷ
gần đây, con người mới có khả năng tách chiết và xác định được cấu trúc
phân tử của những chất này.
Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự DNA của Maxam – Gilbert (1977,
1980) và Singer (1977) [23] đã mở ra một ứng dụng to lớn cho phân loại
học phân tử. Hiện nay phân tích hay được sử dụng trong phân loại học phân
tử là so sánh trình tự DNA, sử dụng kỹ thuật sắp xếp phân tử (alignment)
để xác định mức độ giống nhau. Các biến đổi phân tử đơn giản hơn nhiều
so với các biến đổi hình thái, vì vật chất di truyền DNA chỉ cấu thành từ 4
loại nucleotide (adenine, guanine, thymine và cytosine). Mặc khác, các
biến đổi phân tử ít bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường. Ưu thế lớn
nhất của hệ thống học phân tử là có thể phân biệt rõ ràng các đặc điểm
tương đồng với đặc điểm tương tự [23]. Ngoài ra, nhiều phần của vật chất
di truyền có nguồn gốc và kiểu biến đổi chung cho mọi sinh vật, nên có thể
so sánh trực tiếp bất kể nhóm sinh vật nào với nhau. Các biến đổi tiến hoá
nhỏ (microevolution), hay đa dạng di truyền giữa các quần thể sinh vật
cũng thể hiện qua các biến đổi phân tử rõ hơn so với các biến đổi hình thái.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Tính thống nhất cao là một trong những ưu điểm của hệ thống học
phân tử, sử dụng tiêu chuẩn phân tử chung cho cả sinh giới, có lợi thế trong

nghiên cứu biến đổi tiến hoá nhỏ, nên số liệu phân tử có giá trị cao trong
phân tích quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon ở bậc phân loại thấp,
cũng như đa dạng di truyền quần thể. Nhược điểm chính của hệ thống học
phân tử là không tiện dụng khi nghiên cứu và ứng dụng trong tự nhiên và
hiện chưa hình thành một hệ thống phân loại riêng.
Sự kết hợp giữa hai hệ thống phân loại phân tử và phân loại truyền
thống sẽ đem lại kết quả tốt nhất. Thực tế cũng chứng minh rằng hầu hết
những gì hệ thống học truyền thống đã giải quyết tốt, đều không mâu thuẫn
với các kết quả nghiên cứu của hệ thống học phân tử [23]. Phân tích phân
tử thường được sử dụng để giải quyết một số vấn đề mà hệ thống học
truyền thống còn gặp khó khăn, trong khi chỉ thị phân tử có lợi thế hơn.
Hiện tại, hệ thống học phân tử là phương pháp hữu hiệu hỗ trợ cho phương
pháp phân loại truyền thống và cho kết quả khá tin cậy.
1.4. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật
1.4.1. Cấu trúc hệ gen lục lạp
Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo
(algae), chúng có chứa DNA riêng. DNA lục lạp có từ 10
2
– 10
4
bản sao
trong mỗi tế bào. Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyll) và là nơi thực
hiện quá trình quang hợp của cây. Genome lục lạp thường được sử dụng
cho phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ
hợp di truyền cho thế hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao. Hệ gen lục lạp
được các nhà phân loại học phân tử đánh giá chúng là sự tích luỹ các đột biến theo
thời gian, do vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hoá giữa các loài.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành

18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Hình 1.3: Hệ gen lục lạp [41]
Genome lục lạp (cpDNA) thực chất là một phân tử DNA vòng, sợi
đơn, mỗi gen thường không lặp lại. Không giống như các gen nhân, các
gen lục lạp chỉ mã hoá cho các protein cần thiết cho chức năng quang hợp
và bộ máy biểu hiện những protein này. Vùng DNA không mã hoá trên hệ
gen lục lạp là rất ít.
Genome lục lạp (cpDNA) có kích thước từ 120 kb – 220 kb (hình 1.3),
kích thước này thay đổi do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều
nhau (Inverted repeat), tách genome lục lạp thành hai vùng (vùng lớn LSC
và vùng nhỏ SSC). Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều mang số lượng gen
như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào DNA nhân và biến mất
khỏi hệ gen lục lạp. Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 – 5 lần
so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể
thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại [23].
Hiện nay, các gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu hệ
thống học phân tử thực vật bao gồm: gen matK, gen trnL, vùng đệm psbA -
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

trnH, tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không
lớn hơn 2% giữa các loài lân cận.

Vùng đệm psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân
loại. Vùng này có kích thức xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất
cao (100% với các loài đã được nghiên cứu). Mức độ khác biệt trình tự
nucleotide giữa các loài là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ
0.00% – 0.08% [40]. Trình tự psbA - trnH cũng đã được công bố trên ngân
hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật hạt trần, dương xỉ, rêu và
rêu tản (liverwort).
Gen matK (MaturaseK): cùng với vùng đệm psbA - trnH đã được đề
xuất làm DNA barcoding cho nhóm thực vật có hoa. Kết quả sử dụng gen
matK cho phân loại đã thu được sự tương đồng rất cao với phân loại hình
thái và cho giá trị bootstrap từ 92 – 100% [ 47,48].
Gen trnL: Là gen mã hoá cho tRNA vận chuyển Leucine trong lục
lạp, có kích thước từ 452bp đến 528bp với các loài thuộc họ đâu. Gen này
được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại phân tử [39,46,65]. Các kết
quả thu được trong các nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen
trnL cho thấy đây là một vùng DNA hữu ích cho phân loại.
Gen rbcL (Ribulose – 1,5 – Bisphosphate Carboxylase)
Ribulose – 1,5 – Bisphosphate Carboxylase/oxygenase (Rubisco) là
protein đệm trong lục lạp. Protein này có 8 tiểu phần lớn (55 kDa) và 8 tiểu
phần nhỏ (12 kDa) giống nhau. Các tiểu phần lớn được mã hoá bằng gen
lục lạp (rbcL), còn các tiểu phần nhỏ mã hoá bằng gen nhân. Riêng đối với
tảo nâu và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hoá cho tiểu phần nhỏ.
Các gen rbcL ở thực vật bậc cao không có intron. Các gen này được dùng
nhiều trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Ngoài các locus được nêu trên, các vùng DNA: gen rbcL, vùng đệm
trnL – trnF, trnT – trnL thuộc hệ gen lục lạp cũng thường được sử dụng
cho phân tích. Việc sử dụng mỗi đoạn gen cho những ưu nhược điểm khác
nhau, kết quả phân loại sẽ chính xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều gen.
1.4.2. Vùng ITS
Vùng gen ITS: vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá
cho ribosome gồm các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (hình 1.4). Giữa các
đơn vị gen có các đoạn ITS-1 và ITS-2, các thành phần này tạo thành một
nhóm gen cơ bản. Các nhóm gen như vậy lặp lại liên tục trong hàng nghìn
bản sao trong hệ gen nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng NTS
(nontranscribed spacer) (hình 1.4)



Hình 1.4: Sơ đồ vùng gen ITS
Trong các nghiên cứu phân loại thực vật ở mức độ loài, vùng ITS là
locus được giải mã phổ biến nhất [28]. Vùng ITS cho thấy có sự hiệu quả
cao trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật và nấm (ngoại trừ
dương xỉ), và đây là một locus được kiến nghị làm vùng DNA barcode cho
thực vật (kỹ thuật nhận biết các loài sử dụng trình tự DNA ngắn). Ở mức
độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

gũi) và đã được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu. Thuận lợi của
vùng ITS là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và ITS2) nằm hai
bên với locus 5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu bị hư hại.

Vùng ITS cũng đã được chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên trong
loài [27,28].
Ngày nay với sự hiện diện của trên 60.000 trình tự ITS (tính đến
8/2010) được công bố trên ngân hàng Genbank, đây là nguồn tư liệu có giá
trị, mở ra những triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại và giám định, số
lượng các trình tự vẫn tiếp tục được bổ sung hàng ngày.
1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong nghiên cứu phân loại
1.5.1. Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử
 Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử
đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân
loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên
kỹ thuật phân tích DNA. Các chỉ thị AFLP (đa hình các đoạn nhân chọn
lọc), RFLP (đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các
đoạn được nhân bản ngẫu nhiên), SSR (DNA vệ tinh hay trình tự lặp lại
đơn giản), cpSSR (trình tự lặp lại đơn giản genome lục lạp), gen mã hoá
18S rRNA,… hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng
các đoạn DNA hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [8]. Với số lượng bản
sao lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR (phản ứng
chuỗi polymerase) với các cặp mồi (primers) thích hợp.
Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (GenBank, 2007) đã
lưu giữ trên 70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotit. Đây là nguồn
dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý
do chính là (1) số liệu về trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

định các đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc

loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự nucleotit đảm bảo độ chính xác cao
nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, trong
nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các
biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa cha
mẹ và con cái ; (3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác
loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà
vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…;
và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố
khách quan do môi trường hay con người gây ra.
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử
đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát
hiện các loài mới, giải quyết các nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy
đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của
nhiếu loài động thực vật và vi sinh vật [23]. Các kết quả nghiên cứu ở
mức độ DNA đã và đang góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định
hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài
nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam [52].
Do có giá trị sử dụng và thương mại lớn, nên nghiên cứu đa dạng di
truyền đối với một số loài cây gỗ quý của chi Dalbergia sử dụng các chỉ thị
RAPD, cpSSR, AFLP cũng được nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu.
Chẳng hạn, Olivarimbola và cộng sự (2004) [21] đã dựng mối quan hệ di
truyền của 122 cá thể loài Dalbergia monticola của Madagascar bằng việc
phân tích với 60 chỉ thị RAPD và 03 chỉ thị cpSSR, kết quả nhận được cho
thấy các quần thể cây ở vùng trung tâm phía Bắc có nguồn gốc từ vùng
Holocene của phía Nam. Tương tự, các nhóm tác giả ở Pháp, Ấn Độ,
Brasil cũng đã sử dụng các chỉ thị RAPD, SSR để nghiên cứu mối quan
hệ di truyền giữa các loài, các quần thể và xác định trình tự các đoạn gen
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành

23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

đặc trưng cho một số loài cây thân gỗ thuộc chi Dalbergia (Subhash et al.,
2004) [26,37,56,67]. Vì thế, riêng đối với chi Dalbergia trong ngân hàng
Genbank cũng đã lưu giữ hàng trăm trình tự nucleotit đặc trưng cho một số
loài ở một số quốc gia (trang Web NCBI). Đây là nguồn dữ liệu có giá trị
để chúng tôi có thể khai thác ứng dụng cho nghiên cứu chi này của Việt
Nam.
 Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục
vụ công tác bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới
quan tâm và phát triển. Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước
cũng đã từng bước tiếp cận. Tuy nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu
DNA có tính hệ thống cao mới được thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật cho một số loài động vật quý hiếm. Còn đối với thực vật
thì hầu như chưa có, hơn nữa trong thực tế, sự tồn tại phân bố của nhiều
loài ở dạng biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng nguồn gen rất lớn mà chưa
được nghiên cứu.
Vài năm trở lại đây, nghiên cứu đa dạng DNA ở thực vật đã và đang
được tiến hành nghiên cứu ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm
nghiệp Việt Nam, Trường Đại học Lâm nghiệp và Bảo tàng Thiên nhiên
Việt Nam, nhưng mới chỉ tập trung được vào vài đối tượng cây trồng (cây
lạc, lúa, một số loài hoa lan, một số loài thuộc chi họ Dầu, Vạn tuế, Bách
xanh và Giổi). Mặc dù các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào việc đánh giá
đa dạng di truyền quần thể nhưng cũng rất có giá trị cho nghiên cứu bảo
tồn, tiến hoá và tái tạo nguồn gen.
Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên
cứu đa dạng di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam
cũng đã đạt được nhiều kết quả có giá trị. Đối với một số loài động thực

Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vật là nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải [8] đã dùng gen ty thể (18S
rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định DNA một số loài lan Hài, cây
Bình vôi, chim (gà Lôi), cá (cá Vược) và đã phát hiện ra mức độ tiến hóa
của chúng. Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử
dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh
chủng loại của một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [2,4].
Nguyễn Thuý Hạnh (2006), Lê Thị Muội và cs (2005) đã dùng chỉ thị
ISSR và cpSSR để nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài chi họ Dầu và
Lạc của Việt Nam [9,15]. Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã
dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây Vạn tuế của Việt
Nam làm cơ sở cho công tác bảo tồn đa dạng di truyền [13].
Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp
phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn rất ít. Đặc biệt đối với
nhóm cây rừng nói chung và loài gỗ quý có nguy cơ truyệt chủng nói riêng
nên cần tập trung nghiên cứu có hệ thống.
1.5.2. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karry Mullis và
cộng sự mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách
mạng trong sinh học phân tử. Đây là phương pháp invitro để nhân bản
nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế
(cỡ 10
-3
µg
). Kỹ thuật này có độ nhạy cảm rất cao và được ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chẩn đoán bệnh, trong di truyền quần
thể và phân tích pháp y.
Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR rất hữu hiệu cho việc xác
định trình tự nucleotit của các đoạn DNA được nhân, có thể sử dụng PCR
để tách dòng đặc hiệu, nó giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích gen
từ các tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá trình tiến hóa ở mức độ phân tử.
Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng chục triệu
năm.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành


25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.5.3. Đọc trình tự nucleotide
Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương
pháp Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-
determination method) là một phương pháp xác định trình tự DNA được
Frederick Sanger phát triển vào năm 1975.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của
enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA
polymerase xúc tác gắn các nucleotit vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở
vị trí 3' có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotit không có nhóm 3'-OH
thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp là sử dụng
các loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách
ngẫu nhiên. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA là đoạn DNA mạch đơn
có kích thước 20 nucleotit.
1.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
Cây phát sinh chủng loại là một sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hoá
giữa các loài, được xây dựng dựa trên sự giống và khác nhau các đặc điểm

vật chất di truyền hay cơ thể. Trong nghiên cứu này là sự giống và khác
nhau về cấu trúc DNA giữa các loài. Các taxa được nối với nhau trên cây
thể hiện mối quan hệ di truyền giữa chúng, khoảng cách càng lớn, mối
quan hệ di truyền càng xa và ngược lại. Trên cây có rễ mỗi nút bên trong
cây đại diện cho một loài tổ tiên chung. Giả định nút gần nhất với rễ là
loài khởi điểm, các nút còn lại được toả ra từ nút này được gọi là con
cháu. Mỗi một nút được gọi là một đơn vị phân loại, các nút trong cây
được gọi là các đơn vị phân loại giải thiết. Độ dài của cành cây mô phỏng
thời gian tiến hoá. Cây không rễ là cây không có điểm khởi đầu, do đó nó
không tái dựng lịch sử tiến hoá của các loài. Cây không rễ chỉ cho biết
mối quan hệ họ hàng giữa các loài hiện tại. Có 4 phương pháp tạo cây bao