thiết kế vector mang cấu trúc gen gmdreb2 nhằm phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC





HOÀNG THỊ THU HOÀN





THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2
NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG
CHUYỂN GEN CHỊU HẠN







LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái nguyên, 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




HOÀNG THỊ THU HOÀN




THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2
NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG
CHUYỂN GEN CHỊU HẠN



Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60. 42. 02. 01



LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, 2014

i


LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn là do tôi tìm
hiểu, nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự cộng
tác giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu, kết quả trình
bày trong luận văn đã được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên
cứu. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.


Tác giả luận văn



Hoàng Thị Thu Hoàn

ii


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Đào Xuân Tân và các thầy cô Bộ môn
Di truyền học & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – Kỹ thuật nông nghiệp,
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài.
Tôi xin cảm ơn TS Lê Văn Sơn và các cán bộ Phòng Công nghệ DNA
ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh
học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tân Trào, Tuyên
Quang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành
khoá học.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên
khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn.
Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học
của Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học
Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tác giả luận văn



Hoàng Thị Thu Hoàn

iii

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục bảng iv
Danh mục hình v
Những chữ viết tắt vi
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 3
1.1.1. Cây đậu tương
3
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương
8
1.2. DREB VÀ GEN DREB2 13
1.2.1. Gen DREB

13
1.2.2. DREB2 và gen GmDREB2
15
1.3. CHUYỂN GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 17
1.3.1. Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp và gián tiếp ở thực vật 17
1.3.2. Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 19
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
22
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
23
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
24

iv

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1. Phân lập gen
24
2.2.1.1. Phương pháp tách chiết RNA
24
2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
25
2.2.1.3. Phương pháp PCR
26
2.2.1.4. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR)
27
2.2.1.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
27

2.2.1.6. Phương pháp ghép nối gen đích vào plasmid
27
2.2.1.7. Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp
28
2.2.1.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen
29
2.2.2. Phương pháp thiết kế vector
29
2.2.3. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens 30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN
DT2008 31
3.1.1. Nhân bản gen GmDREB2 từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR
31
3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2
32
3.1.3. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmDREB2
35
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 38
3.2.1. Kết quả cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 bằng XbaI và SacI
38
3.2.2. Kết quả cắt plasmid pBI121 bằng XbaI và SacI
39
3.2.3. Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2
40
3.3. KẾT QUẢ TẠO DÒNG VI KHUẨN A. tumefaciens MANG CẤU
TRÚC GEN GmDREB2 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43
1. Kết luận 43
2. Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

iv




DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 7
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 23
Bảng 2.2. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 25
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR 26
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 26
Bảng 2.5. Thành phần gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT 27
Bảng 2.6. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 28
Bảng 3.1. Sự sai khác giữa trình tự đoạn gen GmDREB2 của giống đậu
tương DT2008 và trình tự có mã số DQ054363 36
Bảng 3.2. Sự sai khác giữa trình tự amino acid của protein DREB2
(DT2008) và trình tự có mã số AAY89658 37

v


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Ảnh hạt của giống đậu tương DT2008 22
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu 23
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen 30
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmDREB2; 31
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen
GmDREB2 32
Hình 3.3. Ảnh đĩa khuẩn lạc 33
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid
tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2 34
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; 34
Hình 3.6. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmDREB2 của giống đậu
tương DT2008 và DQ054363 35
Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 giữa giống
DT2008 và AAY89658 37
Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 được cắt bằng XbaI
và SacI 38
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pBI121 được cắt bằng
XbaI và SacI 39
Hình 3.10. Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid
pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp 41
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ vi khuẩn A. tumefaciens
mang plasmid pBI121/GmDREB2 42

vi

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT


ABA Axit absisic
bp Cặp base
cs Cộng sự
C:I Chloroform : Isoamyl
DEPC Diethyl pyrocarbonate
DNA Deoxyribonucleic Acid
DREB Dehydration – Responsive Element Binding
dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid
E. coli Escherichia coli
kb Kilo base
LB Luria Bertani
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi
RNA Ribonucleic Acid
TAE Tris - Acetate - EDTA
Taq Thermus aquaticus
v/p vòng / phút
X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside


1


MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) còn gọi là đậu nành là cây trồng
cạn ngắn ngày mang ý nghĩa chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới do có
giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Hạt đậu tương chứa 30% - 56% protein,
chứa 12% - 25% lipid, chứa 36% - 40% hydrat cacbon và các loại amino acid
cần thiết cho cơ thể con người như: cystein, lysine, triptophan, leucine,
methyonine… Ngoài ra trong đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin (B1, B2,
C, D, E, K…) là nguồn năng lượng cần thiết cho cuộc sống của con người và
động vật. Do có thời gian sinh trưởng ngắn, trong hệ rễ lại có nốt sần mang vi
khuẩn cố định nitơ không khí nên cây đậu tương thường được trồng luân canh
với lúa và ngô để tăng vụ, cải tạo đất bạc màu và bảo vệ môi trường.
Cây đậu tương đang trở thành một trong những cây trồng quan trọng
không chỉ đối với Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới. Sản phẩm của
nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu quan trọng
cho nhiều ngành công nghiệp.

Trong những năm gần đây hạn hán xảy ra thường xuyên đã tác động
xấu đến sự sinh trưởng, phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng
trong đó có đậu tương. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện
ngoại cảnh và thuộc vào nhóm cây chịu hạn kém, khi thiếu nước ở các thời kì
khác đều có tác động xấu, làm giảm năng suất cây đậu tương.
Đặc tính chịu hạn ở đậu tương là tính trạng đa gen mà sản phẩm của
các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện tính chịu hạn hoặc có chức
năng điều hoà nhóm gen chịu hạn. DREB là một loại protein điều hòa có chức
năng kích thích hoạt động phiên mã của nhóm gen chịu hạn, đây nhân tố

2

phiên mã đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của nhóm gen chịu hạn

khi cây đậu tương ở điều kiện cực đoan.
Vì vậy cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương trong định hướng chọn
giống chịu hạn bằng công nghệ gen đang được các nhà chọn giống quan tâm
ứng dụng. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Thiết
kế vector mang cấu trúc gen GmDREB2 nhằm phục vụ tạo cây đậu tương
chuyển gen chịu hạn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2 phân lập từ
cây đậu tương chịu hạn và biến nạp được vào vi khuẩn Agrobacterium
tumefacien.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA. Nhân gen GmDREB2 bằng PCR
với cặp mồi đặc hiệu từ các giống đậu tương chịu hạn tốt DT2008. Tách dòng
và xác định trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB2;
3.2. Tạo vector chuyển gen mang gen GmDREB2. Kiểm tra vector tái tổ hợp
bằng enzym cắt giới hạn;
3.3. Tạo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp.





3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU
TƯƠNG

1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử
dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm
được xác minh. Cây đậu tương có nguồn gốc từ Trung quốc và nó sớm được
người dân thuần hóa và trồng làm cây lương thực vào khoảng thế kỉ 17 trước
công nguyên. Sau đó, nó được đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Nam
Á và Đông Nam Á qua con đường tơ lụa. Đậu tương truyền bá sang Châu Âu
vào khoảng thế kỉ thứ 17, sang Hoa Kì thế kỉ thứ 18 và ngày nay Hoa Kì là
quốc gia sản xuất đậu tương hàng đầu trên thế giới, chiếm 50% sản lượng trên
toàn thế giới, tiếp theo là các nước Trung Quốc, Ấn Độ,… Ở trung du Việt
Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu vực
trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ [3], [5].
Cây đậu tương hay đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill,
thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoideae), bộ
Phaseoleae và có bộ NST 2n = 40. Đối với đậu tương có thể phân loại theo đặc
điểm thực vật học, dựa vào thời gian sinh trưởng, theo thời vụ. Theo cách phân
loại của Hymowit và Newell (1984) dựa trên đặc điểm về hình thái, sự phân bố
địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja.
Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được
chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Gtycine (L) Merr và loài hoang dại hàng
năm G. Soja Sieb và Zucc [3], [5], [9].

4

Cây đậu tương gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Rễ
đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi
khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của không khí tạo
thành đạm dễ tiêu. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay
nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kĩ thuật trồng. Trong giai đoạn
sinh trưởng sinh dưỡng, sinh trưởng của rễ nhanh hơn thân, nên khi vào thời

kì ra hoa rộ, lúc đó độ sâu của rễ thường dài gấp đôi chiều cao của thân cây,
và rễ vẫn tiếp tục phát triển cho đến khi quả vào mẩy và hạt bước vào giai
đoạn chín sinh lý mới ngừng lại [3], [5], [14].
Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, thân hình tròn,
nhiều lông nhỏ, mang nhiều đốt. Thân khi còn non thường có màu xanh hoặc
màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, chiều cao trung bình từ 0,5 –
1,2 m, thay đổi tùy theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phân bón…
Giống đậu tương dại cao 2 - 3 m. Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay
mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc. Những giống thân to thường là thân
đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão [5]. Số cành trên thân nhiều hay
ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canh tác. Có giống chỉ có 1 - 2 cành
hoặc thậm chí không có cành. Các cành mọc ra từ chồi ở các nách lá. Các
chồi ở dưới thân chính sẽ phát triển thành các chùm quả, các chồi ở giữa và
ngọn thì phát triển thành các chùm hoa. Các cành mọc ra ở đốt thứ nhất hay
đốt thứ hai sẽ khỏe hơn các cành mọc ở phía trên. Các cành cùng với thân sẽ
tạo thành tán cây [14].
Cây đậu tương có 3 loại lá chính là: lá mầm, cặp lá đơn, lá chét và
ngoài ra còn có thêm lá gốc. Lá đậu tương có hình dạng khác nhau: tròn, hẹp,
bầu dục, lưỡi mác hoặc hình thoi… nhưng thường quy thành hai loại là lá
rộng và lá hẹp. Cặp lá mầm là 2 lá đầu tiên, khi mới mọc thường có màu vàng
hay xanh lục nhưng khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh. Hạt

5

giống to thì cho lá mầm to thì chứa nhiều chất dinh dưỡng để nuôi cây, khi
hết chất dinh dưỡng thì khô và rụng đi. Cặp lá đơn xuất hiện khi cây mọc
được 2 - 3 ngày và mọc trên lá mầm. Lá có màu xanh đậm và có phiến lá hình
ô van. Lá đơn mọc đối xứng nhau. Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây
sinh trưởng tốt. Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có khả năng
chịu rét. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bình

thường. Đậu tương thường có 3 lá chét sau cặp lá đơn và được xếp xen kẽ
thành 2 hàng đối diện. Phiến lá chét có hình ô van rộng tới hẹp tùy thuộc vào
từng loại giống. Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ. Những giống có lá nhỏ và
dài chịu hạn khỏe nhưng cho năng suất thấp. Còn những giống có lá to chống
chịu hạn kém nhưng lại cho năng suất cao. Lá gốc xuất hiện ở cuống của mỗi
cành, là một lá đơn rất nhỏ. Lá gốc không có cuống và lá gối [3], [5].
Đậu tương là cây tự thụ phấn, có hoa dạng cánh bướm đặc trưng, hoa
đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ
nách lá hoặc ngọn. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 - 10 hoa và
thường có 3 - 5 hoa. Hoa đậu tương nhiều nhưng tỉ lệ đậu quả thấp do chịu
nhiều ảnh hưởng từ môi trường [9], [14].
Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông
khi chín có màu vàng hoặc xám. Quả đậu tương có số lượng biến động từ 2
đến 20 quả trên một chùm hoa và có thể có 400 quả trên một cây. Một quả
thường có từ 1 đến 5 hạt, nhưng chủ yếu là 2 đến 3 hạt. Hạt đậu tương không
có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Hạt có hình tròn
hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng
nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng. Trong hạt, phôi
thường chiếm 2%, lá mầm chiếm đến 90% và còn lại là vỏ hạt chiếm 8% tổng
khối lượng hạt [3], [5].

6

Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nó được dùng làm thực
phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là
hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Đậu tương có hàm lượng protein cao
hơn trong gạo, thịt, cá và cao gấp hai lần các loại đậu đỗ khác. Trong hạt đậu
tương không có thành phần cấu tạo của cholesteron. Đậu tương còn được xem
là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipid đậu tương chứa thành phần các
acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18%. Hạt đậu tương

còn chứa nhiều loại vitamin như: Vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin
E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần chất xơ tốt
cho tiêu hóa. Đậu tương là cây cung cấp nguyên liệu hàng đầu cho công
nghiệp ép dầu và một số ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân
tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo… Đối với nông nghiệp đậu tương được sử
dụng làm thức ăn gia súc và đóng vai trò quan trọng trong việc cải tạo đất
trồng [5], [12], [14].
Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế
giới, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Do khả năng thích ứng
rộng nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở
châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á 21,27% và một số nước khác trên thế
giới. Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế
giới. Trong đó, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là Mỹ, Brazil,
Argentina và Trung Quốc. Hiện nay đậu tương được trồng ở Việt Nam có hai
nguồn gốc, đó là các giống địa phương và giống nhập nội. Trước cách mạng
tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tương ở Việt Nam chỉ khoảng 32
ha, năng suất 4,1 tạ/ha, cho đến nay diện tích đó tăng lên đáng kể [5], [18].
Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong
đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng
Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng

7

bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung
1,6%, diện tích gieo trồng đậu tương tính đến tháng 4/2010 là 123,9 nghìn
ha. Cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của
nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát
triển [5], [7], [12], [18].
Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu
cũng như hạn hán đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậu tương ở

Việt Nam. Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự biến động
và có xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất và sản lượng đậu
tương gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
Diện tích
(1000 ha)
190,1 192,1 146,2 197,8 173,6 200 230
Năng suất
(tấn/ha)
1,45 1,39 1,46 002 1,46 1,5 1,52
Tổng sản lượng
cả năm (tấn)
275,5 267,6 213,6 296,9 254,2 300 350
Nguồn: Tổng cục thống kê [38]


Do chưa được đầu tư cao nên năng suất đậu tương còn nhiều hạn chế.
Năng suất đậu tương của nước ta rất thấp, chỉ bằng 50 – 70% năng suất đậu
tương của toàn thế giới. Sản lượng đậu tương sản xuất ra chưa kịp đáp ứng
nhu cầu trong nước. Hàng năm, chúng ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng
đáng kể từ nước ngoài. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên, có thể
là do dịch bệnh, kỹ thuật canh tác, nhưng chủ yếu là do biến đổi khí hậu và
hạn hán. Cùng với việc nghiên cứu các công nghệ sinh học và các loại đậu

8

tương cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao với chi phí sản xuất
thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu

tương có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như:
nóng, lạnh, hạn, mặn, phèn… [4], [7], [9].
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương
Mỗi loài cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố
sinh thái của môi trường như: nhiệt độ (nóng, lạnh), nước, phèn, độ
mặn… Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây
và gây mất nước trong cây [2], [14]. Trong những nhân tố sinh thái của
môi trường thì nước là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, là
sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển
hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật Nước là môi trường để các
phản ứng trao đổi chất xảy ra trong tế bào. Sự thiếu hụt nước ảnh hưởng
xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ
sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ
keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô
kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn
thương và chết. Thiếu nước trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước
của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý như quang hợp, hô
hấp, dinh dưỡng khoáng do đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển
của thực vật [1], [7], [12]. Ở thực vật khi bị thiếu hụt nước sẽ xảy ra sự
hoạt hóa phosphoryl hóa các protein. Một số protein kinase đã được mô
tả như nhân tố truyền tín hiệu (singnal transduction factor) liên quan đến
phản ứng thẩm thấu ở thực vật. Trong đó, SnRK2 (SNF1 – related
protein kinase 2) là protein liên quan đến các phản ứng thích nghi với
điều kện bất lợi của môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA
(Umezawa và cs, 2004; Hiroaki Fujii và cs, 2009) [25]. Một số nghiên

9

cứu cũng đã chứng minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đến
phản ứng điều kiện khô hạn của cây trồng (Umezawa và cs, 2004) [36].

Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối
ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng của thực
vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là
tính chịu hạn [15], [17].
Khô hạn có thể phân ra làm các trường hợp sau:
(i) Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở
giai đoạn nhất định trong chu kì sống ở thực vật (hạt, hạt phấn, bào tử). Hiện
tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây. Đây là quá trình
biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di
truyền. Trong giai đoạn hình thành hạt nếu tế bào mất nước khả năng chịu hạn
tăng lên. Khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và có chiều hướng giảm
dần khi hạt nảy mầm. Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt điều
kiện ngoại cảnh bất lợi khác như nhiệt độ, gió.
(ii) Hạn do tác động của môi trường chịu tác động bên ngoài rất lớn,
gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể gây hủy hoại cây cối và gây mất
mùa. Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước
đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế
bào. Những yếu tố bất lợi chính là các thành phần như thổ nhưỡng, nhiệt độ,
gió nóng hay thời tiết, khí hậu. Có hai loại hạn do môi trường tác động là hạn
đất và hạn không khí.
(iii) Hạn đất thường xảy ra ở những vùng có khí hậu hay thổ
nhưỡng đặc thù, hạn tác động mạnh mẽ lên bộ rễ của cây. Sự tác động này
được biểu hiện qua sự điều tiết các hoocmon giúp cho cây chống chịu với
điều kiện cực đoan.

10

(iv) Hạn nhiệt độ không khí thường xảy ra ở những vùng có gió nóng,
nhiệt độ cao. Hạn không khí thường tác động lên các bộ phận trên mặt đất
như lá, hoa. Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất nước

trong cây ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau [8], [13].
Cây đậu tương là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác và
là cây chịu hạn kém. Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của cây
không đồng đều qua các giai đoạn. Hạn thường làm giảm 40% năng suất đậu
tương và tác động đến tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, từ nảy
mầm, ra hoa, tạo hạt cũng như chất lượng hạt được tạo thành. Nói chung hạn
hán ảnh hưởng đến mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt với cây đậu
tương thì giai đoạn tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn này quá trình tổng
hợp protein diễn ra mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúc này có ý nghĩa lớn
quyết định năng suất. Ở cây đậu tương, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500-530
kg nước. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương cũng
khá cao 50%, trong khi ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26%.
Khi nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện
sinh lý và di truyền đã cho thấy, các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc
điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Khi
gặp hạn, axit absisic (ABA) được sinh ra chủ yếu ở phần rễ rồi chuyển hoá
lên lá, gây hiện tượng héo lá, đóng khí khổng và đẩy nhanh tốc độ già hoá bộ
lá. Khi hàm lượng ABA được chuyển hoá tới hạt, làm hạt bị lép trong quá
trình đẫy hạt. Theo Paroda thì khả năng chịu hạn ở thực vật liên quan đến một
số đặc trưng về hình thái như chín sớm, mầu lá, diện tích lá, khả năng phát
triển của hệ rễ, số lượng lông hút, mầu sắc thân, độ phủ lông trên thân lá
Ngoài ra, khả năng chịu hạn còn liên quan đến một số yếu tố sinh lý như khả
năng đóng mở của khí khổng, quá trình quang hợp, hô hấp, điều chỉnh áp suất
thẩm thấu, nhiệt độ tán cây

11

Tính chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen, chúng thể hiện ở
nhiều khía cạnh khác nhau: như sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm
tương đối cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng

nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Căn cứ vào
đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm:
- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của
cây.
Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu tương có thể dễ vượt qua hơn,
còn ở những giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp
hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể.
Signh và Sarkar (1991) chia cơ chế chịu hạn ở thực vật làm 3 loại:
- Tránh hạn: là khả năng của cây có thể hoàn thành chu kỳ sống của nó
trước khi sự thiếu hụt nước xuất hiện.
- Chịu hạn: là khả năng của cây có thể sống, phát triển và cho năng suất
trong điều kiện cung cấp nước hạn chế hoặc thụ động trải qua các giai đoạn
thiếu nước và tiếp tục phát triển khi điều kiện trở lại bình thường.
- Chống hạn: là khả năng của cây trồng chống lại sự thiếu hụt nước
bằng cách duy trì nước trong mô tế bào cao [6], [9], [13].
Đã có rất nhiều công trình khoa học trên thế giới nghiên cứu về tính chịu
hạn của cây đậu tương nhằm góp phần quan trọng trong công tác chọn giống.
Năm 2004, nhóm nghiên cứu gồm Huang và cs của trường Đại học Tự
nhiên và Kỹ thuật Pingtung - Taiwan đã phân lập được gen P5CS ở đậu tương từ
mRNA với kích thước 2148 bp. Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng
hợp proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên [6].

12

Prorcel và cs (2005) đã nghiên cứu phân lập gen P5CS ở đậu tương
và đăng kí trên ngân hàng gen NCBI với mã số là AJ715851, kích thước
là 831 bp [35].
Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Thúy Hường và cs (2009) đã phân lập gen
P5CS từ mRNA với kích thước 2148 bp [34].

Hiroaki và cs (2009) đã tìm ra ABRE1 là một nhân tố phiên mã của
ABA. ABRE có khả năng tăng cường tính chịu hạn ở Arabidopsis [26].
Năm 1998, Ji Hoon Ahn và cs phát hiện gen Sb-HRGP3 dài 1.353 bp ở
đậu tương mã hoá hydroxyproline giàu glycoprotein hoạt động mạnh trong
mô của vùng chuyển đổi cấu tạo sơ cấp sang cấu tạo thứ cấp của rễ. Ở rễ thứ
cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với các rễ chính. Rất có thể, sự biểu hiện
của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ [19].
Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng
chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko
Watanabe và cs (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế
liên quan đến rễ và chồi. Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương các
tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật thiết với
các cơ chế kháng hạn. Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu tố quan
trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán.
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen liên
quan đến tính chịu hạn, chịu nóng của cây đậu tương. Trần Thị Phương Liên
và cs (2003) phân lập gen chaperonin CCTδ từ giống đậu tương địa phương
chịu hạn Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotide mã hoá cho 533 axit amin
[8]. Nguyễn Thu Hiền và cs (2005) phân lập gen dehydrin với kích thước 751
bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tương vàng Mường
Khương và Cao Bằng 4. Nguyễn Thị Thuý Hường và cs (2011) đã phân lập,
tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm
chuyển vào cây đậu tương Việt Nam [6].

13

1.2. DREB VÀ GEN DREB2
1.2.1. Gen DREB
Các protein điều hoà phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu
hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển

trên vùng khởi động gen và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức
hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng. Nhóm gen mã hóa các
nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8-10% trong hệ gen mỗi loài và đóng vai trò
quan trọng trong mọi hoạt động sống như quá trình sinh trưởng phát triển và
chống chịu với bất lợi môi trường. Ở đậu tương, hơn 2000 yếu tố phiên mã từ
các mô cơ quan chính đã được xác định, khoảng trên 180 yếu tố phiên mã ở rễ
liên quan đến tính chịu hạn. Các nhà khoa học đã xác định các nhân tố tham
gia vào quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn là DREB, ADREB, NAC,
bZIP, ZFHD…
DREB là họ gen tổng hợp protein được tìm thấy nhiều trong tế bào
sống khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn và lạnh. Nhiều
công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng DREB là
nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạt
nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều
kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, mặn và lạnh. Khi nghiên cứu cấu
trúc protein họ DREB đã cho thấy rằng chúng có chứa vùng bảo thủ duy nhất
để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ERF, cho phép chúng tương tác với
một loạt các gen phía sau theo hình thức không phụ thuộc ABA. Các miền
AP2/ERF khá bảo thủ và có khoảng 60 amino acid [21], [24], [27].
Shahrokhabadi và cs (2008) đã xác định được các gen trong họ gen
DREB ở đậu tương.
Trình tự đặc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự lõi là
A/GCCGAC lần đầu tiên được phát hiện nằm trong vùng điều khiển gen rd29

14

ở Arabidopsis và sau này được phát hiện trên rất nhiều vùng điều khiển gen
của các gen biểu hiện trong điều kiện hạn và lạnh khác (Huang B, 2007) [27].
Dubouzet và cs (2003) cho rằng gen OsDREB1A, OsDREB1B,
OsDREB1C, OsDREB1D, gặp lạnh, OsDREB2A được biểu hiện khi mất

nước và nồng độ muối cao; các OsDREB1A và OsDREB2A tạo protein liên
quan đến yếu tố DRE và kích hoạt yếu tố phiên mã của GUS tham gia vào
quá trình chống chịu hạn.
Theo Li và cộng sự (2005) phân lập gen trên đối tượng cây đậu tương
và đã chia thành các phân họ DREB gồm: GmDREBa, GmDREBb,
GmDREBc, ngoài ra còn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5 mỗi
gen có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều khi đậu
tương gặp các điều kiện hạn [29].
Ở Arabidopsis, 10 DREBs (DREB2 – DREB11) được phân thành 5
nhóm, nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB5; nhóm thứ hai gồm
W50, DREB6, DREB7, DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8; nhóm
thứ tư gồm DREB9 và DREB10; nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 và
ERF2 (Liu và cs, 1998; Riechman và cs, 2000; Tsui – Hung Phang, 2008).
Các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu và giải
trình tự gen DREB trên loài cúc và hướng dương, lúa mỳ…
Chen và cs (2007) đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 từ mRNA ở cây
đậu tương với kích thước là 927 bp [23].
Liu và Feng (2008) đã phân lập gen DREB4 từ mRNA ở cây thuốc lá
có kích thước là 644 bp [31].
Lucas và cs (2009) nghiên cứu gen DREB11 từ mRNA ở cây hướng
dương có kích thước 1380 bp [32].

15

Trong những gen trên, gen DREB2 tham gia tích cực vào việc chống
hạn của đậu tương. Gen DREB2 được biểu hiện trong môi trường có xử lý bởi
hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp.
1.2.2. DREB2 và gen GmDREB2
Việc mất nước được đáp ứng bởi nhóm DREB2 bao gồm các yếu tố
phiên mã góp phần chống hạn và chống stress nhiệt bằng cách kích hoạt phiên

mã thông qua các yếu tố cis đáp ứng mất nước.
Gen DREB2 tham gia tích cực vào việc chống hạn. Gen DREB2 được biểu
hiện trong môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp.
Nakashima và cs đã xác định được ở cây Arabidopsis gen DREB2 có liên
quan đến sự mất nước và độ mặn cao trong biểu hiện gen. Trong cây
Arabidopsis gen biểu hiện trong điều kiện mất nước đặc trưng bởi một nhóm gen
DRE/CRT – binding protein là DREB2A và DREB2B. Khi phân tích thấy rằng
cả hai gen được gây ra bởi sự mất nước và độ mặn cao. Mức độ biểu hiện của
hai gen rất cao trong rễ khi nồng độ muối cao và trong thân và rễ khi cây bị mất
nước. Gen DREB2A nằm trên NST số 5 và DREB2B nằm trên NST số 3, cả 2
gen bị gián đoạn bởi 1 intron duy nhất tại các vị trí giống hệt nhau [33].
Trong cây chuyển gen Arabidopsis gen DREB2 giải phóng ra Beta-
glucuronidase (GUS) trong điều kiện cây bị mất nước và độ mặn cao [33].
Chen và cs (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa
trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 trong
gen GmDREB2 nhóm gen DREB. Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong
môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và AB [23].
Sự biểu hiện của GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen được tích lũy cao hơn
của hàm lượng proline [31]. Đối với cây đậu tương với chức năng kích hoạt
sự phiên mã của là cơ sở quan trọng và hữu ích cho việc cải tiến khả năng
chịu hạn của cây.

16

Liu và cs (2008) đã nghiên cứu gen DREB2 ở cây hoa cúc
Dendranthema vestitum. DvDREB2A được phân lập từ hoa cúc
Dendranthema vestitum nó chứa một (ORF) dài 1.471 bp mã hóa 366 amino
acid và được xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiều trình tự.
Trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP DNA - binding miền gần khu
vực N. Trong một phân tích protein DvDREB2A đã bị ràng buộc bởi yếu tố

DRE (Trình tự lõi, AGCCGAC) và kích hoạt sự biểu hiện của HIS3 và giải
phóng lacZ. Các thí nghiệm cho thấy mức độ biểu hiện của DvDREB2A đã bị
ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt, nhiệt độ thấp, hạn hán, ABA, độ mặn cao,
những kết quả này chỉ ra rằng gen DvDREB2A là một yếu tố mới của các yếu
tố phiên mã DREB, có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng khả
năng chịu áp lực môi trường [30].
Kobayashi và cs (2008) kích hoạt gen DREB2 lúa mì (wDREB2)
trong thuốc lá chuyển gen. Tạo ra cây thuốc lá biến đổi gen biểu hiện
wDREB2, wDREB2 biểu hiện tăng khả năng chịu lạnh và thẩm thấu
trong cây thuốc lá [28].
Chen và cs (2009) đã phân lập gen PeDREB2 từ cây populus
euphratica. Dựa trên sự liên kết nhiều trình tự và đặc tính phát sinh loài
PeDREB2 được xếp vào phân họ A2 trong nhóm gen DREB. Sự biểu hiện
của PeDREB2 được gây ra bởi môi trường có xử lý hạn hán, lạnh và độ mặn
cao nhưng không có ABA. PeDREB2 tăng khả năng chịu mặn trong cây
thuốc lá chuyển gen và không gây ra chậm phát triển. Kết quả cho thấy
PeDREB2 có chức năng như là một yếu tố phiên mã liên quan đến phản ứng
của nồng độ muối cao và có thể có ích trong việc cải thiện khả năng chịu mặn
trong cây chuyển gen [22].