Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của các
loài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhóm
virus cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chim
mang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy
hiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác. Ngoài ra, chúng còn là nơi
cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên các subtype mới. Các
subtype virus cúm A gây bệnh trên người đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể
và biến chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh, trước
đây đã tạo nên những vụ dịch thảm khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại tái
hiện và gây nên đại dịch mới. Năm 2004 các đại dịch cúm gia cầm tại các
nước châu Á (bao gồm dịch do H5N1 gây ra tại Trung Quốc, Nhật, Nam
Triều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia và Lào; do H7N3
(Pakistan); do H5N2 ( Đài Loan) đã gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làm
chết hàng chục người ở Việt Nam và tại Thái Lan. Chủng H5N1 điển hình ở
châu Á có tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng
A/Vietnam/1203/04.
Để phòng chống sự lây lan mạnh mẽ của đại dịch cúm gia cầm, hàng
năm Việt Nam cần một lượng vaccine rất lớn để tiêm chủng cho hàng trăm
triệu con gà vịt. Ngoài những công nghệ sẵn có Việt Nam đang tìm kiếm
những công nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao.
Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được
các tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem là
hướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức
khoẻ cộng đồng như Việt Nam.
1
Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào các
cây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trong
những hướng đi chính hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũng
được bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấy

sinh khối tế bào để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Do tế bào thực
vật có ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng
sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng
hơn cả tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang các mầm bệnh cho người.
Với mục đích tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúm
A/H5N1, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương
pháp khả thi, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế
vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu
chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein
vỏ của virus H5N1.
- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây
thuốc lá tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens.
3. Nội dung nghiên cứu
- Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào
vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp.
- Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của
virus H5N1.
- Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein
vỏ của virus H5N1 và biến nạp vào vi khuẩn A. rhizogens.
- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây
thuốc lá tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cúm A/H5N1
1.1.1. Cấu tạo
Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính
của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra.
Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân

type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt vỏ của hạt
virus . Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện,
đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử
khoảng 250 triệu Dal. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa
khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là
carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc
ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand (Hình
1).
Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp
ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A. Ghi chú: A: Các dạng hình thái
3
khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo
hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase:
phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme
polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP
(Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).
Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của
virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào
nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có
khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng
10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ
virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các
dấu ấn khác của virus , . Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử
NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên
có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm
nhiễm , . Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9
phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các
phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau
về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan
trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA),

hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm
và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Các subtype này gây nhiễm cho
hầu như phần lớn mọi loài sinh vật bao gồm các loài lông vũ (gà, chim và
thuỷ cầm), lợn, ngựa, chồn đất, hải cẩu, cá voi và loài người. Trên cơ sở
trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân đoạn (HA,
NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên
trong vỏ virus, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide, mã hóa cho
11 protein tương ứng của virus (hình 2).
4
Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen (hình trái) gồm 8 gen là 8 đoạn RNA sợi
đơn âm (-ssRNA) và mô hình (hình phải) thể virus cúm H5N1 gồm các
protein và các đoạn –ssRNA. (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology,
University of Cambridge).
1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ
Độc lực gây bệnh của virus cúm A
Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại:
Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc
lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn
tại trong tự nhiên .
- HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ
quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết
100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48h sau nhiễm. Loại này rất nguy
hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào
phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin , .
- LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây
bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết
vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự
nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có
5
độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI

nguy hiểm , .
Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1
Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim
hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự
nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ
của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên .
Hình 1.3. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của
virus cúm A (Nguồn:
qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194)
Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm
A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như
gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở
người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại
loài” như gà - lợn; gà - lợn - người. Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm
khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm , , . Đặc
điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi,
6
tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên
(gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có
khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi
chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh
từ gia cầm sang người và giữa người với người , , .
1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô
hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn
thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó
còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng . Khả năng gây bệnh của virus
cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng
virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn
ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng

cường độc (H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ
quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người, có lẽ do tính
thích ứng thụ thể sialic của chúng , . Hầu hết các chủng virus cúm A nhân
lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng
cường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm
lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm
thực nghiệm trên chuột lang, chuột Hamster, chồn đất , .
Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn
dịch chống lại virus bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể
không có tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus
cúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ở
tự nhiên, và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm
A . Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng
nguyên khác với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít
7
có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới. Đây là
nguyên nhân làm cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều
lần trong năm, và các đợt dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có
thể gây nên đại dịch cúm mới . Khả năng gây bệnh của biến chủng virus
cúm mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể có được đáp ứng miễn dịch đặc
hiệu với biến chủng đó và chúng trở nên thích nghi lây nhiễm ở loài vật
chủ mới , ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân của các
đại dịch cúm trên người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người. Tuy
nhiên, các chủng này vẫn thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng năm
ở người, do khả năng biến đổi kháng nguyên của chúng . Đây cũng chính là
nguồn virus trao đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia cầm,
để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên
người , , , .
1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và

nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp,
đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [49], .
Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp
của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối
cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm.
Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của
tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy
ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi
tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian một chu
trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng
vài giờ. Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng
các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá
8
trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật
chủ , .
Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen
của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của
virus và các RNA vận chuyển. Phức hợp protein – RNA của virus được vận
chuyển vào trong nhân tế bào .
Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi
dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng
tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi
này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’-
và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp
ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào.
Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống
enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10
- 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’, sau đó được vận chuyển ra bào tương và
dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus.
Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển

gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện
tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại
nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP
của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus
gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic
acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng
thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác , .
9
Hình 1.4. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A/H5N1
trong tế bào chủ (Nguồn: />qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194)
1.2. Kháng nguyên HA
Hemagglutinin hay Haemagglutinin là glycoprotein kháng nguyên
tìm thấy trên bề mặt của virus cúm cũng như nhiều vi khuẩn và virus khác.
Nó có tác dụng gắn virus vào tế bào bị nhiễm. Tên gọi của HA bắt nguồn
từ việc protein HA có khả năng ngưng kết hồng cầu (hem: bao vây).
16 loại kháng nguyên HA khác nhau được đánh dấu từ 1 đến 16. H16
mới được phát hiện ở virus phân
lập từ mòng biển đầu đen tại Thuỵ
Điển và Na Uy năm 2005 [15]. Ba
loại protein HA đầu tiên (H1, H2
và H3) được tìm thấy phổ biến ở
virus cúm người .
Cấu trúc:
10
HA là một glycoprotein màng tạo thành từ 3 tiểu phần giống hệt
nhau. Nó có hình trụ, dài khoảng 135 Ǻ. 3 monomer tạo thành lõi xoắn
alpha ở giữa; 3 đầu hình cầu chứa vị trí gắn sialic acid. Những monomer
HA được tổng hợp, glycosyl hoá, rồi cắt thành hai chuỗi polypeptide nhỏ
hơn: HA1 và HA2. Mỗi monomer bao gồm một chuỗi xoắn dài HA2 neo
bám vào màng virus và một hạt HA1 lớn ở đầu .

Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus
cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704
- 1707 bp). Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA -
kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA
1
và HA
2
. Vùng
nối giữa HA
1
và HA
2
gồm một
số amino acid mang tính kiềm
được mã hóa bởi một chuỗi
oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzym protease, và đây là vùng quyết
định độc lực của virus , . Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.10
3
Dal (nếu không được glycosyl hóa) và 77.10
3
Dal (nếu được glycosyl hóa,
trong đó HA
1
là 48.10
3
Dal và HA
2
là 29.10
3
Dal) , .

Chức năng: Cho phép nhận biết tế bào đích của động vật có xương
sống và hoàn thành quá trình nhận biết bằng cách gắn kết với thụ thể chứa
sialic acid của những tế bào này; và cho phép đưa bộ gen của virus vào tế
bào đích bằng cách hợp nhất màng endopisome của tế bào chủ với vỏ ngoài
virus .
Cơ chế hoạt động: HA gắn kết với phân tử glycoprotein trên bề mặt
của tế bào đích, dẫn đến các phân tử virus kết dính với tế bào vật chủ.
Màng tế bào sẽ bao bọc lấy virus và phần màng này sẽ tách ra hình thành
một màng mới nằm trong tế bào gọi là endosome, endosome chứa virus
được bao gói. Tế bào sau đó bắt đầu cố gắng phân giải những thành phần
11
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc protein 3 chiều của HA
(Nguồn: />bên trong endosome bằng cách acid hoá phần bên trong nó và biến nó
thành một lysosome (thể sinh tan). Tuy nhiên, ngay khi pH trong endosome
xuống 6.0, cấu trúc vốn được gấp lại của phân tử HA trở nên không bền,
mở ra một phần và giải phóng một chuỗi peptide rất kị nước nằm trong
phân tử protein. Chuỗi fusion protein này hoạt động như một mỏ neo, gắn
vào màng của endosome và khoá lại. Sau đó, ở pH thấp hơn, phần còn lại
của HA sẽ gấp lại hình thành một cấu trúc mới, rút mỏ neo lại và kéo màng
endosome vào sát màng virus rồi hợp nhất hai màng này. Ngay lúc này, các
thành phần của virus, bao gồm RNA genome, tự do hoà vào tế bào chất .
1.3. Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/
H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới
1.3.1. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới
Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người
trong các vụ dịch cúm gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do
virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian
influenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay và phát sinh nhiều dưới dòng
(sublineage) và nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực rất cao , . Chủng virus
cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại

Scotland vào năm 1959. Có thể gọi cúm A/H5N1 phân lập năm 1959 tại
Scotland là virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-Ck-Scotland-(59)
(H5N1) (số đăng ký: X07869). Từ đó cho đến nay, H5 và N1 đã có thay đổi
lớn xét về cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch . Sau gần 40
năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông (1996), và
Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà
còn thích ứng và gây chết người bệnh. Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003 đến
nay, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây
bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ
12
truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1
trước đây , , .
Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế
giới đã có hàng trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho
ngành chăn nuôi và kinh tế. Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do virus
cúm A/H5N1, mỗi năm một cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm
gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến
tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243
trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11%. Việt Nam và Indonesia là các 2
quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 trên
thế giới. Tính gây bệnh của A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở
chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng
của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây
bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến. Hàng ngàn công trình
nghiên cứu về cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt trong 5
năm gần đây, trong đó có phát triển công nghệ và các loại vaccine gây
miễn dịch cho gia cầm và chuẩn bị đối phó với đại dịch có thể xảy ra ở
người.
Virus cúm A/H5N1 có 3 trong 4 tính chất cần có để tạo một đại dịch:
có khả năng lây nhiễm trên người, gần như tất cả mọi người đều chưa có

đáp ứng miễn dịch bảo vệ và virus có khả năng gây chết cao. Trong số 16
nước có người chết do cúm gia cầm, Inonesia và Việt Nam được WHO xác
định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúm A/H5N1 có được các điều kiện
thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người.
Không giống như dịch cúm A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2002, có thể khống
chế bằng cách tiệu diệt và loại trừ loài gia cầm trong vùng dịch để cắt đứt
nguồn lây. Cúm A/H5N1 thể độc lực cao giai đoạn 2003 đến nay, với sự
13
xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan truyền từ
Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới, đây vẫn là thách thức đối
với cộng đồng và cần nghiên cứu ứng dụng các phương pháp khác nhau để
khống chế sự lây truyền một cách có hiệu quả.
Theo số liệu thống kê năm 2006, virut cúm gia cầm đã làm số người
chết ở Indonesia 45 người, Trung Quốc là 8 người, Thái Lan là 3 người, và
cho đến nay, chủng A/Vietnam/1203/2004 (Viet04) là một trong những
chủng có độc tính cao nhất ở động vật có vú, như chồn và chuột.
Trước tình hình lây lan của dịch cúm A/H5N1. Trên thế giới cũng
như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu như:
Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus
cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ
những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi
gen giúp xác định phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã được
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch
tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen , [44]. Trên
cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng định
nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam
cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc . Các biến chủng H5N1
của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc,
Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng
(A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biến

chủng thuộc dòng Quảng Đông . Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia
cầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biến
đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ
vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông. Các chủng phân lập những năm
2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ
14
phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1
vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-
Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm
vùng Trung Quốc và Hồng Kông , . Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng
H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn
đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng
kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng
Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch .
Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân
biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt
các phân type HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết
hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Phát hiện nhanh H5N1 và các phân
type khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học
phân tử đã được xây dựng thành phương pháp . Nghiên cứu vaccine và miễn
dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo
chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp
trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam .
Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ sinh học được giao đề
tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine
cúm A/H5N1 cho gia cầm” và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm
A/H5N1 cho gia cầm tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” trong giai đoạn
2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương
(VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung ương II (NAVETCO), Trung tâm
Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccine

sản xuất từ chủng NIBRG-14 .
15
1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới
Trong tự nhiên, “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” là các hiện
tượng xảy ra liên tục theo thời gian, còn “trộn kháng nguyên” tái tổ hợp
subtype Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) thường định kỳ xảy
ra giữa các loài mắc nhằm tạo nên các biến thể virus cúm mới mà hệ miễn
dịch của cơ thể vật chủ không có khả năng nhận dạng đáp ứng và kịp hình
thành miễn dịch. H5N1 sử dụng thụ thể sialic xâm nhập tế bào .
Hemagglutinin cùng với protein enzyme neuraminidase, được xác định là
protein có vai trò kháng nguyên và độc lực và các protein kháng nguyên
có nguồn gen từ các chủng H5N1 của Việt Nam, cũng được nghiên cứu sản
xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp và sử dụng với các mục đích khác nhau, trong
đó có thử nghiệm làm kháng nguyên kích thích miễn dịch và chẩn đoán.
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính
chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch
cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát
triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà
còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người .
Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng
nguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều
loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm
đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Có nhiều loại kháng thể, nhưng
trước hết chỉ kháng thể kháng HA(H5) có vai trò tiên quyết quan trọng
trong quá trình trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch. Các vaccine phòng
bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và
vaccine thế hệ mới
Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị
chủng. Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại
16

vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như
chủng gây bệnh trên thực địa. Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous
vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống
chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng.
Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được
sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang
được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:
Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus
đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus
type H5N1 và H7N1. Ví dụ, hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine
TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2),
sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi.
Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và
tách chiết làm vaccine.
Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc
Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen
kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm
vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1.
Vaccine DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA,
NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen .
Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật
di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ
gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi
bằng kỹ thuật gen . Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản
xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC),
VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). Hai chủng cúm
17
A/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1)
hoặc A/Vietnam/1203/2004(H5N1). Trung Quốc cũng là nước sản xuất

nhiều giống virus vaccine chống cúm, ví dụ, Viện Nghiên cứu Thú y
Harbin (Cáp - Nhĩ - Tân) đã thành công trong việc tạo giống vaccine vô
hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng
A/Turkey/England/N-28/73(H5N2), loại subtype H5N2 có độc lực yếu; hay
giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1 từ
chủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu . Các loại
vaccine này đã được nhập và sử dụng tại Việt Nam từ năm 2006 cho đến
nay.
Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14: Chủng NIBRG-14 là giống
virus vaccine nhược độc (attenuated vaccine) thế hệ mới, thuộc loại hình
vaccine được xóa gen bằng công nghệ gen (gene-deletion vaccines), được
lắp ráp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics –based
technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà. Phương pháp
di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus nhân tạo nhược độc
làm vaccine, cụ thể hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG-14 này được tái tổ
hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount
Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm
nền, còn các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúm
cường độc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam
(A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) . Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 đã bị
đột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số đột biến điểm ở
các bộ mã ở hai đầu của vùng “độc”, làm thay đổi 3 amino acid tại vùng
gây độc. Như vậy về mặt miễn dịch học, mặc dù virus được xử lý làm mất
độc tính gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên
bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã lấy mẫu ban đầu, do vậy, có
18
khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1
gây bệnh trong tự nhiên.
1.4. Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens và ứng dụng
1.4.1. Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens

Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc nhóm Gram (-), yếm
khí, khi xâm nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn này gây ra các triệu
chứng bệnh trên thực vật như tạo khối u hay lông rễ. Agrobacterium thuộc
họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính: Agrobacterium
tumefaciens, Agrobacterium rhizogens, Agrobacterium radiobacter,
Agrobacterium rubi. Trong đó A. tunefaciens và A. rhizogenes là hai loài
được nghiên cứu nhiều nhất là vi khuẩn gây ra bệnh khối u (crown gall) và
bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm.
Tác nhân gây bệnh của hai loài vi khuẩn trên đã được xác định là do
sự có mặt của Ti (tumour inducing) ở A. tumefaciens và Ri (root-inducing)
ở A. rhizogenes . Khi tế bào thực vật bị thương, sẽ tiết ra các polyphenol
hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển đoạn T-DNA (transfer DNA) từ T-
plasmid hay R-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung, cơ chế
của quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-
DNA vào tế bào vật chủ của hai loài vi khuẩn này được chính minh là
tương tự nhau . Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn A. tumefaciens
do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đó các gen mã hóa
sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A. rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá
trình hình thành rễ tơ ở thực vật , .
Giống như Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi
kép, có trọng lượng phân tử lớn, từ 200 - 800 kb, gồm hai vùng chính là T-
DNA và vir (virulence). Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ
- nguồn cacbon và nito cho vi khuẩn. Ri-plasmid được chia làm hai nhóm
19
chính: agropine và mannopine và một số nhóm phụ được tìm thấy và phân
loại sau này như: cucumopine và mikimopine. Trong đó các chủng thuộc
nhóm agropine (A4, 15834, LBA9402, 1855) được chứng minh là độc hơn
so với các chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng
này được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật , .
T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là

vùng biên trái T
L
-DNA và biên phải T
R
-DNA. Hai vùng này đều có kích
thước khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNA
này sẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng T
R
-DNA
mang các gen mã hóa tổng hợp DNA (tms1 và tms2), vùng T
L
-DNA bao
gồm 18 khung đọc (ORFs) trong đó có bốn loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa
cho rol A, B, C và D (root locus). Các Ri-plasmid của các chủng
A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa
vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống như vùng T
L
-DNA của các chủng
thuộc nhóm agropine nhưng khuyết gen rolD , .
20
Các gen rolA, rolB and rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình
cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen
này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ tơ
đặc điểm sinh trưởng, phân nhánh mạnh và phát triển nhanh hơn rất nhiều
so với rễ bình thường . Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan
trọng hơn cả, khi gen rolB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng
tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu
hình rễ tơ .
1.4.2. Hệ vector nhị thể
Kích thước lớn của Ri-plasmid và Ti-plasmid gây nhiều khó khăn

trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium và trong các thao tác
sử dụng để thiết kế gen vào các vector này. Mặt khác các enzyme giới hạn
có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi công nghệ
gen lại cần những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzyme giới
hạn. Thêm vào đó, ở A.tumefaciens, một số gen mã hóa sinh tổng hợp auxin
được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội nhưng lại cản trở quá trình
21
Hình 1.6. Cấu trúc Ri plasmid
tái sinh bình thường ở thực vật. Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đã
cải tiến Ti-plasmid thành một hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen
(mang cấu trúc T-DNA) và vector bổ trợ (mang các gen vir) đảm nhiệm
chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật .
Vector chuyển gen trong hệ vector nhị thể ở A.tumefaciens có thể sử
dụng để chuyển gen thông qua A.rhizogenes. Khi nhiễm A.rhizogenes với
thực vật sẽ làm chuyển T-DNA từ vector chuyển gen cùng với T-DNA của
A.rhizogenes vào genome thực vật .
Sự tái sinh thành cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogenes có
thể xảy ra thông qua sự phát triển phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan từ
rễ. Tuy nhiên, thực vật tái sinh từ lông rễ thường bị biến đổi hình thái: lá bị
gấp nếp, hệ thống rễ ăn nghiêng, sinh trưởng cằn cỗi và khả năng sinh sản
kém.
22
Hình 1.7. Hình ảnh tạo khối u gây ra do A. tumefaciens (trái) và
rễ tơ do A. rhizogenes (phải).
1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp
Tế bào thực vật nói chung và rễ tơ nói riêng với ưu thế nuôi cấy dễ
dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng
sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thực
vật không mang các mầm bệnh cho người , được xem là một trong những
xu hướng hiện nay được sử dụng để biểu hiện các dược phẩm sinh học tái

tổ hợp. Đặc biệt rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường
không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư
lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa các rễ tơ có thể
được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền
sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Thêm vào
đó, so sánh với thực vật chuyển gen, nuôi cấy mô tế bào thực vật có ưu
điểm lớn trong công tác sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp là
không đòi hỏi diện tích canh tác, không chịu ảnh hưởng vào khí hậu, mùa
vụ, sản phẩm thu được không mang các yếu tố độc hại từ thuốc trừ sâu,
thuốc diệt cỏ và rút ngắn được rất nhiều thời gian trong trồng trọt. Đặc biệt
hơn cả ở hệ thống nuôi cấy lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dược
phẩm sinh học tái tổ hợp ra ngoài môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản
hơn rất nhiều trong quá trình tinh sạch các dược phẩm sinh học này .
Cho tới nay, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất thành công các protein
tái tổ hợp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơ
như SEAP (human secreted alkaline phosphatase) , protein huỳnh quang
kết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B) , fungal phytase , và đặc biệt hơn
cả là các kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể , (hình
1.8).
23
24
Hình 1.8. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra
a: bằng hệ thống bioreactor
b, c: thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy
(Nguồn:o/content/vol11/issue2/full/6/f4.jpg&im
grefurl)
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu
a. Thực vật:

Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 đang nuôi cấy trong điều
kiện in vitro do Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật-Viện Công nghệ sinh học
cung cấp.
b. Chủng vi khuẩn:
- Chủng vi khuẩn E. coli One Shot TOP 10 (Invitrogen).
- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 (Viện Sinh học phân tử
và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức)
c. Các vector:
- HA của virus H5N1 đã được tối ưu hóa mã để biểu hiện ở thực vật do
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- Vector chuyển gen pK7WG2D(1) (phụ lục 2)
- Vector pENTR
TM
221/cal

nhận từ Viện Sinh học phân tử và Dược học,
Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức. Vector này được thiết kế mang đoạn
signal peptide calreticulin nằm giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai
điểm cắt của enzyme giới hạn là SacI và HindIII nằm ở đầu 3’ của đoạn tín
hiệu dẫn (phụ lục 2).
- Vector chuyển gen pPTN289 mang gen gus được sử dụng để kiểm tra
qui trình chuyển gen sử dụng trong nghiên cứu (phụ lục 2)
2.1.2. Hóa chất
a) Các môi trường nuôi cấy:
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB, YMP.
- Môi trường nuôi cấy thực vật: WPM, MS.
Thành phần của các loại môi trường được trình bày trong phụ lục 1.
25