Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phả hệ phân tử vùng gen nrSSU

B GIÁO DC VÀ ÀO TO
TRNG I HC M TP.HCM




BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

Tên đ tài:
H TR NH DANH CÁC LOÀI NM THUC CHI
NM KÝ SINH CÔN TRÙNG DA TRÊN PHÂN
TÍCH PH H PHÂN T VÙNG GEN nrSSU

KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T



GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
ThS. Lao c Thun
SVTH: Trng Th Bch Vân
MSSV: 1053010938
Khóa: 2010 - 2014



Tp. H Chí Minh, tháng 05, nm 2014
i

LI CM N
Li đu tiên, tôi xin gi li cám n chơn thƠnh nht đn nhng ngi thy,

nhng ngi bn đƣ luôn  bên, truyn cho tôi nim đam mê nghiên cu khoa hc
và cho tôi nhng li khuyên b ích đ tôi có th vng bc hn trên con đng mà
mình đang bc đi.
Tôi xin gi li tri ân sâu sc đn cô PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy và ThS.
Lao c Thun đƣ tn tình hng dn, giúp đ, truyn đt kinh nghim và kin
thc quý báu trong sut thi gian ph vic ti phòng thí nghim Sinh hc phân t đ
hoàn thành tt khóa lun tt nghip này.
Cm n các bn ph vic trong phòng thí nghim Sinh hc phân t trng
H M Tp.HCM đƣ nhit tình giúp đ, đng viên tôi nhng lúc khó khn trong thi
gian thc hin khóa lun tt nghip.
Tôi cng xin gi li cám n đn quý thy cô tham gia ging dy khóa 2010
khoa Công ngh sinh hc đƣ giúp em trau di kin thc, to nn tng vng chc đ
em thc hin đ tƠi cng nh kinh nghim làm vic sau này.
Và trên ht, con xin gi li cm n đn cha m, nhng ngi đƣ có công sinh
thƠnh, dng dc con, luôn to mi điu kin tt nht, luôn yêu thng vƠ ng h
con trên con đng mình đƣ chn.

Bình Dng, ngƠy 22 tháng 05 nm 2014

Trng Th Bch Vân


ii

DANH MC BNG
Bng 2.1. Trình t các mi s dng trong phn ng PCR
B
nrSSU
Bng 3.1
vùng gen nrSSU

Bng 3.2. Thông tin 62 trình t tham chiu dùng đ xây dng d liu vùng trình t
nrSSU
Bng 3.3. Kt qu kim tra DNA bng quang ph k kho sát trên 3 mu nm ký
sinh côn trùng đc tách chit theo phng pháp Phenol:Chloroform
Bng 3.4. Kt qu kim tra DNA bng mt đ quang ph các mu nm tách chit có
b sung -mercaptoethanol
Bng 3.5. Kt qu kim tra DNA bng mt đ quang ph k các mu nm tách chit
có b sung -mercaptoethanol
B
t lp chu k nhit PCR khuch đi các vùng gen nrSSU ca
các mu nm ký sinh côn trùng
Bng 3.7. Bng hiu chnh các nucleotide ti các v trí (i) đn (xi)
Bng 3.8. Tng hp kt qu hiu chnh trình t các mu nm ký sinh côn trùng
Bng 3.9. Kt qu chiu dài các trình t trc và sau hiu chnh
Bng 3.10. Kt qu so sánh trình t nrSSU đƣ hiu chnh vi các trình t trên
GenBank
B


iii

DANH MC HÌNH
Hình 1.1. Cordyceps sinensis
Hình 1.2.
Hình 1.3. Cu trúc ca rDNA
nrSSU
Hình 3.1. Kt qu Annhyb cp mi NS1/NS4 vi trình t gen nrSSU
Hình 3.2. Kt qu BLAST cp mi NS1/NS4 khuch đi vùng gen nrSSU
Hình 3.3. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Neighbor Joining
vi b d liu 62 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr bootstrap ca 1000

ln lp li)
Hình 3.4. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Maximum
Parsimony vi b d liu 62 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr
bootstrap ca 1000 ln lp li)
Hình 3.5. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Maximum
Likelihood vi b d liu 62 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr
bootstrap ca 1000 ln lp li)
Hình 3.6. Kt qu đin di sn phm cp mi NS1/NS4 tách chit theo phng pháp
Phenol:Chloroform
Hình 3.7. Kt qu đin di sn phm cp mi NS1/NS4 tách chit theo phng pháp
Phenol:Chloroform b sung -mercaptoethanol
Hình 3.8. Kt qu đin di sn phm cp mi NS1/NS4, có b sung
-mercaptoethanol, và ti u hóa nhit đ
Hình 3.9. Vùng tín hiu nhiu  đu hai mch ca SSU
iv

Hình 3.10. Hiu chnh vùng tín hiu b nhiu  mt mch ca SSU
Hình 3.11. Hiu chnh  vùng gia trên hai mch SSU
Hình 3.12. V trí sai lch ca hai kt qu gii trình t  đu mch xuôi ca nrSSU
Hình 3.13. Hình kt qu BLAST trình t nrSSU mch xuôi đƣ hiu chnh
Hình 3.14. Kim tra mc đ tng đng bng công c Dot Plot
Hình 3.15. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Neighbor Joining
vi b d liu 68 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr bootstrap ca 1000
ln lp li)
Hình 3.16. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Maximum
Parsimony vi b d liu 68 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr
bootstrap ca 1000 ln lp li)
Hình 3.17. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Maximum
Likelihood vi b d liu 68 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr
bootstrap ca 1000 ln lp li)

v

MC LC
T VN  ……………………………………………………………… 1
PHN I - TNG QUAN TÀI LIU
1.1. 3
1.1.1. 3
1.1.2. 5
1.2.
8
1.2.1. 8
1.2.2. 9
1.2.3. Nhóm gen gi nhà (house-keeping gene) trong đnh danh phân t
m 10
1.3. 13
1.4. 14
1.4.1.
14
1.4.2. Nhng b
14
1.5.
19
1.5.1. 19
1.5.2.  20
PHN 2 - VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CÚU
2.1. 21
2.2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 21
2.2.1.
21

2.2.2. D ậ ậ 21
2.2.3. 23
2.2.4. Tin trình nghiên cu 24
2.2.5. Hiu chnh trình t 27
2.2.6. 28
2.2.7.  28
2.2.8.
28
vi

2.2.9.
29
PHN 3 - KT QU VÀ THO LUN
3.1. KT QU ÁNH GIÁ MI 30
3.1.1. ánh giá mi trên IDT 30
3.1.2. Kt qu kim tra Annhyb cp mi NS1/NS4 trên trình t gen nrSSU31
3.1.3. ánh giá mi bng BLAST trên NCBI 31
3.2. C S D LIU CC B TRÌNH T nrSSU NHÓM NM KÝ SINH
CÔN TRÙNG 32
3.3.
nrSSU U N 42
3.4. KT QU HIU CHNH TRÌNH T 47
3.5. KT QU SO SÁNH VI C S D LIU GENBANK 53
3.6. KT QU XÂY DNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 54
PHN 4 - KT LUN VÀ  NGH
4.1. KT LUN 61
4.1.1. V lý thuyt 61
4.1.2. V thc nghim 61
4.2.  NGH 61
TÀI LIU THAM KHO………………………………………………… 62

Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 1

T VN 
ông trùng h tho (Cordyceps sinensis) lƠ mt loƠi nm ký sinh trên côn trùng,
t lơu đƣ đc s dng trong các bƠi thuc c truyn ca nhiu quc gia chơu Á bao
gm Vit Nam. Gn đơy, nhiu nghiên cu cho thy không ch Cordyceps sinensis mà
còn nhiu loƠi khác trong nhóm nm nƠy có tim nng ng dng trong y dc rt ln,
bao gm các chi nm Cordyceps, Isaria, Paecilomyces… Nhng nghiên cu v các
hot cht ca nhóm nm nƠy cho thy chúng có kh nng cha tr hiu qu nhiu bnh
khác nhau, đin hình nh kh nng điu hoƠ đáp ng min dch ca C. sinensis, C.
cicadae (Weng et al., 2002) hay c ch các t bào khi u ca C. sinensis, C. cicadae
(Weng et al., 2002), C. ophioglossoides
n nay, hn 400 loƠi Cordyceps đƣ đc phát hin và xp vào h
Clavicipitaceae, da trên cu trúc th sinh sn, bào t và qu th Tuy nhiên, hiu bit
v thành phn loài ca chi nm này còn rt hn ch bi nhiu nguyên nhơn trong đó
phi k đn lƠ các khó khn gp phi trong công tác phân loi, đnh danh. Vì vy, mc
dù các nhà nm hc đƣ mt nhiu nm nghiên cu, tuy nhiên nhng công b v thành
phn loài chi nm này vn cha tht s hp lý và còn nhiu mâu thun, đc bit khi
xem xét nhng bin đi di truyn nh hng bi nhng vùng đa lý khác nhau hay mi
liên h gia th vô tính (anamorph) và th hu tính (teleomorph) ca chúng. Nguyên
nhân dn đn nhng khó khn nƠy lƠ do kh nng bin đi rt cao ca các loài nm bi
nh hng ca điu kin môi trng. Trong nhng nm gn đơy, các nghi ng trên đƣ
đc gii quyt hiu qu nh s đóng góp tích cc ca sinh hc phân t. Vi hng
tip cn này, trình t nrSSU (nuclear ribosomal small subunit ậ tiu đn v nh ca
ribosome) thuc vùng bo tn 18S rRNA, đc s dng đ phân tích s phát sinh loài
và s đa dng di truyn ca sinh vt. Nghiên cu phát sinh loài gn đơy da trên nhiu

locus đc lp cung cp mt mc đ tin cy ln hn giúp xác đnh danh pháp các loài
nm kí sinh côn trùng.
 Vit Nam, hiu bit v thƠnh phn loƠi ca Cordyceps còn rt hn ch, các
nghiên cu vn cha đc quan tơm nhiu vƠ gn nh cha có mt b su tp hoƠn
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 2

chnh nƠo đc công b v chi nm nƠy trong nc. Bên cnh đó, nhiu sn phm t
Cordyceps đc bán trên th trng có ngun gc không rõ rƠng, ch yu đc nhp
t nc ngoƠi. Vi mt chi nm có nhiu ng dng rng rƣi trong y dc, vic su tp
vƠ phơn lp các ging thun, khai thác thông tin khoa hc v các loƠi nm nƠy lƠ mt
vic lƠm cn thit. Khi có đc nhng hiu bit đy đ v thƠnh phn loƠi, s to điu
kin cho vic khai thác vƠ nuôi trng ni đa ngun dc liu quý nƠy, góp phn lƠm
gim giá thƠnh, hn ch s nhp ngoi các sn phm Cordyceps không rõ ngun gc.
Hn na, vic có đc nhng thông tin khoa hc đy đ v các loƠi nm nƠy s lƠ c
s cho các nghiên cu ng dng Cordyceps  Vit Nam.
Trong gii hn đ tƠi, tôi tin hƠnh tip cn vùng gen nrSSU vƠ xơy dng c s
d liu vùng gen nrSSU, tip đn tin hƠnh thc nghim xơy dng quy trình tách chit
DNA t h si nm, ti u hóa quy trình PCR đ khuch đi vùng gen mc tiêu
nrSSU, gii trình t, xơy dng vƠ so sánh các cơy ph h phơn t t c s d liu trình
t thu thp đc.

1 PHN 1 ậ TNG QUAN TÀI LIU
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 3

1.1.

1.1.1.

Cordyceps là mt chi nm ký sinh trên côn trùng thuc h Clavicipitaceae, b
Hypocreales, lp Pyrenomycetes, ngành nm túi Ascomycota [20]. Chi Cordyceps
xut phát t ting Latin, “cord” = “chùy”, “ceps” = “đu” đƣ mô t đúng đc đim hình
dng trong t nhiên ca nm có hình ging nh gy đánh khúc quơn cu, đu có dng
hình chùy. im ni bt ca nm ký sinh côn trùng là nhng giá tr y dc đc đáo vƠ
quý him, sng ký sinh trên u trùng ca các loài sâu thuc chi Thitarodes (đc bit là
Thitarodes armoricanus; Thitarodes baimaensis) có tên gi thông thng lƠ “ông
Trùng H Tho” [20]. Ngi ta đƣ phát hin ra rt nhiu các hp cht có hot tính sinh
hc trong chi Cordyceps. Trc ht phi k đn Cordyceps sinensis (C. sinensis), là
loài nm đc coi nh có cha nhiu hot cht quan trng dùng trong y dc nht.
Các nghiên cu cho thy sinh khi ca loài nm nƠy có đn hn 20 tác dng cha bnh
khác nhau đi vi con ngi: (1) iu hòa đáp ng min đch (Kuo et al., 1996) [24],
(2) c ch s phát trin ca t bào khi u (Bok et al., 1999) [10], (3) Gia tng chc
nng gan (Manabe et al., 1996) [28], (4) Thúc đy vic tit ra các hormone tuyn
thng thn [44], Gim huyt áp và s cng c (Chiou et al., 2000) [13] vvv.
Ngày nay, vi s phát trin vt bc ca nn y hc, nhiu nghiên cu v nhóm
nm Cordyceps cho thy không ch riêng C. sinensis mi có các dc tính nh vy mà

còn nhiu loài Cordyceps spp. cng có kh nng ng dng ln trong y hc. Tiêu biu
nh Cordycepin có trong C. militaris có kh nng c ch quá trình tng hp RNA,
DNA vƠ ngn chn s tái bn ca virus [24]. Kh nng chng ung th ca
Paecilomyces tenuipes đi vi c th sng đƣ đc Ban và cng s phát hin nm
1998 [9]. Cng  loài nm này, Shim và cng s tìm thy kh nng gơy đc t bào
chng li các dòng t bƠo ung th [33].
Trong t nhiên, Cordyceps sinh sôi ny n tt trong các khu rng ôn đi và nhit
đi m 
u trùng và c trên cá th trng thành
ca nhiu loài côn trùng khác nhau. Sau khi xâm nhp vƠo c th côn trùng, bào t
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 4

nm s ny mm và phát trin thành h si nm. H si nm s xâm chim và thay th
các mô vt ch và s hình thành qu th khi gp điu kin thích hp [27]. Do vy, qu
th ca Cordyceps thng đc tìm thy trên xác nhng hoc u trùng ca côn trùng
sau mt thi gian nhim nm. Qu th nm có dng hình tr, có th phân nhánh hay có
hình dng phc tp. Chi nm này và mt vài các chi h hàng phân b nhiu  Châu Á,
đc bit lƠ vùng ông Á, ngoƠi ra còn có  Châu Úc và mt s n
c tìm thy  đ cao t 4000-
5000 m so vi mt nc bin trên các cao nguyên Himalaya, Tây Tng, T Xuyên,
Thanh H
c miêu t [37].

Hình 1.3. Cordyceps sinensis [51]
Gn đơy đa s các nm ký sinh  đng vt chơn đt ca b Hypocreales đu đc
xp vào chi Cordyceps thuc h Clavicipitaceae [35]. Phân loi này da trên các đc
đim: th túi dng tr, đnh túi dày và các bào t túi dng si thng có th ngt ri
thành nhiu bào t th cp [37]. Nghiên cu phát sinh loài gn đơy da trên nhiu

locus đc lp cung cp mt mc đ tin cy ln hn giúp xác đnh danh pháp các loài
nm kí sinh côn trùng [35][38]. Nm 2007, Sung vƠ cng s đƣ sp xp li h thng
nhóm nm Cordyceps và Clavicipitaceae, kt qu phân loi thành ba h đn ngƠnh:
Clavicipitaceae s.s. (Clavicipitaceae lp A), Cordycipitaceae (Clavicipitaceae lp B)
và Ophiocordycipitaceae (Clavicipitaceae lp C) [35][37][38].
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 5

- Vic phân loi phát sinh loài hin ti ca nm Hypocreleales [54] nh sau:
Clavicipitaceae s.s: Conoideocrella, Hypocrella, Metacordyceps,
Moelleriella,Orbiocrella,Regiocrella, Samuelsia, Shimizuomyces, Villosiclava,…
Ophiocordycipitaceae:Cordyceps s.s, Elaphocordyceps, Ophiocordyceps,…
Cordycipitaceae: Ascopolyporus, Cordyceps, Hyperdermium, Torrubiella.
Chi Cordyceps sensu lato (Clavicipitaceae, Hypocreales, Ascomycota) gn đơy
đƣ đc chia thành 3 h và 4 chi là: Metacordyceps (Clavicipitaceae),
Elaphocordyceps(Ophiocordycipitaceae),Ophiocordyceps(Ophiocordycipitaceae)
Cordyceps (Cordycipitaceae) [37].
1.1.2.

1.1.1.1. Các thành phn dinh dng chung ca Cordyceps – các thành phn hóa hc
Các phân tích hoá hc cho thy trong sinh khi ca Cordyceps sinensis có cha
nhiu thành phn dinh dng nh: các amino acid, vitamin E, K, B1, B2, B12, C…
Ngoài ra, chúng còn cha nhiu đng, bao gm c mono-, di-, oligosaccharide và
nhiu phc hp polysaccharide, protein, sterol, nucleoside, và các nguyên t
(K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V, và Zr).
1.1.1.2. Thành phn hot cht chính ca Cordyceps
- Cordycepin
Cordycepin có c
-deoxyadenosin, là m

Cordyceps militaris
C. kyushuensis C. sinensis và C. militaris
ôi c  nhiên và trong si n
u trùng ch [36].
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 6


Hình 1.4

- Polysaccharide
- ng hp cht có ngun gc t
đng ca Cordyceps bao gm d-mannitol (cordycepic acid), beta-glucan, beta-
mannan và mt s các polysaccharide phc tp kt hp nhiu loi phân t đng khác
nhau. Các polysaccharide có kh nng chng ung th nhng không tn công trc tip
mà gián tip bng vic kích hot các h thng min dch khác nhau [46]. Bên cnh đó,
chúng còn có kh nng gim lng đng trong máu [40], kháng oxy hóa, kháng viêm
cng nh tác đng điu hòa min dch [44].
- Sterol
Các sterol trong Cordyceps đc tìm thy gm: ergosterol, delta-3 ergosterol,
ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol, campesterol Ergosterol có trong h si
và là mt sterol u th trong nm. Các ergosterol và c
a nó có hot tính
kháng virus, điu hoà tim mch, điu tr bnh thn [50]. Dng glycosyl hoá ca
ergosterol peroxide có tác dng c ch s tng sinh các dòng t bƠo ung th K562,
Jurkat, WM-1341, HL-60 và RPMI-8226 [10].
- Protein, acid am

HƠm lng protein trong Cordyceps vào khong 29 ậ 33% bao gm 18 acid

amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin, Các acid amin có
hƠm lng axid amin cao nht là glutamat, arginin, acid aspartic vƠ có dc tính cao
nh
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 7

polyamine, các amino acid và mt s các dipeptide vòng ca Cordyceps cng có hot
tính chng ung th vƠ tim nng min dch. Nm Hypcrealean AP và vài loài trong chi
Cordyceps có kh nng sn xut ra các cht chuyn hóa th cp có hot tính sinh hc
làm ngun tim nng đ sn xut dc phm và thuc điu tr. Ví d: Cyclosporin A là
thuc ngn chn min dch vi thành phn dc cht là cyclosporin có tác dng kìm
hãm h min dch giúp ích trong cy ghép các b phn ca c th ngi. Cyclosporin
là mt sn phm chuyn hóa ca Cordycepin đc phân lp t nm Tolypocladium
inflatum [46]. Nm nƠy đc bit là dng sinh sn vô tính ca nm Elaphocordyceps
subsessilis (Cordyceps subsessilis) [19] [37].
1.1.1.3. ng dng trong y dc
- iu tr ung th
ng min dch tác dng h
tr tt cho bnh nhơn ung th [20]. Rt nhiu nghiên cu đƣ đc công b ch
 k đn mt vài nghiên cu nh: c ch
s phát trin ca t bào khi u [10][30], kh nng kháng ung th ca alkali-soluble
polysaccharide thu t C. phioglossoides [49], kh nng gơy đc t bƠo đ chng t bào
ung th ca Paecilomyces tenuipes [9][33]
- H thng min dch
ng đi n dch ca c th vƠ ngn nga b
y ra tn thng mô, ngn ch i ghép sau khi cy ghép
ni tng [42], đi
n dch bm sinh vƠ đáp ng mi [31].
1.1.1.4. ng dng kim soát côn trùng

Ngoài tim nng ng dng trong y dc, các loƠi Cordyceps còn đc ng dng
trong kim soát sinh hc. Do đc đim ký sinh trên côn trùng, Cordyceps tr thành
thiên đch ca các loài côn trùng gây hi. Vì vy nhiu loƠi đƣ đc s dng rng rãi
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 8

trong đu tranh sinh hc kim soát dch bnh, trong đó ph bin là các loài Beauveria
bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Theo McCoy (1990) [29], các
tiêu chí quan trng đ các loài nm côn trùng có th đc s dng làm thuc tr sâu
sinh hc bao gm kh nng gơy đc cho ký ch cao, có tác dng nhanh, có ph ký ch
rng, có tính n đnh trong nuôi cy và bo qun, d dàng lên men chìm, d kim soát
và phân tích s lng vƠ an toƠn cho con ngi [1]. Theo Taborsky (1992) [40], ng
dng đu tiên s dng Metarhizium anisopliae cho đu tranh sinh hc đc thc hin
vƠo nm 1888 bi Krassilstchik. Trên th trng hin có sn phm thuc tr sâu sinh
hc Green Muscle đc làm t nm Metarhizium anisopliae var. acridum giúp thay
th thuc tr sâu hóa hc đ kim soát châu chu  Châu Phi. Ti Vit Nam, nhiu
nghiên cu đƣ thƠnh công trong vic s dng nm ký sinh côn trùng phòng tr các loi
côn trùng và sâu hi cây trng, đin hình nh nm Metarhizium anisopliae và
Beauveria bassiana đƣ đc ng dng trong phòng tr mi nhà [2], sâu khoang hi ci
xanh [8], sâu hi đu tng vƠ đu xanh [5], ry mm và các loài sâu hi lúa [6][3].
1.2.

1.2.1.
danh
Trc đơy, vic đ
ng h thng hc các loài nm này ch yu
da trên phân tích hình thái gii phu. Các đc đim đ nhn bit h Clavicipitaceae
bao gm: th túi dng tr, đnh túi dày và các bào t túi dng si thng có th ngt
ri thành nhiu bào t th cp [37]. Nm 1982, Kobayashi trên c s x lý các thông

tin t vic phân tích 282 loài Cordyceps, 59 loài Torrubiella và 75 loài thuc v các
chi lân cn khác đƣ xơy dng nên khóa đnh lo

Cordyceps sensu lato
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 9

Cordyceps
militaris


Metarcordyceps youngmunensis
(Metarcordyceps taii

Ophiocordyceps sinensis
(Ophiocordyceps variabilis

c chi nm ký
sinh côn trùng có kh nng bin đi r
u kin môi tr
c đim l u tính (dng
qu th
ng si) c
i s phát tri a sinh hc phân t
nh chính xác hn các loƠi
c

1.2.2.

nh danh phân t
i sinh vt  mc đ phân t da trên
c s so sánh trình t nucleotide và axit amin ca các phân t DNA, RNA, protein.
Trong nghiên cu đnh danh phân t, vic la chn vùng trình t DNA, RNA, protein
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 10

đ kho sát gia các loài là mt bc quan trng, trình t này cn đm bo tính bo
tn cao trong cùng mt loƠi nhng bin đng ln gia các loƠi khác nhau. i vi đnh
danh mt s loài thì vùng gen gi nhà (house-keeping gen) đƣ đc s dng ph bin
trong nhiu nm g
n nay, đnh danh phân t đang tr thành ngành khoa
hc mi nhn trong phân loi hc, b sung trong phân loi hc truyn thng nhng
phng pháp nghiên cu m
h d

1.2.3. Nhóm gen gi nhà (house-keeping gene) trong đnh danh phân t
nm
-
nh danh
phân t n
- ng vùng trình
t bo t
i vi nhóm Cordyceps, vùng gen (SSU nrDNA, LSU nrDNA) đƣ đc s dng ph
bin đ nghiên cu phát sinh loài trong nhng nm gn đơy [17][32][34]. Tuy nhiên,
cơy phát sinh loƠi đc xây dng da trên d liu ca nhng vùng gen mã hóa rRNA
ca ribosome vn cha gii quyt đc mi quan h  cp đ chi vƠ loƠi. iu nƠy đƣ
khin các nhà phân loi hc tìm kim nhng gen thay th, đc bit là nhng gen mã
hóa protein đ nghiên cu ph h phân t. Nhng gen mƣ hóa protein nh: tef1-,

rpb1, rpb2, tub, atp6 đƣ đc chn trong d án AFTOL (Assembling the fungal tree of
life) và trong nhiu nghiên cu ph h da trên nhiu locus (multi-locus) g

Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 11

[41]. Trong nghiên cu này, chúng tôi s dng các gen thuc nhóm house-keeping
genes, trong đó bao gm gen nrSSU (nuclear ribosomal small subunit ậ tiu đn v nh
ca ribosome), nrLSU (nuclear ribosomal large subunit ậ tiu đn v ln ribosome) và
nhiu gen khác nh tef1 (elongation factor 1 ậ nhân t kéo dƠi 1), rpb1 (largest
subunit of RNA polymerase II ậ tiu đn v ln nht ca RNA polymerase II), rpb2
(second largest subunit of RNA polymerase II ậ tiu đn v ln th hai ca RNA
polymerase II), tub ( tubulin) vƠ atp6 (mitochondrial atp

1.2.3.1.

i vi nhóm Cordyceps vùng gene mã hoá cho RNA ribosome (DNA ribosome,
rDNA) đƣ đc s dng ph bin đ nghiên cu trong nhiu nm gn đây. rDNA
(ribosomal DNA) là nhóm gene mã hóa rRNA ca ribosome, có nhiu bn sao và
không mã hóa cho bt k protein nƠo. ơy lƠ vùng gen bo tn nên đc xem lƠ c s
chính xác đ tìm ra s tng đng và các khác bit ca các sinh vt cùng loài hay khác
loƠi, đóng vai trò quan trng trong các nghiên cu quá trình tin hóa, phát sinh loài,
phân loi nm vƠ xác đnh tính đa dng di truyn ca sinh vt cng nh các dòng nm
do vic phân loi nm da vƠo đc đim hình thái, đc đim sinh hóa có kt qu phân
loi thng không chính xác và cn khong thi gian dài [17].
Ribosome là bào quan nh có trong tt c các t bào ca sinh vt nhơn s vƠ sinh
vt nhân chun. Chúng đm nhim chc nng thc hin quá trình sinh tng hp
protein ca t bào. RNA ribosome là mt trong hai thành phn chính ca ribosome.
Tiu phn nh ca ribosome cha 18S RNA, tiu phn ln cha 28S, 5.85S và 5S.

RNA ribosome đc phiên mã t DNA ribosome. DNA ribosome bao gm nhiu đn
v lp li, mi đn v lp li bao gm vùng ITS (internal transcribed spacer), vùng 18S,
5.8S, 25-28S, 5S RNA và vùng IGS (intergenic spacer) (Hình 1.2.). Vùng IGS bao
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 12

gm phn ETS (external transcribed spacer) và phn không phiên mã NTS (non-
transcribed spacer).

Hình 1.3. Cu trúc ca rDNA [53]
rDNA 18S thng đc quan tâm nghiên cu, rDNA 5,8S có kích thc rt nh
và ít có s bin đi song rRNA 5S là thành phn không th thiu ca nu - LSU-
rRNA, có vai trò n đnh cu trúc ribosome vƠ thúc đy quá trình tng
hp protein [39], rDNA 25S mc dù ít có s bin đi song li rt có ý ngha trong
phân loi [17].
1.2.3.2.

nrSSU [56]
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 13

Gen nrSSU đóng vai trò quan trng trong vic mƣ hóa vùng 18S rRNA (đn v
hình thành tiu phn nh c

nrSSU
 nrSSU là vùng trình t có tính bo tn cao
nhng trong trình t vn có các vùng bin đng nh cho phép các nhà khoa hc so
sánh trình t ca các loƠi khác nhau [55].  thu nhn trình t cn phân tích, vùng

nrSSU có th đc đc trình t bng mt cp mi ph quát (universal primer). Các cp
mi này đc thit k da trên các trình t nucleotide bo t
[47].
1.3.

 Vit Nam, các nghiên cu v thành phn loài vn cha đc quan tâm. Do
vy, cho đn nay cha có mt công b đy đ nào v các loài nm ký sinh côn trùng.
S thiu thông tin v thành phn loài làm cho kh nng khai thác các loƠi nm trong
nc ng dng trong nghiên cu, xây dng quy trình nuôi trng nm và sn xut dc
liu gp nhiu tr ngi.
Ti Vit Nam, nhng nghiên cu v thành phn loài nm ông trùng h tho
đc công b vào nhng nm 1996 vƠ 2001 có ba loƠi nm thuc chi Cordyceps, đó lƠ
Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris và Cordyceps sabrolifera và hai loài mi
đc phát hin cho khu h nm Vit Nam đó lƠ Cordyceps nutans và Cordyceps
gunnii [4][7].
Vin Khoa hc Lâm nghip Vit Nam đƣ tin hành thu mu ông trùng h tho
ti mt s Vn quc gia và Khu bo t
ng s 24 loài nm
ông trùng h tho đc giám đnh. Các loài nm ông trùng h tho nƠy đu thuc
h Clavicipitaceae, b Hypocriales, lp Sordariomycetes, ngành ph n
n gen các loài nm nƠy đang đc lu tr ti Trung tâm
Nghiên cu bo v rng, Vin Khoa hc Lâm nghip Vit Nam. Trên c s ngun gen
thu thp đc vƠ su tp t Trung Quc và Nht Bn, Trung tâm Nghiên cu bo v
rng, Vin Khoa hc Lâm nghip Vit Nam đƣ nghiên cu nuôi trng qu th nm
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 14

đông trùng h tho trên giá th nhân to. Mt s loƠi đƣ có quy trình công ngh sn
sàng chuyn giao cho các c s sn xut nm nh: quy trình nuôi trng nm Nhng

trùng tho (Cordyceps militaris), ông trùng h tho bông tuyt (Isaria tenuipes) và
ông trùng h tho b xít (Cordyceps nutans) [4].
Nm 2009, ln đu tiên  Vit Nam, ái Duy Ban cùng các nhƠ khoa hc uy tín
đƣ tìm ra vƠ nhơn nuôi thƠnh công ông Trùng H Tho vi công trình “Nghiên cu
phát hin mi loƠi đông trùng h tho Isaria cerambycidae  Vit Nam vƠ xác đnh
mt s hot cht sinh hc trong đông trùng h tho”.
1.4.

1.4.1.

Ph h phân t là nghiên cu v mi quan h tin hóa ca tp hp các trình t
gen, d

Dng cây ph h phân t là mt quá trình phc tp bi thc t không th xây
dng mt cơy đúng nht. Tp hp d liu phát sinh loài có th bao gm hƠng trm loƠi
khác nhau, mt trong s đó có th đƣ thay đi t l đt bin dn đn nh hng tin
hóa. Do đó, có rt nhiu mô hình tin hóa khác nhau vƠ các phng pháp phơn tích
phát sinh chng loài, dò tìm cây tin hóa ti thích cho mt phân tích phát sinh loài
[15].
1.4.2. Nhng b
1.4.2.1. Chn l

Bc đu tiên là cn xác đnh protein hay trình t DNA s là d liu đc ch
trình t quan tâm có th ly t trang NCBI hay các công c tìm kim tng đng khác,
đ to ra mt c s d liu cuc b [15].
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 15

1.4.2.2. c và hiu chnh trình t

Do các phân tích phát sinh chng loài da trên nhng s khác bit khi quan sát
các trình t đc so sánh thng hƠng. Do đó li trình t s có th đa đn mt cây tin
hóa không tht chính xác. c bit vi trng hp vùng DNA có đ bo tn cao và
nhà phân tích chn mô hình tin hóa phc tp thì li trình t s cho ra kt qu có đ sai
khác rt ln.  tránh trng hp li trình t do ch quan, ngi ta buc phi đc
trình t c hai si đ vic hiu chnh sau đó đc đm bo tính khách quan hn.
1.4.2.3.

Vic sp c
c hin bng máy tính mt cách t đ
i nhng gen hay vùng
DNA kém bo tn thì quá trình sp xp thng hàng t đng rt d gây ra li. Do đó vi
gene hay vùng DNA có đ bin thiên cao cn đc trc tip thc hin quá trình sp
xp thng hàng bng mt. Vi nhng vùng không có kh nng sp xp thng hàng thì
cn ph  trc khi đa vƠo phơn tích.
1.4.2.4. Chn la mô hình tin hóa
i d liu phi tri qua quá trình kim tra dò tìm mô hình tin
hóa thích hp.
Trong mô hình tin hóa đn gin nht, tc đ bin đi cng đc gi đnh là
bng nhau cho mi dng đt bin đim. Khi đó s lng các dng bin đi trong mô
hình tin hóa nƠy đc thit lp là 1.
Mô hình tin hóa phc tp nht hin nay là mô hình có kh nng hi bin tng
quát theo thi gian (General time reverible model). Mô hình này cho rng có 6 kiu
bin đ
i kiu bin đi có mt tc đ khác nhau.
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 16

Mt vài mô hình tin hóa ngu nhiên ph bin gm Jukes-Cantor, Kimura 2-

parameter (K2P), Tamura 3-parameter, Hasegawa-Kishino-Yano (HKY), Tamura Nei,
General Time Reversible (GTR)…
Mt s chng trình phn mm, nh PAUP *, s t đng s dng mt mô hình
mc đ

1.4.2.5.
VƠi phng pháp nhm suy lun cây phát sinh ch c bit khá rõ
hin nay đu là nhng phng pháp kt hp thu
i thích và mt
nhóm tiêu chun ti u chn trc. Tin trình thc hin ca nó là dò tìm nhng cây
tin hóa ti thích, sau đó nhng cây tin hóa nƠy đc đánh giá di nhng tiêu chun
ti u chn trc đ cho ra mt cây tin hóa tt nht.
-

Trong thc nghim ng n hai phng pháp dò tìm cơy tin hóa
đó lƠ phng pháp branch-and-bound vƠ phng pháp heuristics.
Trong phng pháp branch-and-bound, mt cơy đc coi là tt nht s đc la
chn, sau đó cơy nƠy đc đánh giá cho đim theo các tiêu chun đƣ chn trc. Cây
này s đc gi trong b nh vƠ đim ca cơy nƠy đc xem lƠ “đim chun”. im
các cơy khác đc so sánh, nu di đim chun s b b qua, nu cao hn đim chun
thì s tr thành cây tt nht mi vi đim chun mi. Tin trình c th tip tc cho đn
ht. Thut toán này cho phép dò tìm cây tin hóa tt nht nhng li tiêu tn nhiu thi
gian.
Phng pháp heuristics mc dù không cho kt qu chính xác cao nh phng
pháp trên nhng vn thng đ

t phng pháp na lƠ phng pháp phơn rƣ hình ngôi sao.
Phng pháp nƠy có nguyên lý lƠ đu tiên mt hình cây d
chnh đc to thành, k đn mt taxa liên h gn nht đc đa vƠo sao cho nó phi
Khóa lun tt nghip

SVTH: Trng Th Bch Vân 17

tìm đc v trí tt nht. Tin trình thc hin nhiu ln cho đn khi cây tin hóa hình
thành.
- Tiêu

t l t nht v lch s tin hóa da
vào nhng thông tin cha hoƠn chnh ca d liu. Phng pháp s dng tiêu chun ti
u có 2 bc theo th t: u tiên lƠ xác đnh m c nng tính đim
cơy. Bc hai là tìm mt cây thay th ng vi mt tiêu chu
cây. Quá trình tt s cho ra nhiu gii pháp thay th ti u.
a phng
pháp maximum parsimony là tìm kim mt cây sao cho s lng thay đi tin hóa là
thp nht đ gii thích nhng s khác nhau đc nhìn th
 chn cây có tng chiu dài nh
nht.

ng cách chính là khong cách tin hóa gia các cp đi tng
đang đc so sánh. V nguyên tc, phng pháp khong cách c tìm ra mt cây thích
hp da vào ma trn khong cách gen ca các cp trình t. Khi tt c các khong cách
gia các cp trình t
c tính toán và thit l  đó đa hình hc mt ca
cơy đc xây dng nh vƠo các phng pháp khác nhau. Phng pháp kho
a vƠo đ 
dng mô hình đt bin. Tuy nhiên, t ng cách không chng