phân lập và chọn môi trường nhân sinh khỏi 3 loại nấm ký sinh côn trùng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TNTN
BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG
________________













ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG



PHÂN LẬP VÀ CHỌN MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH
KHỐI BA LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG
Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok,
Beauveria bassiana (Bals.) Vuill VÀ
Paecilomyces spp. TRÊN NHÓM

RAU ĂN LÁ Ở ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG









Chủ nhiệm đề tài: LÊ HỮU PHƯỚC
Long Xuyên, tháng 8 năm 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TNTN
BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG
________________

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG



PHÂN LẬP VÀ CHỌN MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH
KHỐI BA LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG
Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok (Ma),
Beauveria bassiana (Bals.) Vuill (Bb) VÀ
Paecilomyces spp. (Pae) TRÊN NHÓM
RAU ĂN LÁ Ở ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG







Chủ nhiệm đề tài: Thành viên tham gia:
Lê Hữu Phước Võ Thị Hướng Dương
Lê Hòa Lợi


LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn

PGS. Trần Văn Hai và Ks. Trịnh Thị Lan – Khoa Nông Nghiệp – Đại hoc Cần Thơ đã
hướng dẫn và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cô Võ Thị Hướng Dương – Khoa Nông Nghiệp và TNTN – Đại học AN Giang đã sát
cánh cùng tôi trong suốt quá trình làm đề tài này.
Cô Nguyễn Thị Diệu Hương, Phòng Thí Nghiệp NEDO – Bộ môn BVTV (hợp tác với
Chính Phủ Nhật Bản) đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện đề tài này.
Cùng các bạn sinh viên Nông học, Trồng trọt, Bảo vệ thực vật Khóa 31 đã giúp đở tôi
ghi nhận, đo đếm các chỉ tiêu.




i



TÓM LƯỢC

Nhằm mục đích thu thập, phân lập và định danh 3 loài nấm ký sinh côn trùng
Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. ở một số tỉnh
Đồng bằng sông Cửu Long để nghiên cứu chọn ra dòng nấm tốt phục vụ cho việc
nghiên cứu chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh, đề tài: “Phân lập và chọn môi trường nhân
sinh khối ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok,
Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp. trên nhóm rau ăn lá ở Đồng
bằng sông Cửu Long” được thực hiện.
Kết quả đã thu thập được tổng cộng 288 dòng nấm từ 6 tỉnh An Giang, Tiền
Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Sóc Trăng, và Hậu Giang, bao gồm 3 loài nấm ký sinh
côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. Trong

đó, quá trình phân lập, tách ròng và định danh (trong môi trường PDA) đã thu được 51
dòng.
Thí nghiệm trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm được bố trí theo
thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design) và 5 lần lặp lại và 52
nghiệm thức (51 dòng nấm và 1 đối chứng), đã chọn ra 10 dòng nấm có hiệu quả tốt
nhất M
2
-AG, M
5
-AG, M
1
-CT, M
3
-VL, M
1
-ST, B
2
-AG, B
2
-TG, B
1
–VL, P
2
-AG và P
3
-
TG. Môi trường SDAY3 là môi trường cho mật số bào tử (bào tử.ml
-1
) cao nhất trong
4 loại môi trường lỏng (không chứa agar) CDA, CAM, SDAY

1
và SDAY
3
. Chín ngày
sau khi lắc (NSKL) là thời điểm tối ưu đối với nấm Metarhizium anisoplia. Trong khi
đó, sáu đến chín NSKL, mật số bào tử được tạo ra cao nhất đối với nấm Beauveria
bassiana và 6 NSKL đối với nấm Paecilomyces spp.



ii


MỤC LỤC
Trang
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU ............................................................................................1
A. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.....................................................2
I. MỤC TIÊU ...........................................................................................................2
II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................................2
B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU.....................................................2
I. ĐỐI TƯỢNG........................................................................................................2
II. PHẠM VI NGHIÊN CỨU..................................................................................2
C. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................2
I. CƠ SỞ LÝ LUẬN.................................................................................................2
1. Phân loại................................................................................................................2
2. Sự phân bố.............................................................................................................3
3. Đặc điểm hình thái, sinh học và khả năng gây hại..................................................4
3.1. Metarhizium anisopliae.................................................................................4
3.2. Beauveria bassiana .......................................................................................4
3.3. Paecilomyces spp..........................................................................................5

4. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa....................................................................................6
4.1. Metarhizium anisopliae.................................................................................6
4.2. Beauveria bassiana .......................................................................................6
4.3. Paecilomyces spp..........................................................................................6
5. Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng và các sản phẩm trao đổi chất.........................7
5.1. Metarhizium anisopliae.................................................................................7
5.2. Beauveria bassiana .......................................................................................7
5.3. Paecilomyces spp..........................................................................................8
6. Cơ chế tác động của nấm lên côn trùng..................................................................8
6.1. Metarhizium anisopliae.................................................................................8
6.2. Beauveria bassiana .......................................................................................8
6.3 Paecilomyces spp...........................................................................................8
7. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của bào tử nấm...............9
7.1. Metarhizium anisopliae.................................................................................9
7.2. Beauveria bassiana .......................................................................................9
7.3. Paecilomyces spp..........................................................................................9
8. Ảnh hưởng của một số môi trường nhân sinh khối lên các loài nấm ký sinh
côn trùng....................................................................................................................9
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................11
1. Phương tiện thí nghiệm........................................................................................11
2. Phương pháp thí nghiệm......................................................................................11
2.1. Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn
trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.)
Sorok và Paecilomyces spp. ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh
Long, Hậu Giang và Tiền Giang..............................................................................11
2.2. Phân lập, tách ròng, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong
môi trường PDA (Potato Destrose Agar)..................................................................12
2.3. Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn
tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm.......................................................................13
2.4. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành

và phát triển bào tử của các loại nấm xanh Metarhizium anisopliae (Ma), nấm
iii


trắng Beauveria bassiana (Bb), nấm tím Paecilomyces spp. (Pae) trong môi
trường lỏng..............................................................................................................14
2.4.1. Nguồn nấm............................................................................................14
2.4.2. Bố trí thí nghiệm....................................................................................14
2. 4.3. Chỉ tiêu đánh giá...................................................................................16
2.4.4. Thống kê: Tổng hợp số liệu và phân tích thống kê bằng phần mềm
MSTATC.................................................................................................................16
CHƯƠNG II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................17
I. Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn
trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.)
Sorok và Paecilomyces spp. ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh
Long, Hậu Giang và Tiền Giang...............................................................................17
II. Phân lập, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA
(Potato Destrose Agar).............................................................................................18
III. Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn
tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm.......................................................................20
IV. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành và
phát triển bào tử của các dòng nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria
bassiana và nấm Paecilomyces spp. trong 4 môi trường dinh dưỡng (môi trường
lỏng)........................................................................................................................23
1. Khả năng sinh bào tử của nấm Metarhizium anisopliae M
2
-AG trên 4 loại
môi trường dinh dưỡng............................................................................................23
2. Khả năng sinh bào tử của nấm Metarhizium anisopliae M
5

-AG trên 4 loại
môi trường dinh dưỡng............................................................................................24
3. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M
1
- CT trên 4
loại môi trường dinh dưỡng......................................................................................25
4. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4
loại môi trường dinh dưỡng......................................................................................26
5. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M
1
-ST trên 4
loại môi trường dinh dưỡng......................................................................................26
6. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B
2
-AG trên 4 loại
môi trường dinh dưỡng............................................................................................27
7. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B
2
-TG trên 4 loại
môi trường dinh dưỡng............................................................................................28
8. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B
1
–VL trên 4 loại
môi trường dinh dưỡng............................................................................................29
9. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae
2
- AG trên 4 loại
môi trường dinh dưỡng............................................................................................30
10. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae
3

- TG trên 4 loại
môi trường dinh dưỡng............................................................................................30
CHƯƠNG III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................34
I. Kết luận................................................................................................................34
II. Kiến nghị ............................................................................................................34

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƯƠNG
iv


DANH SÁCH BẢNG

Bảng Tựa Bảng Trang
1 Thành phần các nguyên vật liệu dùng để nuôi sâu ăn tạp 13
2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 15
3 Tỷ lệ khoáng chất của các loại môi trường lỏng 16
4
Số mẫu sâu hại bị nhiễm nấm ký sinh thu thập được ở một số tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long, tháng 8-9 năm 2008.
17
5
Danh sách các dòng nấm phân lập được trong môi trường PDA tại
phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ, tháng 9-
11 năm 2008.
18
6
Hiệu lực (%) của các dòng nấm đối với sâu ăn tạp trong điều kiện
phòng thí nghiệm, bộ môn BVTV, ĐHCT, tháng 12 năm 2008.
21

7
Danh sách mười dòng nấm có hiệu quả cao được chọn qua thí nghiệm
trong phòng, được trữ đông để tiếp tục các thí nghiệm sau.
23
8
Số lượng bào tử của nấm M
2
-AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày
sau khi lắc.
23
9
Số lượng bào tử của nấm M
5
-AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày
sau khi lắc.
24
10
Số lượng bào tử của nấm M
1
-CT ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày
sau khi lắc.
25
11
Số lượng bào tử của nấm M3-VL ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày
sau khi lắc.
26
12
Số lượng bào tử của nấm M
1
-ST ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày

sau khi lắc.
26
13
Số lượng bào tử của nấm B
2
-AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày
sau khi lắc.
27
14
Số lượng bào tử của nấm B
2
-TG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày
sau khi lắc.
28
15
Số lượng bào tử của nấm B
1
–VL ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày
sau khi lắc.
29
16
Số lượng bào tử của nấm Pae
2
- AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14
ngày sau khi lắc.
30
17
Số lượng bào tử của nấm Pae
3
- TG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày

sau khi lắc.
30

v


DANH SÁCH HÌNH

Hình Tựa Hình Trang
1 Nuôi cấy nấm theo phương pháp Slide Culture 12
2 Thu thập nấm Metarhizium anisopliae 32
3
Thu thập nấm Beauveria bassiana
32
4
Thu Thập nấm Paecilomyces spp.
32
5
Màu sắc tơ nấm trong môi trường nhân tạo PDA
33
6
Thực hiện tiêu bản, đếm mật số bào tử nấm trong phòng thí nghiệm
33
7
Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm trong phòng thí nghiệm
33
8
Nấm sau khi lắc trong các môi trường dinh dưỡng
33

1


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

Phòng trừ sâu hại là một trong những khó khăn lớn nhất trong nghề trồng rau
và là mối quan tâm lo lắng hàng đầu của nông dân. Biện pháp phòng trừ của nông dân
chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học là chính mà rất ít biết đến các biện pháp
khác. Nông dân đã sử dụng tới hơn 30 loại thuốc trừ sâu trên rau, trong đó có nhiều
loại đã bị cấm sử dụng (Nguyễn Quí Hùng và ctv.,1999). Sâu ăn tạp (Spodoptera
litura Fabricius), sâu ăn đọt cải (Hellula undalis Fabricius và Crocidolomia binotalis
Zeller), sâu tơ (Plutela xylostella), rầy phấn trắng (Bemiscia tabaci), sâu xanh da láng
(Spodoptera exigua) và bọ nhảy (Phyllostreta striolata) là những đối tượng gây hại
quan trọng và phổ biến nhất trên nhóm rau ăn lá tại Đồng bằng sông Cửu Long (Trần
Thị Ba, 1999). Sự phát triển tính kháng thuốc của sâu hại cũng như ảnh hưởng của
thuốc hóa học lên sức khỏe con người và môi trường đã tạo áp lực mạnh cho sự phát
triển của các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại.
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như
Úc, Brazil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký
sinh côn trùng trong phòng trừ tổng hợp các loài sâu gây hại một cách hợp lý đã mang
lại hiệu quả khá cao (Burges H. D., 1998; Butt T. M and Copping L., 2000). Ở Châu
Á, tại Malaysia, đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ mối đất đạt
hiệu quả 64,57% sau 14 ngày. Tại Philippines, đã nghiên cứu sử dụng nấm
Metarhizium anisopliae để diệt rầy nâu hại lúa, hiệu lực đạt 60% sau 10 ngày. Tại Úc,
năm 1991 Milner đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ hung
hại mía đạt hiệu quả 68%. Tại Nhật Bản, năm 1988 một số nhà khoa học đã sử dụng
nấm Beauveria bassiana để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên 70% sau 10
ngày. Tại Trung Quốc, Am và Wu đã sử dụng dòng nấm Paecilomyces spp. và
Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông qua đông đạt hiệu quả cao.

Ở trong nước, đã có một số nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật phân lập
được các dòng nấm ký sinh trên rầy nâu hại lúa, châu chấu hại bắp, sâu đo xanh hại
đay, bọ hại dừa, sùng đất hại đậu phộng và sử dụng đạt được hiệu quả rất cao. Viện
Lúa Đồng bằng sông Cửu Long cũng sử dụng các dòng nấm trên rầy nâu đạt hiệu quả
rất tốt, hơn 67% sau 10 ngày.
Tuy nhiên, việc sử dụng các dòng nấm này trong quá trình quản lý và phòng
trừ tổng hợp còn hạn chế do các dòng nấm giảm dần độc tính qua một thời gian sử
dụng. Ngoài ra, việc thu thập, phân lập và thử nghiệm các dòng nấm có khả năng diệt
sâu cao là yêu cầu thường xuyên và cấp thiết. Từ đó, đưa đến yêu cầu cần phải tiến
hành nghiên cứu bổ sung thêm các chất khoáng dinh dưỡng để tăng cường khả năng
tạo mật số bào tử trên môi trường giống cấp 1 (nấm nguồn) là việc làm rất quan trọng,
tiến tới nghiên cứu môi trường sản xuất chế phẩm sinh học có chất lượng tốt phục vụ
cho việc thử nghiệm và đưa ra ứng dụng đạt hiệu quả cao hơn. Đề tài: “Phân lập và
chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium
anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp.
trên nhóm rau ăn lá ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện đáp ứng các yêu
cầu trên.
2


A. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
I. MỤC TIÊU
1. Phân lập được ba loài nấm ký sinh chuyên biệt từ 6 tỉnh Đồng bằng sông
Cửu Long và bước đầu chọn ra những dòng nấm có hiệu quả trong phòng thí nghiệm
qua thử nghiệm hiệu quả đối với sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fab.).
2. Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp để nhân nhanh sinh khối 3
loại nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và
Paecilomyces spp., làm cơ sở cho việc nghiên cứu, sản xuất chế phẩm phòng trừ sâu
hại.
II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1. Thu thập các loài nấm ký sinh côn trùng trên các loài rau ăn lá như sâu ăn
tạp, sâu ăn đọt cải, sâu xanh da láng, sâu tơ, bọ nhảy, rầy mềm,… tại những vùng sản
xuất rau có diện tích tương đối lớn. Phân lập và tách ròng các dòng nấm này trên đĩa
pêtri (invitro) trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar).
2. Khảo sát hiệu lực của các dòng nấm đã phân lập được đối với sâu ăn tạp
(Spodoptera litura) trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3. Khảo sát ảnh hưởng của bốn loại môi trường dinh dưỡng CDA, CAM,
SDAY
1
, SDAY
3
lên sự hình thành và phát triển bào tử của 3 loài nấm Metarhizium
anisopliae, Beauveria bassiana, và Paecilomyces spp.
B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
I. ĐỐI TƯỢNG
Phân lập, định danh và ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng CAM,
CDA, SDAY
1
và SDAY
3
đối với 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium
anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. được thu thập và phân lập ở 6
tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long trong điều kiện invitro.
II. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Phân lập các dòng nấm nấm ký sinh côn trùng trên rau thu thập từ 6 tỉnh
Đồng bằng sông Cửu Long: An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, Tiền Giang
và Sóc Trăng.
Bố trí thí nghiệm về hiệu quả của các dòng nấm đã phân lập được đối với sâu
ăn tạp trong phòng thí nghiệm và ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng lên
sự hình thành và phát triển của bào tử các dòng nấm này.

C. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. CƠ SỞ LÝ LUẬN
1. Phân loại
Theo hệ thống phân loại nấm của Ainsworth, G. C. (1996), ba loài nấm ký
sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. đã
được phân loại như sau:
Nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn
Deuteromycetes, giống. Một số tác giả khác lại cho rằng nấm Metarhizium anisopliae
thuộc ngành phụ lớp nấm túi Asscomycotia, lớp Pletomyces và giống Metarhizium.
Tuy nhiên, phân loại theo Ainsworth được nhiều tác giả chấp nhận hơn cả.
3


Nấm Beauveria bassiana thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn
Deuteromycetes, giống Beauveria. Theo Macleod, H. L (1954), loài Beauveria
bassiana là loài điển hình trong chi nấm bạch cương Beauveria
Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và
phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus,
Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus,
Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K.
Arora, P. D. Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004).
2. Sự phân bố
Nấm Metarhizium anisopliae được tìm thấy trên khắp các châu lục với hơn
200 loài côn trùng khác nhau như rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen và rất nhiều loài sâu hại
khác. Sau khi xâm nhiễm, chúng hình thành trên bề mặt côn trùng một lớp phấn màu
xanh vàng đến màu xanh đậm, trên mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng (Ferron L. K,
1978).
Nấm Metarhizium anisopliae là nấm hại côn trùng, xuất hiện phổ biến trong
tự nhiên, có thể phân lập từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất. Ở
những nơi không có côn trùng, người ta cũng phân lập được Metarhizium anisopliae

ngay cả trong điều kiện thời tiết rất khắc nghiệt (như ở Đức), trên những khu đất ở
rừng sâu khi bị đốt cháy, cả trong những chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm) hoặc
trong trầm tích ở sông chứa đất đầm lầy trồng những loại cây đước, hoặc trong tổ của
một số loài chim và cả trong rễ của cây dâu tây cũng có thể phân lập được nấm
Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004).
Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, được tìm thấy
trên và trong đất cũng như ký sinh trên rất nhiều loài côn trùng hại bông, khoai tây,
lúa mì, đậu và ngô ở Mỹ (Alaoui Abdelaziz và Elmeziane Abdellatif, 2008). Nấm
Beauveria bassiana (hay còn gọi là nấm bạch cương) là loại nấm hại côn trùng phân
bố trên khắp thế giới, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập dễ dàng từ
xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất (James R. Fuxa và Yoshinori
Tanada. 1993.).
Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng,
cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ dàng
tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật.
Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số loài
quan trọng trong phòng trừ sinh học như:
- Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng
- Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất
- Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng.
- Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở côn trùng chết, rừng
cao su (Crop Protection Compennium, 2002).
4


3. Đặc điểm hình thái, sinh học và khả năng gây hại
3.1. Metarhizium anisopliae
Nấm Metarhizium anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang,
đường kính 3 – 4 µm (Trần Thị Thanh, 2004). Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn
trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi

nấm dày đặc. Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám
đến ôliu - lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể
thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh
lục. Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 - 4 µm, dài
khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ
(Phạm Thị Thùy, 2004).
Nấm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn
lạc có màu xanh, thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế. Loài Metarhizium
anisopliae có 2 dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium anisopliae var
có kích thước bào tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 µm, dạng bào tử lớn là Metarhizium
anisopliae var. major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0 µm .
Để phân biệt 2 loài trên, Tsai. K. và ctv., (2006) đã nghiên cứu đặc tính huyết
thanh khác nhau của 2 loài này và xác định rằng loài Metarhizium anisopliae là chủng
gây bệnh mạnh nhất trên côn trùng thuộc bộ cánh cứng Coleoptera. Nhiều nhà khoa
học đã nghiên cứu và tìm thấy có khoảng 204 loài côn trùng thuộc họ Elaridae và
Curculionidae dễ bị nhiễm bệnh bởi nấm Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy,
2004).
Nấm Metarhizium anisopliae là loài nấm ký sinh rất rộng trên các đối tượng
gây hại nông lâm nghiệp trên khắp thế giới như bộ cánh cứng, cánh đều, cánh nửa
cứng, cánh vẩy,… Cho đến nay các nhà khoa học trên thế giới vẫn chưa xác định được
một loại vi nấm nào có hiệu lực cao và phổ tác dụng rộng rãi như chủng M.
anisopliae. Tại Úc năm 1995, Richard Miller đã tách được vài trăm dòng nấm
Metarhizium anisopliae từ một nhóm côn trùng sống trong đất dưới gốc mía. Trong số
95 chủng thử nghiệm trực tiếp, tác giả chỉ chọn được hai chủng có khả năng diệt sâu là
Lepidota frenchi và L. consobrina hại rễ mía và một chủng diệt sâu Antitrogus
parvulus với LD
50
là 1 - 5 x 10
4
bào tử.g

-1
. Henel đã chọn từ 22 chủng vi nấm, chỉ có 1
chủng Metarhizium anisopliae là phù hợp cho phương pháp phòng trừ sinh học đối
với loài mối Masutiesrmes exitiosus (Hill K. L, 1999, trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy,
2004).
Nhiều loài nấm trong chi Metarhizium có khả năng diệt côn trùng thuộc họ
Elalerdae và Curculionidae thuộc bộ cánh cứng Coleoptera, ấu trùng muỗi Aedes
aegypti, Anopheles setphensi, Clexpipiens thuộc bộ hai cánh Diptera, bọ xít đen hại
lúa mì Scotiphora coarctata thuộc bộ cánh nửa cứng Hemiptera, châu chấu sống lưng
vàng Patanga sucincta, châu chấu mía Heiroglyphus tonkinensis thuộc bộ cánh thẳng
Orthopterra, mối hại đất Masutitermes extiosus thuộc bộ cánh bằng Isoptera.
3.2. Beauveria bassiana
Nấm có sợi từ màu trắng đến màu kem có pha một ít màu đỏ, da cam, đôi khi
pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu
xanh da trời. Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn ngang, có chiều dài khoảng 3 - 5µm
phát triển dày đặc trên môi trường, về sau xuất hiện chi chít các cuống sinh bào tử.
5


Đặc điểm của loại nấm này là có sợi xốp, cuống bào tử trần đứng riêng rẽ
hay tụ lại thành từng đám, không phân nhánh hoặc phân nhánh, hình ống hoặc hình
bình với chiều dài không đều nhau. Trên cuống có những nhánh nhỏ mang bào tử trần
(Phạm Thị Thùy, 2004).
Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử trần đơn bào (chỉ gồm một tế
bào) không màu, trong suốt, không vách ngăn từ hình cầu (đường kính 1 – 4 µm) đến
hình trứng (kích thước 1,5 - 5,5 µm). Bào tử trần mọc trong vòng xoắn, phát sinh từ
sợi sinh dưỡng mọc thành từng đám, có cuống phình ra. Tế bào sinh bào tử trần có
cuống dạng hình cầu hoặc elip, hình thoi trụ, hình cổ chai. Cuống tế bào sinh bào tử
trần có hình ziczag nhưng là mấu dạng răng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép
(Phạm Thị Thùy, 2004).

Nấm Beauveria bassiana xâm nhiễm nhiều loài côn trùng gây hại cho nông
nghiệp thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh màng
Hymenoptera, và cả bộ cánh nửa cứng Hemiptera, bộ hai cánh Diptera (Yoshinori
Tanada và Harry K. Kaya, 1993). Clark G. H và ctv., (1986) cho biết có thể sử dụng
nấm Beauveria bassiana để diệt muỗi.
3.3. Paecilomyces spp.
Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces spp. có thể là dạng thảm nhung, dạng bó
sợi, màu trắng, hồng nhạt hoặc tím (nên thường được gọi là nấm tím), nâu vàng và nâu
xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt. Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân
nhánh của nấm Paecilomyces spp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc
cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp
dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành
chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002).
Julio J. D và ctv. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm
được tạo nên ở các nhiệt độ 12, 16, và 30
o
C. Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình
sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp.
sẽ không tạo nhiều bào tử. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces
spp. khi tấn công vào cơ thể côn trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về
nhiệt độ và ẩm độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant
structures) để đối phó lại với môi trường (Penland, 1982).
Nấm Paecilomyces spp. gây bệnh cho các loài côn trùng thuộc bộ cánh vẩy
thường gây ra dịch bệnh trên ruộng đậu. Nấm Paecilomyces spp. còn được sử dụng để
diệt sâu đo Trichoplusia ni, sâu xanh Spodoptera frugiperda, sâu ăn tạp Spodoptera
litura (Yoshinori Tanada và Harry K. Kaya, 1993). Nấm Paecilomyces spp. có hiệu
quả cao đối với việc phòng trị sâu do có độc tố gọi là Mycotoxin. Ở Ấn Độ, các nhà
khoa học đã chứng minh được nếu sử dụng nấm Paecilomyces spp. với nồng độ 10
8
bào tử.ml

-1
chủng vào sâu non, sâu non sẽ chết sau 6-8 ngày. Khi chết xác sâu sẽ bị
khô lại, sau đó nấm sẽ phát triển và cơ thể của sâu sẽ bị bao phủ bởi lớp nấm màu
xanh (Vimala Devi, P.S. 1994). Ngoài ra, người ta còn sử dụng nấm Paecilomyces
spp. để phòng trừ sâu hại bông, ngài đêm vân lệch, sâu cuốn lá lúa, sâu đục thân bắp
(Trần Văn Mão, 2002),
6


4. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
4.1. Metarhizium anisopliae
Nấm Metarhizium anisopliae không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất
không có kitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 8
0
C, có biên độ về độ ẩm rộng, ở nơi
tích lũy nhiều CO
2
và thiếu O
2
chúng có thể sống tới 445 ngày.
Ở nhiệt độ dưới 10
0
C và trên 45
0
C thì nấm thường không hình thành bào tử.
Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 - 30
0
C và sẽ bị chết ở 49 -
55
0

C, nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 25
0
C. pH thích hợp là 6,0 và có thể dao
động trong khoảng 3,3 - 8,5. Nấm Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh
bột, xenlulose và kitin (lông và da côn trùng).
Nấm Metarhizium anisopliae có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon
khác nhau. Chúng phát triển tốt trên môi trường có chứa glucose hay lipid. Muốn tạo
thành bào tử, nấm Metarhizium anisopliae đòi hỏi phải có ẩm độ không khí khá cao.
Sản phẩm trao đổi chất có thể làm tê liệt ấu trùng của sâu loài Galleria,
Mellonela và Bombyx mori. Trong dịch nuôi cấy người ta đã tách được dung dịch
toxin và xác định bản chất hóa học của chúng là peptid vòng destruxin A, B, C và D
(Phạm Thị Thùy, 2004).
4.2. Beauveria bassiana
Nấm Beauveria bassiana cũng khó sinh trưởng tốt trên nền cơ chất
không có kitin. Nấm Beauveria bassiana được phân lập từ đất hoặc trên xác chết côn
trùng, chúng phát triển trên môi trường PDB (Potato Dextrose Broth - Nước luộc
khoai tây detroza) ở nhiệt độ 25-30
0
C với pH = 5-7.
Ở nhiệt độ dưới 10
0
C và trên 45
0
C thì nấm thường không hình thành bào tử.
Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 - 30
0
C và bị chết ở 49 - 55
0
C,
nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 22- 25

0
C. pH thích hợp là 6 và có thể dao động
trong khoảng 3 - 8,5. Nấm Beauveria bassiana có khả năng phân giải tinh bột,
xeluloza và kitin (lông và da côn trùng). Chase A. R và ctv., sử dụng môi trường chứa
nguồn tinh bột tự nhiên (bột yến mạch) để phân lập nấm Beauveria bassiana.
Nấm Beauveria bassiana có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác
nhau. Chúng phát triển tốt trên môi trường có thể chứa glucose hay lipid. Muốn tạo
thành bào tử, nấm Beauveria bassiana đòi hỏi phải có ẩm độ không khí cao, tuy nhiên
ẩm độ dưới 50% vẫn kích thích nấm sinh bào tử (Gottwald. G. L, H. L Tedders,
1982).
4.3. Paecilomyces spp.
Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces spp. cần nhiều dưỡng chất, nếu
thiếu chất dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng
(Trần Văn Mão, 2002).
Nhiệt độ và ẩm độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của bào
tử nấm Paecilomyces spp., Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt
độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 15
0
C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt độ
24
0
C. Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 26
0
C,
nhưng ở nhiệt độ 18
0
C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18% so với nhiệt độ 25
0
C. Nguyên nhân
có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hóa, làm tăng quá trình đồng

hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002).
7


Gần đây Stathers, T. E., D. Moore và C. Prior (2004) đã cho công bố những
kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm
Paecilomyces spp. và xác định nấm Paecilomyces spp. thích hợp ở nhiệt độ 28
0
C và
ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80-90% (Phạm Thị Thùy, 2004).
Độ ẩm cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy
nhiên độ ẩm thấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm
Paecilomyces spp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 - 34% hơn là khi
ẩm độ 75% (Trần Văn Mão, 2002).
Nấm côn trùng nói chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và nấm
Paecilomyces spp. cũng không ngoại lệ. Vì vậy ánh sáng là nhân tố không thể thiếu
trong sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces spp. (Trần Văn Mão, 2002).
5. Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng và các sản phẩm trao đổi chất
5.1. Metarhizium anisopliae
Độc tố của nấm M. anisopliae gồm một số ngoại độc tố có tên là Destruxin
A, B, C hay D. Các ngoại độc tố đó là các sản phẩm thứ cấp vòng peptit, L-prolyu, L-
leucine, anhydride và Desmethyl Destruxin B. Cấu trúc cơ bản của chúng gồm 5
aminoacid và α-hytroxy acid. Destruxin gây chán ăn và gây độc cho côn trùng khi
chúng hấp thu vào da, một số Destruxin gây tê liệt côn trùng (Amiri, B. L và ctv.,
1999; Dumas, C. K và ctv., 1996). Một số Destruxin khác ức chế miễn dịch rất mạnh
mẽ (Cerenius, L và ctv., 1990).
Các sản phẩm thứ cấp đó thường được tích lũy vào cuối giai đoạn sinh
trưởng của nấm, khi các nguồn thức ăn và năng lượng cạn kiệt (Phạm Thị Thùy,
2004).
Theo Suziki, K. Kawakami và ctv., (1998):

Destruxin A có công thức nguyên là: C
29
H
47
N
5
O
7
, có điểm sôi là 188
0
C
Destruxin B có công thức nguyên là: C
30
H
51
O
7
N
5
, có điểm sôi là 234
0
C.
Gần đây, Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havlek and Vladimr
Mat'ha (1998) đã ly trích thành công được độc tố có tên là Destruxin Ed
1
, một
Cyclopeptide từ nấm này.
Năm 1969, Hamill, R. L. đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm
bạch cương Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin. Dombrink
Kurtzman M.A. (2003) đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi

chất là vòng peptit có sắc tố màu vàng là tenelin và basianin, những sắc tố này có thể
là do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra từ testosteron (C
19
H
28
O
2
) sinh
ra.
5.2. Beauveria bassiana
Độc tố của nấm Beauveria bassiana là Beuvericin. Về mặt hoá học,
Beuvericin có danh pháp là xyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxy- izovaleryl)
3. Đó là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-940C. Từ 1 lít môi trường
nuôi cấy nấm bạch cương Beauveria bassiana các nhà khoa học Trung Quốc ở trường
Đại học tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách ra được 1,5 g độc tố Beauvericin và
từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã chiết tách ra được 3,8 g Beauvericin (Phạm Thị
Thùy, 2004).
8


Thành phần của môi trường sẽ gây ảnh hưởng đến sự sản sinh độc tố của
nấm Beauveria bassiana. Theo Fang W, Bidochka MJ. (2006), sự hiện diện của
đường fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm gia tăng đáng kể độc tố Beauvericin
của nấm Beauveria bassiana.
Theo Bidochka M. J và J. J. Khachatourians (2001) thì sản phẩm của nấm
Beauveria bassiana là 2 axit hữu cơ, đó là axit oxalic và axit citric, khi nuôi cấy trên
môi trường có chứa kitin. Các tác giả đã chứng minh được chính hai axit trên đã tham
gia vào trong quá trình hòa tan protein biểu bì của côn trùng (Phạm Thị Thuỳ, 2004).
5.3. Paecilomyces spp.
Độc tố của nấm Paecilomyces là Paecilotoxin, cấu trúc cực kỳ phức tạp, có

pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[2-[2-(3-
arbamoylpropylcarbamoyl)propan-2-ylcarbamoyl] propan-2-ylcarbamoyl]-3-methyl
butyl] carbamoyl] -3-methyl-butyl]carbamoyl]propan-2-ylcarbamoyl]-2-hydroxy-3-
methyl-butyl] carbamoyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1-[(E,4S)-4-
methylhex - 2 - enoyl] pyrrolidine - 2 - carboxamide (Nevalainen Helena, 1977).
6. Cơ chế tác động của nấm lên côn trùng
6.1. Metarhizium anisopliae
Khi bào tử nấm Metarhizium anisopliae bám trên bề mặt côn trùng sẽ nảy
mầm tạo thành ống mầm xuyên qua biểu bì bên ngoài. Bào tử bám chặt vào da và tấn
công theo cơ chế bám dính không chuyên biệt thông qua tính kỵ nước của vách tế bào
(Bocias, H. I; Bandan, A. R., 1988; 1991). Khi tiếp xúc với da côn trùng và với điều
kiện thích hợp bào tử sẽ mọc mầm có thể tạo ra các cấu trúc xâm nhiễm như tạo ra các
ống mầm, túi ngoại bào hoặc túi áp suất, từ đó xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn
trùng qua lớp chitin. Sự xâm nhập của nấm vào trong biểu bì thường là do sự phối hợp
của enzyme và cơ chế cơ học. Nấm tiết ra các loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo
thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm xâm
nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Các enzyme đó là exoproteases, endoproteases,
esterases, lipases, chitinases và chitobiases (Leger St. và ctv., 1996; Butt và ctv.,
1998).
6.2. Beauveria bassiana
Những bào tử nấm Beauveria bassiana thường bay trong không khí khi dính
vào côn trùng, gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm xuyên
qua vỏ kitin. Chúng phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện các tế
bào nấm đầu tiên (có dạng chuỗi ngắn như nấm men), côn trùng đã phải huy động hết
các tế bào bạch huyết (lympho-cyte) để chống đỡ nhưng nấm bạch cương đã sử dụng
những vũ khí hóa học rất lợi hại là độc tố Beauvericin, proteaza và một số chất khác
làm cho tế bào bạch huyết của tằm không chống đỡ nổi nên lần lượt bị huỷ diệt. Khi
độc tố nấm đã tiêu diệt hết các tế bào bạch huyết cũng là lúc côn trùng bị chết, cơ thể
côn trùng bị cứng lại là do các sợi nấm đan xen lại với nhau; bào tử của nấm bạch
cương đã được sử dụng một cách có hiệu quả để phòng trừ nhiều loại côn trùng hại

cây trồng (Phạm Thị Thùy, 2004).
6.3 Paecilomyces spp.
Côn trùng khi bị nấm Paecilomyces spp. tấn công thì ở chỗ bào tử bám vào
sẽ sản sinh ra enzyme phân hủy vỏ chitin của côn trùng. Nấm sẽ phát triển bên trong
thân của sâu non tạo nên một vệt đen không có hình thù nhất định. Côn trùng chết đi
thường có màu trắng, đôi khi màu tím nhạt, thân hơi cứng lại (Phạm Thị Thùy, 2004).
9


7. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của bào tử nấm
Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển,
nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc.
7.1. Metarhizium anisopliae
Trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm M. anisopliae cần các
nguồn C, N. Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau. Môi
trường thích hợp nhất cho nấm M. anisopliae là môi trường có chứa kitin làm nguồn
cacbon, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy nấm M.
anisopliae sẽ thu được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin trong môi trường
nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, nó giúp cho sự phát triển và hình thành
bào tử đính (Conidiospore) và bào tử trần (Blastospore). Ngoài nguồn nitơ vô cơ ra,
nấm M. anisopliae còn sử dụng tốt nguồn hữu cơ như protein, pepton, các axit amim
trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho nấm phát triển. Các nguyên tố vi lượng
như C
++
, Zn
++
có tác dụng kích thích cho sự phát triển của nấm (Leger St, et al.,
1996).
7.2. Beauveria bassiana
Nấm Beauveria bassiana khi nảy mầm cần rất nhiều chất dinh dưỡng, nếu để

trong nước cất thì chúng nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm. Nấm bạch cương nảy
mầm tốt trong môi trường có đường mía và peptone (Trần Văn Mão, 2002).
Cũng như nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana cần các
nguồn C, kitin và glucoza.
Trong các loại đường nói chung, đường glucoza luôn là nguồn carbon khá tốt
cho các loài nấm. Nấm Beauveria bassiana sử dụng glucoza trong đường đơn khá tốt,
nhưng xyloza lại rất kém; trong đường đôi chúng sử dụng đường mía và đường
maltoza khá tốt nhưng đường lactoza lại rất kém; trong đường đa chúng sử dụng tinh
bột rất tốt, nhưng đường đơn lại rất kém; đối với xenluloza hầu như chúng không sử
dụng. Trong axit chúng sử dụng axit hữu cơ (lactic) rất kém, nhưng glycerin (3 cacbon
và 6 cacbon) lại rất tốt (Trần Văn Mão, 2002).
Không những yêu cầu về nguồn cacbon, nấm Beauveria bassiana còn yêu
cầu nitơ hữu cơ và vô cơ, trong nitơ vô cơ nấm Beauveria bassiana sử dụng tốt NO
3
-

tốt hơn là NH
4
+
. P là nhân tố quan trọng làm tăng sản lượng nấm bạch cương, trong
giai đoạn sinh trưởng hàng loạt sợi nấm, Beauveria bassiana rất cần C, N, nhưng đến
khi sợi nấm đứt ra thì nhu cầu C, N giảm dần, nhu cầu đối với P tăng lên (Trần Văn
Mão, 2002).
7.3. Paecilomyces spp.
Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces spp. cần nhiều dưỡng chất, nếu
thiếu chất dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng.
Liang, K. (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động
vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K. L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão,
2002).
8. Ảnh hưởng của một số môi trường nhân sinh khối lên các loài nấm ký

sinh côn trùng
Nấm Metarhizium anisopliae phát triển chậm trên môi trường không có pepton
(ví dụ như môi trường PDA, Czapek – Dox), thích hợp trên môi trường có pepton cụ
10


thể trên môi trường Sabouraud nấm phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ 25
0
C sau 7 -
10 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc có đường kính 4 - 6cm. Loài nấm Metarhizium
anisopliae có hai loài dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium
anisopliae var. anisopliae có kích thước 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5µm, dạng bào tử lớn là
Metarhizium anisopliae var. major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0µm (Stathers, T. E,
2004).
Các loại nấm bất toàn như nấm bạch cương, nấm lục cương khi nảy mầm lại cần
chất dinh dưỡng, nếu để trong nước cất thì chúng nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất
chậm. Nấm bạch cương nảy mầm rất tốt trong môi trường có đường mía và peptone,
nấm lục cương lại nảy mầm tốt trong môi trường có peptone, dấm dầu, nước chiết rau
cải, nước phân bón lót (Phạm Thị Thùy, 2004).
Tamura, K. và ctv., (2008) đã tiến hành nuôi cấy nấm M. anisopliae cũng đã tách
được những độc tố trên từ môi trường Czapek – Dox có chứa 0,5% pepton. Từ 1 lít
dung dịch nuôi cấy người ta có thể thu nhận được 13 - 15mg độc tố Destruxin A và B,
dịch lọc được xử lý bằng than hoạt tính rồi được phản hấp thụ bằng N – butanol, sau
đó được tách bằng benzen và được làm sạch trên cột nhôm oxit trung tính.
Môi trường nuôi cấy là yêu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu
môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc. Nấm bạch cương Beauveria
bassiana khi nảy mầm cần rất nhiều chất dinh dưỡng, nếu để trong nước cất thì chúng
nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm. Nấm bạch cương nảy mầm tốt trong môi
trường có đường mía và peptone Ngoài ra, nấm còn cần nguồn C, N. Nếu bổ sung
thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria bassiana sẽ thu

được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy là rất cần
thiết đối với các loài nấm (Trần Văn Mão, 2002).
Trong các loại đường nói chung, đường glucoza luôn là nguồn carbon khá tốt
cho các loài nấm. Nấm Beauveria bassiana sử dụng glucoza trong đường đơn khá tốt,
nhưng xyloza lại rất kém. Trong đường đôi chúng sử dụng đường mía và đường
maltoza khá tốt nhưng đường lactoza lại rất kém. Trong đường đa, chúng sử dụng tinh
bột rất tốt, nhưng đường cục lại rất kém; đối với xenluloza hầu như chúng không lợi
dụng. Trong axit chúng lợi dụng axit hữu cơ (lactic) rất kém, nhưng lợi dụng glycerin
(3 cacbon và 6 cacbon) lại rất. Không những yêu cầu về nguồn cacbon, nấm
Beauveria bassiana còn yêu cầu nitơ hữu cơ và vô cơ, trong nitơ vô cơ nấm Beauveria
bassiana sử dụng tốt NO
3
_
tốt hơn là NH
4
+
. P là nhân tố quan trọng làm tăng sản
lượng nấm bạch cương, trong giai đoạn sinh trưởng hàng loạt sợi nấm, Beauveria
bassiana rất cần C, N, nhưng đến khi sợi nấm đứt ra thì nhu cầu C, N giảm dần, nhu
cầu đối với P tăng lên (Trần Văn Mão, 2002).
Nấm Paecilomyces spp. là một loài nấm ký sinh côn trùng thuộc ngành phụ lớp
nấm bất toàn Deuteromycetes, có đặc tính sử dụng các loại chất dinh dưỡng tương tự
như nấm xanh hay nấm lục cương, nếu được bổ dung pepton và yeast extract thì phát
triển rất tốt trên môi trường lỏng (Trần Văn Mão, 2002).



11

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Phương tiện thí nghiệm
1.1. Vật liệu, dụng cụ và thiết bị
- Các dòng nấm diệt côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana,
Paecilomyces spp. được phân lập từ các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.
- Đĩa pêtri, Beaker, bình tam giác, nước cất, cồn 70%, cồn 99%.
- Gòn không thấm, gòn thấm, giấy thấm, giấy kissme, kẹp inox, cọ lông, kéo,
keo dán, bút lông, bọc nylon,...
- Chai thủy tinh, hóa chất để nấu môi trường nuôi cấy nấm.
- Kính hiển vi chụp ảnh, lame đếm hiệu Thoma (Nhật sản xuất), micropipette,
cân điện tử.
- Tủ cấy, tủ úm, nồi khử trùng áp suất (autoclave), micropipet, lò viba, đũa
cấy,...
1.2. Hóa chất
Các loại hóa chất cung cấp nguồn dinh dưỡng thêm vào môi trường: NaNO
3
,
KH
2
PO
4
, MgSO
4
.7H
2
O, MgSO
4
, KCl, FeSO
4
.7H

2
O, Na
2
HPO
4
, NH
4
NO
3
, Glucose,
Pepton, Yeast extract...
2. Phương pháp thí nghiệm
2.1. Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh
côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.)
Sorok và Paecilomyces spp. ở 6 tỉnh: An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long,
Hậu Giang và Tiền Giang.
- Thời gian thu mẫu: tháng 08 – 11/2008, có thể thu vào mọi thời điểm trong
ngày nhưng tốt nhất là vào buổi sáng sớm hay chiều mát vì lúc đó ẩm độ cao, sợi nấm
mọc trương nước, khả năng sinh trưởng mạnh, thu về phân lập sẽ dễ hơn. Lịch thu
mẫu theo từng địa phương, đi hết tỉnh này đến tỉnh khác, nếu các lần đi thu mẫu không
đủ sâu bị nhiễm nấm thì có thể đi bổ sung vào những ngày khác. Nói chung, thời gian
lấy mẫu không quan trọng bằng địa điểm phân lập các isolates và khả năng phát triển
của nguồn nấm.
- Chọn điểm thu thập những mẫu sâu hại: ở mỗi tỉnh chọn 1 huyện nơi có diện
tích trồng rau tập trung. Mỗi huyện chọn 4 xã để thu mẫu. Mỗi ruộng rau thu ít nhất 4
mẫu cho mỗi loại nấm.
4 mẫu/ruộng x 3 loại nấm x 4 xã x 6 tỉnh = 288 mẫu.
- Cách lấy mẫu sâu nhiễm nấm: Dùng kẹp inox đặt các mẫu sâu nhiễm nấm
ngoài tự nhiên (quan sát được bằng mắt thường) vào trong tuýp có sẵn bông gòn thấm
ướt để tạo ẩm độ, ghi nhãn nơi thu thập.

- Nhận biết mẫu sâu bị nhiễm nấm ngoài tự nhiên: Quan sát bằng mắt thường,
nhận diện hình thái bên ngoài nấm trên cơ thể côn trùng:
+ Nấm Metarhizium anisopilae: có màu lục hoặc xanh lục (là nấm lục cương).
Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng ban đầu màu trắng sau chuyển sang màu
xanh nhạt. Trên bề mặt cơ thể côn trùng có một lớp phấn khá rõ màu xanh lục, các sợi
nấm khá mịn (hình 2).
12


+ Nấm Beauveria bassiana (nấm bạch cương): đặc điểm của loại nấm này là sợi
nấm mọc xốp, trông như những sợi nấm trắng mịn mọc xốp bao phủ bề mặt côn trùng
(hình 3).
+ Nấm Paecilomyces: các sợi nấm mọc mịn bao phủ côn trùng, ban đầu có màu
tím rất nhạt sau đó sợi nấm chuyển sang màu tím nhạt (hình 4).
Sâu bị nhiễm nấm có tơ nấm xuất hiện trên cơ thể. Bị nhiễm vi khuẩn không có
tơ nấm và thường nhũn nước, có mùi rất hôi. Sâu bị nhiễm virus thường nứt bụng
hoặc khi chết treo ngược cành cây. Sâu bị chết do thuốc sâu cũng không có tơ nấm
trên thân hoặc màu sắc, hình dạng nấm không đặc trưng.
2.2 Phân lập, tách ròng, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được
trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar)
- Phương pháp phân lập: Mẫu thu về được trữ trong đĩa pêtri có lót giấy thấm
và bông gòn ẩm để tạo ẩm độ cho nấm phát triển, quan sát thấy tơ nấm xuất hiện tiến
hành nuôi cấy nấm trong môi trường PDA. Nuôi cấy theo phương pháp Slide culture
(Harris J. L, 1986) để quan sát bào tử và cành bào đài. Tiến hành theo các bước sau:
- Chuẩn bị một miếng môi trường Agar đặt trên dĩa petri, có diện tích 5 mm
2
,
cao 2 mm.
- Đặt miếng môi trường Agar trên lam, trong dĩa petri có để giấy thấm nước
tạo ẩm độ.

- Cấy một ít bào tử nấm vào miếng Agar. Sau đó dùng lame đậy lên trên miếng
Agar.
- Ủ dĩa Petri với nhiệt độ 25
0
C trong 3 – 5 ngày. Sau đó chuyển lame trên
miếng Agar đặt lên một lam mới và đem quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang,
quan sát nhận diện, mô tả và chụp hình dạng bào tử, cành bào đài của các dòng nấm
này.
- Tiến hành định danh theo hệ thống phân loại của H. L. Barnett and Barry,
B. Hunter (1998) và G. C. Ainsworth (1971) sau khi đã có dạng bào tử và cành bào
đài của các dòng nấm.
- Các mẫu nấm một phần nhân nuôi ra làm thí nghiệm, phần còn lại mang đi
trữ nguồn trong các tuýp Glycerol 10% ở điều kiện -80
0
C đã thanh trùng (D. Smith,
2002).
Quan sát, ghi nhận một số đặc điểm sinh học trong quá trình phân lập để
bước đầu ghi nhận những dòng nấm sinh trưởng mạnh, dễ nhân sinh khối như màu
sắc, hình dạng, đặc điểm của bào tử, khuẩn lạc trên đĩa petri.



Hình 1. Nuôi cấy nấm theo phương pháp Slide Culture (Harris, J. L, 1986)

13


2.3. Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn
tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm

Nuôi nhân sâu ăn tạp trong phòng thí nghiệm: nuôi sâu ăn tạp đến tuổi 2, chọn
sâu đồng cở để làm thí nghiệm.
- Nguồn sâu ăn tạp được thu thập từ ngoài đồng đem về nuôi trong điều kiện
phòng thí nghiệm bằng thức ăn nhân tạo nấu sẵn.
- Khi ở giai đoạn nhộng, chọn ra những nhộng đực và nhộng cái khỏe cho vào
bọc giấy (mỗi bọc giấy một cặp nhộng).
- Sau khi nhộng vũ hoá, thường xuyên cho bướm uống nước đường glucose
10% .
- Sau khi thấy những ổ trứng xuất hiện (3 - 4 ổ trứng), kiểm tra bướm để thu
bướm sạch. Cách thực hiện như sau:
+ Cho cả cặp bướm bố mẹ vào cối nghiền có sẵn nước cất (khoảng 1 ml).
+ Dùng ống nhỏ giọt hút lấy một phần mẫu nghiền trong cối nghiền ở trên và
nhỏ lên lam, đậy lame rồi đem quan sát dưới kính hiển vi phản pha.
+ Khi quan sát mẫu nghiền, nếu không thấy sự hiện diện của virus NPV,
protozoa hoặc mật số vi khuẩn rất thấp thì có thể sử dụng ổ trứng của cặp bướm bố mẹ
đó.
- Thu những ổ trứng sạch cho vào dung dịch Formaline 10%, ngâm trong thời
gian 25 phút để khử bỏ những vi sinh vật bám bên ngoài vỏ trứng. Sau đó vớt ổ trứng
ra và rửa lại bằng nước cất.
- Cho ổ trứng vào hộp nhựa có sẵn thức ăn chờ trứng nở.
- Sau khi trứng đã nở, thu ấu trùng sâu non và tiếp tục nuôi bằng thức ăn nhân
tạo cho đến khi ấu trùng đạt tuổi 2 thì tiến hành thí nghiệm.
- Ấu trùng sâu ăn tạp được nuôi liên tục trong điều kiện phòng thí nghiệm để
thực hiện thí nghiệm.

Bảng 1. Thành phần các nguyên vật liệu dùng để nuôi sâu ăn tạp (Nguyễn Thị Ngọc
Tuyền, 2003).
Chuẩn bị huyền phù dung dịch nấm
Sử dụng các dòng nấm được phân lập và tách ròng từ các mẫu sâu bị ký sinh
ngoài tự nhiên, cấy nguồn nấm sang môi trường PDA khoảng 7-10 ngày cho sợi nấm

phát triển và sinh một lượng bào tử nhất định. Sau đó tiến hành cạo nấm thu lấy bào
tử, đếm mật số bào tử và pha loãng huyền phù bào tử đến mật số 10
8
bào tử.ml
-1
.

STT Thành phần Số lượng
1 Bột đậu nành 50g
2 Bột mì 50g
3 Men bia 9g
4 Ascorbic acid (500mg/viên) 5v
5 Methyl-p-benzoate 2g
6 Chloramphenicol 50mg
7 L-cystein 20mg
8 Agar 2g
9 Lá cù nèo 200g
10 Nước cất 300ml
14


Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 52 nghiệm thức
(51 dòng nấm và 1 đối chứng), 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 20 cá thể sâu đồng cở.
Nghiệm thức đối chứng sử dụng nước cất thanh trùng. Mỗi cá thể sâu nuôi riêng trong
các cốc nhỏ có nắp đậy để tránh bị nhiễm sang các con sâu khác.
Mỗi cốc nhựa nhỏ có đường kính khoảng 5 cm x cao 6 cm, dưới đáy cốc có
lót giấy thấm để dễ vệ sinh. Chủng vào mỗi cốc 20µl dung dịch huyền phù bào tử nấm
và cho thức ăn nhân tạo vào, đậy cốc lại tránh lây nhiễm.
Lấy chỉ tiêu

Ghi nhận số sâu chết sau 4, 6, 8, 10 ngày sau khi xử lý đối với cả 3 loại nấm
Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. Mỗi lần lấy chỉ
tiêu đều đo nhiệt độ và ẩm độ. Tính độ hữu hiệu (%) bằng công thức Abbott (Trần
Văn Hai, 1998). Số liệu được phân tích thống kê với phần mềm MSTATC.
Độ hữu hiệu (%) = 100.
C
TC −
(Công thứ Abbott)
C: (%) sâu còn sống ở nghiệm thức đối chứng.
T: (%) sâu còn sống ở nghiệm thức có xử lý nấm.

2.4. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình
thành và phát triển bào tử của 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria
bassiana và nấm Paecilomyces spp. trong môi trường lỏng.
2.4.1. Nguồn nấm
Sử dụng 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và
Paecilomyces spp. đã được phân lập và thử độ hữu hiệu trên sâu ăn tạp trong phòng
thí nghiệm. Cấy nguồn nấm vào đĩa petri có chứa 10 ml môi trường cơ bản PDA đối
với cả 3 loại nấm từ 10 đến 14 ngày cho nấm phát triển và sinh ra một số lượng bào tử
nhất định. Sau đó, cho 10ml nước cất vào mỗi đĩa dùng lame cạo nhẹ vào mặt môi
trường để thu lấy bào tử và đếm mật số bào tử ban đầu.
2.4.2. Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức
tương ứng với 4 loại môi trường CDA, CAM, SDAY
1
, SDAY
3
và 5 lần lặp lại. Mỗi
đơn vị thí nghiệm tương ứng với 1 bình tam giác 400ml (chứa 100ml môi trường thử
nghiệm như trong hình 7). Các bình tam giác chứa môi trường này đã được thanh

trùng bằng autoclave ở 121
0
C trong 30 phút. Ở mỗi bình tam giác, chủng 1ml huyền
phù bào tử nấm có mật số 10
7
bào tử.ml
-1
.
Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa môi trường) được đặt trên máy lắc tốc độ
120 vòng.phút
-1
ở nhiệt độ và ánh sáng phòng thí nghiệm.
10 dòng nấm x 4 môi trường x 5 lặp lại = 200 đơn vị thí nghiệm.

15


Bảng 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
AI1 CI2 DI1 CIII1 BIII3
BIII2 DIV1 BI3 AIII4 AIII9
DIV2 BIII4 CI3 DI2 CI1
DV5 AII9 DI3 DIV3 AI10
BV6 DV3 AII4 BIII1 DV7
DV4 BV7 CIV4 DV2 BV8
AIII5 DIV5 AV2 BI7 BI1
DI4 AII1 AV8 DIV4 AII8
DIV6 BIII5 AI2 DI6 AV3
BII4 BIV8 BV5 DV6 BIV7
CIV8 BI8 BII3 AIV4 BII2
AIV3 DI5 BIV6 AI3 AIII8

CIV5 AIV7 CI4 DIII1 BV4
AI9 CII10 BI2 BII10 BI6
CI5 CI6 DI7 CIV7 CII9
AV4 BV2 AIV2 AIII6 BIII6
BIII7 AIII7 DIII2 CII3 AI8
CII2 CIV6 BV3 BIV5 CIII8
CIII5 BIII8 CII1 BI9 BII9
AII3 CV2 BI5 DV1 CV1
CIII4 AIII10 AI7 BII1 AIII3
BIV4 DIII3 BIV3 CII8 DV8
CIV9 CV3 AV1 DII10 BI4
AV7 AIV6 AII2 AIV8 DIV10
AII6 DI8 CI7 DV10 AII7
CV5 BV10 AV6 BIII9 CII6
CIII3 AI4 CIII2 DII9 DIV9
BIII10 DI9 BIV2 DV9 CIII7
CV4 AIV10 CIII9 AII10 AV5
BI10 DIV7 CII7 DII8 AIV5
DII3 CV6 CIV10 BII5 DII7
CIII10 BII6 AIV1 BV9 AI5
DII4 DII5 CI8 CV7 DIII9
AIII1 CI9 DII6 BIV1 CV8
DIII4 CIV3 AIII2 BIV9 CIII6
DII2 DIII6 DIV8 DIII5 BII8
AV9 AI6 BV1 AII5 DI10
BII7 DIII7 CIV1 DIII8 CII5
CV10 DII1 AIV9 DIII10 CI10
BIV10 CII4 CV9 CIV2 AV10
A: Môi trường CDA C: Môi trường SDAY
1

B: Môi trường CAM D: Môi trường SDAY
3
I, II, III, IV, V: Năm lần lặp lại
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: mười dòng nấm chọn ra từ thí nghiệm trong phòng


16


Bảng 3. Tỷ lệ khoáng chất của các loại môi trường lỏng
Môi trường



Khoáng chất
CDA
(Czapek -
Dox)
CAM
(Complete
Media)
SDAY1
(Sabouraud
dextrose
Yeast)
SDAY3
(Sabouraud
dextrose Yeast)
có thêm khoáng

chất
NaNO
3
2g - - 2g
KH
2
PO
4
1g 0,4g - 1g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5g - - 0,5g
MgSO
4
- 1g - -
KCl 0,5g 1g - -
FeSO
4
.7H
2
O 0,01g - - -
Na
2
HPO
4
- 1.4g - -
NH
4

NO
3
- 0,7g - -
Glucose 30g 10g 40g 40g
Pepton 2g - 10g 10g
Yeast extract - 5g 2g 2g
Nước cất 1000ml 1000ml 1000ml 1000ml
pH 6,5 – 7,2 6,5 – 7,2 6,5 – 7,2 6,5 – 7,2

2. 4.3. Chỉ tiêu đánh giá
Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào các thời điểm: 2, 4, 6, 9, 12 và 14
ngày sau khi lắc cho cho tất cả các dòng nấm thí nghiệm. Ở mỗi thời điểm, tiến hành
pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi bình môi trường. Đếm mật số
bào tử.ml
-1
cho từng nghiệm thức.
Số liệu mật số bào tử.ml
-1
được đổi sang logarit thập phân.
2.4.4. Thống kê: Tổng hợp số liệu và phân tích thống kê bằng phần mềm
MSTATC.

17


CHƯƠNG 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
I. Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria
bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces
spp. ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền
Giang.

Qua quá trình đi thu thập các mẫu côn trùng bị nhiễm vi nấm ngoài tự nhiên
trên đồng ruộng, chúng tôi nhận định rằng côn trùng bị nhiễm các loài nấm ký sinh khi
chúng hiện diện với mật số cao, gây thành dịch và ít sử dụng thuốc bảo vệ thực vật.
Hai trăm tám mươi tám dòng nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và
Paecilomyces spp. được thu thập từ những ruộng sản xuất rau của nông dân hoặc vườn
rau gia đình tại 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền
Giang (Bảng 4). Các dòng nấm chủ yếu thu thập trên các đối tượng như gây hại như:
sâu ăn tạp (Spodoptera litura), sâu ăn đọt (Crocidolomia binotalis), sâu xanh da láng
(Spodoptera exigua), rầy phấn trắng (Aleurodicus dispersus), sâu tơ (Plutella
xylostella), sâu đục trái đậu nành (Etiella zinckenella), rầy mềm (Brevicoryne
brassacicae) và bọ nhảy (Phyllotetra striolata).
Bảng 4. Số mẫu sâu hại bị nhiễm nấm ký sinh thu thập được ở một số tỉnh
Đồng bằng sông Cửu Long, tháng 8-9 năm 2008.
STT Phường, Xã
Quận,
Huyện
Tỉnh
Số
mẫu
Nhiệt độ / ẩm độ
trung bình
1
Kiến An Chợ Mới An Giang 12 29,4
0
C / 70,4%
2
Long Điền A Chợ Mới An Giang 12 30,4
0
C / 68,5%
3

Bình Phước Xuân Chợ Mới An Giang 10 31,1
0
C / 62,5%
4
Mỹ Hiệp Chợ Mới An Giang 12 26,4
0
C / 62,6%
5
Long Tuyền Bình Thủy Cần Thơ 16 30,6
0
C / 70%
6
Long Hòa Bình Thủy Cần Thơ 12 25,8
0
C / 75%
7
Bình Thủy Bình Thủy Cần Thơ 18 31,3
0
C / 69,7%
8
An Thới Bình Thủy Cần Thơ 12 29,9
0
C / 61%
9
Mỹ Hòa Bình Minh Vĩnh Long 14 32,2
0
C / 70%
10
Đông Bình Bình Minh Vĩnh Long 12 28,5
0

C / 66%
11
Đông Thạnh Bình Minh Vĩnh Long 12 30,4
0
C / 69,8%
12
Đông Thành Bình Minh Vĩnh Long 12 27,6
0
C / 71%
13
Tân Phú Long Mỹ Hậu Giang 12 29,9
0
C / 70,1%
14
Vĩnh Thuận Đông Long Mỹ Hậu Giang 12 30,8
0
C / 69%
15
Thuận Hòa Long Mỹ Hậu Giang 12 25,9
0
C / 74,8%
16
Thuân Hưng Long Mỹ Hậu Giang 12 32,1
0
C / 69,8%
17
Lai Hòa Vĩnh Châu Sóc Trăng 12 27,6
0
C / 70,3%
18

Vĩnh Tân Vĩnh Châu Sóc Trăng 9 30,4
0
C / 69,6%
19
Vĩnh Phước Vĩnh Châu Sóc Trăng 12 29,6
0
C / 71,2%
20
Vĩnh Hiệp Vĩnh Châu Sóc Trăng 8 30,5
0
C / 74%
21
Phú Kiết Chợ Gạo Tiền Giang 12 31,6
0
C / 74,4%
22
Hòa Tịnh Chợ Gạo Tiền Giang 12 30,0
0
C / 70,1%
23
Mỹ Tịnh An Chợ Gạo Tiền Giang 12 29,6
0
C / 69,7%
24
Trung Hòa Chợ Gạo Tiền Giang 9 29,7
0
C / 70,8%

Tổng cộng
288