Hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phả hệ vùng gen RPB1

B GIÁO DC VÀ ÀO TO
TRNG I HC M TP.HCM


KHÓA LUN TT NGHIP

Tên đ tài:
H TR NH DANH NM KÝ SINH CÔN TRÙNG DA TRÊN
PHÂN TÍCH PH H VÙNG GEN RPB1



KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HC PHÂN T




GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
ThS. Lao c Thun
SVTH : Hunh Tho Trân
MSSV : 1053010833
Khóa : 2010-2014


Bình Dng, tháng 5 nm 2014




LI CM N

u tiên cho phép em đc gi li cm n chân thành và s tri ân sâu sc ti
cô Lê Huyn Ái Thúy, cô Trng Kim Phng và thy Lao c Thun. Thy, cô
không ch truyn đt nhng kin thc quý báu mà còn dy em nhng bài hc trong
cuc sng, giúp em hoàn thin nhân cách cng nh tri thc. c bit, thy cô đã cho
em c hi tìm thy đam mê tht s và đc làm vic ht mình cho nhng điu mình
yêu thích.
Vi lòng bit n sâu sc nht, em xin gi đn quý thy cô  khoa Công ngh
sinh hc nói chung và các thy cô trong chuyên ngành vi sinh – sinh hc phân t
nói riêng đã truyn đt cho em vn kin thc quý báu.
Bên cnh đó, xin gi li cm n đn các bn và các em  phòng thí nghim đã
luôn giúp đ và đng viên tôi trong sut quá trình thc hin đ tài.
Cui cùng, con xin gi li cm đn cha m, đã dy d, yêu thng, nuôi nng
con khôn ln nh ngày hôm nay. Gia đình là ch da tinh thn giúp con vt qua
nhng khó khn trong cuc sng.
Em xin chúc quý thy cô di dào sc khe, gt hái nhiu thành công.
Bình Dng, tháng 5 nm 2014


Hunh Tho Trân

MC LC
1.1. TNG QUAN V NM CORDYCEPS 3
1.1.1. c đim chung 3
1.1.2. Phân loi khoa hc 3
1.1.3. Ngun gc tên gi 4
1.1.4. Các hp cht có trong Cordyceps 4
1.1.5. ng dng 6
1.2. NGHIÊN CU NH DANH 8
1.2.1. nh danh bng đc đim hình thái và phân tích gii phu 8
1.2.2. Tng quan v gen rpb1 8

1.3. NGHIÊN CU PHÁT SINH LOÀI 10
1.3.1. Ph h phân t trong nghiên cu phát sinh loài: 10
1.3.2. Nhng bc c bn trong nghiên cu phát sinh loài: 10
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CU TRONG NC 14
1.5. THU THP C S D LIU 15
1.5.1.Mc đích 15
1.5.2. Khai thác và x lý thông tin 15
1.6. CÁC PHNG PHÁP SINH HC PHÂN T 16
1.6.1.K thut PCR (Polymerase Chain Reaction) 16
1.6.2. in di 17
1.6.3. Gii trình t 17
1.7. HIU CHNH TRÌNH T (proofreading): 18
2.1. VT LIU 20
2.1.1. B mu nm ký sinh côn trùng 20
2.1.2. Dng c -thit b-hóa cht 20
2.1.3. Danh mc các phn mm và trang web trc tuyn 22
2.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU 22
2.2.1. Kho sát in silico 22
2.2.2. Tin hành thc nghim 23
2.2.3. Hiu chnh và phân tích kt qu gii trình t 27
3.1. C S D LIU CC B VÀ KHO SÁT IN SILICO 28
3.1.1. C s d liu cc b 28
3.1.2. Kt qu đánh giá mi 31
3.2. KT QU THC NGHIM TRÊN MU NM KÝ SINH CÔN TRÙNG36
3.1.1. Tách chit DNA và ti u hóa quy trình 36
3.1.2. Phn ng khuch đi DNA và ti u hóa quy trình 37
3.1.3. Gii trình t và hiu chnh sau gii 40
3.1.4. Kt qu so sánh vi d liu Genbank 46
3.3. KT QU DNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 47
4.1.KT LUN 57

4.2.  NGH 57

DANH MC BNG
Bng 1.1. Các chc nng ca BLAST
Bng 2.1. Các mi s dng khuch đi gen rpb1
Bng 2.2. Các thành phn trong phn ng PCR
Bng 3.1. Ngun gc các trình t rpb1 dùng tham chiu
Bng 3.2. Trình t và các thông s đánh giá mi ca IDT khuch đi gen rpb1
Bng 3.3. Kt qu đo OD tách chit DNA theo phng pháp Phenol:chloroform
Bng 3.4. Kt qu đo OD các mu DL0038B, DL0075
Bng 3.5.Tng hp kt qu hiu ch
nh trình t các mu nm ký sinh côn trùng
Bng 3.6.Kt qu chiu dài trc và sau khi hiu chnh
Bng 3.7. Kt qu so sánh trình t rpb1đã hiu chnh t vi các trình t trên
GenBank
Bng 3.8. Tng hp kt qu đnh danh mu nm t d liu phân t


DANH MC HÌNH
Hình 1.1. Mô t chc nng vùng CTD ca gen rpb1
Hình 1.2. Cu trúc vùng gen rpb1
Hình 2.1. Các thông s thi lp chu k nhit phn ng PCR khuch đi gen rpb1
Hình 3.1. Mô t kt qu Annhyb khuch đi vùng gen rpb1
Hình 3.2. Kt qu BLAST cp mi CRBP1/RBP1Cr
Hình 3.3. Kt qu đin di hai mu nm DL0038B và DL0075 tách chit theo
phng pháp phenol:chloroform
Hình 3.4. Kt qu đin di hai mu nm DL0038B và DL0075 khuch đi gen rpb1
vi Ta=53
o
C

Hình 3.5. Kt qu đin di hai mu nm DL0038B và DL0075 khuch đi gen rpb1
vi Ta=46,3
o
C
Hình 3.6. Kt qu đin di sáu mu DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075,
DL0077 đc thc hin bng quy trình ti u
Hình 3.7. Hiu chnh tín hiu  đu mch xuôi mu DL0038B
Hình 3.8. Hiu chnh tín hiu  vùng đu trên 2 mch-vùng s 3
Hình 3.9. Hiu chnh  vùng gia hai mch rpb1
Hình 3.10. Hiu chnh vùng cui 2 mch-vùng 4
Hình 3.11. Hiu chnh trình t cui ca hai mch
Hình 3.12. Kt qu BLAST trình t mch xuôi đã hi
u chnh
Hình 3.13. Kim tra mc đ tng đng bng công c Dot plot
Hình 3.14. Cây ph h phân t thuc nhóm Clavicipitaceae clade A dng theo
phng pháp NJ - Neighbor joining
Hình 3.15. Cây ph h phân t thuc nhóm Clavicipitaceae clade B dng theo
phng pháp ML - Maximum likelihood
Hình 3.16. Cây ph h phân t thuc nhóm Clavicipitaceae clade C dng theo
phng pháp NJ - Neighbor joining
Hình 6.1. Kt qu BLAST trình t mu DL006 đã hiu chnh
Cây ph h đnh danh 6 mu dng bng phng pháp NJ
Hình 6.2. Kt qu BLAST trình t mu DL0015 đã hiu chnh
Hình 6.3. Kt qu BLAST trình t mu DL0038B đ
ã hiu chnh
Hình 6.4. Kt qu BLAST trình t mu DL0069 đã hiu chnh
Hình 6.5. Kt qu BLAST trình t mu DL0075 đã hiu chnh
Hình 6.6. Kt qu BLAST trình t mu DL0077 đã hiu chnh
Hình 6.7. Cây ph h đnh danh 6 mu dng bng phng pháp NJ
Hình 6.8.Cây Cây ph h đnh danh 6 mu dng bng phng pháp ML

Hình 6.9. Cây ph h đnh danh 6 mu dng bng phng pháp MP
Hình 6.10. Cây ph h phân t
dng bng phng pháp ML
Hình 6.11. Cây ph h phân t dng bng phng pháp MP



Danh mc nhng ch vit tt

ATP
: Adenosine triphosphate
BLAST
: Basic Local Alignment Search Tool
Bp
: base-pair
DNA
: deoxyribonucleotide triphosphate
LSU
: large subunit
ML
: maximum likelihood
MP
: maximum parsimony
NJ
: neighbor-joining
Nu
: nucleotide
rDNA
: ribosomal DNA
RNA

: ribosomal RNA
rRNA
: ribosomal RNA
SSU
: small subunit
TBE
: Tris, Borate, EDTA








T VN 
1

Cordyceps là nm ký sinh  côn trùng nh sâu bm, côn trùng cánh cng,
b xít, chun chun, ve su, kin, nhn Các loài nm thuc chi Cordyceps có
nhiu ng dng trong lnh vc y dc, vì nm có cha các hot cht có kh nng
điu hòa đáp ng min dch, c ch t bào ung th [35][22]; ci thin chc nng
phi, thn [48]. Hin nay trên th trng các sn phm t nm có giá tr v dc
tính khác nhau và mi loài li có giá tr cha tr riêng tng loi bnh. Do đó,
vic xác đnh loài trong chi này là rt cn thit. Tuy nhiên, vic đnh danh loài
nm Cordyceps là rt khó khn bi chúng có hình thc sinh sn hu tính
(teleomorph) và hình thc sinh sn vô tính (anamorph). Ngoài ra chúng còn
chu tác đng ca môi trng nên có th bin thành dng d hình thái khin các
nhà phân loi nhm ln. Do đó, cùng mt ging loài có các tên khác nhau. Ví
d, Metacordyceps taii là tên khác ca Metarhizium anisopliae hay Cordyecps

congfragosa còn tên gi khác là Lecanicillium lecanii [42]. Hin nay, s kt hp
gia sinh hc phân t và tin sinh hc đã góp phn tích cc trong vic gii quyt mt
cách hu hiu nhng vn đ khó khn trên. Ngoài ra s kt hp này còn giúp xác
đnh mt cách chính xác loài và h thng phát sinh loài ca nhóm nm này da vào
vic xây dng cây ph h trên các trình t có tính đc trng cho các chi và các loài
nm. in hình nh Sung và cs nghiên cu theo hng các gen thuc nhóm gen gi

nhà (house-keeping-genes) xây dng h thng phát sinh loài [42] hay các gen đc
s dng đ phân tích ph h phân t trong d án AFTOL (Assembling the Fungal
Tree of Life) [53]. Trong đó có gen rpb1 (rpb1 là vùng gen mã hóa protein RNA
polymerase II). Tiu phn 1 này cha các exon có đ bo tn có ý ngha trong tin
hóa và phân loi các loài nm. Xut phát t các vn đ trên đ tài: “H tr đnh
danh nm ký sinh côn trùng da trên phân tích ph h vùng gen rpb1” đc thc
hin.  tài nghiên cu trên c s phân tích trình t gen rpb1 vi nhng mc tiêu và
phng pháp sau: (1) kho sát in silico - thu thp trình t to c s d li
u cc b
gen rpb1, đánh giá cp mi đ khuch đi gen rpb1 da theo các ch tiêu; (2) tin
hành thc nghim xây dng quy trình tách chit DNA t h si nm, ti u hóa chu
trình PCR đ khuch đi vùng gen mc tiêu, gii trình t, xây dng và so sánh các
cây ph h phân t t c s d liu trình t thu thp đc.
2

Hy vng vi nhng kt qu thu đc đ tài s cung cp thêm mt phng
pháp nhm h tr đnh danh nm ký sinh côn trùng.

PHN 1. TNG QUAN
3

1.1. TNG QUAN V NM CORDYCEPS
1.1.1. c đim chung
Cordyceps (thuc h Clavicipitaceae) là nm ký sinh  côn trùng và đi din
là nm Cordyceps sinensis gây nhim trên sâu Hepialus armoricanus.
 Vit Nam và Trung Quc, C.sinensis đc gi vi tên thông thng là
đông trùng h tho.
C.sinensis có gc gn vi đu ca sâu, có hình ging nh gy đánh khúc
quân cu, đu có dng hình chùy (ging Cordyceps xut phát t ting
Latinh, Cord = chùy, ceps = đu). Nm dng qu th có màu nâu đen hoc
màu đen, dài khong 4-11cm, trng lng khong 0,06g. Khi thành thc s
phát tán các bào t ra xung quanh khong vài cm, nu gp gió có th phát tán
cao hn. Nm ông trùng h tho ch đc phát hin vào mùa hè  mt s cao
nguyên có đ cao t 3.500 m đn 5.000 m so vi mt bin; đó là các vùng Tây
Tng, T Xuyên, Cam Túc, Vân Nam [1].
1.1.2. Phân loi khoa hc
Cordyceps (Fr) Link sensu lato (s. l) hay Clavicipitaceae bao gm 400-500
loài [54]. Theo Kobayasi 1941, 1982 đã chia Cordyceps s. l thành 3 chi ph
(subgenera) và 7 nhóm nh (subsection) da vào đc đim hình thái gii phu
[23][24].
Tuy nhiên đn nm 2007 Sung và cs đã phân tích ph h phân t da vào by
gen gi nhà, tác gi đã tái phân chia Cordyceps s. l thành 4 chi (genera) –
Cordydyceps sensu stricto (s. s.), Metarcordyceps, Elaphocordyceps và
Ophiocordyceps. Bn chi này nm trong 3 h (families) – Clavicipitaceae,
Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae [42]. Trong các h này ngoài các chi k
trên còn mt s chi khác nh: (1) Clavicipitaceae gm Hypocrella, Regiocrella và
Torrubiella; (2) Cordycipitaceae gm chi: Ascopolyporus, Hyperdermium,

Torrubiella,
4


1.1.3. Ngun gc tên gi
Nm 1878, nhà khoa hc Pier Andrea Saccarado đã công b nm này tên gi
là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc [38]. Nm này ký sinh trên u trùng các loài
bm thuc chi Thitarodes. Thng d gp nht  sâu non loài Thitarodes
baimaensis hoc Thitarodes armoricanus, ngoài ra còn 46 loài khác thuc chi
Thitarodes cng có th b Cordyceps sinensis ký sinh.
Vào cui mùa thu, các cht trên da ca sâu non tng tác vi các bào t nm
và to ra các si nm, các si nm đâm sâu vào u trùng, coi chúng là cht dinh
dng đ phát trin. n đu mùa hè n
m sau, nm phát sinh mnh và gây cht sâu,
sau đó chúng hình thành chi, phát trin chui ra khi mt đt, nhng gc vn dính
vào đu sâu. Do đó nhiu ngi gi là nm ông trùng h tho bi vì mùa đông
nm sng trong c th côn trùng, mùa hè thì nm phát trin ra ngoài c th ging
nh cây c [46]. Chính vì đc đim sinh trng này đã gây nhm ln v tên gi ca
chi nm này. Vào mùa đông vì đi
u kin khí hu khc nghit-nhit đ và m đ
không khí thp nm ký sinh dng h si, hình thc sinh sn vô tính (anamorph) vi
bào t dng đính. Vào mùa hè, điu kin môi trng thun li nhit đ, m đ cao
nm chuyn thành hình thc sinh sn hu tính (teleomorph) hình thành qu th. Do
đc đim hình thc sinh sn nêu trên nên  mt s chi nm có h lng danh [6].
1.1.4. Các hp cht có trong Cordyceps

1.1.4.1. Nhng thành phn dinh dng chung
Cordyceps cha mt lot các hp cht dinh dng. Nó cha tt c các acid
amin, vitamin B
1

, B
2
, B
12
, E và K, mt lot các loi đng bao gm mono, di
và oligosaccharide và rt nhiu các polysaccharides, protein, sterol, nucleoside
và mt lot các yu t khác (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni,
Sr, Ti, Cr, Ga, V và Zn) [18].
5

1.1.4.2. Các cht hot tính sinh hc chính
Cordycepin [3’-deoxyadenosine] và acid Cordycepic [d-manito] là nhng
hp cht ban đu đc tách chit t loài Cordyceps militaris. Cyclosporin là
cht c ch min dch tìm thy trong Cordyceps, đc s dng cho vic cy
ghép các b phn trên c th ngi, có ngun gc t các loài Cordyceps
subsessilis (dng vô tính: Tolypocaldium infalatum). Nhng hp cht c ch
min dch khác đc tìm thy trong mt loài liên quan mt thit
đn Cordyceps có tên là Isaria Sinclarii. Nhng thành phn khác đc tìm thy
bao gm saccharides, polyssaccharides có s đa dng và phc tp. Rt nhiu
nucleosides đã đc tìm thy trong Cordyceps, bao gm uridine, mt vài cu
trúc tiêu biu ca deoxyuridines, adenosine, 2’3’ dideoxyadenosine (đc đa
ra th trng khp th gii nh là cht antiretroviruses ban đu cho điu tr lây
nhim HIV di các tên nh Didannosine, Videx,…) [1].
1.1.4.3. Polysaccharides
Mt s các polysaccharides và các cht dn xut dng khác nh là acid
cordycepic [d-mannito] đã đc tìm thy và xác đnh hot tính dc lý. Nhng
polysaccharides này có hiu qu trong vic điu tit đng trong máu, chng di
cn và hiu qu chng ung th và tng cng min dch [35][22].
1.1.4.4. Proteins và các hp cht Nitragenous
Cordyceps cha protein, peptide và tt c các acid amin thit yu khác,

Cordyceps cha mt s dipeptide cyclic không ph bin bao gm cyclo -[Gly-
Pro], cyclo - [Leu-Pro], cyclo -[Ala-Leu], cyclo - [Ala-Val] và Cyclo - [Thr-
Leu]. Khi lng nh các polyamine bao gm 1,3 diamino propane, cadaverine,
spermidine, spermine và pustrescine đã đc nhn dng và nhn đnh chúng có
tác dng kháng sinh [18].
1.1.4.5. Sterols
Mt s hp cht loi sterol đã đc tìm thy trong Cordyceps gm
ergosterol, Delta - 3 ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol và
6

campasterol Các hp cht này có liên quan ti sex-steroid chng ri lon tình
dc[45] nh hng đn ham mun và chc nng tình dc, tác đng ti h thng
hormon tình dc-trc hypothalomo-pituitary-adrenocortical hoc trc tip tác
đng lên c quan sinh dc [50].
1.1.4.6. Các thành phn cu to khác
28 acids béo đã đc bão hòa hay cha bão hòa và các cht dn xut ca
chúng đã đc tách chit t C. sinensis. Hp cht phân cc ca chit
xut Cordyceps bao gm rt nhiu hp cht hydrocarbon, alcohol và aldehyde.
Trong đó có cht hydrocarbon aromatic polycylic (PAH) đc sn xut bi
Cordyceps sinensis nh là cht chuyn hóa th cp.
1.1.5. ng dng
1.1.5.1. Y-dc
Các nghiên cu y hc và dc hc đã chng minh đc nm ông trùng h
tho Cordyceps có nhng tác dng sau: kìm hãm s phát trin ca t bào ung th
máu [26][36], ung th phi, ung th vú [19]. Nhiu nghiên cu cng đã chng
minh nm có hiu qu trong cha tr ri lon chc nng ca gan [33], s lão hoá,
các chng viêm [47]. Ngoài ra nm còn có tác dng kìm hãm s oxy hoá ca lipid,
lipoprotein và lipoprotein t trng thp [8]…
Vi nhng tác dng trên thì nm ông trùng h tho còn trc tip nh hng
đn mt s h thng quan trng trong c th .

H thng min dch
Cordyceps có tác dng điu tit min dch ca c th và ngn nga bnh.
ông trùng h tho giúp tng cng kh nng min dch bng cách tng t bào
lympho, các t bào git t nhiên, sn xut các interleukin, interferon và các
nhân t hoi t khi u [25][29]. Cordyceps còn đc s dng đ c ch min
dch c th là kim soát các ri lon t min dch và viêm khi xy ra tn thng
mô, cng nh đ ngn chn thi ghép sau khi cy ghép ni tng [44]. Ngoài ra
7

Cordyceps còn gây c ch và tác đng lên h min dch thông qua điu chnh min
dch bm sinh và đáp ng min [28][34].
H thng tun hoàn tim, não
Nm đông trùng h tho có tác dng làm giãn mch máu, làm tng lu lng
tun hoàn máu  não và tim [21]. Mt khác, nm còn có kh nng điu chnh lipit
máu, làm gim lng cholesterol và lipoprotein, hn ch quá trình tin trin ca
tình trng x va đng mch [48].
H hô hp
Cordyceps có tác dng vi nhiu bnh v phi: hp ph qun, viêm ph qun,
lao, hen và phòng chng khí ph thng. Nm có tác dng chng viêm và đc tr vi
bnh hen ph qun, tng s lu thông không khí trong phi do đó gim nh các cn
hen [49].
H thng ni tit
Theo Chen và cs cho bit nm ông trùng h tho có tác dng làm tng
trng lng tuyn v thng thn và tng tng hp các hormon tuyn này, đng
thi nm có tác dng tng t nh hormon nam tính và làm tng trng lng tinh
hoàn cng nh các c quan sinh dc ph trên đng vt thc nghim. Ngoài ra nm
còn có tác dng chng ung th, chông viêm nhim, chng quá trình lão hoá và trn
tnh chng co git [10].
1.1.5.2. Kim soát sinh hc
Nm kí sinh côn trùng là thiên đch ph bin ca các loài chân khp trên khp

th gii và đc xem nh là các đi tng kim soát sinh hc [14][40]. Nhóm nm
này có s phân b rng, tính đa dng các loài nm côn trùng tùy thuc vào điu kin
môi trng, tính đa dng ca các loài côn trùng và tình trng ca ký ch [23].
Nhiu loài nm côn trùng đã đc ng dng rng rãi trong đu tranh sinh hc
kim soát dch hi, trong đó ph bi
n là các loài Beauveria bassiana, Metarhizium
anisopliae và Normurea rileyi. Trong đó Beauveria bassiana hay còn gi là nm
8

bch cng, ký sinh trên sâu bm và côn trùng cánh cng; Metarhizium anisopliae
hay nm lc cng chính là th vô tính ca Cordyceps brittlebankosoides[30]; còn
Normurea rileyi là nm bt gây bnh trên sâu đc thân, sâu cun lá, sâu keo và sâu
phao. Theo Taborsky (1992), ng dng đu tiên s dng Metarhizium anisopliae
cho đu tranh sinh hc đc thc hin vào nm 1888 bi Krassilstchik [43].
Ti Vit Nam, nhiu nghiên cu đã thành công trong vic s dng nm côn
trùng phòng tr các loi côn trùng và sâu hi cây trng, đin hình nh n
m
Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã đc ng dng trong phòng tr,
sâu hi đu tng và đu xanh [7],
ry mm và các loài sâu hi lúa [4].
1.2. NGHIÊN CU NH DANH
1.2.1. nh danh bng đc đim hình thái và phân tích gii phu
Trc đây, vic đnh danh và xây dng h thng hc các loài nm này ch yu
da trên phân tích hình thái gii phu nh cu trúc th sinh sn, dng bào t , hình
dng qu th, màu ca cht nn Nm 1982, Kobayashi trên c s x lý các thông
tin t vic phân tích 282 loài Cordyceps, 59 loài Torrubiella và 75 loài thuc v các
chi lân cn khác đã xây dng nên khóa đnh loi cho nhóm Cordyceps và
Torrubiella [24]. Khóa đnh loi này đn nay vn
đc xem là hu hiu nht đ
đnh danh nhóm nm này theo phng pháp c đin.

Vic phân loi nm mt cách chính xác là mt công vic khó khn. Nhng
phân tích hình thái qu th và côn trùng ch mà nm ký sinh không th đa ra kt
lun chính xác v loài. Nm tuy có cu trúc đn gin nhng li có thành phn loài
vô cùng phong phú. Mt khó khn khác là đc đim lng danh ca chúng. Ví d
nh Tolypocladium inflatum đã đc Hodge và cs ch
ng minh đây là mt th vô
tính ca C. subsessilis.
Do đó, nghiên cu v mt phân t kt hp tin sinh hc là xu hng mi giúp
h tr đnh danh chính xác hn, c th trong phm vi đ tài là tp trung phân tích,
so sánh các trình t DNA ca các vùng gen rpb1.

1.2.2. Tng quan v gen rpb1
9

Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II – tiu đn v ln nht ca
RNApolymerase II) là vùng gen mã hóa cho tiu phn ln nht ca protein RNA
polymerase II. ây là enzyme xúc tác quá trình sao mã RNA t DNA  Eukaryote.
Gen này có cha vùng carbon đu cui là 52 vùng lp li heptapeptide có chc
nng quan trng trong s hot đng ca enzyme RNA polymerase. Vùng lp li
này còn đc gi là CTD (C-terminal domain) gm các acid amin lp li giàu
Serin (Tyrosine-Serine-Proline-Threonine-Serine-Proline-). Ser 5 là v trí
phosphoryl hóa bi hot đng kinase ca TFIIH, kích hot enzyme RNA
polymerase II chuyn dch qua promotor và phiên mã.

Hình 1.1. Mô t chc nng ca vùng CTD ca gen rpb1 [16]
Rpb1 có trng lng phân t khong 220kDa, chiu dài khong 3Kbp có cha các
vùng exon có đ bo tn cao đc th hin trong hình 2 (vùng tô đen là các exon) [51].

Hình 1.2. Cu trúc vùng gen rpb1 [52]
Gen rpb1 thng đc s dng trong nghiên cu phân tích ph h  sinh vt

nhân thc nh thc vt, đng vt, nm. a s gen rpb1  các loài ch có mt bn
sao ch tr  mt vài loài thc vt và loài Trypanosome cha gen paralogous [37].
Mt s công trình nghiên cu s dng gen rpb1 đ h tr cho vic nghiên
cu phát sinh ph h:
10

Croan và cs đã s dng gen rpb1 đ vic nghiên cu mi quan h hàng gia
các loài nm Leishmania. Tác gi đã so sánh trình t gen gia DNA và RNA
polymerase[12]. Hn th có th s dng rpb1 đ phân tích phát sinh loài  mc sâu
hn. Theo Hirt và cs đã s dng trình t gen rpb1 đ chng minh Microsporidia
(sinh vt hoi sinh hoc kí sinh) có quan h gn vi gii nm [17]. Tác gi
Matheny và cs đã s dng vùng gen rpb1;
rpb1 kt hp rpb2 so sánh vi vùng gen
mã hóa cho ribosome-nLSU đ ci thin và m rng phân tích cây phát sinh loài 
nm [31][32]. Do đó vic s dng gen rpb1 làm c s phân t đ tin hành nghiên
cu phát sinh loài và dng cây ph h phân t đ h tr đnh danh nm ký sinh côn
trùng là hp lý.
1.3. NGHIÊN CU PHÁT SINH LOÀI
1.3.1. Ph h phân t trong nghiên cu phát sinh loài:
Ph h phân t là nghiên cu v mi quan h tin hóa ca tp hp các trình t
gen, da vào phân tích s khác bit di truyn phân t (DNA, RNA, protein). Kt
qu phân tích phân t đc th hin qua mt cây ph h. Dng cây ph h phân t
là mt quá trình phc tp bi thc t là không th xây dng mt cây đúng nht. Tp
hp d liu phát sinh loài có th bao gm hàng trm loài khác nhau, m
t trong s đó
có th đã thay đi t l đt bin dn đn nh hng tin hóa. Do đó, hin nay có rt
nhiu mô hình tin hóa khác nhau, các phng pháp phân tích phát sinh chng loài,
dò tìm cây tin hóa ti thích cho mt phân tích phát sinh loài [21].
1.3.2. Nhng bc c bn trong nghiên cu phát sinh loài:
1.3.2.1. Chn la marker phân t và sp xp b d liu

Tùy theo mc đích dng cây ph h phân t mà xác đnh protein hay trình t
DNA s là d liu đc chn. Tip theo là phi thu thp các trình t này đ to ra
mt c s d liu cc b. Hin nay, nh có các công c trc tuyn min phí đã giúp
cho công vic này tr nên đn gin hn. Các trình t quan tâm có th ly t trang
NCBI hay các công c tìm kim tng đng khác. Khi đánh giá các trình t l
y
trong BLAST, cn chú ý ti s đim (score) và giá tr E (E-value). Mt đim s cao
11

ch ra mc đ tng đng gia các trình t vi chui trình t truy vn, giá tr E-
value biu th xác sut các trình t tng đng, giá tr E càng nh chng t đ đc
hiu càng cao [21].
1.3.2.2. c và hiu chnh trình t
Do các phân tích phát sinh chng loài da trên nhng s khác bit khi quan
sát các trình t đc so sánh thng hàng. Do đó li trình t s có th đa đn mt
cây tin hóa không chính xác. c bit vi trng hp vùng DNA có đ bo tn cao
và nhà phân tích chn mô hình tin hóa phc tp thì li trình t s cho ra kt qu có
đ sai khác rt ln.  tránh trng hp li trình t do ch quan, ngi ta buc phi
đc trình t c
hai si đ vic hiu chnh sau đó đc đm bo tính khách quan hn.
1.3.2.3. Sp ct thng hàng các trình t
Vic sp ct thng hàng thng đc thc hin bng máy tính mt cách t
đng, có th dùng ClustalW đ thc hin công vic này. Tuy nhiên, vi nhng gen
hay vùng DNA kém bo tn thì quá trình sp xp thng hàng t đng rt d gây ra
li. Do đó vi gene hay vùng DNA có đ bin thiên cao cn đc trc tip thc
hin quá trình sp xp thng hàng bng mt. Vi nhng vùng không có kh nng
sp xp thng hàng thì cn phi loi b trc khi đa vào phân tích [21].
1.3.2.4. Chn la mô hình tin hóa
Trc khi chui d liu thc s đc tính toán và phân tích, chúng phi tri
qua quá trình kim tra dò tìm mô hình tin hóa thích hp. Các mô hình này da vào

quá trình đt bin ngu nhiên, chúng là kt qu thay đi trình t trong chui phân
t, mt s trong đó xy ra mt cách tình c hoc chn lc t nhiên. Cây phát sinh
loài đc gi đnh và tin hành thc hin thay th mt cách ngu nhiên
Mt vài mô hình tin hóa ngu nhiên ph bin gm ph
ng pháp phng pháp
Jukes - Cantor , phnng pháp Kimura, Hasegawa - Kishino - Yano (HKY),
Tamura Nei, General Time Reversible (GTR)
Mô hình tin hóa phc tp nht hin nay là mô hình có kh nng hi bin tng
quát theo thi gian (General time reverible model). Mô hình này thng to thành
12

dng ghép GTR+I+, kt hp bi các thông s sau: t l thông s ma trn (r(AC),
r(AG), r(AT), r(CG), r(CT), và r(GT) =1); tn sut base (A, C, G vi T =1–
(A+C+G)) và phân b gamma [21].
1.3.2.5.Phân tích s phát sinh chng loài
Vài phng pháp nhm suy lun cây phát sinh chng loài đã đc bit khá rõ hin
nay đu là nhng phng pháp kt hp thut toán dò tìm cây ti thích và mt nhóm
tiêu chun ti u chn trc. Tin trình thc hin ca nó là dò tìm nhng cây tin
hóa ti thích, sau đó nhng cây tin hóa này đc đánh giá di nhng tiêu chun
ti u chn trc đ cho ra mt cây tin hóa tt nht [27].
Dò tìm cây tin hóa ti thích
Phng pháp dò tìm cây tin hóa ti u là phng pháp kt hp thut toán dò
tìm cây ti thích nh thut toán phân nhánh và gii hn (branch- and- bound) và
thut toán t tìm tòi (heuristics) cùng vi mt nhóm tiêu chun ti u chn trc,
cây tin hóa tt nht là cây tin hóa tha mãn vi nhng tiêu chun đã đc chn
trc.

Tiêu chun ti u
Tiêu chun ti u là quá trình thit lp mô hình tt nht v lch s tin hóa da
vào nhng thông tin cha hoàn chnh ca d liu. Phng pháp s dng tiêu chun

ti u có 2 bc theo th t: u tiên là xác đnh mt tiêu chun có chc nng tính
đim cây. Bc hai là tìm mt cây thay th ng vi mt tiêu chun này ri t đó tìm
ra mt cây. Quá trình tt s cho ra nhi
u gii pháp thay th ti u.
Phng pháp Maximum parsimony (MP -hà tin ti đa)
Phng pháp tin hành đánh giá sai khác nucleotide ti tng v trí và thc hin
cho đim các cây có th. Cây tt nht là cây có tng s thay đi tin hóa (s thay th
nucleotide) ít nht. Phng pháp dò tìm cây theo thut tóan heuristics thng áp
dng cho phng pháp parsimony.

13

Phng pháp khong cách – distance method
Trong phng pháp này tng cp trình t mt s đc so sánh thng hàng cp
đôi và ng vi tng cp, khang cách di truyn có tính cng. Cây đc xây dng
bng cách tìm mt cp chui lân cn mà chúng gim thiu đ dài ca cây. Và đc
đim ca cây tin hóa dng bng phng pháp neighbor-joining là to ra mt cây
không gc.
ây là mt trong nhng phng pháp nhanh nht đ dò tìm cây tin hóa nên
nó thng đc s dng đ phân tích khi d liu ln vi nhiu taxa.
Phng pháp Maximum Likelihood
Nhóm phng pháp hp lý cc đi nhóm phng pháp này da trên mt hàm
toán hc tính toán xác sut kh nng mt cây tin hóa đc to thành t d liu đã
quan sát. Hàm này cho phép vic tích hp các quá trình tin hóa ca đc tính thành
mô hình xác sut. Phng pháp hp lý cc đi chn la cây tin hóa ti đa mà khi
quan sát các d liu di mt mô hình nào đó có xác xut ti đa.
Phân tích giá tr bootstrap
Phân tính bootstrap là mt phng pháp thng kê đ có đc s c tính v
các li sai sót khi dng cây. Phân tích bootstrap thng dùng đ kim tra đ tin cy
mt cây, c th là đánh giá đ tin cy ca s phân nhóm loài trên mt cây. Phân tích

này thng đc s dng đ kim tra các taxa đc nhóm thành cm nh th nào
da vào các trình t nucleotide hay acid amin làm mu ph [13].u đim ca
phng pháp bootstrap là nó có th áp dng cho tt c các ph
ng pháp dng cây c
bn.

14

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CU TRONG NC
Hin nay  nc ta nghiên cu v nm Cordyceps đang trong giai đon mi
đt đc mt s kt qu. Vic nghiên cu mi ch mang tính cht điu tra, phát hin
và thu thp chúng trong điu kin Vit Nam.
Nm 2005, Phm Th Vng (Vin Bo v Thc vt) và Lng Vn Hà
(Vn quc gia Cúc Phng) cùng vi các nhà nm hc trng 
i hc Quc gia
Kangwon, Hàn Quc tin hành điu tra nhóm nm ký sinh côn trùng ti vn quc
gia Cúc Phng. Nghiên cu s dng phng pháp so sánh hình thái gii phu đ
phân loi. Kt qu công b có các loài Cordyceps sp., C. nutans, C. pruinosa, C.
specocephala và Beauveria bassiana, Beauveria sp., Gibellalus sp., Paecilomyces
sp.[15].
Nm 2006, nhóm các nhà nghiên cu nm ký sinh côn trùng ca BIOTEC,
Thái Lan đã kt hp vi Vin Sinh hc Nhit đi kho sát nhóm nm này trong
vn quc gia Cát Tiên. Kt qu công b vào n
m 2007 cho bit h đã thu đc
tng cng 259 mu nm. S b đnh danh bng hình thái da trên h thng phân
loi mi cho thy có tng cng 41 loài đc ghi nhn thuc 17 chi bao gm
Akanthomyces, Aschersonia, Beauveria, Conoideocrella, Cordyceps, Gibellula,
Hirsutella, Hymenostilbe, Hypocrella, Isaria, Metarhizium, Moelleriella, Nomuraea,
Ophiocordyceps, Paecilomyces, Torrubiella và Verticillium. Tuy nhiên trong s này
ch ghi nhn có 1 loài thuc chi Cordyceps và 2 loài thuc chi Ophiocordyceps (Lê

Tn Hng & cs 2010)[2].
Nm 2009, Vin Khoa Hc Lâm Nghip Vit Nam và trng i hc Lâm
Nghip đã tin hành đi
u tra thu mu nm THT (Cordyceps nutans) ti khu bo
tn Tây Yên T - Sn ng - Bc Giang. Tác gi Phm Quang Thu đã thông báo
phát hin đc loài nm ông trùng h tho và đc giám đnh là loài Cordyceps
nutans. ây là loài nm đu tiên đc mô t và ghi nhn có phân b ti Vit Nam
[5].
15

Ti hi tho: “Khoa hc và công ngh phc v sn xut nông nghip, công
nghip cao ti tnh Lâm ng” (2013) có báo cáo ca Phm Quang Thu v nghiên
cu nuôi trng qu th ca ông trùng h tho [6] và ca Nguyn Mu Tun và
cng s v mt s kt qu nghiên cu nm ông trùng h tho  tnh Lâm ng [3].
1.5. THU THP C S D LIU
1.5.1.Mc đích
Hin nay trên th gii có nhiu nhóm nghiên cu sinh hc hot đng trong
nhiu lnh vc khác nhau, nhu cu trao đi thông tin càng cn thit hn. Các c s
d liu trên th gii ra đi vi mc đích giúp các nhà sinh hc có điu kin trao đi
thông tin, qun lý, khai thác kho d liu sinh hc khng l. c bit vi nghiên cu
đnh danh và phân loi bng sinh hc phân t, nhu cu tham kho và chia s
thông
tin là mt trong nhng nhu cu cn thit.Các nghiên cu này cn tp hp lng d
liu mu ln, có đ tin cy. T đó mi có th thng kê chính xác, so sánh và đa ra
ra kt qu.
1.5.2. Khai thác và x lý thông tin
Hin nay có rt nhiu dng c s d liu thuc nhiu lnh vc vc sinh hc
khác nhau, trong đó d liu v sinh hc phân t luôn chim u th do tính đc thù
trong nghiên cu.
Trong nghiên cu sinh hc phân t, thng xuyên phi làm vic trên các đi

tng là nucleic acid (DNA) và protein. ây là các dng trình t sinh hc đc lu
ph bin trong các c s d liu sinh hc. Hin nay, các thông tin này đc lu tr
ch yu trong các c s d liu ln trên th gii nh h thng GenBank (NCBI,
USA), EMBL (European Molecular Biology Laboratory, UK), DDBJ (DNA
Database of Janpan, JP) và mt s h thng c s d liu khác trên th gii.
C s d liu NCBI
NCBI (National Center for Biotechnology Information) là tài nguyên quc gia
ca M v thông tin sinh hc phân t. NCBI to thành và lu tr nhng c s d