Khảo sát khả năng phát sinh mô sẹo (Callus) và tái sinh cây bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn in vitro trên một số tổ hợp lai của lúa (Oryza sativa L)

i

LI CM N
u tiên, con xin cm n ba má đư sinh con ra, dy d, nuôi nng cho con n hc nên
ngi
K đn, em xin gi li cm n chơn thƠnh đn tt c thy cô trong khoa Công ngh sinh
hc đư truyn đt cho em kin thc trong sut quá trình hc tp.
Em xin gi li cm n sơu sc đn cô Lê Th Kính đư hng dn em thc hin đ tài.
Em cm n anh Hi, ch Trang, anh Khánh cng nh các ch trong t Nuôi Cy Mô ca
Trung Tâm Nghiên Cu Ging Cây Trng Min Nam đư luôn giúp đ em trong thi
gian qua.













ii

Mc lc
I. TNG QUAN 1
1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa. 1
1.1.1. Tình hình nuôi cy bao phn lúa trên th gii 1
1.1.2. Tình hình nuôi cy bao phn  Vit Nam 4

1.2. C s khoa hc ca nuôi cy in vitro 6
1.2.1. Tính toƠn nng ca t bào 6
1.2.2. S phân hoá và phn phân hoá t bào 7
1.2.3. C ch di truyn thông qua các th h t bào 8
1.2.4. Môi trng nuôi cy (môi trng dinh dng) 9
1.2.5. iu kin vô trùng 10
1.2.6. iu kin ánh sáng và nhit đ 10
1.2.7. Vt liu nuôi cy 11
1.3. Các yu t nh hng đn quá trình nuôi cy bao phn lúa 12
1.3.1. Kiu gen ca cây cho bao phn 12
1.3.2. Giai đon phát trin ca bao phn 12
1.3.3. iu kin sinh lý ca cây cho bao phn 13
1.3.4. Nhit đ và thi gian x lỦ đòng 13
1.4. Các giai đon chính trong nuôi cy bao phn 14
1.4.1. Khái nim nuôi cy bao phn 14
1.4.2. Các giai đon chính 15
1.5. K thut đn bi in vitro và công tác ging cây trng 17
1.5.1. Cơy đn bi 17
1.5.2. K thut đn bi trong công tác chn to ging cây trng 18
II. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 22
iii

II.1 Vt liu. 22
II.1.1 a đim và thi gian thí nghim 22
II.1.2 Vt liu 22
II.2 Phng pháp nghiên cu. 22
II.2.1 Kho sát kh nng to mô so (callus) ca mt s kiu gen (thí nghim 1).22
II.2.2 Kho sát kh nng tái sinh cơy ca mt s kiu gen (thí nghim 2). 23
II.2.3 Xác đnh cơy đn bi vƠ đn bi kép. 25
III. KT QU VÀ THO LUN 26

III.1 Kho sát kh nng to mô so ca mt s kiu gen (thí nghim 1). 26
III.2 Kho sát kh nng tái sinh cơy ca mt s kiu gen (thí nghim 2). 28
III.3 Xác đnh cơy đn bi vƠ đn bi kép. 34
IV. KT LUN VÀ  NGH 40
IV.1 Kt lun 40
IV.2  ngh 40






iv

Mc lc Hình nh, Bng và Biu đ
Hình 1: Chiu dƠi đng lúa cn thu khong 20 cm 24
Hình 2: V trí ly bông lúa t đng lúa 24
Hình 3: Gié lúa thích hp cho nuôi cy bao phn (A), bao phn tách ri (B) (3x) 25
Hình 4: on bông lúa chun b đem cy bao phn 25
Hình 5: Mô so phát sinh t bao phn lúa trên môi trng N6 sau 1 tháng nuôi cy 26
Hình 6: Mô so phát sinh t bao phn lúa s đc chuyn vƠo môi trng tái sinh MS
28
Hình 7: Quá trình phát trin mô so ca t hp lai LL5 29
Hình 10: Mô so cht (t hp lai LL3) 32

Hình 11: Cây bch tng ậ LL5 (2 tun tui) 33
Hình 12: Cơy bình thng ậ LL5 (2 tun tui) 33

Hình 13: Cây bch tng ậLL5 (1 tháng tui) 34
Hình 14: Cơy bình thng ậ LL5 (1 tháng tui) 34

Hình 15: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 (A) và LL2 (B) 1 tháng tui34
Hình 16: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 45 ngày tui 35
Hình 17: cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 2 tháng tui 35
Hình 18: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 3 tháng tui 36
Hình 19: Chun b thu ht 36
Hình 20: S khác bit v kh nng sinh trng và phát trin gia cơy đn bi vƠ đn
bi kép, (A) cơy đn bi kép ậ t hp lai LL5, (B) cơy đn bi ậ t hp lai khác 37
Hình 21: S khác bit v hoa ca cơy đn bi kép ậ t hp lai LL5 (A) vƠ cơy đn bi ậ
t hp lai khác (B) 38

Bng 1: Bng b trí nghim thc 22
Bng 2: nh hng ca kiu gen đn kh nng to mô so 26
v

Bng 3: nh hng ca kiu gen đn kh nng to cây tái sinh 29

Biu đ 1: nh hng ca kiu gen đn kh nng to mô so 27
Biu đ 2: nh hng ca kiu gen đn kh nng phát trin ca mô so 30
Biu đ 3: nh hng ca kiu gen đn s bit hóa ca mô so 31
Biu đ 4: nh hng ca kiu gen đn kh nng to cây tái sinh 33

Bng vit tt
Cs: cng s
IAA: Indole-3-acetic acid
NAA: 1-Naphthaleneacetic acid
BA: 6-Benzylaminopurine
2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

vi

T VN 
Cây lúa (Oryza sativa L.) lƠ cơy lng thc gi vai trò quan trng hƠng đu. Mi
nm, khong 1/2 dân s th gii s dng lúa go lƠm lng thc chính. Lúa đc trng
ph bin  các nc Châu Á, Châu Phi, Châu M La Tinh. i vi các nc Chơu nh:
n , Trung Quc, Indonesia, Bangladesh, Myanmar, Thái Lan và Vit Nam thì lúa
go lƠ cơy lng thc đc bit quan trng trong đi sng con ngi.
Trong nhng nm gn đơy, cùng vi đƠ tng dơn s, s phát trin mnh m ca
nn công nghip vƠ đô th hoá nông thôn làm cho din tích đt trng trt ngày càng thu
hp li.  đáp ng đ nhu cu lúa go ca ngi tiêu dùng vƠ an ninh lng thc quc
gia, các nhà to ging phi tìm cách lƠm tng nng sut, sn lng lúa trên din tích đt
trng không th m rng. Phng án s dng các bin pháp k thut thâm canh trên
nhng ging lúa cao sn, chu thâm canh là thích hp nht.
Bng phng pháp lai to truyn thng
các nhà to ging đư có nhiu thành công
vi nhng ging mi có nng sut và sn lng cao. Song vic s dng phng pháp
này tuy có to ra nhng t hp lai nng sut cao nhng đ thun cha n đnh. Mt
khác, nu áp dng phng pháp lai to truyn thng thì phi mt khong 10 v (4-5
nm) mi có đc dòng thun. Trong nhng nm gn đơy, vic ng dng bin pháp
nuôi cy bao phn to các dòng đn bi kép, nhanh chóng to các ging lúa thun có
nng sut cao, chng chu tt, đư thu đc nhiu kt qu. ó lƠ phng pháp to dòng
thun nhanh (1 nm) và hiu qu nht.
 thành công trong vic to các dòng thun bng k thut nuôi cy chúng ta
phi xác đnh đc nhng yu t v kiu gen, môi trng dinh dng, các tác nhân vt
lý, hoá hc… Trong đó, kiu gen là yu t đc nhiu nhà khoa hc đt lên hƠng đu
(Sharmin S. 2003, Sharmin S.2004) do nó nh hng rt ln đn kh nng to mô so

cng nh s lng, cht lng cây tái sinh. Tuy nhiên, đó lƠ nhng nghiên cu  nc
vii

ngoài, trong khi các ging lúa  nc ta phát trin  nhit đ, điu kin sinh trng
khác nhau. Do đó, yu t kiu gen cn đc kho sát li nhm xác đnh phng pháp
nuôi cy bao phn có hoàn toàn thích hp cho tt c các kiu gen ca lúa  nc ta hay
không, hay ch ti u cho mt s kiu gen thôi.
Xut phát t nhng vn đ trên, chúng tôi tin hành thc hin đ tài: Kho sát
kh nng phát sinh mô so (callus) và tái sinh cây bng phng pháp nuôi cy bao
phn in vitro trên mt s t hp lai ca lúa (Oryza sativa L.)”.
1


I. TNG QUAN
1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa.
1.1.1. Tình hình nuôi cy bao phn lúa trên th gii
Nm 1968 Nishi vƠ cng s là nhng tác gi đu tiên thƠnh công trong lnh vc
nuôi cy bao phn trên nhng cây mt lá mm sau khi công b kt qu tái sinh cây lúa
hoàn chnh t mô so. Sau đó, hƠng lot các tác gi cng công b nhng kt qu kh
quan nh: Chu et. al (1975), Chen (1977),. Kt qu to cơy đn bi và lng bi thun
thu đc ch yu  loài ph Japonica, đi vi loài ph Indica thì kt qu cha cao.
Các ging lúa có ngun gc h ph Indica là nhng ging lúa khó tính trong
vic nuôi cy bao phn.  tin ti thành công, các nhà khoa hc đư vƠ đang tìm cách
xác đnh s nh hng ca các yu t có tác đng trc tip hoc gián tip đn quá trình
nuôi cy. Các yu t đó lƠ: Kiu gen ca cây cho phn, giai đon phát trin ca cây
trong thi đim ly mu, thành phn môi trng nuôi cy, các yu t vt lý nh nhit
đ, ánh sáng
* nh hng ca kiu gen cây cho bao phn:
S thay đi ca tn s to mô so và kh nng tái sinh ca mô so  phn hoa
ph thuc phn ln vào kiu gen ca cây. Kt qu quan sát ca Sharmin S. (2004) cho

thy s khác bit ca các kiu gen kéo theo s khác bit trong kh nng nuôi cy lúa.
Kiu gen loài ph Indica phát trin và to mô so kém so vi loài ph Japonica.
Theo Mathias và Fukki (1986) kh nng tái sinh ca cây lúa trong nuôi cy t
bào b chi phi bi s tng tác t bào cht, nhân ca chính nó.
* nh hng ca giai đon phát trin ca cây trong thi đim ly mu
Các tác gi Oono (1975), Lin (1976), Chen (1977) cho thy: mu bao phn đc ly
vào thi đim các tiu bào t trong bao phn đang  giai đon đn bƠo mun là tt
nht. Bao phn  giai đon t th không có kh nng phát trin trong môi trng nuôi
cy in vitro, Bao phn  giai đon đn bƠo sm phát trin kém.
2

Ht phn ch có th phát trin tt khi đư tách ra khi t t (giai đon đn bƠo gia đn
đn bƠo mun).
*nh hng ca nhit đ và thi gian x lý đòng
Kêt qu nghiên cu ca Zhou vƠ Cs (1983) đư cho thy rng: X lỦ đòng 
nhit đ thp rt có hiu qu trong nuôi cy bao phn lúa. iu kin lnh lƠm tng kh
nng to cây xanh.
 Chaleff và Cs (1975) x lỦ đòng  6
o
C trong 5 ngày
 Hu vƠ Cs (1978) đư x lỦ đòng lúa  nhit đ 10
0
C trong thi gian 4 - 8 ngày.
 Matitin vƠ Drimo Millo (1981) đư tin hành x lỦ đòng lúa  nhit đ 2 ậ 4
o
C
trong thi gian 48h.
 Gupta vƠ Borthakeu (1987) đư x lỦ đòng lúa  nhit đ 10
0
C trong thi gian

11 ngày.
 Guapta, Quimio và Zapata (1990) x lỦ đòng  6-8
o
C trong thi gian 8 ngày.
 Rush và cng s (1982) đư tin hành x lỦ đòng lúa  nhit đ 40
o
C trong
thi gian 15 phút.
 Nm 1886, Torrizo x lỦ đòng  35
o
C trong 15 phút cng cho kt qu kh
quan.
Nói chung, đư có nhiu thí nghim nghiên cu v s nh hng ca nhit đ và thi
gian x lỦ đòng đn kt qu nuôi cy bao phn lúa. Kt qu nghiên cu ca các tác gi
cho thy rng x lỦ đòng  nhit đ khác nhau s cho nhng kt qu nuôi cy khác
nhau
* nh hng ca nng đ Cacbon đn quá trình to mô so và tái sinh cây.
Nng đ cacbon có th lƠm thay đi t l hình thành mô so và kh nng tái
sinh cây trong nuôi cy bao phn lúa.
Chen (1978) cho bit đng có tác dng lƠm thay đi áp sut thm thu ca môi
trng nuôi cy. Nng đ đng trong môi trng nuôi cy t 6 - 8% s lƠm tng c
hai quá trình hình thành mô so và tái sinh tip theo.
3

Nm 1988 Kim vƠ Paghavan thông báo rng: T l hình thành mô so t bao
phn s gim đi khi nng đ đng trong môi trng nuôi cy cao (8 -12%)
* nh hng ca cht điu hoà sinh trng đn quá trình to mô so và tái sinh
cây.
Trong k thut nuôi cy bao phn lúa, các cht điu hoà sinh trng có th s
dng  dng đn hay kt hp theo nhng t l khác nhau

Nm 1980, Khi nuôi cy bao phn lúa Japonica, Yang và cng s đư s dng kt hp
NAA 4mg/l + 2,4D 1mg/l + IAA 2mg/l + Kinetin 3mg/l . Kt qu cho thy rng nu
môi trng to mô so có cha 2,4D nng đ 1mg/l thì mô so d dàng tái sinh thành
cây.
Theo Wasakd (1982): IAA xúc tin quá trình hình thành r, S kt hp các
auxin: IAA, NAA, Kinetin mt cách hp lý s xúc tin mnh m quá trình phân hoá t
bào và tái sinh cây xanh.
Nhìn chung, các cht tham gia vào môi trng nuôi cy bao phn lúa nh cht
điu hoà sinh trng, mui, đng, st, Vitamin đu có s nh hng ln nhau và
nh hng chung đn kt qu ca quá trình nuôi cy.
* nh hng ca các yu t vt lý trong môi trng
Các yu t vt lý ca môi trng bao gm:
 Trng thái vt lý ca môi trng  dng rn hay lng
  pH môi trng
  m không khí
 Ánh sáng và nhit đ ca phòng nuôi cy
Các yu t trên tác dng trc tip đn s hình thành mô so và kh nng tái sinh
chi.
Kt qu nghiên cu lúa mì ca Bjarmsta (1989) cho thy rng x lý ánh sáng
cng đ cao s kìm hãm quá trình to mô so nhng li kích thích quá trình to cây
4

xanh, ánh sáng yu hoc ánh sáng khuych tán không nh hng gì đn kh nng to
mô so ca mu cy.
* nh hng ca các môi trng khác nhau đn quá trình nuôi cy bao phn.
Các môi trng khác nhau s cho nhng kt qu nuôi cy bao phn là khác
nhau. Nm 1962 Dono thông báo môi trng MS là môi trng thích hp nht cho
nuôi cy bao phn. n nm 1975 thì Chu vƠ cng s li thông báo rng môi trng
N6 là môi trng tt nht cho nuôi cy bao phn lúa.
Nm 1974, hai nhóm nghiên cu ca Chen vƠ Wang đư thƠnh công ln khi s

dng môi trng Miller trong nuôi cy bao phn lúa.
Rt nhiu tác gi có chung mt kt lun rng: môi trng có nng đ mui vô
c cao s rt thích hp cho phân hoá mô so.
1.1.2. Tình hình nuôi cy bao phn  Vit Nam
 nc ta, nghiên cu nuôi cy mô thc vt mi bt đu t nm 1975 ( Nng
Vnh, 2005). K thut nhân ging in vitro đư đc tin hành trên nhiu đi tng thc
vt khác nhau nh: chui, khoai tơy, cƠ chua, ngô, lúa, phong lan…vƠ cng đư đt đc
nhng kt qu nht đnh, lƠm tng h s nhân ging và to đc ging mi sch bnh 
các loi cây này.
K thut nuôi cy bao phn lúa đc ng dng rt sm vào công tác chn to
ging vƠ đư đc tin hành  nhng c quan nghiên cu khoa hc, các trng đi hc.
Phng pháp nƠy đc thc hin có s tr giúp ca công ngh sinh hc nhm chuyn
lp gen, gây áp lc bng điu kin ngoi cnh bt li  mc đ t bào (rét, nóng, bnh
hi…), nuôi cy bao phn, dung hp t bào trn, nuôi cy phôi lúa. Bng công ngh
sinh hc ngi ta có th ch đng chuyn thêm mt s gen mi có li đư đc nghiên
cu k vào cây lúa nh gen kháng bc lá, gen chu phèn, gen chu rét, gen chu
mn…Tuy nhiên s lng nhng ging lúa đt nng sut, cht lng đc to ra cha
nhiu.
5

 Nng Vnh và Lê Th Diu Mui, 1978 đư nghiên cu mt s yu t nh
hng đn kh nng to thành mô so và to thành cây lúa t ht phn bng phng
pháp nuôi cy in vitro.
Sau nhiu nm tin hành nghiên cu v nuôi cy bao phn, nm 1993 Nguyn
Hu H và Nguyn Vn Uyn đư có nhng kt lun sau:
- Trong mô túi phn có cht c ch nh hng ti s phát trin ht phn
- Gia phôi dinh dng và ht phn hoc là gia các phôi vi nhau luôn luôn có
s cnh tranh làm c ch quá trình tái sinh cây.
- Trong môi trng nuôi cy, phôi dinh dng nh bi phát trin mnh hn ht
phn tách ri dn đn kt qu là mô so nh bi chim u th so vi mô so đn

bi.
-  loi b các nhân t cnh tranh đi vi s phát trin ca ht phn, các nhà
nghiên cu đư tin hành nuôi ht phn ht phn sau khi đư tách ri khi mô túi
phn. Song kt qu đt đc vn còn rt khiêm tn. Thc t cho thy t l mô
so hình thành thp, sc tái sinh cây t mô so cng không cao.
Cng trong thi gian này, các tác gi đư th nghim nuôi cy bao phn lúa trong
môi trng lng và rút ra kt lun:
 Môi trng lng thun li cho s hp thu dinh dng hn môi trng rn.
 Các cht đc do ht phn cht to ra không có tác đng xu ti các ht phn
khác bi vì nó đư b khuch tán vào môi trng lng.
Nm 1994, Vin di truyn nông nghip công b quá trình nuôi cy bao phn,
nâng cao t l to mô so và kh nng tái sinh ca cơy đn bi (Nguyn Vn ng, V
c Quang, Phm Ngc Lng, Trn Duy Quý 1994).
T nm 1994 ậ 2001, đư có công trình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa mi đ
chn to ngun vt liu khi đu phc v phát trin lúa lai đc công b (Vin di
truyn nng nghip 1997 - 2000).
6

Các nhà khoa hc Vit Nam đư đt đc mt s thành tu có Ủ ngha to ln
trong sn xut. Ti vin Di Truyn Nông nghip, phng pháp nuôi cy bao phn kt
hp vi chn dòng bin d đư to ra 50 dòng bt dc phn ng vi nhit đ mi , trong
đó 5 dòng đc xác đnh là có tính bt dc n đnh, có u th lai cao khi lai to vƠ đang
đc s dng trong chn ging lúa lai 2 dòng.
Bng phng pháp nuôi cy bao phn đư to ra 12 dòng, ging thun có u th
lai gn tng đng vi con lai F1 các dòng ging có trin vng gm DT26, DT29,
DT32, AC22, AC23, AC24, AC25, đang đc kho nghim. Nh nuôi cy bao phn
lúa có th rút ngn thi gian chn ging mi xung t 4-6 th h. K thut đn bi in
vitro cng đang đc trin khai mnh trong chn ging  Vin lúa ng bng sông
Cu Long, Vin công ngh sinh hc (Trn Vn Minh, 1997).
Nhng nm gn đơy, V c Quang và cng s đư tin hành nghiên cu và ci

tin môi trng N6 thành môi trng HD. Ông cho rng môi trng HD có u đim
vt tri so vi môi trng N6 và là môi trng tt nht cho s phát trin ca bao phn
lúa.
Vin Di truyn nông nghip Hà Ni đư to ra 3 ging lúa quc gia DT10, A20, DT11
bng phng pháp gơy đt bin.
1.2. C s khoa hc ca nuôi cy in vitro
1.2.1. Tính toàn nng ca t bào
Haberlandt (1902) là ngi đu tiên đ xut phng pháp nuôi cy mô và t bào
thc vt đ chng minh tính toƠn nng ca t bào.
Haberlandt cho rng mi t bào ca bt k sinh vt nƠo cng đu có kh nng
tim tƠng đ phát trin thành mt c th hoàn chnh. Ông nhn thy rng, mi t bào
ca c th đa bƠo đu phát sinh t hp bào thông qua quá trình phân bào nguyên
nhim. iu đó có ngha lƠ mi t bào ca mt sinh vt s cha toàn b thông tin di
truyn cn thit ca mt c th hoàn chnh. Khi gp điu kin thun li nht đnh,
7

nhng t bƠo đó có th s phát trin thành mt c th hoàn chnh. (Nguyn c Thành,
2000)
Miller vƠ Skoog (1956) đư to chi thành công t mô thuc lá nuôi cy, chng
minh đc tính toƠn nng ca t bƠo. ThƠnh công trên đư to ra công ngh mi: Công
ngh sinh hc ng dng trong nhân ging vô tính, to ging cây trng và dòng chng
chu.
Tính toƠn nng ca t bƠo mƠ Haberlandt nêu ra chính lƠ c s lý lun ca phng
pháp nuôi cy mô và t bào thc vt. Cho đn nay, con ngi đư hoƠn toƠn chng minh
đc kh nng tái sinh mt c th thc vt hoàn chnh t mt t bào riêng r.
1.2.2. S phân hoá và phn phân hoá t bào
C th thc vt trng thành là mt chnh th thng nht bao gm nhiu c
quan chc nng khác nhau, trong đó có nhiu loi t bào khác nhau.
Mi t bào khác nhau s thc hin mt chc nng c th khác nhau nhng các t
bào này đu đc to thành t t bào phôi sinh. (Nguyn Quan Thch, 2005)

S phân hoá t bào là s chuyn các t bào phôi sinh thành các t bào ca mô
chuyn hoá, đm nhn các chc nng khác nhau trong c th. Quá trình phân hoá ca
t bào có th biu th nh sau:
T bào phôi sinh T bào giãn T bào chuyên hoá chc nng
riêng
Mc dù các t bƠo đư chuyn hoá thành các mô chc nng nhng chúng vn gi
nguyên kh nng phơn chia. Trong điu kin thích hp, các t bào li có th tr v dng
t bào phôi sinh và phân chia mnh m. Quá trình đó đc gi là phn phân hoá t bào,
(ngc li vi quá trình phân hoá t bào). Tuy nhiên, khi t bào đư phơn hoá thƠnh các
t bào có chc nng chuyên bit, chúng không hoàn toàn mt kh nng bin đi ca
mình. Trong điu kin cn thit  điu kin thích hp, chúng li có th tr v dng t
bào phôi sinh và phân chia mnh m. Quá trình đó gi là phn phân hoá t bào, ngc
li vi quá trình phân hoá t bào.
8

Quá trình phát sinh hình thái trong quá trình nuôi cy mô, t bào thc vt thc
cht là kt qu ca quá trình phân hóa và phn phân hóa t bào. K thut nuôi cy mô,
t bào xét cho cùng là k thut điu khin s phát sinh hình thái ca t bào thc vt
mt cách đnh hng da vào s phân hóa và phn phân hóa ca t bƠo trên c s tính
toƠn nng ca t bào thc vt.  điu khin s phát sinh hình thái ca mô nuôi cy,
ngi ta thng b sung vào môi trng nuôi cy 2 nhóm cht điu tit sinh trng
thc vt là auxin và cytokinin. Nu t l auxin/cytokinin thp thì s phát sinh hình thái
theo hng to chi; nu t l này cao thì to thành r, còn khi t l này cân bng thì s
phát sinh theo hng to mô so (Lê Trn Bình, 2004).
1.2.3. C ch di truyn thông qua các th h t bào
C ch di truyn thông qua các th h t bào bao gm các công đon:
Trong quá trình nguyên phân, t mt t bào m s nhơn đôi, to ra 2 t bào con
ging nhau và ging t bào m ban đu. Nh vy qua nguyên phân b NST trong ni
b tng c th đc din ra theo c ch nguyên phơn, đơy lƠ c ch phân bào mà t
mt t bƠo ban đu s phân chia thành hai t bào con có b NST ging b NST ca t

bào m đư truyn nguyên vn sang t bào con. S d có hin tng này là do trc mi
ln gim phân, mi phân t DNA đư thc hin quá trình tái sinh đ t mi phân t
DNA hình thành 2 phân t DNA ging nhau và ging DNA ban đu. Quá trình này
đc thc hin  k trung gian vƠ thông qua c ch phơn ly đu ca NST  k sau, là
c s cho s truyn nguyên vn thông tin di truyn trong ni b c th.
Gia 2 th h c th đc hình thƠnh thông qua c ch gim phơn đư lƠm cho 
th h đi sau có hin tng phân ly tính trng, do b NST ca th h sau không ging
nhau và không ging b m. Vì vy vic duy trì các tính trng mong mun  b m
sang th h sau bng sinh sn hu tính s không th đm bo hoàn toàn chc chn. ơy
là mt tr ngi ln trong sinh sn hu tính. Ngày nay bng phng pháp sinh sn vô
tính, ngi ta đư khc phc đc nhc đim nƠy. c bit là nhân ging vô tính in
vitro.
9

Da trên c ch nguyên phân, trong nhân ging in vitro khi ly các b phn sinh
dng trong mt cơy đem nhơn ging thì các b phn đó có thông tin di truyn ging
nhau và to nên các c th mi có thông tin di truyn ging nhau và ging c th m.
Nh vy nu c th m có các tính trng di truyn tt thì các tính trng đó s đc th
hin  mi c th con cái. (Trn Vn Minh, 1997)
1.2.4. Môi trng nuôi cy (môi trng dinh dng)
1.2.4.1. Khái nim
Môi trng nuôi cy lƠ điu kin vô cùng quan trng, có tính cht quyt đnh s
phân hoá t bƠo vƠ c quan trong nuôi cy.
Theo Street, 1973 thì môi trng nuôi cy và môi trng xung quanh là nhng
nhân t quyt đnh s thành công hoc tht bi ca quá trình nuôi cy in vitro. Môi
trng nuôi cy là ngun cung cp các cht cn thit cho s phân chia và phân hoá ca
mô t bào trong sut quá trình nuôi cy. Vì vy, môi trng dinh dng phi đy đ
cht dinh dng, các cht cn thit.
i vi hu ht các loài thc vt, Môi trng nuôi cy bao gm các nguyên t
đa lng, vi lng, ngun các bon, các axitamin, các cht điu hoà sinh trng và mt

s cht ph gia. Thành phn dinh dng, hàm lng các cht cn thit cho t bào sinh
trng tt nht thay đi tu theo tng loài, ging, ngun gc mu cy hay tng c quan
khác nhau trên cùng mt c th.
1.2.4.2. Mt s môi trng c bn
ư có rt nhiu môi trng dinh dng ln lt đc tìm ra trên c s ci tin
môi trng ca Kotte và Robbin (1902) nh: Môi trng White (1934), Knudson
(1946), Vacin và Went (1949), Heller(1953), Murasnige - Skoog (1962), Gammborg
(B5) (1968), Knop (1974), WMR (1982), Aderson (1984),… Tuy nhiên, mi môi
trng ch thích hp vi mt loài cây nht đnh nh: Môi trng Knudson (1946),
Vacin và Went (1949), ch thích hp cho các loài Lan, môi trng MS thích hp cho
10

các loài cây thân tho và mt s loài cây thân g sinh trng nhanh nh Keo, Bch
đƠn…Môi trng WMP ch thích hp cho các loài cây thân g (Trn Vn Minh, 1997).
Tu thuc vào tng đi tng c th, trong mi giai đon nuôi cy, mà la chn
loi môi trng thích hp thì mi có kt qu kh quan. Thông thng, ngi ta hay s
dng môi trng H5 và môi trng N6 cho nuôi cy bao phn lúa (Sharmin S., 2004)
1.2.5. iu kin vô trùng
Nuôi cy in vitro là nuôi cy trong điu kin vô trùng. Nu không đm bo tt
điu kin vô trùng mu nuôi cy hoc môi trng s b nhim, mô nuôi cy s b cht.
iu kin vô trùng có Ủ ngha quyt đnh đn s thành bi ca ca nuôi cy mô in vitro
(Nguyn Quan Thch, 2005)
Phng pháp vô trùng vt liu thông dng nht hin nay là dùng các cht hóa hc, tia
cc tím có kh nng dit nm và vi khun.
Vô trùng ban đu là mt thao tác khó vƠ lƠ khơu đu tiên có Ủ ngha quyt đnh.
Tuy vy, nu tìm đc nng đ và thi gian x lý thích hp s cho t l sng cao,
thông thng hay s dng mt s hóa cht nh HgCl
2
0.1%, NaHCl 10%, nc javen,
cn 76

0
, clorox,…đ kh trùng.
Phng tin kh trùng: Ni hp vô trùng, t sy, bung và bàn cy vô trùng,
phòng nuôi cây.
1.2.6. iu kin ánh sáng và nhit đ
Ánh sáng và nhêt đ là hai yu t chính có nh hng c bn đn quá trình sinh
trng ca mô nuôi cy (Thái Xuân Du, 2001)
1.2.6.1. Ánh sáng:
S phát sinh hình thái ca mô nuôi cy chu nh hng t các yu t nh: thi
gian chiu sáng, cng đ ánh sáng và cht lng ánh sáng.Thi gian chiu sáng tác
đng đn quá trình phát trin ca mô nuôi cy. Thi gian chiu sáng thích hp vi đa
s các loài cây là 12 ậ 18 h/ngày.
11

Cng đ ánh sáng tác đng đn s phát sinh hình thái ca mô nuôi cy. Theo
Ammirato (1986): cng đ ánh sáng cao kích thích s sinh trng ca mô so. Ngc
li, cng đ ánh sáng thp kích thích s to chi. Nhìn chung cng đ ánh sáng
thích hp cho mô nuôi cy là 1000 - 7000 lux (Morein, 1974), ngoài ra cht lng ánh
sáng cng nh hng ti s phát sinh hình thái ca mô thc vt in vitro: ánh sáng đ
lƠm tng chiu cao ca thân chi hn so vi ánh sáng trng. Nu mô nuôi cy trong ánh
sáng xanh thì s c ch vn cao nhng li có nh hng tt ti s sinh trng ca mô
so.
Hin nay trong các phòng thí nghim nuôi cy mô đ cung cp ngun ánh sáng
có cng đ 2000 - 2500 lux ngi ta s dng các dƠn đèn hunh quang đt cách bình
nuôi cy t 35- 40cm.
1.2.6.2. Nhit đ
Trong nuôi cy mô t bào thc vt, nhit đ là nhân t quan trng nh hng ti
s phân chia t bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuc vào xut x ca mu
nuôi cy mƠ điu chnh nhit đ cho phù hp. Nhìn chung nhit đ thích hp nht cho
s sinh trng tt  nhiu loài cây là 25

0
C (white, 1973).

1.2.7. Vt liu nuôi cy
 bt đu quá trình nhân ging vô tính cho 1 loài hoc 1 dòng ngi ta phi
chú trng trc nht là vt liu nuôi cy. ơy lƠ bc đu tiên và là khâu quan trng
quyt đnh đn s thành bi và tc đ sinh trng ca quá trình nhân ging. Theo
nguyên tc, bt k mt t bƠo trong c th đu có kh nng tái sinh thƠnh mt cây hoàn
chnh trong điu kin thích hp. Tuy vy đ có tc đ tái sinh, sc sng, sc chng
chu ca cây con cao thì kh nng đó còn tùy thuc vào tui sinh lý ca vt liu nuôi
cy (Nguyn c Thành, 2000)
Trong nuôi cy mô ngi ta thng s dng vt liu nuôi cy nh đnh sinh
trng, chi, bao phn, gieo qua ht, thân mm….
12

1.3. Các yu t nh hng đn quá trình nuôi cy bao phn lúa
1.3.1. Kiu gen ca cây cho bao phn
Kiu gen ca cây cho bao phn nuôi cy có nh hng rt ln đn kt qu nuôi
cy. Nuôi cy bao phn ca các ging lúa thuc loài ph Japonica (k c trng hp
không x lý lnh trc) đu đt t l thành cây thng cao hn nuôi cy bao phn ca
các ging lúa thuc loài ph Indica. Chen và Lin (1981) còn thy rng t l bao phn
to callus, kh nng callus tái sinh thƠnh cơy, t l cây xanh/cây bch tng và s lng
nhim sc th ca cơy tái sinh đu liên quan đn kiu gen ca cây cho bao phn. iu
này chng t kh nng nuôi cy bao phn lúa cng do gen điu khin, đi vi nhng
ging phn ng tt có th cha nhiu gen tác đng lên quá trình này.
 tng hiu qu nuôi cy có th bng cách lai to nhm ci tin ging. Ví d :
 khoai tây kiu gen phn ng tt có th thu đc bng cách lai gia kiu gen phn ng
kém vi kiu gen phn ng tt.
Phi thay đi điu kin và môi trng nuôi cy cho tng loi cây trng thm chí
cho tng ging cây trong cùng mt loài.

1.3.2. Ảiai đon phát trin ca bao phn
Giai đon phát trin ca bao phn ti thi đim tách ri ra và nuôi cy cng có
nh hng rt quan trng đn kt qu nuôi cy. i vi lúa giai đon phn ng tt nht
là trc và gia giai đon ht phn mt nhơn trong điu kin nng đ đng trong môi
trng nuôi cy tng t 6% đn 9% (Chen, 1978).
Các tác gi Oono (1975), Lin (1976) và Chen (1977) cho thy: Mu bao phn
đc ly vào thi đim các tiu bào t trong bao phn đang  giai đon đn bƠo mun
là tt nht. Bao phn  giai đon t th không có kh nng phát trin trong môi trng
nuôi cy in vitro. Bao phn  giai đon đn bƠo sm phát trin kém. Ht phn ch có
th phát trin tt khi đư tách ra khi t t (giai đon đn bƠo gia đn đn bƠo mun).
13

1.3.3. iu kin sinh lý ca cây cho bao phn
Chen và Lin (1976), Chen và Tsay (1984) cho rng bao phn nƠo đc ly 
nhng bông tr sm thì cho kt qu nuôi cy tt hn bao phn ly  nhng bông tr
mun. T l to callus  bao phn ly t nhánh cp 3 thp hn bao phn t nhánh cp
1, cp 2 và t cây m. Lý do bao phn t nhánh cp 3 cho hiu qu nuôi cy kém hn
có th nhng nhánh này thiu dinh dng. Tuy nhiên không có s sai khác gia nhng
hoa  các v trí khác nhau trên cùng mt nhánh. Nhìn chung cây nào sinh trng kho,
trong điu kiên môi trng dinh dng ti u, có cng đ ánh sáng mnh thng cho
bao phn có t l thành cây cao.
1.3.4. Nhit đ và thi gian x lý đòng
Kt qu nghiên cu ca Zhou và c.s (1983) đư cho thy rng: X lỦ đòng  nhit
đ thp rt có hiu qu trong nuôi cy bao phn. iu kin lnh lƠm tng kh nng to
cây xanh.
Hiu qu ca x lý trc nhit đ thp đn vic hình thƠnh callus vƠ cơy con đư
đc nghiên cu bi mt s tác gi v mt s phng pháp x lý nh: X lỦ bông đư
tách b, x lý bông cha tách b hoc x lý bao phn đư đc nuôi cy. Tt c các
phng pháp đó đu cho kt qu tt, Tuy nhiên tt hn c là theo phng pháp ca
Genovest và Magill (1979), x lý bông còn nm trong b lá đòng  nhit đ 10- 13

o
C
trong 10-14 ngày (Nguyn c Thành, 2000)
Tsay và Chen (1984), Lin và Tsay (1984) phát hin ra rng nhng ht phn
đc x lý lnh đt ngt  8-10
o
C trong 7 ngày to ra nhiu callus hn gp 2 ln so vi
không x lý. Tuy nhiên kt qu không khác bit khi x lý lnh bao phn đư cy trên
môi trng.
Theo Chen và C.s (1982), thi gian x lý lnh dài 8-10 ngày tt hn 2-4 ngày.
Tuy nhiên nu kéo dài thi gian này quá 15 ngày li c ch quá trình hình thành callus.
14

Lin và Tsay (1984), Tsay và c.s (1988) cho bit callus hình thành t bao phn đc x
lý lnh s to ra nhiu cơy đn bi và ít cây lng bi hn lƠ t bao phn không x lý,
điu kin lnh đư kích thích vic to callus sm và kh nng tái sinh thƠnh cơy cao.
Các ging khác nhau đòi hi điu kin x lý khác nhau, trng thái sinh lý và giai
đon phát trin ca ht phn cng nh hng đn hiu qu ca x lý. Tsay và c.s
(1988) thy rng kh nng hình thƠnh callus tng gp 2 ln khi x lý bao phn cha
bào t  giai đon gia và cui mt nhân trong 7-14 ngày, quá 14 ngày thì t l cây
xanh gim.
Nói chung đư có nhiu nghiên cu v nh hng ca nhit đ và thi gian x lý
đòng đn kt qu nuôi cy bao phn. Kt qu ca các tác gi cho thy rng x lỦ đòng
 nhit đ khác nhau s cho kt qu nuôi cy khác nhau.
1.4. Các giai đon chính trong nuôi cy bao phn
1.4.1. Khái nim nuôi cy bao phn
Nuôi cy bao phn cha các bào t hoc ht phn cha chín trong môi trng
nhân to nhm to cơy đn bi vƠ đc s dng rng rãi trong ci tin ging cây trng.
Thông qua phng pháp nƠy rút ngn thi gian chn to, tng tính bin d cho chn lc
và gii quyt vn đ lai xa. T đó to dòng thn t nuôi cy bao phn F1 hoc F2 trong

thi gian ngn. K thut nuôi cy in vitro kích thích tiu bào t phát trin thành cây
trong môi trng nuôi cy bao phn và ht phn. Cho phép nhân nhanh chóng, to ra
hàng lot cơy đn bi đó lƠ mt li thoát kì diu đi vi ng dng cơy đn bi, di
truyn ging cây trng (Trn Duy Quý, 2002)
Bình thng s phát trin ca t bào sinh dc đc trong bao phn đi theo các
giai đon sau: T bào t t bào m thông qua tính phân bào gim nhim hình thành tiu
bào t (đn bi). Sau đó các tiu bào t hình thành các giao t đc (ht phn cng đn
bi). Nhng khi ta đa bao phn và nuôi cy trong môi trng nhân to, s phát trin
ca tiu bào t s khác đi. Di s tác đng ca hàng lot các yu t trong môi trng
nhân to, đc bit là các cht kích thích sinh trng, trong t bào s din ra quá trình
15

phn phân hoá, t đó các bƠo t s phân chia thành mô so, các mô so nƠy lúc đu là
đn bi. Sau đó tu theo tng điu kin nuôi cy chúng có th lƠ đn bi hay lng bi
hoá, khi chuyn vƠo trong môi trng tái sinh cây, ta s thu đc cơy đn bi hay
lng bi. Khi cn thit cơy đn bi thu đc ta có th x lý bng colchicine đ lng
bi hoá dòng đn bi thu đc (Theo Phan Khi, V c Quang và cng s, 1990).
1.4.2. Các giai đon chính
1.4.2.1. Ảiai đon 1: Chun b
ơy lƠ giai đon la chn đi tng nuôi cy (cây trng, ging) t đó xác đnh
b phn thích hp ca cơy đ làm vt liu nuôi cy. (Ví d: thân, lá, chi, n, cung
hoa, đ hoa, ht phn ) Song song vi vic chun b mu cy là tin hành v sinh và
kh trùng phòng nuôi cy, các dng c nuôi cy, mu cy. Yêu cu đi vi mu cy
trc khi đa vƠo nuôi cy là phi đc vô trùng, t l nhim thp, t l sng cao, tc
đ sinh trng nhanh.
Kt qu giai đon nƠy đc quyt đnh bi k nng ly mu, nng đ cht kh
trùng và thi gian x lý kh trùng mu cy.
1.4.2.2. Ảiai đon 2: Cy mu to mô so
Sau khi vt liu cy đư đc kh trùng trong thi gian nht đnh thì tin hành
cy mu vƠo môi trng in vitro đ to mô so.

Yêu cu ca giai đon này là phi hn ch ti đa t l nhim nm và khun
trong phòng nuôi cy.
1.4.2.3. Ảiai đon 3: Tái sinh chi
Khi mu cy trong ng nghim đư to đc nhiu mô so thì tin hành cy tái
sinh. Yêu cu ca giai đon này là tái sinh mt cách đnh hng s phát trin ca mô
nuôi cy.
16

Quá trình đc điu khin ch yu da vào t l ca các hp cht
auxin/xytokinin đa vƠo môi trng nuôi cy.  tái sinh mu nuôi cy trong ng
nghim thng s dng chi đnh, chi nách, mô so…
1.4.2.4. Ảiai đon 4: Nhân nhanh chi
 to h s nhân chi cao nht, tin hành cy chuyn các chi đc tái sinh 
mu tái sinh sang môi trng dinh dng mi.
Ngi ta thng đa vƠo môi trng dinh dng nhân to các cht điu hòa
sinh trng: auxin, xytokinin…các cht b sung khác nh: nc da, dch chit nm
men…đng thi điu khin nhit đ ánh sáng thích hp…to điu kin tt nht cho
chi sinh trng tt, tng h s nhân chi tái sinh.
Tùy thuc vƠo đi tng nuôi cy ngi ta có th nhân nhanh bng kích thích s
hình thành cm chi hoc kích thích s phát trin chi nách.
1.4.2.5. Ảiai đon 5: Cy to r
Khi chi đt đc kích thc nht đnh ta cy chuyn các chi đó sang môi
trng ra r. Thng sau 2-3 tun t nhng chi riêng l này s xut hin r và phát
trin thành cây hoàn chnh.  giai đon nƠy ngi ta thng b sung vƠo môi trng
nuôi cy các auxin có chc nng to r ph t chi.
Thông thng, các nhóm cht IAA, NAA, 2,4D đc s dng nhiu trong quá
trình nghiên cu và sn xut, tác dng xúc tin hình thành r t chi tái sinh. Mi mt
loài cây, loi mô s yêu cu mt nng đ hoá cht khác nhau đ to r tt nht.
1.4.2.6. Ảiai đon 6: a cây tái sinh tr v điu kin sng t nhiên
ơy lƠ công đon cui cùng ca quá trình nuôi cy in vitro. Cơy đư tái sinh hoƠn

chnh (đ r, thơn, lá) đc đa ra khi ng nghim, thun dng trong các môi trng
nh đt, môi trng thun dng lng… kt qu ca giai đon này s quyt đnh kh
nng ng dng cây in vitro trong các chng trình ging hoc vào các mc đích khác
nhau.
17

1.5. K thut đn bi in vitro và công tác ging cơy trng
1.5.1. Cây đn bi
Cây trng trong t nhiên da dng v loài và mi loài có mc bi th khác nhau.
Song, hu ht cây trng có nhim sc th ln hn 1 dng nh bi th 2n là ph bin.
Cng có nhng loài cây có b nhim sc th tam bi, t bi, lc bi ví d nh: Cơy
mía, cây khoai lang có b nhim sc th hn lon 2n, 4n vƠ 6n. Nh vy, mi đc đim
di truyn ca chúng đu b hai hay nhiu gen chi phi, mt s gen s có trên 2 alen và
có hin tng tri hoc ln ca mt gen.
Nu cơy đa bi th mang nhng cp gen d hp t thì biu hin kiu hình là do
các tính trng tri hoc ln quyt đnh. i vi nhng cây có nhim sc th đn bi thì
kiu hình s phn ánh trung thc kiu gen. Da vƠo đc đim nƠy ngi ta có th nhn
bit d dƠng các đt bin ln ca ging đang nghiên cu. Vì vy cơy đn bi là vt liu
lỦ tng trong công tác chn ging cây trng.
Trong c th thc vt, ch có ht phn và noãn là nhng t bƠo đn bi (1n). T
nm 1924 Blakeslee vƠ cng s đư chng minh đc rng: Hoàn toàn có th thu đc
nhng dòng đng hp t nh bi thun bng cách nh bi hoá c th đn bi.
Nm 1968, Oono (Nht Bn) đư thƠnh công trong vic to cơy lng bi đng
hp t tuyt đi t cơy đn bi bng phng pháp nuôi cy bao phn lúa. Hin nay đư
có 65 loi cây trng đc to ra bng con đng đn bi.
K thut to cơy đn bi in vitro bng cách kích thích tiu bào t phát trin
thành cây thông qua nuôi cy bao phn đư to ra hàng lot cơy đn bi mt cách nhanh
chóng. ơy lƠ thƠnh tu vô cùng to ln, m ra mt hng đi mi trong lnh vc ng
dng đn bi vào công tác chn ging cây trng, có th rút ngn thi gian to ging t
5 đn 7 nm.

18

1.5.2. K thut đn bi trong công tác chn to ging cây trng
1.5.2.1. To cây t ht phn ca các dòng lai F1
Giá tr ca cơy đn bi trong công tác chn to ging đư đc phát hin t lâu.
Tuy nhiên, các cơy đn bi xut hin ngu nhiên vi tn s rt thp không th đáp ng
nhu cu ca nghiên cu và chn to ging ( Nng Vnh, 2005)
Nm 1964, ln đu tiên trên Th gii, 2 nhà khoa hc n  Guha và
Maheshwari thành công trong vic to cơy đn bi t nuôi cy bao phn in vitro cây cà
Datura innoxia. Ngay sau đó, cơy đn bi đư đc to ra bng nuôi cy bao phn 
hàng lot cây trng khác nhau. Ngoài nuôi cy bao phn các nhà khoa hc còn thành
công rt ln trong nuôi cy noưn cha th tinh, nuôi cy ht phn tách ri. K thut
này to ra nhanh chóng hàng lot cơy đn bi, phc v đc lc cho công tác chn to
ging cây trng.
Hai phng pháp nghiên cu cơy đn bi hin nay là :
-Nuôi cy bao phn hay tiu bào t tách ri, còn gi lƠ phng pháp trinh sinh
đc trong ng nghim.
-Nuôi cy t bào trng cha th tinh, còn gi lƠ phng pháp trinh sinh cái trong
ng nghim.
Ti Trung Quc, công ngh đn bi đư đc trin khai trên quy mô rng ln và
có đnh hng chin lc rõ ràng trong to ging mi. Hn mt nghìn c s nuôi cy
bao phn đư hot đng trên toàn quc t nhng nm 1970. Kt qu đư to đc trên
100 ging lúa mi trong mt thi gian ngn.
Ti Triu Tiên, k thut nuôi cy bao phn đư to ra 42 ging lúa mi (Sasson,
1993; Jain, 1997).
u th ca các phng pháp nƠy lƠ tt c các cây to thƠnh đu có ngun gc t
tiu bào t hoc đi bào t, vì vy con nhơn đc s lƠ cơy đn bi hoc nh bi đng
hp t tuyt đi vi các cp nhim sc th hoàn toàn ging nhau (tr trng hp đt
bin) ( Nng Vnh, 2005)