Khảo sát sự ổn định chủng E.coli và Bacillus cereus trên nền mẫu và điều kiện bảo quản khác nhau

B GIÁO DC VÀ ÀO TO
TRNG I HC M TP. H CHÍ MINH




BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP


Tên đ tài:
Kho sát s n đnh chng E.coli và Bacillus cereus trên
nn mu và điu kin bo qun khác nhau.



KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T

GVHD: Th.S Nguyn Vn Hòa
Th.S Trn Th Ánh Nguyt
SVTH: Nguyn Kim Hoàng
MSSV: 1053012253
Khóa: 2010 ậ 2014


Tp. H Chí Minh, tháng 05 nm 2014
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

2






LI CM N
u tiên em xin gi li cm n chân thành đn thy Nguyn Vn Hòa, thy
Nguyn Vn Minh, cô Dng Nht Linh, cô Phm Vân An, ThS. Trn Th Ánh
Nguyt, ThS. V Diu Thu, ThS. Chu Nguyên Thanh và CN. Nguyn Th Ngc Thùy
đã tn tình hng dn, giúp đ em trong sut thi gian thc tp và khóa lun tt
nghip.
Em xin cm n Ban giám đc Trung tâm k thut tiêu chun đo lng cht lng
3 - QUATEST 3 và các nhân viên Phòng Vi sinh - GMO đã luôn to điu kin tt
nht, truyn đt các kin thc khoa hc và kinh nghim qúy báu cho em đ em có
th t tin cho công vic trong tng lai.
Cui cùng, em xin cm n Ban giám hiu Trng i hc M Thành ph H Chí
Minh, các thy cô Khoa Công Ngh Sinh Hc cùng gia đình và các bn sinh viên
lp Công Ngh Sinh Hc khóa 010 đã ht lòng quan tâm h tr, tn tâm dy d và
đng viên em đ em hoàn thành tt khóa lun tt nghip này.
Thành ph H Chí Minh, tháng 05 nm 2014
Sinh viên
Nguyn Kim Hoàng

Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

3


MC LC
T VN  6
Mc tiêu 6
PHN 1: TNG QUAN 7
1.1. Tng quan v Trung tâm k thut tiêu chun đo lng cht lng 3 -
QUATEST 3 7
1.1.1. Gii thiu chung v Trung tâm 7
1.1.2 Phòng vi sinh & GMO 11
1.2. i cng v Bacillus cereus và Escherichia coli 11
1.2.1 i cng v Bacillus cereus 11
1.2.2. i cng v Escherichia coli 16
PHN 2: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 21
2.1. Thi gian vƠ đa đim thc hin 21
2.2. Vt liu 21
2.2.1. Thit b và dng c 21
2.2.2. Hóa cht vƠ môi trng 21
2.2.3. Vt liu thí nghim 21
2.3. Phng pháp thc hin 22
PHN 3: KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 35
3.1. Kt qu kim tra đ nhim khun ca mu 35
3.2. Kt qu tng sinh chng vi sinh vt 35
3.3. Kho sát s n đnh ca Bacillus cereus trên nn mu go 36
3.4. Kho sát s n đnh ca Escherichia coli trên nn mu rau sy 40

PHN 4: KT LUN VÀ  NGH 43
4.1. Kt lun 43
4.2.  ngh 43
TÀI LIU THAM KHO 44
PH LC 46
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

4

DANH SÁCH CÁC CH VIT TT
1) AOAC: Association of Official Analytical Chemists
2) B.cereus: Bacillus cereus
3) DSM: Difco Sporulation Medium
4) E.coli: Escherichia coli
5) EMB: Eosin Methylene Blue Lactose
6) GMO: Genetically Modified Organism
7) IEC: The International Electrotechnical Commission
8) ISO : International organization for standardization
9) LT: Heat Labile
10) MYP: Mannitol-egg-yolk-polymyxin
11) PCA: Plate count agar.
12) ST: Heat Stable
13) TBSD: T bƠo sinh dng
14) TBX: Tryptone-bile-glucuronic medium
15) TCVN: Tiêu chun Vit Nam
16) TSB : Trypticase (tryptic) soy broth
17) VSV: Vi sinh vt
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

5

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIU 
Hình 1: Vi khun Bacillus cereus.
Hình 2: Bào t Bacillus cereus chp di kính hin vi đin t.
Hình 3: Cu trúc bào t chng B. cereus S69 không hot đng quan sát di kính
hin vi đin t.
Hình 4 :Bào t Bacillus cereus chp di kính hin vi 100X.
Hình 5: Vi khun Escherichia coli.
Hình 6: Kt qu th nghim IMViC ca Escherichia coli.
Hình 7: Mu go sau khi sy khô.
Hình 8: Khun lc Escherichia coli trên mô trng TBX.
Hình 9: Khun lc ca Bacillus cereus trên MYP.
Hình 10: Khun lc Bacillus cereus có vòng phân gii hng cu trên thch máu.
Biu đ 3.1: Kt qu mt đ bào t Bacillus cereus trên môi trng TSB  các nhit
đ 20
o
C, 30
o
C, 41,5
o
C ti các thi đim khác nhau.
Biu đ 3.2: Kt qu mt đ bào t Bacillus cereus trên môi trng DSM  các
nhit đ 20
o
C, 30
o
C, 41,5
o

C ti các thi đim khác nhau.

DANH SÁCH CÁC BNG
Bng 3.3.1: Mt đ chng Bacillus cereus sau khi bo qun (CFU/g).
Bng 3.3.2: Mt đ bƠo t Bacillus cereus sau khi bo qun (CFU/g).
Bng 3.4: Mt đ chng Escherichia Coli sau khi bo qun (CFU/g).

Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

6

T VN 
Vi sinh vt lƠ các c th sng vô cùng nh bé có các đc tính sinh lí, sinh hóa
khó n đnh qua thi gian dài. Các vi sinh vt có th phát trin mnh hn hoc b
cht đi do tác đng ca các điu kin bo qun, vn chuyn, yu t ngoi cnh khác
nhau. Vì vy, vic to ra mt mu chun (reference material) có cha mt đ vi sinh
vt n đnh trong thi gian dài là rt khó khn.  chính xác ca các kt qu phân
tích và thao tác ca k thut viên là ht sc quan trng trong các nghiên cu khoa
hc công ngh cng nh trong kim tra, đánh giá cht lng sn phm. Trên thc
t, có rt nhiu phòng thí nghim vi sinh rt cn các mu chun có cha vi sinh vt
mc tiêu có mt đ n đnh. Các mu chun này s giúp các phòng thí nghim có
th t kim tra tay ngh ca nhân viên, nâng cao hiu qu kim soát cht lng,
kim soát quy trình thí nghim, kim tra giá tr s dng ca phng pháp th
nghim và chng minh nng lc k thut ca phòng thí nghim đi vi các bên
quan tâm.
Hin nay, trên th trng, các rt nhiu nhà cung cp các mu chun vi sinh
(APLAC, CMS, LGC,ầ) nhng vi giá c khá cao (khong 6,5 triu/mu). Vn đ
nƠy gơy khó khn cho các phòng thí nghim đ thc hin công tác đm bo cht
lng. VƠ đơy cng lƠ đòi hi ca c quan qun lỦ nhƠ nc trong vic công nhn

phòng th nghim, phòng xét nghim và phòng thí nghim theo ISO/IEC 17025. T
nhu cu trên, tôi xin tin hƠnh đ tƠi “Kho sát s n đnh ca ca E.coli và
Bacillus cereus trên nn mu và điu kin bo qun khác nhau.”.  tài nhm
xây dng các mu th cha vi sinh vt mc tiêu cho chng trình kim tra đánh giá
tay ngh ca kim nghim viên hoc s dng làm mu kim soát cht lng phc
v quá trình kim soát quy trình phân tích ti phòng thí nghim.  tài thc hin
trên E.coli và Bacillus cereus.
 Mc tiêu
Kho sát s n đnh ca ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu vƠ điu kin
bo qun khác nhau.
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

7

PHN 1: TNG QUAN
1.1. Tng quan v Trung tâm k thut tiêu chun đo lng cht lng 3 -
QUATEST 3 [17]:
1.1.1. Gii thiu chung v Trung tâm
QUATEST 3 là t chc khoa hc công ngh thuc Tng cc Tiêu chun o
lng Cht lng ậ B Khoa hc và Công ngh, đc thành lp t tháng 5 nm
1976 trên c s Vin nh chun Quc gia trc đơy.
QUATEST 3 áp dng h thng qun lý cht lng theo tiêu chun ISO 9001;
lnh vc thí nghim đc công nhn phù hp vi tiêu chun ISO/IEC 17025, lnh
vc giám đnh hàng hóa đc công nhn phù hp vi ISO/IEC 17020, lnh vc
chng nhn sn phm đc công nhn phù hp vi ISO/IEC Guide 65 và lnh vc
t vn, đƠo to đc chng nhn phù hp vi ISO 9001.
Qua 30 nm hot đng, QUATEST 3 đư đc bit đn nh mt đn v hƠng đu
ti Vit Nam trong lnh vc cung cp dch v k thut v tiêu chun, đo lng và
cht lng. QUATEST 3 có đi ng chuyên viên, k thut viên đc đƠo to

chuyên sâu và có nhiu kinh nghim, h thng phòng thí nghim vi trang thit b
hin đi theo chun mc quc t.
Vi n lc nơng cao nng lc k thut ca các phòng th nghim đ đc tha
nhn quc t và khu vc, Phòng Th nghim Vi sinh - GMO ca QUATEST 3 đc
các nc ASEAN chn là phòng th nghim đi chng (ASEAN Reference
Laboratory ậ ARL) theo chng trình EC - ASEAN và Phòng Th nghim in
đc các nc ASEAN tha nhn kt qu th nghim đi vi các sn phm đin
gia dng theo tha thun tha nhn ln nhau trong lnh vc th nghim đin vƠ đin
t ( ASEAN EE MRA). Ngoài ra, QUATEST 3 đang trin khai chng trình m
rng s tha nhn ca khu vc và quc t cho các lnh vc th nghim khác.
Các lnh vc hot đng chính ca trung tâm:
 Dch v th nghim
Các phòng th nghim ca QUATEST 3 đu đc công nhn phù hp vi tiêu
chun ISO/IEC 17025, phòng th nghim thc phm và phòng th nghim vi sinh-
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

8

GMO cng đc công nhn bi t chc công nhn ca Na Uy (Norway
Accreditation Body).
Các lnh vc th nghim chính bao gm:
- C khí và không phá hy
- Hàng tiêu dùng
-  g gia dng
- Vt liu xây dng
- in & đin t
- Tng thích đin t
- Hóa cht
- Môi trng

- Du khí
- Thc phm
- Vi sinh - sinh vt bin đi gen
 Dch v đo lng
QUATEST 3 cung cp dch v đo lng trong các lnh vc:
-  dài
- Khi lng
- C
- Dung tích-Lu lng
- in
- Nhit
- Hoá lý
 Dch v giám đnh
i tng giám đnh s phù hp bao gm:
- Hàng hóa
- Công ngh
- Môi trng
- Công trình
- An toàn công nghip
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

9

 Kim tra:
- Thép tròn cán nóng và thép d ng lc,
- M bo him cho ngi đi xe máy
- Xng, du diesel
-  chi tr em
- Thc phm, ph gia, nguyên liu, cht h tr ch bin thc phm và bao bì

thc phm
- Thy sn, sn phm thy sn
- Thc n gia súc, nguyên liu thc n gia súc, phơn bón, thuc bo v thc
vt
- Dơy đin bc nha PVC, sn phm đin gia dng
- Ximng Pooc lng các loi, tm lp fibro-ximng, dm bêtông ct thép ng
lc trc PPB
- Sn phm bo h lao đng
 Chng nhn
Hot đng chng nhn sn phm ca QUATEST 3 đc công nhn phù hp vi
chun mc quc t ISO/IEC Guide 65.
QUATEST 3 là t chc chng nhn (bên th ba) thc hin vic chng nhn s
phù hp ca sn phm vi tiêu chun quc gia, tiêu chun quc t hoc quy chun
k thut trong nhiu lnh vc: đin - đin t, c khí, hóa cht, xây dng, hàng tiêu
dùng, du, khí, thc phm, rau an toàn sn xut theo quy trình VietGAP
Du chng nhn ca QUATEST 3 xác nhn sn phm đáp ng yêu cu v cht
lng và an toàn, to thun li cho doanh nghip nơng cao uy tín thng hiu, tham
gia đu thu, đa sn phm ra th trng đng thi là du hiu giúp ngi tiêu dùng
la chn khi mua sn phm.
 Dch v t vn
Vi đi ng hn 40 chuyên gia t vn có nhiu nm kinh nghim đc đƠo to
chuyên sâu trong nc vƠ nc ngoƠi trong lnh vc qun lý cht lng, môi trng
vƠ an toƠn, QUATEST 3 đư cung cp dch v t vn h thng qun lý cho gn 1000
t chc, doanh nghip và tr thành mt trong nhng đn v hƠng đu trong nc v
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

10

cung cp dch v t vn các h thng quán lý. Hu ht các chuyên gia t vn ca

QUATEST 3 đu có chng ch chuyên gia đánh giá bên ngoƠi ca IATCA (Hip
hi công nhn vƠ đƠo to đánh giá viên quc t) hoc IRCA (t chc chng nhn
chuyên gia đánh giá viên quc t). H thng qun lý cht lng ca QUATEST 3
cho hot đng t vn đc chng nhn phù hp vi tiêu chun ISO 9001.
QUATEST 3 cung cp dch v t vn cho các t chc, doanh nghip mun xây
dng và áp dng các h thng qun lý: Cht lng - ISO 9001, Môi trng - ISO
14001, An toàn thc phm - ISO 22000, An toàn thông tin - ISO/IEC 27001, Qun
lý phòng thí nghim - ISO/IEC 17025, An toàn sc khe ngh nghip - OHSAS
18001, Trách nhim xã hi - SA 8000 và mt s h thng qun lý chuyên ngành
khác nh: HACCP, GMP, GLP hoc áp dng các công c ci tin nng sut - cht
lng nh: 5S, SPC, COQ, Kaizen, TQM, TPM, QCC, QFD, Benchmarking
 Dch v đƠo to bao gm:
- Ơo to v h thng qun lý
- Ơo to công c ci tin nng sut - cht lng
- Ơo to nghip v tiêu chun đo lng cht lng
- Ơo to k thut thí nghim
- Ơo to chuyên gia t vn
 Thông tin vƠ tiêu chun
QUATEST 3 cung cp thông tin và các tài liu liên quan đn tiêu chun, đo
lng, cht lng theo yêu cu cu t chc, doanh nghip và cá nhân:
- Các tiêu chun Vit Nam (TCVN)
- Các quy chun k thut trong nc (QCVN)
- Các tiêu chun nc ngoƠi: JIS, GOST, BS, IS, AS, DIN, NF, ANSI, KSầ
- Các tiêu chun quc t: ISO, IEC, CODEX, OIMLầ
- Các tiêu chun ca các hip hi chuyên ngành: ASTM, AOAC, AOCS,
APHA, ASME, API, AWS,ầ
- Các tp chí hoc tài liu chuyên ngành khác.
 Mư s - mư vch
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

11

QUATEST 3 là Chi nhánh phía Nam ca T chc GS1 Vit Nam (mã s - mã
vch) vi các nhim v:
Tip nhn các yêu cu đng kỦ s dng mã s - mã vch ca t chc, doanh nghip.
Cung cp dch v kim tra cht lng mã s - mã vch.
T vn vƠ đƠo to trin khai ng dng mã s - mã vch, các gii pháp nhn dng
đin t khác theo các tiêu chun quc t v qun lỦ vƠ điu hành sn xut - kinh
doanh ậ dch v, các công c h tr qun lý chui cung ng sn phm và dch v,
truy xut ngun gc sn phm.
 Dch v trang b
Sn xut và cung cp chun đo lng, phng tin đo kim nh: chun khi
lng, chun dung tích, thit b kim đnh đng h đo nc lnh, thit b kim đnh
công t đin, cân bàn, cân ô tô
Cung cp các cht chun, thit b, phng tin đo kim, thit b và dng c thí
nghimầ
Cung cp dch v bo trì, bo dng và sa cha các phng tin đo kim, thit
b phòng thí nghim.
1.1.2 Phòng vi sinh & GMO
 Nng lc k thut chính
Phân tích vi sinh trong thc phm, nông sn, m phm, nc, thc n chn nuôi,
đ ung, phân vi sinh, ch phm sinh hc và các sn phm tiêu dùng khác.
Phơn tích đnh tính vƠ đnh lng sinh vt bin đi gen (GMO) có trong các loi
sn phm có ngun gc t thc vt, các loi ht ging, các loi thc n dƠnh cho gia
súcầ
 Phng pháp th nghim
TCVN, APHA, USFDA, BS, ISO, GS, AOAC,ầ
1.2. i cng v Bacillus cereus và Escherichia coli
1.2.1 i cng v Bacillus cereus.

B.cereus là trc khun k khí, gram dng, rng khong 1 m, dài khong 3-
4m, có kh nng sinh nha bƠo, bƠo t dng hình ovan có th sng sót khi x lý
nhit và hóa cht [2], chúng có kh nng thích nghi vi mt lot các điu kin môi
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

12

trng, nó đc phân phi rng rãi trong t nhiên nh trong bi, đt,  các loài
đng vt khác nhau, thng thy trong nhng ht ng cc, go, bt hoc thc phm
khô ln ln chung vi nhau nh go, mì, khoai, ngô do b nhim t đt trong quá
trình trng trt và thu hoch [8].

Hình 1: Vi khun Bacillus cereus [16]
 c đim nuôi cy:
 Là loi vi khun d mc trên các môi trng nuôi cy vi khun thông thng
 Tng trng đc trong khong nhit đ 5-50
0
C, ti u  35-40
0
C
 pH 4,5-9,3, thích hp  pH 7-7,2
 Trên môi trng thch MYP vƠ môi trng thch Mossel (cereus selective
agar) vi khun B. cereus mc to thành dng khun lc có màu hng phn
chung quanh có vòng sáng.
 Tính cht sinh hóa:
 Trên môi trng đng: lên men glucose trong điu kin hiu khí và k khí.
 Kh nitrat thành nitrit.
 Phân gii Tyrosin
 Catalase (+), Citrate (+)

 Theo phân loi quc t B.cereus :
 Ngành (phylum) Firmicutes
 Thuc gii Bacteria
 Lp (class) Bacilli
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

13

 B (order) Bacillales
 H (family) Bacillaceaem
 Chi (genius) Bacillus
 Loài (species) Cereus
 Bào t Bacillus cereus:
Bào t vi khun là các t bƠo đc bit, đc hình thƠnh đ vi khun có th tn ti
trong điu kin bt li. Chúng đc hình thành bên trong các t bào vi khun và do
đó đc gi là ni bào t. Có nhiu loi t bào chuyên bit đc hình thành t các
vi khun đ tn ti trong các điu kin nghèo dinh dng và khc nghit khác nhau,
nhng ni bào t ca vi khun là nhng t bào có kh nng tn ti bn vng và dài
nht.
Cu trúc ca bào t rt khác so vi cu trúc ca t bào vi khun sinh dng bình
thng. Bào t không hot đng trao đi cht và có kh nng chng li điu kin
bt li nh môi trng sng nghèo dinh dng, nhit đ cao, bc x ion hóa, dung
môi hóa cht, cht ty ra, các enzym thy phơn, đ m thp, thay đi pH và kháng
sinh.

Hình 2: Bào t Bacillus cereus chp di kính hin vi đin t. Bào t Bacillus
cereus có lp exosporium nhìn nh mt lp màng lng lo bao xung quanh [13].
Cu trúc ca bào t Bacillus cereus gm [13,14]:
 Màng exosporium:  nhiu loài vi khun, áo bào t đc bao quanh bi mt

cu trúc màng lng lo gi là exosporium (Hình 2). Màng exosporium rt quan
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

14

trng đi vi tính k nc và tính kt dính ca bào t. T lâu, đư phát hin thy
bào t B. cereus và B.anthracis có lp màng exosporium cha các kháng nguyên
quan trng có th phát hin và nhn dng; ngoài ra còn có cha mt s enzyme,
mt s trong đó có th liên quan đn vic ny mm.
 Áo bào t: là mt cu trúc protein phc tp gm ba lp riêng bit. Áo bào t
bo v lp v peptidoglycan ca bào t khi các enzyme tn công. Hn na, áo
bào t có liên quan đn kh nng chng bc x tia UV t môi trng và nhiu
loi hóa cht bao gm các cht oxy hóa. Tuy nhiên, áo bào t không có kh nng
chng li hp t. Áo bào t có cha các enzyme nht đnh, chng hn nh
laccases, mt enzyme có th hot đng ngay c khi lõi bào t không có các hot
đng trao đi cht. Các lp bên trong ca lp áo bào t cha mt enzyme phân
hy, giúp làm tan v bào t trong quá trình ny mm.
 V bào t: là lp vách t bào khá dày gm lp peptidoglycan, rt quan trng
cho vic duy trì trng thái mt nc và trng thái tim sinh ca lõi bào t. Nó
nh mt cu trúc tnh giúp duy trì tình trng mt nc. Cu trúc c th ca v
bào t đc bo tn gia các loài và có th đóng vai trò quan trng trong kh
nng chu nhit ca bào t, mc dù mi tng quan rõ ràng gia cu trúc v bào
t và kh nng chu nhit cha đc tìm thy. Trong quá trình ny mm, các lp
v peptidoglycan nhanh chóng b phân hy bi các enzyme  lp áo bào t.
 Lõi bào t: cha t bào cht vi các thành phn ging t bƠo sinh dng, nh
protein, ribosome và DNA. Tuy nhiên, trng thái ca t bào cht trong lõi bào t
khác xa so vi t bào cht ca t bƠo bình sinh dng, hàm lng nc ch 30-
50%, còn t bƠo sinh dng là 70-88%. Trng thái mt nc nƠy đóng mt vai
trò quan trng trong tui th, kh nng tim sinh và sc đ kháng ca bào t. pH

trong lõi bào t là 6,3-6,5, thp hn nhiu so vi đ pH ca t bào cht ca các t
bào sinh dng. T bào cht ca bào t thiu hu ht các hp cht nng lng
cao thng đc tìm thy trong t bào cht ca các t bào sinh dng và ch
cha s lng ln mt loi protein, gi là SASP (small acid soluble proteins).
Nhng protein này to mt phc hp vi các DNA ca bào t, buc các DNA
tn ti  trng thái nén đc bit, giúp bo v DNA chng li nhiu loi tác đng
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

15

ca môi trng. Protein trong t bào cht ca bào t bt đng và t bào cht ca
bào t cha mt lng rt ln ca các ion dng hóa tr hai, ch yu là canxi, có
th to phc vi Pyridine-2,6-dicarboxylic acid (dipicolinic axit hoc DPA).
DPA kt hp vi lõi mt nc, đóng mt vai trò trong kh nng chu hp t và
kháng UV. S lng DPA trong lõi là rt cao, khong 5-15% ca tng trng
lng bào t.

Hình 3: Cu trúc bào t chng B. cereus S69 không hot đng quan sát di kính
hin vi đin t [14].
Bào t ca B.cereus có kh nng bám vƠo các t bào Caco-2 (t bào biu mô ca
ngi). Sau khi bám vào, các bào t này ny mm mt cách nhanh chóng (trong
vòng 1h), hình thành t bào B.cereus sinh dng trên đnh ca các t bào biu mô,
tip đó lƠ sn sinh ra đc t, nu đc t này xut hin trong đng rut, đc t
đng rut s tp trung khoanh vùng  vùng ngoi biên ca ng rut s tng cao
hn vƠ vì vy gây nên mi nguy ln hn vƠ gơy bnh mt cách trm trng, thi gian
 bnh s lâu hn [9].
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

16


Hình 4 : BƠo t ca B.cereus chp di kính hin vi 100X
Ngoài gây ng đc thc phm B.cereus còn gây bnh  mt trong trng hp
viêm ni nhãn sau chn thng có th dn đn mt kh nng nhìn nu không đc
điu tr kp thi. Vic nhim B.cereus cng xut hin dù không đc hiu  nhng
ngi b ung th, suy gim min dch và mt s bnh khác. B.cereus cng lƠ mt
trong nhng nguyên nhân gây viêm vú và sy thai  gia súc, và mt s bnh khác.
1.2.2. i cng v Escherichia coli [1,2]
E.coli là vi sinh vt hiu khí tùy nghi, hin din trong đng rut ca ngi và
các loƠi đng vt máu nóng. Hu ht các dòng E.coli không gây hi vƠ đóng vai trò
quan trng trong vic n đnh sinh lí đng rut.
Các loài E.coli hin din rng rưi trong môi trng b ô nhim phân hay cht thi
hu c, phát trin và tn ti rt lơu trong môi trng. Gn đơy ngi ta còn chng
minh đc rng E.coli cng hin din  nhng vùng nc m, không b ô nhim
cht hu c. Do s phân b rng rãi trong t nhiên nên E.coli d dàng nhim vào
thc phm t nguyên liu hay thông qua ngun nc trong quá trình sn xut hay
ch bin. Các dòng E.coli gây bnh gây ra các triu chng ri lon đng tiêu hóa.
Biu hin lơm sang thay đi t nh đn rt nng, có th gây cht ngi ph thuc
vào mc đ nhim, dòng gây nhim và kh nng đáp ng ca tng ngi.
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

17


Hình 5: Vi khun Escherichia coli [15]
E.coli thuc ging Escherichia, h Enterobacteriaceae, là trc khun Gram âm,
có kích thc dài hay ngn tùy thuc môi trng nuôi cy. Hai đu tròn, mt s li

bt đng, mt s di đng nh tiêm mao, không sinh bào t, to giáp mô mng, trong
bnh phm có khi bt mƠu lng cc.
Nhit đ nuôi cy thích hp là 37
0
C, tuy nhiên có th tng trng t 10 ậ 46
0
C.
Mc d dàng trên Mac Conkey, EMB,ầ Trên môi trng EMB khun lc có màu
tím ánh kim. Mt s hóa cht c ch s phát trin ca E.coli nh chlorine và dn
xut, mui mt, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate,
selenite,ầ
 Tính cht sinh hóa:
E.coli lên men nhiu loi đng nh: glucose, lactose, mantose, mannitol,
xylose, glycerol, sorbitol, arabinoseầ ; không lên men dextrin và inositol, kh
nitrat thƠnh nitrit.  phân bit E.coli vi các vi khun khác, ngi ta thng dùng
th nghim IMViC (Indole, Methyl red, Voges ậ Proskauer, Citrate).
- Indole: Trong môi trng có trytophane, E.coli nh có tryptophanase s ly
gii tryptophan thƠnh Indole.  nhn din Indol, nh vào vài git thuc th
Kovacs, hp cht indole s to vi thuc th hp cht mƠu đ: Indole (+).
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

18

- Methyl red (MR): Trong môi trng có glucose, E.coli phân gii glucose to
acid làm pH gim. Cho thuc th methyl red vƠo thì môi trng chuyn sang
mƠu đ: MR (+)
- Voges ậ Proskauer(VP): tùy loi enzyme vi khun có đc mà quá trình lên
men glucose s cho ra sn phm cui dùng khác nhau. Mt trong s đó lƠ
acetoin, se to phc hp mƠu đ vi thuc th  - naphthol và KOH. E.coli

có phn ng VP (-) (không có mƠu đ).
- Citrate: Trong môi trng Simmons Citrate, ngun C duy nht là citrate. Vi
khun s dng citrate s làm kim hóa môi trng lƠm đi mƠu môi trng
t màu xanh lc sang mƠu l. E.coli có phn ng Citrate (-) (không đi màu).

Hình 6: Kt qu th nghim IMViC ca Escherichia coli
 V kháng nguyên, E.coli có cu trúc kháng nguyên khá phc tp. Da vào
tính cht kháng nguyên, ngi ta phân chia các vi khun cùng loi thành các típ
huyt thanh khác nhau.
Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên ca vách t bào, cu to
bi lipopolysaccharide, có trên 150 loi. c tính ca kháng nguyên O là:
- Chu nhit, không b phân hy khi đun nóng 100
0
C trong 2 gi.
- Kháng cn, không phân hy khi tip xúc vi cn 50%.
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

19

- B phân hy bi fomol 5%
- Rt đc, ch cn 0,05mg đ đ git chut nht trong vòng 24 gi
Kháng nguyên O gp kháng huyt thanh tng ng s xy ra phn ng ngng kt
O. Kháng nguyên O gi vai trò nht đnh đi vi kh nng gây bnh ca dòng vi
khun và có tính cht chuyên bit cho tng loi vt ch.
Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 loi khác nhau, cu to bi
protein và có tính cht không chu nhit, b phân hy cn 50% và các proteinase,
không b phân hy bi formaol 5%. Khi kháng nguyên H gp kháng th tng ng
s xy ra hin tng ngng kt H.
Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có hn 100 loi khác nhau và nm

ngoài kháng nguyên O. Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein. Nu
kháng nguyên K che ph hoàn toàn thân vi khun thì s ngn cn phn ng ngng
kt O. Kháng nguyên giáp mô K giúp E.coli bám vào biu mô trc khi xâm ln
đng tiêu hóa hay đng tit niu.
Kháng nguyên tiên mao F (fimbrial antigen) có dng hình si, dài khong 4
mycrom, thng hay xon, đng kính 2,1 ậ 7 nm, giúp vi khun bám vào t bào
niêm mc rut nên rt quan trng trong kh nng gơy bnh ca vi khun.
Hin nay có hn 700 tuỦp huyt thanh ca E.coli t s t hp các nhóm kháng
nguyên O, H, K, F. Da vƠo đó, ngi ta có th đnh danh vi khun.
 c t đng rut:
c t ca E.coli: loi có giáp mô gơy đc mnh hn loi không có giáp mô.
c t gm có hai loi: ni đc t và ngoi đc t. Ni đc t gây tiêu chy,
ngoi đc t tan huyt, phù thngầ
Ngoi đc t gm hai loi: loi chu nhit ST và loi không chu nhit LT.
Da vào hi chng bnh vào hi chng bnh và tính cht gây bnh ca E.coli,
ngi ta chia chúng thành 5 nhóm:
- EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kt tp  rut.
- EHEC (Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây xut huyt  rut.
- EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bnh đng rut
- ETEC (Enterotoxigenic E.coli) E.coli sinh đc t rut.
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

20

- EIEC (Enteroinvasive E.coli) E.coli xâm ln niêm mc rut.
 Kh nng gơy bnh ca E.coli:
- Nhim khun huyt: Khi sc đ kháng ca c th gim, vi khun vào máu gây
nhim khun máu. Gp  tr s sinh vƠ sau khi nhim khun đng tiu.
- Nhim khun đng tiu: 90% trng hp nhim khun đng tiu ln đu 

ph n là do E.coli, vi các triu chng: tiu lt nht, tiu đau, tiu ra máu,
tiu ra m.
- Viêm màng não: E.coli chim khong 40% trng hp viêm màng não  tr
s sinh, 75 % trong s đó có kháng nguyên K1
- Tiêu chy: nhng chng E.coli thng liên uan đn tiêu chy thuc các nhóm
sau: EPEC, ETEC, EIEC, VTEC(Verocytotoxin ậ producing E.coli).

















Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

21

PHN 2: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU
2.1. Thi gian vƠ đa đim thc hin

Thi gian thc hin đ tài t 05/11/2013 đn 17/05/2014.
Ni ly mu và thc hin thí nghim: Phòng Vi sinh - GMO ậ Trung tâm k
thut tiêu chun đo lng cht lng 3 - QUATEST 3.
2.2. Vt liu
2.2.1. Thit b và dng c
 Dng c:
Bình tam giác, ng đong hình tr 100 mL, pipetman, ng nghim, hp đa petri,
đèn cn, bao PE vô trùng, mung, khay kim loi, ng đông khô.
 Thit b:
Cân phân tích, máy dp mu, máy đông khô, máy lc, ni hp, t cy an toàn
sinh hc, t sy, t m, b điu nhit, t đông sơu -40
0
C.
2.2.2. Hóa cht vƠ môi trng
 Hóa cht:
- Nc ct
- Polymycin B solution
- Eggyolk emulsion 50%
 Môi trng:
- Môi trng Skim milk 10%.
- Môi trng đm phosphate.
- Môi trng Plate count agar.
- Môi trng Mannitol-egg-yolk-polymyxin (MYP agar).
- Môi trng thch máu cu.
- Môi trng Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX medium).
- Môi trng Trypticase (tryptic) soy broth (TSB)
2.2.3. Vt liu thí nghim
i vi chng Bacillus cereus: thc hin bo qun trên mu go.
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

22

i vi chng Escherichia coli: thc hin bo qun trên mu rau ci ngt sy
sn.
2.3. Phng pháp thc hin
Quy trình chung:



















Bc 1: Ly mu và kh trùng mu
 Mu go đc ly ngu nhiên và đc cho vƠo các bình tam giác đ hp vô
trùng  121
0

C trong 15 phút. Sau đó sy  60
0
C cho đn khi mu go khô.
Bc 5
Bc 4
Bc 3
Bc 2
Bc 1
Thu nhn và kh trùng mu ban đu.
Kim tra đ vô trùng ca mu
Tng sinh chng VSV trên môi
trng thích hp t ng chng gc
ban đ
nh lng, xác đnh mt đ chng
sau tng sinh.
Hút 1mL chng cho vào ng
mu đư chun b.
Bo qun mu  -35
0
C trong 12 gi.
Tin hƠnh đông khô mu  -50
0
C trong 12 gi.
Kim tra mt đ chng VSV 
các mc thi gian khác nhau.
Cân mu vào các ng vô trùng.
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

23

Hình 6 : Mu go sau khi sy khô.
 Mu rau sy đc ly ngu nhiên và do mu đư đc sy sn  nhit đ cao
nên không cn thc hin thêm các bc vô trùng mu.
Bc 2: Kim tra đ vô trùngca mu
Thc hin đnh lng tng s vi sinh vt hiu khí cho mu go và mu rau. Các
thí nghim đnh lng đc thc hin lp li 3 ln.
nh lng tng s vi sinh vt hiu khí bng phng pháp đm khun lc [2,5]
Thc hin cho c mu go và mu rau.
 X lý và pha loãng mu:
Cân vô trùng 10 g mu vào túi vô trùng, thêm 90 mL dung dch đm phosphate,
đng nht mu bng máy dp mu trong 20 giây. Dung dch mu thu đc có đ
pha loãng là 10
-1
.
Dung dch mu đng nht đc tip tc pha loãng thành các mt đ 10
-2
, 10
-3

bng cách dùng pipet vô trùng chuyn 1mL mu vào ng nghim cha 9 mL dung
dch đm phosphate. Trn mu trong ng nghim cho đng nht bng máy vortex
hoc dùng pipet hút đo dch mu lên xung 5 ậ 10 ln.
 Cy mu:
Chuyn 1 mL các dung dch pha loãng vào mi đa. Mi mt đ pha loãng cy
hai đa.
Sau khi chuyn, đ vào mi đa 10 ậ 15 mL môi trng PCA. Trn đu dch mu
vi môi trng bng cách xoay tròn đa petri xuôi vƠ ngc chiu kim đng h. t
Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun

khác nhau.

24

đa trong t cy đn khi thch môi trng đông đc. Lt ngc và  các đa trong t
m  35
0
C trong 48 ± 2 gi.
 c kt qu:
m tt c s khun lc xut hin trên các đa sau khi . Chn các đa có s
khun lc t 25 đn 250. Kt qu đc tính theo công thc:
 










CFU/g (mL)
Trong đó:
X: tng s vi sinh vt hiu khí (CFU/g)

: tng s khun lc đm đc trên các đa đư chn
V: th tích dch mu cy  mi đa.
n
i

: s đa cy ti mt đ pha loãng th i.
f
i
: đ pha loưng tng ng.
.














Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun
khác nhau.

25

Quy trình đnh lng tng s vi khun hiu khí bng phng pháp đm
khun lc
i vi mu go:

Trn chung
10
-1

10
-2

10
-3

1 mL
1 mL
 vào mi đa 10 ậ 15 mL môi trng PCA, trn đu
dch mu vi môi trng
  35
0
C trong 48 ± 2 gi
c kt qu
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL