Ứng dụng Marker phân tử trong xác định dòng bất dục đực tế bào chất (CMS) và dòng phục hồi hữu dục Rf ở ớt (Capsicum annuum L.)

TRNG I HC M THÀNH PH H CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGH SINH HC


BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
 tài:
NG DNG MARKER PHÂN T TRONG XÁC NH
DÒNG BT DC C T BÀO CHT (CMS) VÀ DÒNG
PHC HI HU DC Rf  T (Capsicum annuum L.)
KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: CNSH NÔNG NGHIP.
GVHD: TS. Lê Th Kính
CN. Nguyn Duy Khánh
SVTH: Nguyn Ngc Kim
MSSV: 1053010353
Niên khóa: 2010-2014
TP. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang i

LI CM N
u tiên, em xin chân thành cm n tt c thy cô Khoa Công ngh sinh hc,
Trng i hc M TP. H Chí Minh đã nhit tình ging dy, trang b cho em
nhng kin thc cn thit trong sut nhng nm tháng đi hc.
Em xin gi li cm n sâu sc đn cô Lê Th Kính đã hng dn, giúp đ, to
mi điu kin thun li cho em hoàn thành đ tài này.
Cm
n tt c các anh, ch phòng thí nghim Marker phân t đã giúp đ em rt
nhiu trong sut thi gian thc tp và làm khóa lun, đc bit cm n anh Nguyn
Duy Khánh đã tn tình ch dy, hng dn đ em hoàn thành đ tài.
Em xin chân thành cám n Ban giám hiu nhà trng và Ban giám đc cùng

toàn b anh, ch trong công ty C phn ging cây trng Min Nam đã to điu kin
thun li đ em thc t
p và hoàn thành khóa lun.
Trân trng cm n bn bè đã giúp đ, ng h, khích l tinh thn cng nh chia
s, cng c kin thc cùng mình trong quá trình thc tp và thc hin khóa lun tt
nghip.
Cui cùng, con xin t lòng bit n đn ba m đã nuôi nng, dy d, chm sóc,
khích l, to mi điu kin đ con hc tp, hoàn thành thc tp và t
t nghip.


TP. H Chí Minh, tháng 05 nm 2014.
Nguyn Ngc Kim

Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang ii

MC LC
DANH MC HÌNH
DANH MC BNG
1. T VN  1
2. TNG QUAN TÀI LIU 4
2.1 Gii thiu v cây t 5
2.1.1 Tên gi 5
2.1.2 Ngun gc 5
2.1.3 Công dng 5
2.1.4 Phân loi 7
2.1.5 c đim thc vt hc ca cây t 8
2.1.6  cay ca t 10
2.2 Phng pháp phát hin gen CMS và gen Rf 10

2.2.1 Gen CMS 10
2.2.2 Gen phc hi Rf 13
2.2.3 Marker phân t 13
2.2.4 Các dòng t trong h thng sn xut t lai 3 dòng. 15
2.3 Tng quan tình hình nghiên cu v marker phân t liên kt vi gen CMS
và gen phc hi hu dc (Rf)  t 15
2.3.1. Nghiên cu v marker liên kt gen CMS 16
2.3.2 Nghiên cu v marker liên kt gen phc hi hu dc (Rf)  t 17
3. VT LIU
& PHNG PHÁP 20
3.1 Mu thc vt 21
3.2 Nhum ht phn vi acetocarmine 24
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang iii

3.3 Tách chit DNA 24
3.3.1. Phng pháp tách chit DNA genome ca các ging t 24
3.3.1.1. Nguyên lý 24
3.3.1.2. Quy trình 25
3.4 Kim tra tính đc hiu ca các marker bng phng pháp PCR
và đin di 27
3.4.1 Phng pháp PCR 27
3.4.1.1 Nguyên tc 27
3.4.1.2 Thành phn phn ng 29
3.4.2 Phng pháp đin di 30
3.4.2.1 Nguyên lý 30
3.4.2.2 Quy trình đin di gel agarose 30
4. KT QU & THO LUN 31
4.1. Kt qu soi phn hoa 32
4.1.1 Phn hoa ca 8 cp A/B và 7 dòng R 32

4.1.1 Phn hoa ca 49 mu thu thp 33
4.2. Kt qu kho sát các b mi 34
4.2.1 Kt qu tách chit DNA 34
4.2.2 Chy th nghim marker CMS trên dòng CMS và duy trì 35
4.2.3 K
t qu kho sát gradient nhit đ trên các dòng CMS và duy trì 37
4.2.4 Kt qu phân tích marker Orf456 trên 8 cp dòng CMS
và dòng duy trì 38
4.2.5 Chy kim tra marker Rf trên dòng phc hi và dòng duy trì 39
4.2.6 Kt qu kho sát gradient nhit đ ca b mi CRF-SCAR
trên dòng R 40
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang iv

4.2.7 Kt qu phân tích marker CRFSCAR trên 8 dòng B
và 7 dòng R 41
4.2.8 Phân tích yu t bt dc và phc hi trên 49 mu thu thp 43
5. KT LUN &  NGH 47
6. TÀI LIU THAM KHO 50

Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang v

DANH MC HÌNH
Hình Trang
Hình 2.1 Các loi t trng ph bin  Vit Nam 7
Hình 2.2 t à Lt 7
Hình 2.3 Các loi t king 8
Hình 3.1 Phá v màng t bào 24
Hình 3.2 Mu sau khi  vàng cho thêm chloroform - IAA (24:1) 25

Hình 3.3 Mu sau ly tâm 25
Hình 3.4 DNA ta  đáy eppendorf 26
Hình 3.5 Các giai đon ca phn ng PCR 27
Hình 4.1 Ht phn các dòng A/B nhum vi acetocarmine 31
Hình 4.2 Kt qu soi ht phn ca 49 dòng/ging t thu thp 32
Hình 4.3 Kt qu tách chit DNA 33
Hình 4.4 Chy th nghim marker orf456 trên dòng CMS và dòng duy trì 34
Hình 4.5 Chy th nghim marker atp6 trên dòng CMS và duy trì 35
Hình 4.6 Kho sát gradient nhit đ mi orf456 và atp6 36
Hình 4.7 Kt qu phân tích marker CMS trên 8 cp dòng A/B 37
Hình 4.8 Kim tra marker CRFSCAR trên dòng phc hi và dòng duy trì 38
Hình 4.9 Kho sát gradien nhit ca b mi CRFSCAR trên dòng phc hi
và dòng duy trì 39
Hình 4.10 Phân tích marker CRFSCAR trên 8 dòng B và 7 dòng R 40
Hình 4.11 Phân tích nhân t CMS bng marker Orf456 trên 49 mu t
thu thp 42
Hình 4.12 Phân tích nhân t phc hi bng marker CRFSCAR trên 49 mu t
thu thp 43

Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang vi

DANH MC BNG
Bng Trang
Bng 1: Danh sách tên 49 dòng/ ging thu thp 20
Bng 2: Thông và trình t mi s dng trong đ tài 22
Bng 3: Kt qu phân tích yu t bt dc, hu dc bng marker, kim tra ht phn
trên 8 cp A/B và 7 dòng R 40
Bng 4: Kt qu phân tích nhân t CMS, Rf bng marker cùng kt qu kim tra ht
phn trên 49 dòng/ging thu thp 43

Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 1








1. T VN 

Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 2

t là loi cây đc con ngi trng trt và thu hái t lâu đi. Vi nhiu ngi,
đây là gia v không th thiu trong ba n hng ngày, làm tng cm giác ngon
ming. Trong t có các hp cht sinh hc có hot tính tt cho sc khe nh vitamin,
capsaicin, flavonoid,…vì th t đc coi là mt dc liu quý trong y hc. Hn th
na, t còn là nguyên liu quan trng cung cp cho các nhà máy, công ty sn xut
các mt hàng thc ph
m tiêu th và xut khu đem li li nhun cao [36].
 nc ta, t đc trng khp 3 min vi din tích trng khong 26.000 ha,
nhu cu ht ging t hàng nm khong 2,6 tn ht vi giá tr khong 2 triu USD
[7]. Các ging t cay đc trng ch yu  nc ta là nhng ging đa phng nh
t sng, chìa vôi, t him,… Ngoài ra còn mt s ging nhp ni t Trung Quc,
ài Loan và Nht Bn [8].
Th trng ht ging t cay  Vit Nam hu nh do các công ty nc ngoài
chim lnh, nghiên cu v chn to và sn xut ht ging t cay trong nc ch

 phát
trin trong khong mt thp k nay. Nm 2004, B Nông nghip và Phát trin Nông
thôn công nhn ging tm thi và đa vào sn xut th 2 ging t lai F1 do Viên
nghiên cu rau qu Vit Nam lai to là HB 9 và HB 14, nng sut trung bình đt 20-
25 tn/ha. Vin Nghiên cu Cây n qu Min Nam đã cho ra đi ging t lai Long
nh 3 d trng, ít sâu bnh, phù hp vi th nhng vùng ng bng sông Cu
Long, nng sut cao 40-50 tn/ha. Tuy nhiên, các ging t cay k trên vn cha th
kinh doanh trên din rng do cha có kh nng cnh tranh vi các ging ngoi nhp
v nng sut và cht lng thng phm [7].
Khó khn trong sn xut ht ging t lai F1 là do hoa t có kích thc rt nh,
nên vic kh túi phn tn rt nhiu công lao đng, làm tng giá thành sn xut gim
sc cnh tranh ca ging t cay F1. Bin pháp ph bin hin nay đc các công ty
ging s dng là dùng các ging có yu t bt dc đc làm dòng m đ gim chi phí
kh túi phn [7]. V mt di truyn, bt dc đc có 2 dng là bt dc đc do nhân và
bt dc đc t bào cht, dng bt dc đc trong nhân ít đc s dng do nó ph
thuc quá nhiu vào điu kin môi trng, trong bi cnh bin đi khí hu nh hin
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 3

nay s dng dng bt dc đc nhân đ phc v công tác lai to là không tha đáng
vì con lai có kh nng tp nhim cao do dòng m bt dc không n đnh. Vì vy, s
dng yu t bt dc t bào cht trong sn xut t lai 3 dòng là gii pháp u vit do
dòng m có tính n đnh cao và không ph thuc vào điu kin môi trng [11].
Mt hn ch trong chn to ging t cay lai F1 có yu t CMS là mt nhiu
thi gian đ to ra các dòng A/B, R cho con lai 3 dòng, thi gian đ to mt ging
t lai F1 có kh nng kinh doanh là 6-8 nm. Tuy nhiên, các ging t cay nhp ni
ca các công ty nc ngoài hàng nm vào Vit Nam ngày càng nhiu, càng đa dng
thì thi gian 6-8 nm mi ra ging là không có kh
nng cnh tranh [7].
Ngày nay, công ngh sinh hc đóng vai trò quan trng trong nông nghip nói

chung và chn to ging cây trng nói riêng. Mt trong nhng ng dng quan trng
là dùng marker phân t đ xác đnh mt tính trng mc tiêu ca cây trng vi đ
chính xác cao và thi gian nhanh chóng. S dng marker phân t đ xác đnh các
yu t liên quan đn CMS trên t đã đc nghiên cu  nhiu ni trên th gii [11].
Ti Vit Nam, nhóm nghiên cu thu
c trng H Khoa hc T nhiên TP.HCM đã
tin hành kho sát các b mi liên kt vi tính trng CMS và phc hi hu dc 
ging t ch thiên (Capsicum frutescens), kt qu nhóm xác nhn 3 marker đc hiu
trong vic phát hin nhân t CMS và phc hi [12], tuy nhiên đây ch là đ tài s
khi trên 1 ging vi 4 b mi, vì vy cn có nghiên cu sâu hn trên b mi l
n
hn và qun th t đa dng hn bao gm c t ch thiên và ch đa.
T nhng thc tin nêu trên, chúng tôi đã thc hin đ tài: “ng dng
marker phân t trong xác đnh dòng bt dc đc t bào cht (CMS) và dòng
phc hi hu dc Rf  t (Capsicum annuum l.)”. Mc tiêu kho sát đ đc hiu
ca các marker liên kt cht v
i gen CMS và gen phc hi hu dc (Rf). T đó,
chn lc các dòng CMS, dòng phc hi n đnh phc v công tác chn to sn xut
ht t lai F1
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 4







2. TNG QUAN TÀI LIU

Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 5

2.1 Gii thiu v cây t
2.1.1 Tên gi
Tên ting Anh: Hot pepper, Chili pepper
Thuc h cà Solanaceae
Chi Capsicum
Loài Capsicum sp. [38]
2.1.2 Ngun gc
t đã là mt phn trong m thc ca loài ngi ít nht là 7500 nm trc
Công nguyên và có l sm hn. Có nhng bng chng kho c  các khu vc  tây
nam Ecuador cho thy t đã đc thun hóa hn 6000 nm v trc, và là mt
trong nhng loi cây trng đu tiên  châu M.
Christopher Columbus đã là mt trong nhng ngi châu Âu đu tiên thy t
( Caribe), và gi chúng là "tiêu" (pepper) vì chúng có v cay tng t (không phi
b ngoài ging nhau). t đã đc trng khp ni trên th gii sau thi Columbus.
Diego Álvarez Chanca, mt thy thuc trong chuyn đi th hai ca Columbus đn
West Indies nm 1493, đã mang nhng ht t đu tiên v Tây Ban Nha, và đã ln
đu vit v các tác dng dc lý ca chúng vào nm 1494.
T Mexico, vào thi đó đang là thuc đa ca Tây Ban Nha, cng là mt nc
kim soát thng mi vi châu Á, t đã nhanh chóng đc chuyn qua Philippines
và sau đó là Trung Quc, Triu Tiên, Nht Bn vi s tr giúp ca các thy th
châu Âu. Gia v mi này đã nhanh chóng đc s dng trong ch bin thc n ca
các quc gia này [8],[38].
2.1.3 Công dng
Cây t va đc s dng nh 1 loi rau sch n qu cao cp (t ngt), va là
cây gia v phc v cho ba n hng ngày (t cay). Dùng n ti, nguyên liu nu
nng, nguyên liu quan trng trong công nghip ch bin thc phm và dc liu
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính

SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 6

đ bào ch các thuc tr bnh nh các hp cht có hot tính sinh hc cha trong qu
t [10].
Theo y hc c truyn, t có v cay, nóng, có tác dng khoan trung, tán hàn,
kin t, tiêu thc, ch thng (gim đau), kháng nham (cha ung th ). Do vy t
thng đc dùng đ cha đau bng do lnh, tiêu hóa kém, đau khp, dùng ngoài
cha rn rt cn,
Nghiên cu ca y hc hin đi cng thng nht vi y hc c truyn v tác
dng cha bnh ca t. Kt qu nghiên cu ca các nhà khoa hc Trung Quc cho
thy qu t có rt nhiu ích li cho sc khe. Capsaicin trong qu t có tác dng
kích thích não b sn xut ra cht endorphin, mt cht morphin ni sinh, có đc tính
nh nhng thuc gim đau, đc bit có ích cho nhng bnh nhân b viêm khp mãn
tính và các bnh ung th, capsaicin gây nóng và bng rát khi tip xúc vi da ngi,
khi  dng tinh khit capcaicin có th gây cht ngi khi vô ý nut phi, tuy nhiên
ti mt lng nào đó nó mi gây đc cho c th [39].
Ngoài ra, t còn giúp ngn nga bnh tim do cha mt s hot cht giúp máu
lu thông tt, tránh đc tình trng đông vón tiu cu d gây tai bin tim mch. t
còn có tác dng ngn nga tình trng huyt áp tng cao. Mt s nghiên cu cho
thy, nhng loi t v xanh, trái nh có hàm lng capsaicin nhiu hn. Ngoài ra,
trong qu t còn cha nhiu loi vitamin nh vitamin A, C, B1, B2, … Hàm lng
Vitamin A, Vitamin C trong t gp 5-10 ln cà chua và cà rt, qu t còn cha các
cht khoáng nh Ca, Fe, Na, P, S…, 1 s axit amin, protein và cht béo, acid citric,
acid malic, beta caroten…[8] [37] [40]. Cây t trng trong chu có th làm mt loi
cây cnh vì qu t có nhiu màu sc: trng, đ, vàng, cam, xanh, tím…tùy theo
ging cây [37].
Là cây cho giá tr kinh t cao c v mt xut khu ti và ch bin, đc bit là
công thc gii quyt ch đ luân canh cho cây trng trên 1 đn v din tích có nng
sut và giá tr kinh t cao [36].
Bá

o
S
V
lo
à
f
ru
L.
v
đ
c
o
cáo khó
a
V
TT: Nguy

2.1.4 P
h
Có nhi

à
i t đc
t
tescens L.
;
v
à loài C.
c
đim qu


Các lo
i
- t s
n

A. Sn
g
- t ch
u
a
lun tt
n

n Ngc
K
h
ân loi

u quan đi

tr
ng chín
h
;
loài C. c
h
pubescen
s


. t cay q
u
i
t đc t
r
n
g, t hi
m
g
Vàng
Hình 2.1

C
u
ông-t 
à
n
ghi
p
khó
a
K
im-10530

m khác n
h
h
trong t
n
h

inense Ja
c
s
Ruiz an
d
u
 to, dài
v
r
ng ph
b
m

C
ác loi 
t
à
Lt: khô
n
H
(
N
a
2010
1
0353
h
au nhn
g
n

g s 30 l
o
c
quin; loà
i
d
Pavon. C
v
à t ngt t
b
in  Vit
B. Sng
X
t
trng ph

n
g cay.
H
ình 2.2

t
N
gun wi
k

g
theo bn
g
o

ài t: loà
i
i
C. pendu
ác loài t
t
huc v lo
Nam [38]
X
anh

bin  Vi
t
à Lt
k
ipedia)
GV
H
g
phân lo

i
Capsicu
m
lum Willd
e
tr
ng ch
ài C. annu
C.

H
t Nam (
N
H
D: TS Lê
T

i mi nh
t
m
annum
L
e
now var
p
yu đc
p
m. [6], [21
H
im-ch
t
N
gun SR
C
T
h Kính
Trang 7

t
thì có 5

L
.; loài C.
p
endulum
p
hân bit
]

t
hiên
C
)
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 8

- t king nhiu màu sc thng dùng trang trí, không cay. Thng có rt
nhiu màu, trái to, nh, tròn nh cà hay hình git nc.
A
B

Hình 2.3 Các loi t king
A: t hình git nc
B: t tím
(Ngun: SRC)

2.1.5 c đim thc vt hc ca cây t [6] [10]
- Thân: t là cây bi thân g 2 lá mm, thân thng mc thng, đôi khi có th
gp các dng (ging) có thân bò, nhiu cành, chiu cao trung bình 0,5-1,5 m, là cây
hàng nm hoc lâu nm nhng thng đc gieo trng nh cây hng nm.
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính

SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 9

- R: t có r cc phát trin mnh vi rt nhiu r ph. Do vic cy chuyn, r
cc chính đt, mt h r chùm khe phát trin, vì th nhiu khi lm tng t có h
r chùm.
- Lá: thng là lá đn mc xon trên thân chính, có nhiu dng lá, thng gp
nht là dng lá mác, trng ngc, mép lá ít rng ca. Lông trên lá ph thuc vào các
loài khác nhau, mt s có mùi th
m. Lá thng mng có kích thc trung bình 1,5-
12 cm x 0,5-7,5 cm.
- Hoa: các hoa hoàn thin và qu thng đc sinh đn đc trên tng nách lá,
ch có loài C. chinense thng có 2-5 hoa trên mt nách lá. Hoa mc thng đng
hoc buông thng. Trên hoa cung thng không có li tng. Hoa đa s có màu
trng, mt s ging có màu sa, xanh lam và tía (tím). Hoa có 5-7 cánh hoa, có
cung dài khong 1,5 cm, đài ngn có dng chuông 5-7 rng dài khong 2 mm bc
ly qu. Nhy đn gin có màu trng hoc tím, đu nhy có d
ng hình bu. Hoa có
5-7 nh đc vi ng phn màu xanh da tri hoc tía trong khi  nhóm C. frutescens
và C. chinense có ng phn màu trng xanh, còn có th phân bit các nhóm t theo
màu đm chm  gc ca cánh hoa. Kích thc ca hoa cng ph thuc vào các
loài khác nhau, đng kính cánh hoa t 8-15 mm.
- Qu: qu mng có rt nhiu ht vi tht qu nhn và chia làm 2 ngn. Các
ging khác nhau có kích thc qu, hình dng, đ nhn, màu sc, đ
cay và đ
mm ca tht qu rt khác nhau. Qu cha chín có th có màu xanh hoc tím, qu
chín có màu đ, da cam, vàng, nâu, màu kem hoc hi tím.
- Ht: dng thn và màu vàng rm, ch có ht ca C. pubescens có màu đen.
Ht có chiu dài khong 3-5 mm. Mt gam ht t ngt có khong 160 ht, còn t
cay khong 220 ht.  trng 1 ha t cn khong 400 g ht

Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 10

2.1.6  cay ca t
- Qu ca hu ht các loài t có cha capsaicin (methyl vanillyl onenamide),
mt cht tan trong du, chính cht này to v cay cho t. Lng capsaicin trong t
rt đa dng và ph thuc vào di truyn, các loi t cha lng capsaicin khác nhau
cho đ cay khác nhau [21].
- V cay ca t ít hay nhiu là do t l phn trm ca các capsaicinoid
(capsaicin) trong trái to ra. Các ging t ngt thng có hàm lng capsicin rt
th
p (<0.1%). V cay ca t rt quan trng trong chn ging đi vi mt s vùng
trên th gii và ngi ta dùng đn v Scovill (SU: Scovill Unit) đ th hin đ cay
ca mt ging t, ti đa là 1000.
SU=010 là không cay
SU=1130 là cay nh
SU=3180 là cay va
SU>80 là rt cay. [39]

2.2 Phng pháp phát hin gen CMS và gen Rf
2.2.1 Gen CMS
Bt dc đc là hin tng cây trng sn sinh ra các ht phn bt dc (ht phn
không có sc sng, không th ny mm và th tinh trên núm nhy cái), nhng b
phn cái (noãn) vn phát trin bình thng và có kh nng th tinh nh giao phn
chéo. Hin tng này rt có li cho công tác lai ging đi vi các cây t th phn,
vì khi tin hành sn xut ht lai không cn kh
đc dòng m.
Da vào đc tính di truyn hay ngun gc phát sinh ca các dng bt dc 
thc vt, ngi ta phân thành 3 kiu bt dc chính:
- Bt dc đc do x lý hóa cht: ngi ta s dng 1 s loi hóa cht đ làm

mt chc nng ht phn. Hóa cht này đc gi là gametocides (Ethrel, Mendok, )
các hóa cht có nng đ xác đnh đc phun lên hoa vào giai đon chun b n
hoa
đ git ht phn mà không làm nh hng đn b phân cái, do vy kh nng nhn
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 11

phn, th phn, th tinh vn bình thng. Tuy nhiên, phng pháp này không th
làm mt chc nng ca mi ht phn và đôi khi gây tác dng bt li cho môi
trng.
- Bt dc đc nhân (Nuclear Male Sterility-NMS): tính trng bt dc đc
kim soát bi 1 hoc 2 cp gen nhân và không chu s kim soát ca gen trong t
bào cht. Nhiu nghiên cu cho rng cp gen ln trong nhân kim soát tính trng bt
dc đc nh
y cm vi điu kin môi trng, bao gm bt dc đc nhy cm vi đ
dài ngày PGMS- Photoperiodic-sensitive Genic Male Sterility) và bt dc đc nhy
cm vi nhit đ (TGMS- Thermo-sensitive Genic Male Sterility). i vi PGMS,
thông thng cây s bt dc trong điu kin ngày dài (hn 14 gi chiu sáng), hu
dc khi đ dài ngày ngày ngn hn (nh hn 14 gi chiu sáng). Còn vi TGMS
cây thng bt d
c khi nhit đ cao và hu dc khi nhit đ môi trng thp. Dng
bt dc đc trong nhân có th t khôi phc kh nng sinh sn khi điu kin môi
trng thay đi, tuy nhiên đây cng chính là nhc đim ca dng bt dc đc này
vì chúng ph thuc quá nhiu vào điu kin môi trng gây khó khn cho công tác
trng trt, duy trì và s dng dòng bt dc trong công tác sn xu
t ht lai [11].
- Bt dc đc t bào cht (CMS - cytoplasmic male sterility) là kt qu ca s
tng tác gia gen trong nhân và các thay đi v gen hoc cu trúc ca gen  t bào
cht. CMS là mt tính trng di truyn làm cây không sn xut đc ht phn hoc
làm mt chc nng ca ht phn, đc tính này có giá tr quan trng v mt kinh t

trong sn xut ht lai  nhiu loi cây tr
ng. Dòng t bt dc đc CMS đc phát
hin ln đu tiên bi Peterson (1958) [23], k t đó, dòng này là dòng duy nht
đc s dng đ sn xut ht t lai [18],[28]. Gen liên kt vi tính trng bt dc
đc xác đnh thuc b gen ti th [27].
Da vào báo cáo ca Wang và cng s (2004) v kh nng phc hi hu dc
trên t CMS, nhóm nghiên cu [29] gi thuyt rng có th có nhi
u hn 1 yu t
gây nên bt dc đc  t, h cho rng gen atp6 và orf456 thuc gen coxII là 2 trong
nhng yu t to nên tính bt dc  t. Sau khi tin hành thí nghim nhóm kt lun
gen atp6 và orf456 có th là nhân t quan trng trong hình thành tính trng bt dc
đc  t.
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 13

2.2.2 Gen phc hi Rf
Phc hi hu dc  dòng t CMS đc kim soát bi gen Rf nm trong nhân,
s có mt ca gen tri này c ch biu hin thành kiu hình ca gen bt dc đc. Có
nhiu hn 1 gen điu khin kh nng phc hi hu dc  h thng t bt dc. Ngoài
ra, tính phc hi hu dc còn
đc điu khin bi gen phc hi không hoàn toàn
Pr, gen phc hi mt phn b át ch bi gen tri Rf nhng nó li tri so vi gen rf,
gen Pr làm thc vt sn xut đng thi ht phn bình thng và ht phn không
phát trin, nh hng đn quá trình chn lc dòng và lai to ht ging F1 [20] [31]
[34].
2.2.3 Marker phân t
Trong di truyn hc, marker phân t là 1
đon DNA liên kt vi 1 locus nht
đnh trong b gen. Marker phân t đc s dng trong sinh hc phân t và công
ngh sinh hc đ xác đnh mt trình t DNA c th [35].

Mt s k thut phân t ph bin:
 RFLP (Restriction fragment length polymorphism): ct DNA mu
bng 1 hoc nhiu RE (Restriction Endonuclease- emzym ct gii hn ni bào), sn
phm phân tách bng đin di argarose.
u đim ca phng pháp này là: Có kh
 nng lp li cao, xác đnh đc di
truyn đng tri, có tính đc hiu locus (nên trình t bo tn ca các gene trên các
sinh vt có quan h gn gi có th xác đnh đc), không yêu cu thông tin chui,
d ghi đim do kích thc các bng thng khác nhau đáng k. Tuy nhiên, có 1 s
nhc đim đáng k nh: yêu cu s lng và cht lng DNA cao, không th t
đng hóa nên tn công s
c và chi phí, mc đ đa hình thp khó đc kt qu.
 AFLP (Amplified fragment length polymorphism): ci tin t RFLP, phng
pháp này da trên c s khuch đi có chn lc các đon DNA đã b ct, dùng trong
PCR. Mu DNA đc phân ct bng các RE (Restriction Endonuclease- emzym ct
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 14

gii hn ni bào), các sn phm ct đc ni vi các adapter, adapter hot đng nh
1 mi liên tc khuch đi các đon DNA mc tiêu.
u đim:  tin cy và kh nng lp li cao, không cn bit trc v thông tin
genome ca đi tng nghiên cu, rt giàu thông tin vì có th đánh giá đng thi
nhiu locus (đánh giá đa hình trên toàn b gene). Tuy nhiên, phng pháp này tri
qua nhiu b
c thc hin, đòi hi k thut phc tp, đt tin do nhn din bng đin
di polyacrylamide và phi thêm RE, adapter.
 RAPD (Random amplification of polymorphic DNA): k thut này thc cht
là quá trình nhân bn các đon ADN bng k thut PCR có s dng các mi đc
thit k ngu nhiên (thông thng có chiu dài khong 6-10 bp), trong đó DNA
đc khuch đi bi các đon mi ngu nhiên, dùng đ nghiên cu s khác bit di

truyn ca nhng ging/loài khác nhau.
u đim: phát hin nhanh dng di truyn, đn gin không đòi hi k thu
t cao, r,
không dùng phóng x. Nhc đim: xut hin các bng tính trng tri không phân
bit đc cá th đng hp t và d hp t, tính lp li không cao do mi ngu nhiên
và điu kin phn ng PCR.
 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Sequences) thông qua k thut
PCR các phân đon DNA có kích thc khác nhau xut hin to nên s đa hình.
Phng pháp này s dng các mi đc hiu đ nhân b
n vùng trình t xác đnh, sn
phm PCR đc phân ct bng RE (Restriction Endonuclease- emzym ct gii hn
ni bào).
u đim:  tin cy và kh nng lp li cao. Nhc đim: phc tp và tn
kém.
 SCAR (Sequence characterized amplified regions) k thut SCAR đc ci
tin t k thut RADP (Random amplification of polymorphic DNA).  k thut
SCAR đon mi đc s dng dài kho
ng 22-30 nu thay vì 8-10 nu nh  k thut
RAPD, đon mi dài hn và đc thit k đc hiu cho DNA xác đnh nên mi bt
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 15

cp đc hiu ngay v trí đích, khuch đi đúng vùng gen quan tâm, t đó cho kt qu
n đnh hn, d lp li hn so vi k thut RAPD [1]. Tuy nhiên SCAR là marker
tri ch cho kt qu có hoc không nên chúng không phân bit đc cây mang gen
đng hp hay gen d hp, do đó marker này không đc s dng cho nhng loài
gn ging nhau. Mt s marker SCAR c th đã đc áp dng trong các nghiên cu
l
p bn đ gen và h tr chn ging [42].
2.2.4 Các dòng t trong h thng sn xut t lai 3 dòng.

Liên quan đn tính trng bt dc đc có các dòng cây nh sau:
- Dòng bt dc (dòng A): kiu gen ty th có gen đt bin đc trng cho tính
trng bt dc đc, kiu gen trong nhân không có gen tri Rf .
- Dòng phc hi (dòng R): kiu gen ty th có hoc không có gen đt bin đc
trng cho tính tr
ng bt dc đc, kiu gen trong nhân có đng hp tri Rf.
- Dòng duy trì (dòng B): kiu gen ty th không có gen đt bin đc trng cho
tính trng bt dc đc, kiu gen trong nhân không có đng hp tri Rf .
- Dòng F1: con lai ca dòng bt dc đc và dòng phc hi [12].
Dòng A và B đng dng di truyn nhân,  c hai dòng kiu gen trong nhân đu
không có đng hp tri Rf, tuy nhiên  dòng A có gen đt bin hình thành nên tính
trng CMS còn  dòng B thì không có đt bin này. Dòng B dùng đ duy trì dòng A
bng cách lai vi dòng A (dòng A làm m), kt qu nhn đc 100% cây dòng A
bt dc dùng làm dòng m trong sn xut ht lai.

2.3 Tng quan tình hình nghiên cu v marker phân t liên kt
vi gen CMS và gen phc hi hu dc (Rf)  t
Cây t có vai trò không nh trong đi sng con ngi nên nghiên cu đ lai
to nhanh các ging t t dòng CMS càng tr nên cp thit. Trên th gii đã và
đang có các nhà nghiên cu s dng các k thut sinh hc phân t đ phát hin gen
CMS và gen Rf nhm khc phc nhng nhc đim trong công tác chn to ging
t theo phng pháp truyn thng nh chn lc kiu hình, kh đc th công t
n
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 16

nhiu thi gian và công lao đng,… Tôi xin trình bày s lc mt s công trình
nghiên cu v tính trng bt dc đc tiêu biu:
2.3.1. Nghiên cu v marker liên kt gen CMS
- T nghiên cu trc đó trên ging t Milyang (Capsicum annuum cv.) nhóm

nghiên cu [15] cho rng có 2 bn sao atp6 hin din  t hu dc trong khi có 1
bn sao atp6 và 1 gen gi ca atp6 trong dòng CMS [23]. Báo cáo này ca nhóm
nhm b sung thêm đc tính ca
atp6 trong ty th t, đc bit là gen gi atp6 [(S)
watp6-2] trong dòng CMS t.  nghiên cu s tng quan gia gen watp6 và tính
trng CMS, h so sánh RNA phiên mã và RNA chnh sa các atp6  dòng CMS
(thiu gen Rf) và dòng phc hi (mang gen Rf). Kt qu thí nghim cho thy có s
tái t hp xy ra  gen atp6 và coxII, đó có th là nguyên nhân dn đn hình thành
dòng CMS.
- Da trên các kt qu ca phân tích RFLP (restriction fragment length
polymorphism) gi
a dòng t hu dc và dòng CMS, nhóm nghiên cu [17] cho
rng vùng coxII và atp6-2 ca hai dòng này có cu trúc DNA khác nhau. Nhóm tác
gi cho rng có nhiu hn mt tác nhân gây nên tính trng CMS và h phát hin có
s khác bit trong quá trình phiên mã ca gen atp6 gia dòng CMS và dòng hu
dc. Cui cùng, nhóm tác gi kt lun vùng gen orf456 và atp6 có th là nguyên
nhân to nên tính bt dc đc  t.
- Marker phân t orf456 và watp6-2 đc s dng trong chn lc dòng CMS

t. Tuy nhiên, trong thc t, gen orf456 và watp6-2 hin din  c dòng duy trì
(mc đ thp) gây lo ngi v đ tin cy trong vic chn lc nhng cây có cha gen
CMS. Nhóm nghiên cu [30] phát trin marker accD-U giúp xác đnh dòng CMS 
t đáng tin cy hn. Qua kt qu nghiên cu nhóm chng minh rng accD-U có th
xác đnh kiu di truyn t bào cht chính xác hn orf456 hoc watp6-2 trong đó
kiu gen CMS đc xác đ
nh rõ ràng bng s có mt/vng mt các bng và accD-U
kt hp cht ch vi các kiu gen CMS hn.
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 17

2.3.2 Nghiên cu v marker liên kt gen phc hi hu dc (Rf)  t
- Nhóm tác gi [34] cho rng có nhiu gen điu khin kh nng phc hi hu
dc  dòng t bt dc đc, nhóm đã tin hành kho sát đ đc hiu ca marker liên
kt gen phc hi hu dc Rf trên qun th F2 ca Niujiaojiao No.21
(rf/rf)/Xiangtanwan (Rf/Rf). Hai marker RAPD (Random amplified polymorphic
DNA) là OP13
1400
và OW19
800
đc xác đnh là có liên kt cht vi locus Rf,
khong cách di truyn tng ng ca 2 marker này vi locus Rf là 0,37 và 8,12cM.
Hai marker giúp nhn din 13 dòng t lai có kh nng phc hi khác nhau. c bit
c hai marker đu không hin din  tt c các dòng t ngt, chúng có th giúp ích
cho vic chuyn các gen Rf vào các dòng t ngt.
- Nhóm nghiên cu [20] đã tin hành các thí nghim và xác đnh locus Pr
(partical restoration) có liên quan đn kh nng phc h
i hu dc ca dòng CMS,
nghiên cu s dng 87 cá th phân ly ca qun th F2, 8 marker liên kt gen Pr
đc dùng đ xác đnh kh nng phc hi ca các cá th trong qun th F2, kt qu
cho thy marker PR-CAPS hu dng trong vic xác đnh và chn lc các dòng phc
hi.
- Nhóm nghiên cu [21] đã kho sát đ đc hiu ca 4 marker có liên quan vi
gen phc hi hu dc Rf, c
th h s dng 3 marker liên kt gen phc hi Rf
(OPP13-CAPS, AFRF8-CAPS, CRFSCAR-SCAR) và 1 marker liên kt gen phc
hi hu dc không hoàn toàn Pr (PR-CAPS). Kt qu cho rng 4 marker này đu có
liên kt cht vi locus gen phc hi, nhng marker này s giúp ích rt nhiu cho
vic chn lc các dòng duy trì và phc hi khi sn xut t lai bng vic s dng yu
t CMS .
- Gen phc hi hu dc Rf đc s

 dng hiu qu trong sn xut ht lai  t,
mc dù các marker liên kt gen Rf là có sn nhng kh nng ng dng ca chúng
còn hn ch vì có s không thng nht  kiu gen và kiu hình khi xác đnh bng
marker. T nhng nguyên do trên nhóm tác gi [32] đã phát trin và đánh giá kh
nng ng dng ca các marker liên kt gen phc hi hu dc  t, h phát tri
n 3
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 18

marker phân thành 3 nhóm vi khong cách di truyn cách locus Rf ln lt là 0,4
cM (marker CRF-SCAR); 1,4 cM (marker BAC13T7 SCAR); 14 cM (marker
PEPPR1), nh vy marker CRF-SCAR đc cho là có kh nng ng dng cao khi
cho kt qu tng ng gia kiu gen vi kiu hình. Kt qu nghiên cu này cho
thy các marker mi phát trin này cho phép xác đnh dòng phc hi chính xác vi
đ tin cy cao.
-  nghiên cu v nh hng ca kh nng duy trì và kh nng phc hi hu
d
c  dòng bt dc đc t bào cht trên qun th t Capsicum annuum L. ,nhóm
tác gi [33] đã dùng 1 marker liên kt gen Rf (marker CRF- SCAR) đ phân tích
trên 6 dòng CMS, 5 dòng duy trì và 6 dòng phc hi. Kt qu cho thy marker này
đc hiu trong vic xác đnh các dòng cây mang gen phc hi hu dc, t đó góp
phn h tr công tác chn to các dòng cây đ phc v sn xut ht lai bng phng
pháp CMS.
- Ti Vit Nam nm 2013, nhóm nghiên cu [12]
đã tin hành kho sát đ đc
hiu ca 4 b mi liên quan đn tính trng bt dc đc t bào cht và phc hi hu
dc  qun th t ch thiên, sau khi kho sát bng k thut đin di kt hp đi chiu
kt qu kim tra ht phn  các dòng bt dc (không có ht phn bt màu đ khi
nhum v
i acetocarmine), dòng duy trì và dòng phc hi hu dc (có ht phn bt

màu đ khi nhum vi acetocarmine). T nhng kt qu trên nhóm kt lun marker
coxIISCAR, coxIITri-M1 và RFSCAR có th s dng đ nhn din các dòng cây
khác nhau  ging t ch thiên. ng thi, nhóm này cng cho rng marker atp6
không liên h trc tip vi tính trng bt dc đc t bào cht  t ch thiên
(Capsicum frutescens).
Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính
SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 19

Nghiên cu v marker và quy trình phân tích khác nhau đã đc báo cáo trên
th gii, nhng đ tìm đc marker phù hp vi ngun vt liu di truyn và điu
kin công ngh  Vit Nam cn có các thí nghim kho sát c th. Các công trình
nghiên cu v gen CMS và gen phc hi hu dc Rf  t đã và đang đc thc hin
trong và ngoài nc, tuy nhiên  nhng công trình này các nhóm tác gi kho sát
trên nhiu marker vi các k
t qu không ging nhau, vì vy,  đ tài này chúng tôi
tin hành kho sát li tính đc hiu ca các b mi s dng ph bin  các công
trình đã thc hin và các mi này đc nhn đnh là có liên kt cht vi gen bt dc
đc bào cht (CMS), gen phc hi hu dc (Rf) trên đi tng là ging t thng
mi ph bin  Vit Nam Capsicum annuum
L. C th, đi vi tính trng bt dc
đc t bào cht chúng tôi kho sát marker ORF456 và ATP6 trên b t chun là 8
cp dòng A/B do AVRDC (Vin nghiên cu và phát trin rau qu Á Châu) cung
cp, trong đó: A là dòng bt dc đc, B là dòng duy trì bt dc; đi vi tính trng
phc hi hu dc trong nhân (Rf) chúng tôi kho sát tính đc hiu ca các b mi
CRFSCAR, BAC13T7-SCAR, OPP13-CAPS, AFRF8, PR-CAPS, PEPPR1 trên b
t chun là 7 dòng R ca công ty C phn ging cây tr
ng Min Nam. Ngoài ra,
chúng tôi s tin hành phân tích nhân t CMS và nhân t phc hi trên 49
dòng/ging t thu thp ca công ty C phn ging cây trng Min Nam bng các
marker đc hiu đã đc công nhn sau quy trình kho sát.