Báo cáo thực hành môn Virus học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN
PHAN VĂN HÙNG
BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
MÔN VIRUS HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Khóa học: 2010 – 2014
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Ts. Nguyễn Tất Toàn
An Giang, Tháng 04 năm 2014
2
3
Bài I
KỸ THUẬT TIÊM TRỨNG VÀ KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TÁN TRÊN
THẠCH
I. Kỹ thuật tiêm virus Newcastle(Tiêm xoang niệu mô)
1. Mục đích
Xác định sự hiện diện của virus Newcastle trong phôi trứng gà, ứng dụng sâu hơn là sản xuất
Vắc xin.
2. Dụng cụ - hóa chất

Hình 1: Một số dụng cụ và hóa cần thiết
Nước muối sinh lý 10- 20%
Cồn
Iod
Parafin lỏng
Kim tiêm
3. Chuẩn bị nguyên liệu
Chuẩn bị trứng gà đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi
4
Muối sinh lý

10-20%
Hình 2: Trứng 9 – 11 ngày tuổi
Chuẩn bị vắc xin Newcastle nhược độc, sử dụng ở nồng độ 10
-3
, liều lượng là 0.1-0.2ml/trứng
Hình 3: Vắc xin Niu-cát xơ
Pha vắc xin với nước muối sinh lý ở nồng độ 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
.
Hình 4: Khử trùng hủ vắc xin Niu-cát xơ trước khi đem pha
Hình 5: Cho vắc xin vào nước muối sinh lý
5
Hình 6: Lắc để trộn điều vắc xin
Tiến hành pha loãng với các nồng độ 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
Hình 7: Virus Niu-cát-xơ ở 3 nồng độ 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
Sử dụng ở nồng độ 10

-3
để tiêm vào trứng, đối với virus Newcastle. Ta tiến hành tiêm ở xoang
niệu mô, liều lượng là 0,1-0,2 ml/trứng.
4. Quy trình thực hiện
Hình 8: Trứng đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi
6
Hình 9: Soi trứng, xác định buồn hơi thật, vị trí phôi và làm dấu vị trí phôi
Hình 10: Xác trùng vỏ trứng bằng cồn và Iod
Hình 11: Tiến hành đục lỗ, sau đó xác trùng lại lần nữa
Hình 12: Tiến hành tiêm(liều tiêm 0,1-0,2 cc/trứng)
7
Lưu ý : Tiêm về phía đối diện phôi không tiêm trực tiếp lên phôi
Hình 13: Dùng parafin hơi nóng bịt kín lỗ khoan sau đó tiến hành ủ ở 37
0
c
5. Xem kết quả
II. kỹ thuật tiêm Virus Đậu mùa(kỹ thuật tạo buồng hơi giã)
1. Mục đích
Xác định sự hiện diện của Virus đậu mùa trong phôi trứng gà, thông qua bệnh tích biểu hiện
trên màng CAM(nốt pock trên màng CAM).
Ứng dụng sản xuất Vắc xin để phòng bệnh đậu mùa
2. Dụng cụ - hóa chất
Nước muối sinh lý, cồn, Iod, nút bóp cao su…
3. Chuẩn bị nguyên liệu
Chuẩn bị trứng gà đã ấp 9 – 11 ngày tuổi.
Chuẩn bị vắc xin đậu gà nhược độc, pha loãng thành các nồng độ 10
-1
,10
-2
,10

-3
. Sử dụng nồng
độ 10
-3
, liều tiêm 0,1-0,2 ml/trứng. Cách pha loãng thực hiện tương tư như trên.
Hình 14: Vắc xin Đậu gà
8
4. Quy trình thực hiện
Hình 15: Chuẩn bị trứng đã ấp 9-11 ngày tuổi
Hình 16: Soi trứng, đánh dấu vị trí buồng hơi giã, khử trùng vỏ trứng, đục lỗ
Hình 17: Dùng núp bóp cao su hút không khí ở buồn hơi giã ra, cho màng cam tuột khỏi
vỏ lụa
Hình 18: Đục lỗ trên vỏ
9
Hình 19 : Tiêm Virus Đậu mùa vào màng cam, hướng tiêm lệch một góc 30 - 45
0
III. KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TAN TRÊN THẠCH
1. Mục đích
Xem sự khuếch tán của kháng nguyên(kháng thể gà) và kháng thể(kháng thể thỏ) khuếch tán
trên mặt thạch như thế nào ?
2. Chuẩn bị
Kháng nguyên : là kháng thể gà
Kháng thể : là kháng thể thỏ
 Chuẩn bị môi trường : 12,5gr Agar + 80gr NaCl + 5gr phenol trong 1 lít nước cất
Hình 20: Đun môi trường trên bếp cách thủy
Dùng vải lượt, lọc môi trường vừa nấu xong
10
Hình 21: Môi trường được lọc xong cho vào chai
Chú ý : Môi trường rất mao đông đặc lại, cần nên tiến hành ngay sao khi lọc xong
Dùng pipet hút 4 - 5 ml thạch nhỏ vào lame, đặt pipet vuông góc với lame, cho thạch chảy

xuống từ từ. chảy đều trên lame không được có vết nhăn và lồi lỗm chỗ nào, độ dày khoảng 3
mm
Hình 22: Pipet hút, cho lên lame, môi trường thạch dày 3 mm trên Lame
Hình 23: Đem thạch vào tủ lạnh, làm dấu những vị trí cần đục lỗ, tiến hành đục lỗ
Cho kháng nguyên( kháng thể gà) và kháng thể( kháng thể thỏ) vào những vị trí đã đục lỗ
theo quy định như sau : lỗ trung tâm là kháng thể thỏ, 4 lỗ xung quanh là kháng thể gà, từ
20µl - 50µl cho mỗi lỗ trên thạch.
11
Hình 24: Cho kháng thể thỏ vào lỗ trung tâm, kháng thể gà vào 4 lỗ còn lại, đặt những
miếng bông gòn để giữ độ ẩm
Thực hiện xong ta chuyển vào tủ ủ, ủ ở 37
0
c, sau 48h để quan sát kết quả
Bài 2
THAM QUAN CÔNG TY NAVETCO
I. Mục đích
Học hỏi tìm hiểu thêm về quy trình sản xuất Vắc xin của công ty, và một số vấn đề liên quan
về công ty. Một số thiết bị và những ứng dụng Công nghệ sinh hocj vào sản xuất vắc xin được
anh Tú nhiệt tình hướng dẫn
Hai điểm mới và nỗi bật nhất , đáng quan tâm nhất đó là : cách nuôi Virus dùng để sản xuất
vắc xin, và kỹ thuật DNA tái tổ hợp vào sản xuất vắc xin. Điều thiệt thòi nhất là chỉ được ngồi
trên giảng đường, mà không được chứng kiến tận mất. do công ty tan ca làm việc.
II. Một số vắc xin sản xuất được tại công ty
Vắc xin heo tai xanh
Vắc xin cúm
Vắc xin viêm não nhật bản
Vắc xin uốn ván…
III. Quy trình sản xuất vắc xin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp
Công nghệ tái tổ hợp lấy đoạn DNA miễn dịch gắn vào vi khuẩn Plasmid chuyển vào nấm
men, hay vi khuẩn, để nhân nhanh sinh khối, tách thu sinh khối, để sản xuất vắc xin.

12
BÀI 3
KỸ THUẬT PCR
I. Mục đích
Kỹ thuật pcr là một kỹ thuật khuếch đại đoạn gen, mà không cần nhờ vào sinh vật sống như
ecoli, hay nấm men.
Có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong y học, cũng như trong di truyền, nhưng ứng dụng
quan trọng nhất đó chính là chuẩn đoán bệnh tìm ra tác nhân gây bệnh, qua đó xóm đưa ra
biện pháp can thiệp kiệp thời. Được ứng dụng rất nhiều trong việc chuẩn đoán bệnh trên động
vật. Đặc biệt hiện nay một số bệnh quan trọng như virus heo tai xanh(PRRS
), hay virus vịt cúm gia cầm(H5N1),…
II. Quy trình ly trích ARN cho bệnh PRRS, DNA cho bệnh Porcine
Circovirus Type 2 (PCV2) và chạy PCR
1.Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất
Mầu phổi, thận, lách, hạch của heo ngi ngờ mắt bệnh
Hình 25: Mô heo ngi ngờ mất bệnh PRRS(a), PCV2(b)
Bộ kit thương mại để tiến hành phân lập
Hình 26: Bộ kít Promega dùng để trích ly RNA, bộ kít Việt Á dùng để trích ly DNA
13
2.Dụng cụ và thiết bị
Máy chạy PCR
Máy ly tâm có tốc độ cao
Vortex
Máy homogenizer hay chày cối
Pipette, đầu col
Tube
Máy chạy điện di
Eppendorf
3.Cách thực hiện
3.1 Trích ly RNA của bệnh heo tai xanh(PRRS)

Bước 1: xử lý mẫu
Lấy 5gr mẫu đã chuẩn trước đó, cắt nhỏ cho vào cối giã nhiễn ra
Hình 27: Cắt mẫu và giã nhiễn
Cho 5ml dung dịch PBS vào mẫu đã giã nhiễn và trộn điều
Hình 28: Hút dd PBS cho vào mẫu đã giã nhiễn
Hút mẫu mô cho vào eppendorf, bỏ cặn. Đem ly tâm 6000 vòng/5 phút
14
Hình 29: Hút mẫu vào eppendorf và đem ly tâm
Bước 2: Cho 200µl mẫu vào eppendorf chứa sẵn 1000µl RNA Lysis Buffer trộn đều, để yên
30 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/1 phút Phá vỡ tế bào, phóng thích RNA.

Hình 30: Cho mẫu vào eppendorf chứa sẵn RNA Lysis Buffer sau đó trộn đều mẫu
Bước 3: Cho 175µl hỗn hợp dung dịch trên vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer,
trộn đều, ủ 65
o
c trong 3 phút, ly tâm 13000 vòng/ 10 phút  Tủa protein tạp và các tạp chất.
Hình 31: Cho hỗn hợp vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer sau đó đem ly
tâm
Bước 4: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 96
0
. Cho tất cả vào
eppendof lọc, ly tâm 13000 vòng/1 phút  Giữ RNA trên màng lọc.
15
Hình 32: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 96
0
và Cho tất cả vào
eppendof lọc
Bước 5: Đổ hết phần nước, cho 600µl dung dịch rửa vào eppendof lọc ly tâm 13000 vòng/1
phút  Loại bỏ protein tạp và tạp chất.
Hình 32: Hút 600µl dung dịch rửa vào eppendof lọc

Bước 6:
16
4. Thu hoạch trứng tiêm ở màng CAM
Cắt đầu quả trứng hút hết nước lấy phôi quan sát
Cắt đầu quả trứng chỉ lấy màng CAM xem nốt pock
5. Thu hoạch trứng tiêm ở xoang niệu mô
17
Cắt đầu quả trứng
Hút hết nước trong ở xoang niệu
mô
Thử nghiệm phản ứng
HA trên kính
Xác định kích thước
của virus Newcastle
5.1. Phản ứng HA trên kính
Phản ứng này dùng để xét nghiệm nhanh các virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết
hồng cầu của một số loài.
Chuẩn bị
Huyễn dịch hồng cầu 10%.
Gốc virus Newcastle chuẩn làm đối chứng.
Lam kính.
Nước trứng.
Thời gian xảy ra phản ứng là 1 phút.
Thực hiện`
Nước trứng ly tâm 1500- 3000 vòng/phút, lấy nước trong phía trên nhỏ một giọt nước trứng
lên lam sau đó nhỏ một giọt hồng cầu rồi trộn lẫn với nhau.
Quan sát
Nếu có sự ngưng kết hồng cầu thì trong nước trứng có virus Newcastle, kết quả dương tính
(+) và không có sự ngưng kết hồng cầu cho kết quả âm tính (-).
5.2. Xác định kích thước của virus Newcastle

Thực hiện
- Trước tiên lấy huyễn dịch nước trứng với HA (+) đem li tâm.
- Dùng kim tiêm hút lấy phần nước phía trên.
- Bơm kim tiêm đã hút nước huyễn dịch vào màng lọc có kích thước 0.45 µm và 0.22 µm.
- Thu dịch lọc.
Thử nghiệm phản ứng HA trên kính và ghi nhận kết quả
Lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.45µm thực hiện kiểm tra bằng phản ứng HA trên
kính, có 2 trường hợp xảy ra:
+ Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn dịch có
kích thước lớn hơn 0.45µm.
18
+ Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch
có kích thước nhỏ hơn 0.45µm. Ở trường hợp HA dương tính ứng với dịch nước đã lọc được ở màng lọc
0.45µm, tiếp tục lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.22µm thực hiện kiểm tra phản ứng HA trên kính.
* Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn
dịch có kích thước lớn hơn 0.22µm.
* Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch có
kích thước lớn hơn 0.22µm.
6. Kết quả và thảo luận
 Quan sát phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM màu đỏ tươi do virus Đậu gây
xuất huyết phôi nhưng không làm chết phôi. (Hình 1)

Hình 1 : Phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM
 So sánh phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM và tiêm ở xoang niệu mô
- Khi tiêm virus Đậu ở màng CAM không gây chết phôi, nhưng gây xuất huyết, phôi có màu
đỏ tươi và virus này tạo nốt Pock trên màng CAM. Còn tiêm virus Newcastle ở xoang niệu mô thì sau 24 giờ
ấp trứng (sau khi tiêm) virus làm chết phôi. Phôi đã chết nên không có màu đỏ tươi. (Hình 6)
19
Hình 2: Tiêm ở xoang niệu mô làm phôi chết
 Nốt Pock trên màng CAM: Bệnh tích gây thủy thủng, dày lên tạo thành nốt pock trên

màng CAM.
Hình 3: Nốt Pock trên màng CAM
 Phản ứng HA trên kính:
5 mẫu đều xảy ra phản ứng ngưng kết hồng cầu chứng tỏ có sự hiện diện của virus Newcastle.
20
Hình 4: Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
21
Bài 2: Phản ứng ngưng kết hồng cầu
(HA: Haemagglutination)
1. Nguyên lý
Trên bề mặt virus Newcastle có cấu trúc kháng nguyên haemagglutine, có khả năng kết hợp
với các thụ thể trên bề mặt hồng cầu của loài gà, vịt… nên nó làm ngưng kết các loại hồng cầu này lại với
nhau.
2. Mục đích
Xác định hiệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
3. Chuẩn bị và cách tiến hành
 Chuẩn bị
Huyễn dịch hồng cầu gà 1%.
Virus Newcastle.
Nước muối sinh lý 0.9%.
Vĩ 96 lỗ có đáy hình chữ U.
Micropipette 1 đầu và 8 đầu.
Cách chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà 1%.
Chọn gà trống khỏe mạnh, lấy máu có chất kháng đông ở tĩnh mạch cánh.
Lấy máu gà vừa thu nhận trộn với nước muối sinh lý, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút,
loại bỏ phần nước trong bên trên, giữ lại phần hồng cầu lắng dưới đáy. Tiếp tục pha hồng cầu với nước muối
sinh lý, ly tâm. Thực hiện thao tác này đến khi nào hồng cầu được rửa thậtt sạch (thường thực hiện thao tác
ly tâm khoảng 3 – 4 lần). Lần cuối cùng loại bỏ phần nước trong bên trên, phần hồng cầu pha với nước muối
sinh lý để được hồng cầu 1%.
22

Hình 5: Hồng cầu 1%
 Tiến hành
Cho nước muối sinh lý vào các hàng từ lỗ 1 đến 12, mỗi lỗ 50µl
Cho thêm 50µl huyễn dịch virus vào lỗ thứ 1, trộn đều. sau đó lấy 50µl huyễn dịch từ lỗ 1 cho
vào lỗ 2, trộn đều và cứ tiếp tục làm cho đến lỗ thứ 11, hút 50µl huyễn dịch từ lỗ thứ 11 bỏ ra ngoài. Lỗ thứ
12 dùng làm đối chứng.
Cuối cùng cho 50µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các lỗ từ 1 đến 12, lắc đều, để yên
30 phút rồi đọc kết quả.
Ta tiến hành 3 lần lặp lại.
4. Kết quả
 Phản ứn HA dương tính: xảy ra ngưng kết hồng cầu ở:
Hàng I: từ vị trí thứ 1 - 6 (n = 6), đóng nút tại vị trí thứ 7 . Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó
virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 64.
Hàng II: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.
Hàng III: từ vị trí thứ 1 - 8 ( n = 8), đóng nút tại vị trí thứ 9. Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó
virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 512.
Hàng IV: từ vị trí thứ 1- 10 ( n =10), đóng nút tại vị trí thứ 11. Vậy hiệu giá pha loãng mà ở
đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 1024.
Hàng V: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.
Hàng VI: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.
23
 Kết quả: Xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc” có thể do sai sót thao tác không cho huyễn dịch
virus vào lỗ nên không thể ngưng kết hồng cầu gà tạo hiện tượng đống nút.
24
Hình 6: Kết quả phản ứng HA
Bài 3: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu
(HI: Haemagglutination inhibition)
1. Nguyên lý
Khi Newcastle gặp kháng thể đặc hiệu tuơng ứng sẽ bị kháng thể này kết hợp,không còn khả
năng gây ngưng kết hồng cầu, hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở sự ngưng kết hồng cầu của virus.

Mục đích: xác định hàm lựơng kháng thể chống lại bệnh Newcastle
2. Chuẩn bị
Huyễn dịch hồng cầu gà 1%
Huyễn dịch virus newcastle pha loãng ở nồng độ n – 2 (4 đơn vị HA)
Nuớc muối sinh lý 0.9%
Huyết thanh gà thí nghiệm
Vĩ 96 lỗ có đáy hình chữ U
Micropipette 1 đầu và 8 đầu
3. Tiến hành
Cho nuớc muối sinh lý vào hàng thứ nhất từ lỗ thứ 1 đến 12, mỗi lỗ 50 µl.
Cho thêm 50 µl huyết thanh gà vào lỗ 1, trộn đều. Sau đó lấy 50 µl huyễn dịch từ lỗ 1 cho vào
lỗ 2, trộn đều lên và cứ tiếp tục như thế cho đến lỗ thứ 10, hút 50 µl huyễn dịch ở lỗ thứ 10 bỏ ra ngoài. Lỗ
11 dùng làm đối chứng âm, lỗ 12 dùng làm đối chứng duơng.
Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ thứ 11 mỗi lỗ 50 µl huyễn dịch virus đã pha loãng ở nồng độ 4
đơn vị HA. Để yên 10 – 15 phút
25