tiểu luận sinh học các hướng nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1/ Đặt vấn đề :

PHẦN MỞ ĐẦU
DUNG

Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn, đang phát triển trên cơ sở các kĩ
thuật mới mẻ: kĩ thuật di truyền, kĩ thuật dung hợp tế bào; kĩ thuật nuôi cấy mô; kĩ thuật nuôi
cấy tế bào; kĩ thuật cấy chuyển phôi….Những thành tựu này đang chuẩn bị cho một cuộc
cách mạng sinh học trong các ngành kinh tế-kĩ thuật.
Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng từ lâu bởi các nhà trồng hoa và các nhà
chọn giống muốn nhân nhanh những giống đặc cấp, cải thiện hiệu quả của từng thời kì chọn
lọc.
Ni cấy mơ và tế bào thực vật đã được tiến hành ở Việt Nam từ giữa những năm 70.
Hiện nay, trong cả nước đã có vài chục phịng thí nghiệm ni cấy mơ và tế bào. Phần lớn
các phịng thí nghiệm đang tiến hành những nghiên cứu ứng dụng: chủ yếu là vi nhân giống
trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật cịn có những khả năng đóng góp cho
nnhững nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế nữa, đặc biệt là trong cải biến di truyền (chọn
dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi cấy bao/hạt phấn, lai tế bào, chuyển gen) và trong cơng
nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học. Đề tài “Các hướng nghiên cứu và ứng dụng
nuôi cấy mô và tế bào thực vật” giúp cho người viết có được những kiến thức cơ bản về
nuôi cấy mô tế bào thực vật, về các hướng nghiên cứu và ứng dụng đã được tiến hành thành
công tại các phịng thí nghiệm.

2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :
Đối tượng nghiên cứu: là mô và tế bào thực vật, thành phần mơi trường và các chất
kích thích sinh trưởng.
Phạm vi nghiên cứu: chỉ đề cập đến các hướng nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô và
tế bào thực vật.

3/ Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu được lấy từ các

nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự phân tích, tổng hợp, so sánh, đối
chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Mặc dù đề tài được chuẩn bị khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn sơ suất, rất mong
được sự góp ý của q thầy hướng dẫn và các bạn đồng nghiệp. Tác giả chân thành biết ơn.

4/ Cấu trúc tiểu luận:
Phần 1: Vi nhân giống in vitro.
Phần 2: Tạo cây đơn bội và ứng dụng trong nghiên cứu và thực tiễn.
Phần 3: Chọn dòng tế bào thực vật.
Phần 4: Dung hợp protoplast và lai tế bào sôma.
Phần 5: Chuyển gen ở thực vật.
Phần 6: Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở Việt Nam.

MỤC LỤC
Trang
Phần mở đầu...........................................................................................................................1
Phần nội dung.........................................................................................................................3
Phần
1:
Vi
nhân
giống
in
vitro…………………………………………………………………………………………………
... 3
-1-


Phần 2: Tạo cây đơn bội và ứng dụng trong nghiên cứu và thực tiễn………………. ………. 4
I. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phơi và mơ sẹo........................4

1. Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy..................................4
2. Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro ........................4
II. Tái sinh cây..............................................................................................5
III.Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn...........................................................5
Phần
3:
Chọn
dòng
tế
bào
thưcï
vật……………………………………………………………………………………………..6
I. Cơ sở khoa học..........................................................................................6
II. Vật liệu và phương pháp chọn dòng........................................................7
III. Chọn dòng chịu bệnh...............................................................................8
IV. Chọn dòng chống chịu các stress của mơi trường..................................11
V. Chọn dịng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao.......................... 13
Phần
4:
Dung
hợp
protoplast
và
lai
tế
bào
sôma…………………………………………………………………..15
I. Dung hợp protoplast và lai nhân...............................................................15
II. Lai tế bào chất.........................................................................................18
Phần

5:
Chuyển
gen
ớ
thực
vật………………………………………………………………….
………………………………….21
I. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật........................................21
II. Các phương pháp chuyển gen..................................................................22
1. Chuyển gen bằng Agrobacterium........................................................22
2. Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus...................................23
3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp.......................................................23
4. Phương pháp bắn gen...........................................................................23
5. Phương pháp vi tiêm.............................................................................24
Phần 6: Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thưc vật ở
Việt
Nam………………………………………………………………………………………………
……………………………………………..25
KẾT LUẬN..................................................................................................................….27
TÀI
LIỆU
THAM
KHẢO………………………………………………………………………………………………
…………………28

PHẦN NỘI DUNG
.
-2-

Phần 1: VI NHÂN GIỐNG IN VITRO.
Vi nhân giống in vitro gọi tắt là vi nhân giống là hệ thống sử dụng sự phát triển nhân
tạo và nhân các điểm sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây.
Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó khơng những quyết
định sự thành cơng ban đầu mà cả q trình nhân tiếp theo. Các cơng trình của D.Amato
(1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về di truyền. Tiếp
đến là đỉnh mơ phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là
nguyên liệu tốt để nhân.
Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi
trường thạch chứa các muối khống, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng.
Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân sau
đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp. Sự phát triển nhanh của mô nuôi
cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ. Chồi được nhân lên sau 3 đến 4 tuần. Các chồi hình
thành lại được tách ra chuyển sang mơi trường mới và qui trình cứ thế được lặp lại. Trong
một số trường hợp, rễ có thể tạo ngay trên môi trường nhân, trong một số trường hợp khác,
chồi nhân phải chuyển sang mơi trường có auxin hoặc khơng có auxin để tạo rễ. Đây là
phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc
phôi, nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặc điểm của phơi gốc, ít hoặc không bị thay
đổi về mặt di truyền. Hiện nay nhờ phát triển những môi trường và hệ thống nhân phù hợp,
hệ số nhân đã được tăng lên nhiều (5 8 – 515 chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong môi
trường lỏng có lắc hoặc nhân trong các reactor.
Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thơng qua việc tạo phôi hoặc
tái sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phương pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhưng thường kéo
theo sự biến dị sôma nên trước khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ những
thay đổi về di truyền.
Vi nhân giống có những ưu việt sau:
-Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.
-Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m 2 nền có thể để
được tới 18.000 cây.
-Cây được làm sạch bệnh và khơng tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các

cây giống sạch bệnh.
-Thuận tiện và là hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng
15kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4 oC trong hàng
tháng vẫn cho tỉ lệ sống đền 95%.
Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm
trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây. Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng
được yêu cầu thực tiễn.
Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phương pháp vi nhân cịn cao (2500
– 3000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ
giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật q hiếm và có giá trị kinh tế cao.
Trên thực tế cây nhân bằng phương pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây giống từ hạt.
Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây như lan, hoa cúc, hoa hồng,
cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, qt, thơng….
Vi nhân giống ngồi việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây cịn có thể rút
ngắn thời gian đưa các cây lai và các lồi cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm tốt vào
sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai.

Phần 2: TẠO CÂY ĐƠN BỘI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN
CỨU VÀ THỰC TIỄN.
-3-


Có nhiều phương pháp tạo cây đơn bội, nhưng từ những năm 60, việc tạo cây đơn bội
bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng ni cấy
bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) hoặc
môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong q trình ni cấy, hạt phấn phân chia, tạo
mơ sẹo hoặc phơi và tiếp theo có thể tạo cây.

I.Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phơi và mô sẹo.
1.Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy.

Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng rất lớn đến hạt phấn
nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng như nhiệt độ là những yếu tố
ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của Dunwell (1976)
cho thấùy tỉ lệ phôi cao nhận được khi sử dụng những nụ hoa hình thành sớm và cây phát
triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ hạt
phấn cao hơn.
Ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở một
số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu gen cũng
rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấùn của các cây khoai tây nhị bội tạo từ cây đơn bội
sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ. Ngồi ra xử lí bao
phấn ở nhiệt độ thấp (3 – 10oC) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ hạt phấn (Wenzel & cs,
1977).

2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro.
Thành phần cacbonhydrat trong môi trường hết sức quan trọng, đặc biệt là đường
sucrose khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% đến 4%. Đối với khoai tây và lúa cần đến
6%, thậm chí 12%.
Trong các chất hữu cơ, các axit như glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi ở
một số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc lá. Các
dịch chiết tự nhiên như dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất khác như vitamin
C, nước dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo và tái sinh cây trong nuôi cấy bao
phấn.
Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo nhưng lại ức chế tạo phơi. Vì thế trong
trường hợp tạo phơi cần tránh sử dụng auxin. Nói chung auxin thường có tác dụng ở giai
đoạn ni cấy ban đầu. Cytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn ni cấy.
Trong một số ít trường hợp ethylen kích thích tạo mơ sẹo. Wilson & cs (1978) cho biết nuôi
cấy bao phấn trong môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch.
Bổ sung vào mơi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm tăng
hiệu quả nuôi cấy bao phấn.
Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả ni cấy. Đối với

thuốc lá mật độ tối ưu là 105 hạt/ml môi trường. Đối với các cây khác mật độ dao động từ
104 đến 105.
Aùnh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần
300-500 lux. Nhiệt độ bình thường từ 25-28 oC là thích hợp đối với ni cấy bao phấn và hạt
phấn của hầu hết các giống cây.

II.Tái sinh cây.
Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ, thậm chí
cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một số lồi cây
khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngơ, mì), trên mơi trường nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh
trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang mơi trường
khơng có chất điều hịa sinh trưởng. Một số trường hợp phải dùng zeatin và nước dừa mới có
thể tái sinh cây.
-4-


Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên mơi
trường khơng có chất điều hịa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang mơi trường
có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thường hay dùng là BAP và
kinetin. Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừa thường làm gia
tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc.
Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ
tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc thường
có hiện tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977) thấy rằng
tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao. Ngồi ra, cây
bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping, 1978).
Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số lồi cây có cả cây nhị
bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhị bội và
đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà khơng có sự phân chia
nhân xảy ra trong q trình ni cấy.

III.Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn.
Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trước hết là làm nguyên liệu để
tạo các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lương bội hóa các cây đơn bội bằng xử lí
consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Như đã nói trên, ở
một số lịai cây có thể nhận được cây nhị bội ngay trong q trình ni cấy bao phấn hoặc
hạt phấn, nhưng trong trường hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ lưỡng.
Các dịng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng. Chúng được sử dụng tạo
các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) và rút ngắn
thời gian tạo hạt lai. Các dòng đơn bội kép đã tạo được ứng dụng trong sản xuất lúa mạch,
thuốc lá, cải dầu, lúa…. Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc lá cho
năng suất cao và chất lượng tuyệt hảo đã được tạo ra bằng phương pháp cấy bao phấn (Hu
han & cs, 1978). Nhiều giống lúa mới như Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976),
những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã được tạo bằng phương pháp
nuôi cấy hạt phán. Ngồi ra các dòng đơn bội kép còn được sử dụng để phát triển quần thể cho
việc lập bản đồ phân tử.
Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các cặp
NST, ngồi ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác định kiểu di truyền các tính
trạng lặn. Các cây đơn bội cịn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội lệch. Cây đơn bội
cũng được dùng trong lai khác lòai để rút ngắn thời gian ổn định về NST. Nuôi cấy bao phấn
có thể ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến.

Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn
Bao phấn hoặc
hạt phấn

Giống mới

Ni cấy bao phấn
Cây đơn bội

Lưỡng bội hóa
Cây lưỡng bội

Dòng thuần
-5-

Dòng siêu chủng


Phần 3: CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV).
I.Cơ sở khoa học.
Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính tồn năng. Mỗi lồi
thực vật có khả năng tái sinh khác nhau.
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế
bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào ni cấy có thể xem như quần thể thực vật ở đấy
cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh
thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào
phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào
đến khi hình thành một cơ thể hồn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di truyền do ảnh
hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hịa sinh trưởng.
Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển,
những quần thể tế bào này là đối tượng hết sức lí tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột
biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa. Cũng như cây trồng, trong ni cấy mơ và tế bào,
có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một loại là kết quả của sự thay đổi gen, được
gọi là những thay đổi di truyền, cịn một loại khơng liên quan đến thay đổi gen, được gọi là
biến đổi ngồi gen. Những thay đổi ngồi gen không di truyền được.
Ngồi những vấn đề vừa nêu, trong ni cấy mơ và tế bào cịn gặp một hiện tượng phổ
biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào có thể
thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào. Hiện tượng
này gọi là hiện tượng phân dịng sơma. Có tác giả gọi các dịng cây tái sinh từ tế bào nuôi cấy

là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh từ protoplast là
“protoclones” (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981) đưa ra một định nghĩa có
tính chất khái qt hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cả những thay đổi của cây tái sinh từ
bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào.

II.Vật liệu và phương pháp chọn dòng.
Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng. Các vật liệu có thể là tế
bào cho đến các mơ phân hóa. Mỗi loại vật liệu có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Việc
chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các phương pháp
nuôi cấy đối với từng loại cây.
Vật liệu thường dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus). Mơ sẹo được dùng để
chọn các dịng chống chịu như chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối (McHughen,
1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Nozue và
cs, 1987; Hiraoka, 1986).
Đối với mơ sẹo có thể sử dụng các phương pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trên
môi trường chọn lọc chứa một nồng độ nhất định của chất chọn lọc, các mơ và tế bào đột
biến có tính chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phương pháp
chọn lọc từng bước tức là khi mơ hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ nhất định của tác
nhân chọn lọc thì lại chuyển sang nồng độ cao hơn. Ngồi ra cũng có thể sử dụng kết hợp cả
hai phương pháp. Sự ổn định của mô chọn lọc là khả năng phát triển bình thường liên tục
trên mơi trường chọn lọc hoặc khi chuyển môi trường chọn lọc và sau một thời gian dài cấy
trên môi trường không chọn lọc vẫn mất đi đặc điểm đã được chọn lọc.
Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có ưu điểm là đơn giản nhưng nguyên liệu
này có một số nhược điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mơ chọn lọc cịn có nhiều tế
bào bình thường nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những cây mang đặc
điểm chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trong một cây có thể
có phần chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bình thường. Để khắc phục
-6-

nhược điểm này có thể giảm kích thước của mơ: mô càng nhỏ càng tốt. Trọng lượng mô
thường dùng là 100-150 mg, nhưng có thể giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha & Widholin,
1987).
Tế bào nuôi cấy dịch lỏng đã được nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV (Kishinami
& Widholin, 1986; Watad và cs, 1985). Đối với loại tế bào này các phương pháp chọn lọc
trực tiếp và chọn từng bước cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối tượng. Sử dụng tế
bào dịch lỏng để CDTBTV có ưu điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế bào được tiếp xúc đồng
đều với tác nhân chọn lọc, nhưng một nhược điểm quan trọng là sau khi chọn lọc khả năng
tái sinh cây bị giảm đáng kể và trong nhiều trường hợp có thể mất hẳn. Hầu hết các dịng
chọn lọc thơng qua hệ thống tế bào dịch lỏng đều khơng nhận đuợc cây (Dix, 1990). Vì thế
hệ thống tế bào dịch lỏng có thể sử dụng để chọn các dịng có khả năng tổng hợp và tích lũy
các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trường hợp này thì tế bào dịch lỏng đáp ứng được
mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào
thực vật trên qui mô công nghiệp.
Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặt trong
CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào được phát triển đồng
đều trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng
là các mơ sẹo tái sinh thành cây hồn chỉnh, chính vì thế có thể tránh được hiện tượng khảm.
Nhiều dịng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs,
1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã được chọn lọc
nhờ sử dụng hệ thống protoplast.
Trước đây việc ni cấy và tái sinh cây từ protoplast cịn gặp nhiều khó khăn, nhất là
tái sinh cây từ protoplast của những lồi cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống
ni cấy protoplat trong CDTBTV cịn bị hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy protoplast với
hiệu quả cao ở nhiều lồi cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng như khoai tây, cà chua,
ngô, lúa, lúa mì đã được cơng bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu lý tưởng cho
CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast cịn là đối tượng quan trọng trong cải biến di
truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế bào và chuyển
gen.
Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng và

protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mơ tách rời làm ngun liệu
CDTBTV. Một trong những mơ phân hóa được sử dụng là phơi từ hạt (Kueh & Bright, 1981)
hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs (1985) đã chọn
được dịng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs (1989) cũng nhận
được dịng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá.
Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo , tế bào dịch
lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để làm tăng
dần số đột biến và các kiểu đột biến. Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi tách bằng tia
cực tím (UV) hoặc N-methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG). Phương pháp tương tự
cũng được một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng. N-ethyl-N-Nitrosourea
(Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981). Ngồi ra có thể xử lí mẫu vật
bằng các chất gây đột biến trước khi đưa vào ni cấy và chọn lọc.

III.Chọn dịng chịu bệnh:
Mặc dù phương pháp truyền thống có thể tạo được các dịng hoặc giống chịu bệnh
nhưng trong một vài trường hợp không thể chọn được các dòng chịu bệnh bằng những
phương pháp này hoặc chọn được nhưng tốn nhiều công sức và thời gian. Việc gây nhiễm
bệnh nhân tạo cho một số lượng lớn cây để tạo chọn giống chịu bệnh là cả một vấn đề, ngồi
ra gây nhiễm trong nhà kính nhiều khi cũng không thành công. Không những thế bằng
-7-


phương pháp truyền thống việc chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng cùng một loại
bệnh gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai là lai ngược mất rất
nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển được các gen lặn hoặc nhiều gen một lúc. Đặc biệt
đối với các lồi cây chỉ nhân vơ tính thì chuyển gen khơng thể thực hiện được bằng lai tạo.
Đột biến thực nghiệâm có thể tạo được giống cây chịu bệnh nhưng tần số xuất hiện
các đột biến đơn gen rất thấp (10 -4 – 10-6), ngồi ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tương đối
cao.
Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc phục

được nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh như: qui mơ thí nghiệm, thời gian chọn lọc,
khống chế được điều kiện gây nhiễm. Ngồi ra có thể nhận được các đột biến đơn gen và đột
biến lặn. Nếu tần số đột biến đơn gen trong trường hợp đột biến thực nghiệm là 10 -4 – 10-6 thì
ở quần thể cây tái sinh (Ro) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981).
Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có thể làm tăng tần số đột
biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981).
Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần nghiên
cứu giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượng lây nhiễm ở
đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân gây bệnh
không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh).
Để chọn dịng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc tố
gây bệnh (ĐTGB).
Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễm là
protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và phân biệt
được tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển trên
cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975), Murakishi và
Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau đó ni vấy và chọn lọc.
Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu vàng lây nhiễm cây
thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên mơi trường phù hợp cho sự sinh trưởng của tế
bào sạch virus hoặc kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô từ tế bào sạch virus sinh trưởng
nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh trưởng chậm hơn và có màu vàng.
Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh như Phoma lingam, Plamidomonas brassicae
(Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs,
1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs,
1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae (Deaton
& cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977), Xanthomonas oryzae
(Sun & cs, 1986) cũng đã được sử dụng để chọn dòng chịu bệnh.
Prasad và cs (1984) đã chọn được dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sương bằng phương
pháp tái sinh cây từ hoa tự non đã bị nhiễm nấm. Sun & cs (1986) đã nuôi mô sẹo từ phôi lúa
cùng với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae và đã chọn được các dòng kháng bệnh.

Một số tác giả khác đã tiến hành gây nhiễm các cây tái sinh từ mô trong điều kiện in vitro và
nhận được những kết quả đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass, 1986; Joung & cs, 1987).
Ngồi ra có thể đưa các cây tái sinh từ mô hoặc tế bào trồng trên đất bị nhiễm nấm, nhưng
hướng này chưa được tiến hành nhiều.
Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ một số nấm và vi khuẩn đã được dùng nhiều trong
chọn dòng chịu bệnh, sử dụng ĐTGB trong chọn dịng có ưu điểm là các tế bào có thể bị
nhiễm đồng đều và nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), vì thế có thể sử
dụng các ngun liệu một cách đa dạng. Ngồi ra cịn có sự tương quan thuận giữa kháng
ĐTGB trong điều kiện in vitro và in vivo. Chọn các dòng kháng ĐTGB đã được tiến hành
thành công đối với protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dịch lỏng (Connell &
-8-


Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey, 1986), phôi
thứ cấp (Sacristan, 1982) và đỉnh chồi (Gantotti & cs, 1985). Sử dụng ĐTGB đối với tế bào
còn mở ra nhiều triển vọng chọn được các đột biến kháng bệnh hiếm (Carlson, 1973).
Bên cạnh những ưu điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chịu bệnh cần lưu ý một số vấn
đề như xác định cụ thể vai trị của độc tố trong q trình gây bệnh vì trong nhiều trường hợp
cây bị bệnh nhưng không phát hiện có độc tố hoặc xác định được trong cây có độc tố gây
bệnh nhưng độc tố lại khơng có vai trò trong việc gây bệnh (Scheffer, 1983). Một vấn đề nữa
là trong nhiều trường hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại khơng có khả năng kháng
bệnh. Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc dù có những đặc điểm có thể
khơng thể hiện ở cây tái sinh, nhưng nếu ta tái sinh được số lượng cây nhiều đến mức cần
thiết thì cũng có thể có những cây mang những đặc điểm mong đợi. Điều này đã được khẳng
định bằng cơng trình của Thanutong & cs (1983). Các tác giả đã nhận được 10-20% số cây
tái sinh có khả năng kháng độc tố của Pseudomonas và độc tố của Alternaria.
ĐTGB dùng trong chọn dòng chịu bệnh có thể là dạng thơ hoặc tinh khiết. ĐTGB thơ
dưới dạng dịch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn được sử dụng nhiều để chọn dòng chịu bệnh.
Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã được công bố khi sử dụng ĐTGB thô như khoai tây kháng
P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá kháng

Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum
f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke (1985) đã nhận
được dịng ngơ kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae khi sử dụng độc tố
sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên.
Ngồi phương pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế bào, mơ
hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB, ứng dụng
khả năng phân dịng sơma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mơ, ta có thể chọn được dịng chịu
bệnh mà khơng cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980; Hartan & cs,
1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng chịu bệnh theo phương pháp
này. Giống mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) và giống lhoai lang “Sarlet”
chịu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã được chọn và đưa vào sản xuất. Hiện nay khi việc tái
sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng đối với hầu hết các giống cây thì chọn lọc theo
hướng này có nhiều hứa hẹn và trên thực tế đã có các giống chịu bệnh đuợc đưa vào sản xuất
nhưng có một số mặt hạn chế của phương pháp này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần
thể lớn cây tái sinh trong điều kiện tự nhiên; thứ hai là phân dịng sơma làm thay đổi nhiều
đặc điểm khác nên nhiều khi chọn được dòng chị bệnh nhưng lại ảnh hưởng đến đặc điểm
kinh tế (Bidney & Shepard, 1981).
Nhìn chung đã có nhiều cơng trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng nuôi cấy mô
và tế bào để chọn dòng chịu bệnh ở cây trồng nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều vấn đề cần
giải quyết như cơ chế tương hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gây bệnh, liên
quan đến vấn đề này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Một vấn đề quan
trọng nữa là xác định được vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọn lọc in vitro. Một số
vấn đề liên quan về mặt kĩ thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rút ngắn thời gian nuôi cấy và
tái sinh cây để tránh những thay đổi về hình thái và một số đặc điểm khác. Việc chọn lựa đối
tượng để áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào vào chọn dòng chịu bệnh cũng rất quan
trọng. Một số tác giả khác cho rằng nuôi cấy mô, tế bào có thể áp dụng để chọn dịng chịu
bệnh ở các lồi cây sinh sản vơ tính thì phù hợp và có kết quả hơn (Daub, 1986; Jones, 1990).
Ngồi ra ni cấy mơ và tế bào có thể áp dụng để chọn các dòng chịu bệnh đơn gen hoặc chịu
-9-

bệnh mang gen lặn (Jones, 1990). Việc sử dụng các ĐTGB khơng đặc hiệu để chọn các dịng
chịu bệnh đặc biệt mà bằng các phương pháp thông thường không chọn được cũng đã được
đề cập (Jones, 1990).

IV.Chọn dòng chống chịu các stress của môi trường .
Các stress môi trường bao gồm những điều kiện bất lợi của môi trường như phèn,
chua, mặn, khơ, hạn, nóng, lạnh.... Việc chọn tạo những giống cây trồng chống chịu được các
stress môi trường là rất cần thiết. Theo Nabors (1990) hiện nay có ít nhất 25% đất trồng bị
mặn (chủ yếu do NaCl), 25% số đất chua (là do ion nhôm). 40-60% đất khô hạn. Ngồi ra do
việc cải tạo môi trường như tưới tiêu, bón phân, sử dụng các chất diệt sâu bọ và diệt cỏ cũng
dẫn đến việc cần thiết chọn tạo các giống cây trồng chống chịu với các tác nhân trên.
Như đã trình bày ở các phần trên, ni cấy mơ và tế bào có thể đóng góp một phần
trong việc tạo chọn các dịng chống chịu các stress mơi trường. Trước khi giới thiệu một số
thành tựu trong lĩng vực này chúng tôi đề cập đến một số vấn đề liên quan đến cơ sở cũng
như phương pháp chọn các dịng chống chịu stress mơi trường. Ngồi một số vấn đề chung
được đề cập ở các phần chọn dòng chịu bệnh và dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao,
chọn dịng chống chịu stress mơi trường cịn có một số vấn đề liên quan đến cơ sở của tính
chống chịu ở mức độ tế bào và ở cây hồn chỉnh.Đặc biệt là cơ sở di truyền của tính chống
chịu stress mơi trường cịn chưa được biết rõ.Nhiều tác giả cho rằng có thể có nhiều alen
tham gia vào tính chống chịu stress mơi trường, ngồi ra các alen này thường là lặn nên không
thể hiện trong trường hợp dị hợp tử. Đây là những vấn đề làm cho việc chọn các dịng chống
chịu stress mơi trường chưa có được những thành tựu mong muốn. Ngồi ra một số vấn đề
quan trọng nữa là tương quan giữa khả năng chống chịu các stress môi trường ở cây hồn
chỉnh và tế bào ni cấy rất phức tạp vì thế chọn dịng bằng ni cấy mơ có thể khơng tạo
được cây chống chịu những điều kiện đặc biệt trên đồng ruộng. Mặc dù có một số vấn đề hết
sức quan trọng được nêu ở trên, thực tế vẫn có những cơ sở và số liệu đáng tin cậy về triển
vọng ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào để chọn các dịng chống chịu với các stress mơi
trường: chúng ta đều biết nhiều đặc điểm đa gen có thể biến đổi bởi đột biến xảy ra ở một
trong các gen tham gia vào đặc điểm này. Những kết quả nghiên cứu của Gorham và cs

( 1987 ) và Ashraf và cs ( 1986 ) đã cho thấy tính chống chịu với một số stress liên quan đến
thay đổi nhiễm sắc thể và di truyền qua thế hệ sau. Ngồi ra đã có những số liệu về sự phân ly
theo Mendel của các đặc điểm được chọn lọc (Comner & Meredits, 1985).
Cho đến nay hầu hết các cơng trình chọn dịng chống chịu stress môi trường đều chọn
theo phương pháp chọn lọc trực tiếp. Việc tiến hành xử lý các stress có thể tiến hành khi mơ
sẹo (callus) mới hình thành hoặc khi mơ sẹo đã phát triển. Các stress có thể ở mức độ thấp
hoặc ở mức độ gây chết, và có thể xử lý một nồng độ nhất định hoặc khi tế bào chịu được
một nồng độ nào đó lại đưa lên nồng độ cao hơn. Việc tiến hành xử lý có thể liên tục hoặc
gián đoạn, thời gian xử lý có thể ngắn hoặc dài. Cho đến nay chưa có những nghiên cứu so
sánh cụ thể đối với từng trường hợp trên. Tốt nhất tùy từng đối tượng cụ thể mà kết hợp việc
chọn lọc theo cách này hay cách khác. Đây là một vấn đề nghiên cứu về mặt phương pháp
nhưng hết hết sức quan trọng, nó đóng góp vào sự thành cơng trong việc chọn các dịng
chống chịu stress môi trường. Muốn nhận những đột biến mới hoặc đột biến lặn, chọn lọc có
thể tiến hành ở mô đơn bội từ hạt phấn, nếu chọn lọc ở mơ đơn bội từ hạt phấn lai F 1 có thể
nhận được các đột biến đơn gen và các tái tổ hợp của các alen sẵn có.

- 10 -


Trong những năm gần đây đã có những bước tiến đáng kể trong việc chọn dòng chống
chịu muối, hạn, chua và nhiệt độ. Nhiều dòng chịu muối (NaCl) đã được chọn lọc từ mô nuôi
cấy của các lồi Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium, Ipomoea babatas L.
(Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985), Medicago sativa L. (McCoy
1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and Swartz, 1984). Tính chống chịu
trong một vài trường hợp được thông báo là ổn định ở mức độ tế bào và cây hồn chỉnh
(Winnicov, 1991). Về cơ chế của tính chịu muối cũng đã có những kết quả đáng ghi nhận. Ở
Việt Nam việc tiến hành chọn các dòng thuốc lá địa phương chịu muối cũng được tiến hành
và đã thu được những kết quả tiến bộ (Nguyễn Hồng Lộc & cs, 1990). Kết quả nghiên cứu
của một số tác giả cho thấy abscisic axit (ABA) là chất có liên quan đến việc tổng hợp các
protein mới (đặc biệt là protein với phân tử lượng 26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh

& cs, 1987). Mối tương quan giữa ABA, tính chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt
là vấn đề nghiên cứu hết sức lý thú trong những năm tới. Các dịng chịu hạn đã được thơng
báo (Bressan & cs, 1981, Hand & cs, 1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000
hoặc PEG 6000 đưa vào mơi trường để chọn. Vấn đề tạo dịng kháng nhôm được Couner và
cs nghiên cứu khá tỉ mỉ (Conner & Meredith, 1985). Các tác giả đã chọn được các dịng
thuốc lá kháng nhơm ổn định, tính kháng nhơm là đặc điểm trội và di truyền qua thế hệ sau.
Việc chọn các dòng chống chịu với nhiệt độ thấp hoặc cao cũng đã có tiến bộ: Preil và cs.
(1983) đã nhận được các cây cúc chịu được nhiệt độ thấp. Nhìn chung phần lớn các nghiên
cứu từ trước đến nay đều tập trung vào tìm cơ chế của tính chịu lạnh và chịu nóng. Những
kết quả của Chen và Gusta (198) nhận được trên Triticum aetivum L, Secale cereale L, và
Bromus inermis Leyss cho thấy ABA làm tăng khả năng chịu lạnh đáng kể. Các tác giả cho
rằng ABA là chất cần thiết để tạo dòng chịu lạnh. Orr và cs cũng nhận được những kết quả
tương tự về tác dụng của ABA. Cả tính chịu lạnh và tính chịu nhiệt đều liên quan đến việc
tổng hợp hàng loạt các protein mới nhưng vai trò cụ thể của từng loại protein mới này như
thế nào? Chúng có vai trị gì trong quá trình chịu lạnh và chịu nhiệt cao? Đây là những câu
hỏi còn đang để ngỏ.
Chọn dòng chống chịu stress môi trường là yêu cầu chiến lược trong công tác giống
cây trồng nhưng cho đến nay phần lớn các cơng trình tập trung vào tìm kiếm các phương
pháp chọn lọc và tìm ra cơ chế của loại chống chịu này. Những kết quả nhận được mới chỉ là
những cơ sở hết sức ban đầu. Để có được những thành cơng trong tương lai và có được
những áp dụng vào thực tiễn những nghiên cứu thuộc hai hướng trên vẫn là điều quan tâm
hàng đầu.

V. Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao.
Các chất thứ cấp ở thực vật là những hợp chất trong cơ thể thực vật nhưng khơng có
vai trị đối với các q trình sống cơ bản, những hợp chất này giữ vai trò thứ cấp trong cây.
Thực ra về mặt tiến hố, các chất thứ cấp đóng vai trị hết sức quan trọng trong quá trình đấu
tranh sinh tồn vì đây là những chất độc đối với động vật và vi sinh vật, các chất có tác dụng
quyến rũ cơn trùng hoặc có mầu sắc và hương vị đặc biệt. Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy
mô và tế bào trong những năm gần đây đã mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để ni

sinh khối lớn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Hiện nay có nhiều phịng thí nghiệm đã
ký với các hãng sản xuất để thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy trên quy
mô công nghiệp. Một trong những u cầu của q trình cơng nghiệp hố tế bào nuôi cấy để
thu nhận các chất thứ cấp là vấn đề tạo các dòng cho năng suất cao và ổn định.

- 11 -


Vật liệu thường dùng để chọn dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao là mô hoặc
tế bào ni cấy dịch lỏng.
Đối với các chất thứ cấp có màu, có thể chọn bằng mắt. Đối với các chất thứ cấp
khơng có màu trước khi cấy chuyển cần được phân tích. Đây là việc làm tốn khá nhiều cơng
sức và thời gian. Để khắc phục, Ogino và cs (1978) đã đưa ra phương pháp ép tế bào. Theo
phương pháp này, các cụm tế bào hoặc mô được ép giữa hai tờ giấy lọc, nhựa tế bào sẽ ngấm
vào giấy lọc sau đó dùng phương pháp nhuộm để xác định. Đối với một số chất được tế bào
tiết ra môi trường thì có thể xác định theo phương pháp dùng màng phủ than hoạt tính để hấp
thụ các chất sau đó dùng tia cực tím (UV) để xác định (Knoop and Beiderback, 198). Ngồi ra
có thể sử dụng phương pháp xác định dựa vào tính chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn
của các chất do tế bào tiết ra như berberine chẳng hạn (Suzuki & cs, 1987). Các phương pháp
khác như phóng xạ hoặc phân biệt tế bào bằng huỳnh quang cũng đã được sử dụng.
Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao
thành công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào nuôi cấy
là rất quan trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ.Tuy nhiên vai trò
của các chất điều hồ sinh trưởng và nồng độ đường đã được ghi nhận. Hàm lượng các chất
thứ cấp trong tế bào còn phụ thuộc vào tăng trưởng về sinh khối, tốc độ tổng hợp và tiết ra
môi trường của các chất này.
Thường thường tế bào ni cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chu kỳ
sinh trưởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào ni cấy có tốc độ sinh trưởng nhanh và không
kèm theo sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp. Những tế bào nuôi cấy có tốc độ phân
chia chậm thì có ưu thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp.

Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề
được nhiều tác giả quan tâm. Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có
năng suất cao cho hàm lượng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suất thấp.
Cũng trên đối tượng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào ni cấy từ cây có năng suất cao
không phải lúc nào cũng cho năng suất chất thứ cấp cao. Kết quả này cũng được công bố trên
những lồi cây khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979). Cho đến nay vẫn chưa có
chứng minh chắc chắn về tương quan giữa năng suất của cây làm nguyên liệu và năng suất
của tế bào nuôi cấy. Theo Wilson (1990) nên sử dụng những cây đa dạng về di truyền để tạo
dòng tế bào khởi đầu.
Một số tác giả thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây dùng để tạo ra các dịng tế
bào khơng ảnh hưởng tới năng suất các chất thứ cấp (Speake & cs, 1964). Nhiều tác giả khác
lại nhận được các kết quả cho thấy các dòng tế bào từ các bộ phận khác nhau của cây, thậm
chí từ cùng một bộ phận cũng cho năng suất các chất thứ cấp khác nhau (Zenk & cs, 1975;
Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982). Hall và Yeoman (1987) cịn cho biết trong quần
thể tế bào ni cấy khả năng tổng hợp các chất (đặc biệt là đối với các chất màu) cũng khác
nhau giữa các tế bào. Những sự biến động về tích lũy các chất thứ cấp này là những cơ sở để
tìm các phương pháp phù hợp cho việc chọn ra các dòng cho năng suất cao.
Cho đến nay đã tồn tại ba hệ thống chọn lọc, hệ thống thứ nhất là sử dụng các tế bào
nuôi cấy đồng đều và ổn định; hệ thống thứ hai là sử dụng hổn hợp tế bào, nhưng các tế bào
riêng rẽ ổn định; và hệ thống thứ ba là sử dụng hỗn hợp tế bào mà tế bào riêng rẽ không ổn
định.
- 12 -


Hệ thống chọn lọc thứ nhất tạo ra các dòng cho năng suất ổn định còn hệ thống thứ
hai và thứ ba tạo ra các dịng ổn định và khơng ổn định.
Một vấn đề rất quan trọng mà cho đến nay vẫn chưa sáng tỏ là cơ sở của những thay
đổi kiểu hình, quá trình điều khiển trao đổi các chất thứ cấp ở tế bào thực vật nuôi cấy in
vitro. Để có được những phương pháp chọn các dịng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp
cao những nghiên cứu về vấn đề này là rất quan trọng.

Ngồi những phương pháp chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao đã
nêu, ứng dụng công nghệ gen để tạo các dòng tế bào này là một hướng cần được tiến hành,
tuy nhiên ở đây cũng còn nhiều vấn đề liên quan chưa được hiểu biết đặc biệt là những cơ sở
sinh hố và phân tử trong chu trình trao đổi chất thứ cấp.
Mặc dù cịn một số vấn đề cần giải quyết nhưng những thành tựu đạt được trong chọn
dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao đã mở ra triển vọng lớn trong việc đưa tế bào
thực vật nuôi cấy vào sản xuất các chất thứ cấp có ý nghĩa trong nông nghiệp, công nghiệp và
y học. Đặc biệt là sự phát triển hệ thống công nghiệp để sản xuất sắc tố đỏ và chất diệt khuẩn
Shikonin ở Nhật (Curtin, 1983) đã mở ra triển vọng công nghiệp hố việc thu nhận các chất
thứ cấp từ tế bào nuôi cấy. Viện Cơng nghệ sinh học Canada và các phịng nghiên cứu của
hãng Vipont đã hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công nghiệp sản xuất Sangninarine
sử dụng trong sản xuất thuốc đánh răng (Agricell Report, 1989).
Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công nghiệp
dược, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các chất này rất khó tổng hợp và hiện nay nguồn
cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng. Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng nguồn cung cấp
hoặc thay thế việc trồng trọt các cây cho những chất này đang được quan tâm đặc biệt. Vấn
đề tìm ra các phương pháp chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là khâu then
chốt để đưa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mô công nghiệp. Những thành tích đạt được
trong lĩnh vực này đặc biệt là việc công nghiệp hố sản xuất Shikonin bằng tế bào nuôi cấy là
những tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy để nhận các chất thứ cấp có giá trị
kinh tế cao.
Ở Việt Nam các nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận các chất thứ cấp đã được
bắt đầu từ những năm 80 trên các đối tượng thuốc lá, tam thất, thanh hao, taxus. Năm 1988,
Phan Huy Bảo và cs đã thông báo chọn được dòng tam thất cho hàm lượng saponin cao.
Những thay đổi về hàm lượng nicotine liên quan đến quá trình phân hố mơ và cây tái sinh
cũng đã được công bố ( Nguyễn Đức Thành và cs, 1991 ).

Phần 4: DUNG HỢP PROTOPLAST VÀ LAI TẾ BÀO SÔMA.
I. Dung hợp protoplast và lai nhân.
Do khơng có vách xellulơ nên protoplast (tế bào trần) trở thành một đối tượng lý

tưởng trong việc nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai
loại protoplast có thể tạo đươc các cây lai sôma (lai nhân hoặc lai tế bào chất). Ngồi ra có thể
sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan như nhân, lục lạp, ty thể hoặc
chuyển các vectơ mang các gen mã hố cho một số đặc điểm biết trước.

- 13 -


Protoplast có thể dung hợp tự nhiên. Hiện tượng này thường xảy ra sau khi tách
protoplast từ một loại cây. Tần số dung hợp tự nhiên phụ thuộc vào các giốâng cây Schieder
& Vasil, 1980), ở cà độc dược (Datura inoxi) tần số này đạt tới 8% (Schieder, 1974).
Để dung hợp hai loại protoplast khác nhau thường phải xử lý một số tác nhân. Một số
tác giả dùng nước biển (Hofmeister, 1954; Binding, 1966, 1974), hoặc nitrat natri (Power &
cs, 1970; Carlson, 1972), một số khác sùng các chất kích thích như lectin nhưng hiệu suất
dung hợp rất thấp (Hartman & cs, 1973; Burges & Fleming, 1974; Glimelus & cs, 1974).
Hiệu suất dung hợp khá cao có thể đạt được bằng cách xử lý protoplast bằng ion Ca 2+ ở 37oC
và môi trường kiềm (pH=10,5) (Keller & Melchers, 1973; Binding, 1974; Schieder, 1974).
Hiện nay phương pháp có hiệu quả và được sử dụng rộng rãi là phương pháp dung
hợp của Kao và đồng nghiệp (Kao & Michayluk, 1974; Constabel & Kao, 1974). Các tác giả
đã dùng polyethylen glycol (PEG) có phân tử lượng cao (6000) để gắn các protoplast với
nhau. Quá trình dung hợp xảy ra khi làm lỗng dung dịch PEG bằng môi trường nuôi cấy. Khi
PEG bị làm lỗng thì protoplast dần dần trở lại bình thường và ở phần tiếp giáp giữa hai
protoplast bị vỡ ra và quá trình dung hợp được xảy ra. Trong cùng thời gian Wallin và cs. đã
sử dụng thành công phương pháp này (Wallin & cs, 1974). Nagata đã thay PEG bằng rượu
polyvinyl để dung hợp protoplast của thuốc lá, cà rốt và cây họ đậu (Nagata, 1978). Phương
pháp sử dụng PEG có hiệu quả đối với nhiều trường hợp khi dung hợp protoplast của các cây
cùng lồi và khác lồi, dung hợp tế bào động vật và cả trường hợp dung hợp protoplast thực vật
với tế bào động vật (Pontecorvo, 1975; Jone & cs, 1976; Dudits & cs, 1976; Vasil, 1976;
Vasil & cs, 1976).
Về cơ chế của quá trình dung hợp đã được Nagata và Melchers nghiên cứu tỉ mỉ

(Nagata & Melchers, 1978).
Cuối những năm 70 và đầu 80 một số tác giả đã đưa ra phương pháp dung hợp bằng
dòng điện (Sanda & cs, 1979; Zimmermann & Sheurich, 1981; Zimmermann, 1982;
Zimmermann & Vienken, 1982; Vienken & cs, 1983). Bằng phương pháp này, các tác giả đã
đạt được tần số dung hợp tới 60 và 80%. Tuy tần số dung hợp có cao nhưng vấn đề tái sinh
các sản phẩm dung hợp lại gặp khó khăn. Chỉ gần đây một số tác giả mới nhận được cây tái
sinh sau khi sử dụng phương pháp dung hợp này (Kohn & cs, 1985; Moricawa & cs, 1987).
Khi dung hợp hai loại protoplast với nhau thường có ba nguồn gen tham gia (nhân, lục
lạp, ty thể ) được kết hợp trong các sản phẩm dung hợp. Nếu dung hợp hai loại protoplast
giống nhau ta sẽ tạo được các sản phẩm đồng hợp gen (homogenome). Trong trường hợp
dung hợp hai loại protoplast khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm dị hợp gen (heterogenome). Các
sản phẩm đồng hợp gen sẽ tạo ra các kiểu hình giống như bố mẹ nhưng với mức bội thể gấp
đôi. Các sản phẩm dị hợp gen sẽ tạo ra tế bào dị nhân với hỗn hợp lục lạp và ty thể. Một
trong hai nhân có thể bị thối hố hoặc cả hai đều phân ly trong quá trình phân chia tế bào. Sự
thối hố hoặc phân ly của một nhân trong tế bào dị hợp gen sẽ tạo ra những tế bào chứa tế bào
chất của cả hai loại protoplast và chỉ có một nhân. Những tế bào kiểu này được gọi là các thể
lai tế bào chất.
Muốn chọn các thể lai sơma bằng dung hợp protoplast có thể sử dụng các đặc điểm
phối hợp, các đặc điểm kháng sinh hố và các đột biến sắc tố, ngồi ra có thể sử dụng các đặc
điểm khác nhau tự nhiên giữa các loại protoplast.

- 14 -


Melcher là người đầu tiên sử dụng sự phối hợp hai đột biến bạch tạng để chọn sản
phẩm dung hợp ở thuốc lá (Melchers & Labil, 1974). Một số tác giả khác đã sử dụng phương
pháp tương tự trong các thí nghiệm lai giữa các cây dại trên cùng lồi như P.innoxia
(Schieder, 1977) và các cây khác lồi như P Parodii + P.Hybrida (Cocking 1978), N.
Tabacum + N. Glauca (Evans & cs, 1978). Sự phối hợp các đột biến tự dưỡng như thiếu
nitrate reductase, thiếu các axit amin và vitamin hoặc mẫn cảm với nhiệt độ đã được nhiều

tác giả sử dụng có kết quả (Schieder, 1974; Glimelius & cs, 1978; Muller & Grafe, 1978;
Sidorov & cs, 1981; Sidorov & Maliga, 1982; Evola, 1983; Gebhardt & cs, 1983;Shimamoto
& cs, 1983). Điều đáng chú ý là các đột biến sử dụng để chọn phối hợp phải là các đột biến
lặn và khác alen.
Đặc điểm kháng các chất ức chế trao đổi chất cũng được sử dụng rộng rãi để chọn thể
lai. Power và cs (1976) đã sử dụng actinomyxin để chọn thể lai giữa P. Parodii và P.
Hybrida. Maliga và cs (1977, 1982) dùng kanamyxin và streptomyxin để chọn thể lai trong
các thí nghiệm dung hợp giữa các lồi thuốc lá với nhau.
Một số dòng tế bào và cây lai còn được chọn bằng sự khác nhau về khả năng sinh
trưởng và tái sinh của sản phẩm dung hợp và từng loại protoplast (Carlson & cs, 1972; Power
& cs, 1977), bằng ưu thế trong sự phát triển của cây lai (Cocking & cs, 1977; Schieder, 1978;
Schieder & cs, 1978; Krumbiegel & Schieder, 1979; Dudits & cs, 1979; Lonnerndoker &
Schieder, 1980), hoặc hình dạng khơng bình thường của mơ và cây lai (Melchers & cs, 1978;
Binding & Nehls, 1978).
Năm 1977 Kao đưa ra phương pháp tách thể dung hợp bằng cơ học. Phương pháp này
được Gleba và đồng nghiệp phát triển và sử dụng tại phịng thí nghiệm của mình (Gleba &
Hofman, 1978; Gleba & cs, 1978; Gleba & Hofman, 1979).
Cho đến nay dung hợp protoplast là phương pháp hiệu quả nhất để tạo cây lai sơma.
Nó cho phép tạo các tổ hợp lai bất kỳ theo ý muốn. Vấn đề là phải nghiên cứu cải tiến
phương pháp dung hợp, kỹ thuật ni cấy và phương pháp chọnlọc.
Từ cơng trình lịch sử của Carlson (Carlson & cs, 1972) đến nay bằng phương pháp
dung hợp protoplast các nhà khoa học trên thế giới đã tạo được cây lai sôma từ hàng trăm tổ
hợp lai giữa các cây cùng lồi, khác lồi và khác chi. Đây là những thành tựu hết sức lớn lao
mà các nhà khoa học đã đạt được trong lĩnh vực lai sôma bằng dung hợp protoplast. Gần đây
các nhà nghiên cứu đã tạo được cây lai sôma ở cả những giống cây trồng có ý nghĩa kinh tế
như khoai tây, cà chua và lúa (Handley & cs, 1986; O’Connell & Hasnon, 1986; Ausutin &
cs, 1985, 1986; Helgeson & cs, 1986; Terada & cs, 1987; Guri cs, 1988). Qua đây ta thấy
được triển vọng lớn lao của việc ứng dụng phương pháp này để cải biến di truyền ở thực vật
nhằm tạo ra giống cây đáp ứng với yêu cầu đòi hỏi của thực tiễn.

II. Lai tế bào chất.
Ngồi việc tạo ra các thể lai sôma chứa dị hợp nhân, dung hợp protoplast cịn có thể tạo
được các thể lai tế bào chất (hay còn gọi là lai sinh chất). Trong những năm gần đây nhiều
phịng thí nghiệm ở Pháp, Thụy Điển, Canada, Ixraen, Nga, Ucrain và Hungary đã đầu tư
nhiều cho các nghiên cứu trong lĩnh vực này, vì đến nay một số các đặc điểm chống chịu của
thực vật được chứng minh liên quan đến vật chất di truyền tế bào chất.

- 15 -


Trong thời kỳ đầu, các nhà nghiênn cứu đã cố gắng tạo các thể lai tế bào chất bằng
cách đưa các bào quan tách rời vào protoplast. Potrykus là người đầu tiên công bố chuyển
được lục lạp vào protoplast của Petunia hybrida (cây dạ n) nhưng khơng có những số liệu
chứng minh chắc chắn sự tồn tại của lục lạp trong tế bào (Potrykus, 1973). Những cơng trình
của Carlson (1973), Bonnet & Erikson (1974 ) và Kung ( 1975) cũng ở tình trạng tương tự.
Vasil và vợ của ơng đã công bố kết quả chuyển ty thể từ cây bất dục đực (BDĐ) ở ngô
và dã yên vào protoplast của cây bình thường và tái sinh được cây (Vasil & Vasil, 1974;
Vasil, 1976). Các tác giả còn xác định được gen điều khiển tính BDĐ ở ngơ.
Những cơng trình trên đã đi vào lịch sử. Từ đó đến nay khơng có những cơng bố tiếp
theo. Sở dĩ như vậy là do những hạn chế về việc tách nhận các bào quan nguyên vẹn và giữ
nguyên hoạt động của chúng. Đây là vấn đề hết sức khó khăn vì trong q trình tách và làm
sạch, các bào quan bị giảm sức sống. Ngồi ra chúng còn dễ bị ảnh hưởng bởi các tác nhân
trong quá trình dung hợp. Mặt khác nữa là trong các cơng trình kể trên hiệu suất dung hợp
còn rất thấp.
Bắt đầu từ năm 1978 đến nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật dung hợp hai
loại protoplast, trong đó một loại có các d0ặc điểm di truyền lục lạp và ty thể đã được xác
định để tạo các cây lai tế bào chất. Belliard và cs (1978) là những người đầu tiên sử dụng
thành công phương pháp này. Tuy nhiên tỷ lệ cây lai tế bào chất nhận được cịn thấp và việc
phân tích di truyền các cây lai nhận được bị gặp nhiều khó khăn do sự hình thành cả các thể
lai nhân. Để khắc phục những hạn chế trên, Zelcer và đồng nghiệp lần đầu tiên sử dụng

phương pháp dung hợp “cho và nhận“ (Zelcer & cs, 1978). Ôâng dùng tia X để giết nhân của
một loại protoplast. Những protoplast đã bị chiếu xạ này khơng thể phân chia được mà chỉ
đóng góp tế bào chất trong quá trình tạo cây lai. Zelcer dung hợp protoplast đã giết nhân
(protoplast cho tế bào chấ) của N. Tabacum với protoplast nguyên vẹn (protoplast nhận) của
N. Sylvestris. Ơâng đã chuyển được tính BDĐ (đặc điểm ty thể) từ N. Tabacum sang N.
Sylvestris.
Các đặc điểm liên quan tới lục lạp cũng đã được chuyển thành công nhờ phương pháp
trên (Beversdorf & cs, 1980; Menczel & cs, 1982; Aviv & cs, 1984; Fluhr & cs, 1983, 1984,
1985; Kemble & Barsby, 1988).
Ngồi việc dùng tia phóng xạ để giết nhân có thể dùng một số chất hố học như
iodoacetate (Medgyey & cs, 1980), hoặc dùng ly tâm để loại bỏ nhân (Wallin & cs, 1977;
Maliga & cs, 1982). Nhưng trong các trường hợp này tỷ lệ nhân sống sót vẫn còn đáng kể.
Đối với các đặc điểm di truyền lục lạp rất dễ dàng chọn lọc và theo dõi sau khi dung
hợp bằng các chỉ thị di truyền lục lạp như các đột biến lạp thể (Gleba & cs,1978), các đột
biến kháng sinh hố như kháng một số độc tố nấm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs, 1985), các
đột biến kháng thuốc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo & Maliga, 1982;
Cseplo & cs, 1984) và các đột biến kháng chất diệt cỏ ( Gressel & cs, 1984).
Đại phân tử của enzim ribulozo 1,5 difotfat carbonxylase được tổng hợp nhờ thông tin
di truyền lục lạp đã được sử dụng để nghiên cứu sinh hố lục lạp (Kung & cs, 1975). Phương
pháp phân tích sinh hố chính xác hơn nữa đó là phương pháp phân tích điện di đồ của ADN
lục lạp (cpADN) sau khi dùng các enzim cắt giới hạn, cắt cpADN thành những đoạn khác
nhau và phân lập các đoạn cắt này bằng điện di (Belliard & cs, 1978). Hiện nay phương pháp
này được sử dụng rộng rãi ở nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới. Ngồi khả năng sử dụng
- 16 -


với bất kỳ tổ hợp lai nào, phuơng pháp này cịn rất chính xác nó chophép xác định được 1%
hỗn hợp của cpADN.
Khác với lục lạp các đặc điểm liên quan tới ty thể khơng có những chỉ thị để chọn
trong khi nuôi cấy in vitro. Một số tác giả đã dùng chỉ thị lục lạp để chọn (Medgyesy & cs,

1980; Menczel & cs, 1982). Trường hợp này chỉ sử dụng được khi lục lạp và ty thể liên kết
với nhau theo một cơ chế nào đó.
Nghiên cứu hình thái của hoa có thể gíup cho việc xác định ty thể ngoại lai trong các
cây lai. Tính BDĐ cũng đã được sử dụng làm chỉ thị để chọn đặc điểm ty thể ở thuốc lá
Belliard & cs, 1979) và dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980).
Giống như lục lạp phương pháp phân tích điện di đồ của ADN ty thể (mtADN) cũng
được sử dụng rộng rãi để xác định ty thể trong cây lai tế bào chất. Belliard và cs đã dùng
phương pháp này để nghiên cứu ty thể ở những cây lai trong thí nghiệm dung hợp protoplast
thuốc lá và đã phát hiện thấy sự tái tổ hợp của mtADN trong các cây lai (Belliard & cs,
1979). Tiếp sau đó Nagy và cs (1981), Galun và cs (1982) và nhiều tác giả khác đã sử dụng
những phân tích mtADN để nghiên cứu và theo dõi hoạt động của ty thể ở các cây lai tế bào
chất.
Số phận của lục lạp cũng như ty thể ngoại lai trong cơ thể lai tế bào chất là một vấn đề
được các nhà nghiên cứu quan tâm hàng đầu vì việc biến đổi di truyền tế bào chất chỉ có ý
nghĩa khi những thông tin di truyền lục lạp và ty thể ngoại lai tồn tại và hoạt động bình
thường trong cơ thể lai.
Những kết quả đầu tiên của Kung (Kung & cs, 1975, 1977) và Chen (Chen & cs,
1977) cho thấy các cây lai giữa N. Glauca và N. Langsdorffii phần lớn chỉ chứa một loại lục
lạp (hoặc của bố, hoặc của mẹ). Trong cơng trình của Belliard, tác giả chỉ xác định được một
loại cpADN trong cây lai tế bào chất (Belliard & cs, 1978). Thành và cs đã chứng minh cây
thuốc lá nhận được từ dung hợp protoplast của hai loại cây khác tông Salpiglossis sinuata
(cây cho lục lạp) và N. Tabacum (cây nhận lục lạp) chỉ chứa một loại lục lạp của S. Sinuata
(Thanh & cs, 1988). Trong một vài trường hợp các tác giả này lại xác định được cả hai loại
lục lạp. Một số tác giả khác cũng thu được những kết quả tương tự (Aviv & cs, 1980, 1984;
Glimelius, 1981; Bonnet & Glimelius, 1983).
Mặc dù trong một số cơng trình các tác giả chứng minh được sự tồn tại của hai loại
cpADN trong cây lai nhưng chưa ai thấy được hiện tượng tái tổ hợp của cpADN. Vấn đề tái
tổ hợp của cpADN ở thực vật bậc cao tuy đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới
nghiên cứu, xong đến cuối những năm 80 mới có hai cơng bố về sự tái tổ hợp cpADN trong
cây lai tế bào chất ở thuốc lá (Medgyesy & cs, 1985) và cây lai tế bào chất giữa thuốc lá và

khoai tây (Thanh & cs, 1989). Tái tổ hợp ADN lục lạp là một vấn đề rất có ý nghĩa, thơng
qua tái tổ hợp cpADN có thể tạo ra các tổ hợp gen tế bào chất mới.
Đối với ty thể trong tồn bộ các cơng trình đã công bố đều cho thấy ở các cây lai tế bào
chất luôn xảy ra sự tái tổ hợp mtADN (Belliard & cs, 1978; Nagy & cs, 1981, 1983; Clark &
cs, 1986; Kemble, 1986; Robertson & cs, 1987). Kết quả của sự tái tổ hợp này là tạo ra các
kiểu hình hoa mới, và các kiểu hình này rất ổn định (Belliard & Pelletier, 1979). Tái tổ hợp
mtADN xảy ra ngay cả sau khi dung hợp protoplast của hai giống thuốc lá có mtADN tương
tự nhau, tuy nhiên sự tái tổ hợp xảy ra nhiều hơn khi dung hợp hai lồi thuốc lá khác nhau như
N. tabacum và N. Plumbaginifolia (Nagy & cs, 1981, 1983).
- 17 -


Cho đến nay, việc nhận cây lai tế bào chất bằng kỹ thuật dung hợp protoplast mới
được thực hiện chủ yếu ở các lồi thuốc lá, cải và bước đầu thành công ở khoai tây. Tuy vậy
những thành tựu đạt được đã mang lại những ứng dụng thực tiễn trong việc cải biến cây
trồng. Chuyển lục lạp có thể giúp cho việc khôi phục năng suất ở cây cải dầu – Brasica
napus (Bennerot & cs, 1974; Pelletier & cs, 1983) và tạo các giống cây trồng kháng các chất
diệt cỏ (Benversdof & cs, 1980; Binding & cs, 1982; Gressel & cs, 1984; Pelletier & cs,
1985).
Lai tế bào chất bằng dung hợp protoplast có thể rút ngắn thời gian tạo các dịng bất
dục đực 4-5 năm. Chuyển tính BDĐ đã thành công ở thuốc lá (Zelcer & cs, 1978; Aviv
&Galun, 1980; Aviv & cs, 1980; Glimelius & cs, 1981; Uchimiya, 1982; Menczel & cs,
1983; Fluhr & cs, 1984) và dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980; Izhar & cs,
1983, 1984; Boeshore & cs, 1983; Clark cs, 1985; Rothenbenrg & cs, 1985). Đặc biệt là
chuyển tính BDĐ để tạo hạt lai ở cải dầu đã mang lại lợi ích kinh tế (Pelletier & cs, 1985;
Chetrit & cs, 1985).

Phần 5: CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT:
I. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật ni cấy

mơ và tế bào thực vật. Nó trở thành một phương tiện quan trọng để nghiên cứu cơ bản trong
sinh học thực vật. Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen. Ngồi ra
nó mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng. Từ khi khám phá ra
rằng chuyển gen có thể thực hiện nhờ Agrobacterium tumefaciens (Klee & Rogers, 1989) các
nhà khoa học tin rằng Arobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các lồi cây. Nhưng sau đó
kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium không thể thực hiện được trên các
cây ngũ cốc vì thế hàng loạt các kỹ thuật chuyển gen đã được phát triển đó là kỹ thuật
chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1989), kỹ thuật bắn gen (Klein & cs, 1989), kỹ thuật
vi tiêm (Neuhaus & cs, 1987), kỹ thuật chuyển gen qua hạt phấn (Hess & cs, 1977 ; Ohta,
1986), kỹ thuật đường dẫn bằng ống phấn (Luo & cs, Wu, 1988), kỹ thuật ủ hạt hoặc mô với
ADN (Ledoux & cs, 1974), kỹ thuật nhiễm vi khuẩn (Grimsley & cs, 1986), sử dụng ADN
của virus (Gronenborn & Matzeit,1989), Kỹ thuật điện di (Linsay & Jones, 1990), dung hợp
liposom (Ahokas, 1987), phương pháp vĩ tiêm (De la Pena & cs, 1987), và phương pháp xử
lý laser (Weber & cs, 1988). Đến nay nhờ cải tiến các vectơ chuyển gen nên kỹ thuật chuyển
gen bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa (Hiei và cs, 1994).
Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen được thực hiện qua các bước sau :
-Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm.
- Phân lập gen.
-Gắn gen vào các vectơ biến nạp.
-Biến nạp vào E. Coli.
-Tách ADN plasmid.

- 18 -


-Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật.
-Chọn các thể biến nạp.
-Tái sinh cây biến nạp.
-Chứng minh sự có mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh.

Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh
học của hệ thống chuyển gen như :
-Không phải tồn bộ tế bào đều thể hiện tính tồn năng.
-Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu
nhận gen biến nạp vào genôm.
-Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có những khả năng khác nhau. Cần xem
xét một số vấn đề như: chỉ có số ít tế bào có khả năng tái sinh và biến nạp; một số khác có
một trong hai khả năng; một số nếu tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng; một số
khác hồn tồn khơng có khả năng tái sinh và biến nạp.
-Thành phần các quần thể tế bào được xác định bởi lồi, kiểu gen, từng cơ quan, từng
giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
-Cho đến nay gen chỉ có thể chuyển vào tế bào có thành xellulô bằng Agrobacterium,
virus, vi tiêm, bắn gen và chuyển gen trực tiếp.
Khả năng xâm nhập của gen vào genôm một cách ổn định không tỷ lệ với sự thể hiện
tạm thời của gen.
Các ADN không phải là của virus khi có trong genơm chưa bảo đảm là đã gắn ổn định
với genôm.
-Các ADN không phải của virus không chuyển rời từ tế bào nọ sang tế bào kia, nó chỉ
ở nơi mà nó được đưa vào.
-ADN virus khơng xâm nhập vào genôm cây chủ, chuyển từ tế bào này sang tế bào
khác và bị loại ở mô phân sinh.

II. Các phương pháp chuyển gen.
1. Chuyển gen bằng Agrobacterium.
Chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp hữu hiệu đầu tiên dùng để chuyển
gen ở thực vật. Phương pháp này dùng Ti plasmid của A. tumefaciens hoặc Ri plasmid của A.
rhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plasmid gồm hai thành phần T-ADN và vùng
vir (virulence). T-ADN có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy
mà có thể gắn gen muốn chuyển nạp vào T-ADN để đưa vào tế bào. T-ADN chức gen điều
hồ sinh trưởng cục bộ và gen tổng hợp các chất opine. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất

kỳ đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Vùng vir gồm
sáu nhóm từ virA đến virG trong đó virC và virE có tác dụng làn tăng tần số biến nạp.
- 19 -


Để thiết kế vectơ dùng cho biến nạp, trước hết là cắt bỏ các gen điều hồ sinh trưởng
cục bộ sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển
(promote) phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng là gắn gen cần biến nạp.
Chuyển gen bằng Agrobacterium đã thực hiện có hiệu quả trên nhiều loại cây hai lá
mầm như: thuốc lá, cà chua, khoai tây (Cheng và cs, 1992), đậu tương (Hinchee & cs, 1988;
Dhir & cs, 1992), bông (Perlak & cs, 1990), Arobidopsis, ngô (Gould & cs, 1991; Citovsky
& cs, 1994). Những thành công mới nhất trên lúa (Hiei & cs, 1994; Rashid & cs, 1996) đã
làm cho phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium trở nên hấp dẫn và củng cố vị trí của
nó như các nhà tiền bối hy vọng ngay từ đầu. Cho đến nay chuyển gen thông qua
Agrobacterium là phương pháp cho tần số biến nạp cao hơn và có thể xác định được sự xâm
nhập ổn định hơn bất cứ phương pháp chuyển gen nào (Chan & cs, 1993; Hiei & cs, 1994).

2. Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus.
Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus là phương pháp gắn ADN virus vào
T-ADN của Ti plasmid và chuyển vào tế bào thực vật. Khi vào tế bào thì ADN virus được
giải phóng để tạo virus hoạt động và xâm nhập vào genôm tế bào gần vùng u do
Agrobacterium gây nên. Bằng phương pháp này Grimsley và cs (1987) lần đầu tiên cho thấy
khả năng chuyển gen ở cây ngũ cốc bằng Agrobacterium.

3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1988) là phương pháp chuyển
ADN thông qua xử lý polyethylen glycol (PEG). Đây là phương pháp chuyển gen cho hiệu
quả cao.Bằng phương pháp này đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di
truyền qua các thế hệ (Potrykus & cs, 1985). Phương pháp này có các ưu điểm như: tần số
chuyển nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao; có thể chuyển gen vào protoplast

bất kỳ lồi cây nào. Tuy nhiên vấn đề tái sinh cây từ protoplast cịn khó khăn ở một số lồi cây.
Mặc dù đã có nhiều thành tựu trong nuôi cấy protoplast nhất là protoplast của các giống cây
có giá trị kinh tế như lúa, ngơ, l mì, đại mạch ... nhưng phần lớn việc tách ni tế bào đều
phụ thuộc vào việc thiết lập hệ thống nuôi cấy phôi để làm nguyên liệu ban đầu mà điều này
không phải dễ thực hiện đối với các giống cây trong sản xuất.

4. Phương pháp bắn gen.
Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng được bao bọc
ADN bắn vào tế bào. Bằng phương pháp này có thể biến nạp tất cả các loại tế bào. Người ta
hy vọng phương pháp này sẽ giải quyết tất cả các vấn đề chuyển gen, nhưng cho đến nay tần
số biến nạp bằng phương pháp bắn gen còn thấp và thường xuyên nhận được cây biến nạp
khảm (cây có các tế bàobiến nạp và tế bào khơng được biến nạp). Có thể nói đến một số ưu
điểm của phương pháp bắn gen là :
-Thao tác dễ dàng.
-Bắn một lần được nhiều tế bào.
-Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nbuôi cấy, tế bào của các mô biệt hố và
mô phân sinh).

- 20 -


Cây đậu tương biến nạp đầu tiên đã nhận được bằng phương pháp này (McCabe & cs,
1988). Nhiều phịng thí nghiệm đã nhận được cây ngô biến nạp trong cùng thời gian (Fromm
& cs, 1990; Gordom- Kamm & cs, 1990). Một vấn đề tồn tại quan trọng là tần số biến nạp ổn
định thấp vì thế theo Potrykus (1991) thì ưu điểm thực sự của phương pháp bắn gen là ứng
dụng trong nghiên cứu sự thể hiện tạm thời của gen. Nhưng trong những năm gần đây đã có
hàng loạt các công bố về biến nạp thành công trên lúa (Zhang & cs, 1996), đu đủ, mía,
bơng ... đã khẳng định những ưu việt của phương pháp này.

5. Phương pháp vi tiêm.

Phương pháp vi tiêm (microinjection) vào hợp tử và phôi từ hạt phấn. Phương pháp
vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi đưa ADN vào những tế bào nhất định
(Neuhaus & Spangenberg, 1990). Phương pháp này đã tạo được dòng biến nạp từ protoplast
và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn ở cây cải dầu. Giống phương pháp bắn
gen, vi tiêm có thể đưa ADN vào những tế bào xác định có thành xellulơ. Vi tiêm hạn chế
hơn bắn gen ở chổ một phát tiêm chỉ được một tế bào và thao tác cần khéo léo hơn. Vi tiêm
có một số ưu điểm sau :
-Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào.
-Có thể quyết định đưa ADN vào loại tế bào nào.
-Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát đuợc.
-Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc dù hạn chế về số
lượng cũng có thể tiêm một cách chính xác.
-Có thể thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm.
-Có thể biến nạp mọi giống cây .
Cho đến nay bằng các phương pháp kể trên đều đã nhận đuợc cây biến nạp. Ngồi ra
một số phương pháp khác cũng được thực hiện nhưng chưa có kết quả hoặc kết quả chưa
khẳng định, đó là các phương pháp sau :
-Phương pháp ủ hạt khô hoặc phôi trong dung dịch ADN.
-Phương pháp biến nạp thông qua hạt phấn. Phương pháp này dựa vào cơ sở là ADN
có thể được xâm nhập vào hạt phấn ở giai đoạn nảy mầm và có thể di chuyển vào nhân của tế
bào hạt phấn hoặc hợp tử qua ống phấn (Hess, 1987).
-Phương pháp đường dẫn ống phấn (Luo & Wu, 1988). Phương pháp này cũng tương
tự như phương pháp biến nạp thông qua hạt phấn là đưa ADN vào hợp tử bằng ống phấn.
-Phương pháp vĩ tiêm (macroinjection). Phương pháp này sử dụng kim tiêm có đường
kính lớn hơn đường kính tế bào để đưa ADN vào tế bào, các tế bào này bị phá vỡ và ADN
xâm nhập vào tế bào bị thương rồi sau đó được chuyển vào các tế bào bên cạnh (De la Pena
& cs, 1987).
-Phương pháp xung điện (electropoation). trong phương pháp này, dùng hiện tuợng
phóng điện để tạo lỗ trên màng tế bào làm cho việc đưa ADN vào tế bào dễ dàng hơn, nhất là
- 21 -

khi ADN đã tiếp giáp với màng tế bào. Đối với protoplast, phương pháp xung điện đã có một
số kết quả khích lệ (Fromm & cs, 1987), nhưng chưa có những chứng minh chắc chắn cho sự
biến nạp. Hơn nữa việc nuôi cấy protoplast ở một số lồi cây vẫn cịn gặp nhiều khó khăn.
-Ahokas (1989) đã sử dụng điện di để vận chuyển ADN vào mô phân sinh chồi từ hạt
đại mạch để xem phương pháp điện di ADN qua mơ có thể vận chuyển gen vào tế bào hay
không. Kết quả tác giả nhận được sự thể hiện tạm thời của gen chỉ thị (GUS) nhưng không
chứng minh được sự biến nạp ổn định.
-Liposom có chứa ADN cũng đã được sử dụng như một phương tiện để đưa gen ngoại
lai vào tế bào thông qua dung hợp (Caboche, 1990) hoặc vi tiêm vào không bào (Lucas,
1990). Cả hai phương pháp này đều chưa thu đựợc kết quả.
-Phương pháp vi laser được ứng dụng để tạo lỗ hổng trên màng tế bào sau đó ủ tế bào
với dung dịch ADN được Weber và cs (1990) sử dụng như một phương pháp chuyển gen
không cần vectơ, nhưng sau một thời gian dài vẫn chưa có kết quả chắc chắn về sự xâm nhập
của ADN vào tế bào (1995) Guo và cs đã kết hợp việc xử lý tế bào với dung dịch đẳng
trương để rút bớt nước từ tế bào sau đó chuyển vào mơi trường có thế năng thẩm thấu yếu có
chứa ADN ngoại lai và dùng laser tạo lỗ trên màng tế bào để ADN xâm nhập vào tế bào.
Bằng phương pháp này các tác giả đã quan sát thấy sự thể hiện của gen biến nạp sau khi xử
lý tế bào và ở cây tái sinh.

Phần 6: SỰ PHÁT TRIỂN VÀ THÀNH TỰU CỦA NUÔI CẤY MÔ
VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Ở VIỆT NAM.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh
kết thúc (1975). Phịng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào đầu tiên được xây dựng tại viện
Sinh học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Bước đầu
phòng tập trung vào nghiên cứu các phương pháp nuôi cấy cơ bản trong điều kiện Việt Nam
như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Các kết quả đầu tiên về nuôi cấy
thành công bao phấn lúa và thuốc lá đã được công bố vào 1978 (Lê Thị Muội và cs, 1978; Lê
Thị Xuân và cs, 1978). Tiếp đó là thành cơng về ni cấy protoplast ở thuốc lá và khoai tây

(Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980,
1981). Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở thành phố Hồ Chí Minh và muộn hơn
nữa là tại Đại học Nông nghiệp 1 (ĐHNN1), Hà Nội và viện Khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp
Việt Nam (KHKTNNVN) các phịng thí nghiệm cấy mô không những ở các viện nghiên cứu
(viện Di truyền nông nghiệp /DTNN; viện Rau quả trung ương /RQTƯ) mà cả ở một số tỉnh
và cơ sở sản xuất (Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh, Cần Thơ,...).
Từ giữa những năm 80 trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế
bào thực vật được phát triển mạnh. Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lĩnh vục nhân
giống khoai tây (Viện công nghệ sinh học/CNSH, ĐHNN1, viện KHKTNNVN), dứa, chuối,
mía (viện CNSH, ĐHNN1, viện DTNN, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ), một số cây hoa
như Phong lan (phân viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm chướng ( Viện
CNSH, viện Lâm nghiệp ). Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn
dòng tế bào như chọn dòng tế bào kháng thuốc (Lê Bích Thủy vả cs, 1994), chọn dòng chịu
muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và cs, 1994; Đinh Thị Phòng và cs, 1994). Các kết
quả về dung hợp tạo cây lai tế bào chất và chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú
(Nguyễn Đức Thành và cs, 1988; Nguyễn Đức Thành và cs, 1993, 1997). Nuôi cấy bao phấn
- 22 -


để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại viện CNSH và DTNN. Nuôi cấy các cây dược
liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan
trọng cao cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1988; Phan Thị
Bảy và cs, 1995).

KẾT LUẬN
Tóm lại, cơng nghệ ni cấy mơ và tế bào thực vật có những ưu điểm :
-Tạo được hàng loạt cá thể phù hợp, giữ nguyên được tính trạng của cây mẹ.
-Rút ngắn rõ rệt thời gian chọn giống.
-Tái sinh, phục chế được các giống cây quí bị nhiễm bệnh virut, bị thối hóa. Tạo được
các giống sạch bệnh, có phẩm chất tốt mong muốn.

-Giá thành cây giống rẻ hơn nhờ giảm mặt bằng sản xuất : 10 m2 kho cho cây ống
nghiệm trong phịng thí nghiệm tương 10 ha ngồi đồng ( Heller và cs, 1995).
-Tạo được nhanh chóng thế hệ các cây đồng hợp tử sẽ rất cần cho phân tích di truyền
và ứng dụng thực tiễn.
Ngày nay với tiến bộ kĩ thuật nuôi cấy mô người ta có thể sản xuất giống trong phịng
thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh chóng hơn nhiều lần phương pháp cổ điển. Nhờ kết
quả này mà một người có thể sản xuất ra 130.000 cây hồng trong một năm và chỉ cần có
một cây hồng gốc, so với phương pháp cũ như giâm cành thì người đó chỉ có thể sản xuất
được tối đa 50 cây mà thôi. Như vậy, với công nghệ mới này năng suất của người công
nhân nơng nghiệp đã tăng lên 2.500 lần- khơng có lĩnh vực kĩ nghệ nào có thể sánh nổi.
Kĩ thuật sản xuất giống trong phịng thí nghiệm cịn là biện pháp hữu hiệu để xây dựng
những chương trình chọn lọc tối ưu.
Kĩ thuật ni cấy mơ cịn cho phép với một qui trình dài có được những sản phẩm có
tính di truyền hồn hảo như nhau và như thế có thể sử dụng như « bố mẹ lai » và cũng
dùng để tạo ra những dòng mới.

- 23 -


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân, 1994: Công nghệ gen và Công nghệ sinh học ứng dụng
trong y dược học hiện đại, NXB Y học.
2. Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
4. Lê Đình Lương, 2001: Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
5. Nguyễn Đức Thành, 2000: Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Nông nghiệp.
6. Nguyễn Lân Dũng: Thế kỷ 21- thế kỷ vàng của công nghệ sinh học, Khoa học phổ thông,
Xuân 1997.
7. Nguyễn Như Khanh, 2006: Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục.
8. Trần Thế Thông: Công nghệ sinh học với nông nghiệp, Khoa học phổ thông, Xuân 1997.

9. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006: Công nghệ sinh học, NXB Giáo
dục.
10. Cơng nghệ sinh
nghesinhhoc/chuong15.

học

:

/>
11. Tạp chí sinh học, tập 28- số 4, tháng 12/2006.

- 24 -


- 25 -