ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen Chitinase kháng bệnh Đạo Ôn nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Lúa gạo là cây lương thực chính của người dân Châu Á, cũng như ngô
của dân Châu Mỹ, hạt kê của dân Châu Phi hoặc lúa mì của dân Châu Âu và
Bắc Mỹ. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa
gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa
gạo làm nguồn lương thực chính và hơn 110 quốc gia sản xuất và tiêu thụ gạo
với các mức độ khác nhau. Lượng lúa gạo được sản xuất ra và mức tiêu thụ
cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn
1,5 tỉ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này ước
tính đã tăng lên gấp đôi, đối với những người này và người dân nghèo thường
dùng lúa gạo là nguồn lương thực chính, và là nguồn thức ăn chủ yếu cho
cuộc sống hằng ngày của họ. Khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu
hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và
vitamin hơn là năng lượng.
Lúa gạo là cây lương thực quan trọng nhất của nước ta và trồng lúa là
một nghề truyền thống của nhân dân Việt Nam từ rất xa xưa, từ người Việt
cổ. Kinh nghiệm sản xuất lúa đã được hình thành, tích lũy và phát triển cùng
với sự hình thành và phát triển của dân tộc ta. Những tiến bộ khoa học kỹ
thuật, sản xuất lúa trong nước và quốc tế đã thúc đẩy mạnh mẽ ngành trồng
lúa nước ta vươn lên bắt kịp trình độ tiên tiến của thế giới.
Những năm gần đây, Việt Nam đã tham gia vào thị trường lúa gạo
quốc tế với sản lượng gạo xuất khẩu hàng năm đứng thứ 2 trong số các nước
xuất khẩu gạo nhiều nhất thế giới. ĐBSCL và ĐBSH là hai vựa lúa lớn nhất
của cả nước, đã góp phần quan trọng trong thành quả chung đó.
Trong những năm qua Việt Nam đã chọn, tạo nhiều giống lúa có năng
suất cao, phẩm chất tốt. Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu của Việt Nam nóng
ẩm quanh năm, các yếu tố như đất đai, cỏ dại, dịch bệnh và hạn hán diễn biến
rất phức tạp. Cây lúa dễ mắc các dịch bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra như
1
bệnh đạo ôn, khô vằn, bạc lá đã làm giảm chất lượng và năng suất của lúa từ

20 – 80%, có nhiều nơi dịch bệnh đã làm cho mùa màng bị mất trắng.
Việc sử dụng các chất độc hóa học trong bảo vệ thực vật đã ảnh hưởng
không nhỏ đến sức khỏe của con người và các sinh vật khác. Nghiêm trọng hơn
là dư lượng các chất độc hóa học đó đã tồn tại trong đất, nước, qua chuỗi thức
ăn làm mất cân bằng sinh thái, phá hủy môi trường sống đến mức báo động.
Vì vậy, việc chọn tạo ra giống lúa mới có năng suất cao, chất lượng
tốt, có khả năng chống chịu được sâu bệnh, côn trùng và những điều kiện
khắc nghiệt của thời tiết, khí hậu để đáp ứng nhu cầu lương thực và bảo vệ
môi trường đang là nhiệm vụ cấp thiết đối với nhà khoa học
Ngày nay việc tạo ra các giống cây trồng mang gen kháng sâu, bệnh,
đang được các nhà khoa học trong nước và quốc tế quan tâm nghiên cứu.
Một trong các giải pháp được các nhà khoa học hướng tới là tạo giống mới
bằng kĩ thuật chuyển gen, tuy còn khá mới mẻ nhưng kĩ thuật chuyển gen đã
và đang được ứng dụng để tạo ra những vật liệu khởi đầu có giá trị cho
nghiên cứu chọn tạo giống mới trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau.
Tạo cây trồng mang gen kháng sâu, bệnh bằng phương pháp chuyển
gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp nhanh nhất it
tốn kém và đã đạt được kết quả trên nhiều đối tượng cây trồng như thuốc lá,
cà chua, hoa cúc, đậu xanh, lúa và nhiều giống cây trồng khác.
“Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen Chitinase kháng bệnh đạo ôn
nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” là rất cần thiết mang tính ứng
dụng cao nhằm tạo ra các giống lúa chuyển gen có năng suất cao, chất lượng
tốt và kháng bệnh đạo ôn.
2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Nghiên cứu qui trình nuôi cấy mô thích hợp (môi trường tạo callus,
môi trường tạo chồi từ callus, môi trường ra rễ ) từ hạt đối với hai giống lúa
DT
22
và lúa KDĐB (khang dân đột biến).
2

Ứng dụng qui trình tái sinh để chuyển gen Chitinase kháng bệnh đạo
ôn vào hai giống lúa DT
22
và lúa KDĐB nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Tạo ra giống lúa mang gen kháng bệnh đạo ôn
Sử dụng các kỹ thuật PCR để xác định cây lúa chuyển gen
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Xuất phát từ các mục tiêu nói trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các
nội dung sau:
Hiệu quả, thời gian và nồng độ thích hợp của hóa chất khử trùng với
hai giống lúa.
Bước đầu Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo callus, nhân
nhanh callus, tái sinh chồi từ callus và ra rễ.
Bước đầu xác định qui trình chuyển gen Chitinase vào hai giống lúa
DT
22
và lúa KDĐB nhờ Agrobacterium tumefaciens.
Sử dụng các kỹ thuật PCR để xác định cây lúa chuyển gen
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học
Đề tài đã xác định được loại hóa chất, thời gian và nồng độ khử trùng
thích hợp đối với hai giống lúa nghiên cứu trên.
Bước đầu xác định được các điều kiện và thành phần môi trường thích
hợp cho việc tái sinh cây chuyển gen từ hai giống lúa trên. Tạo nguồn
nguyên liêu phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen.
Áp dụng qui trình tái sinh trong nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh
đạo ôn vào hai giống lúa DT
22
và lúa KDĐB nhờ Agrobacterium
tumefaciens.

Ý nghĩa thực tiễn
Xác định được môi trường nuôi cấy mô, tái sinh cây từ callus hạt gạo
của hai giống lúa DT22 và KDĐB sau biến nạp phục vụ cho công tác tái sinh
cây lúa chuyển gen
3
Tạo cây lúa chuyển gen kháng nấm đạo ôn làm vật liệu khởi đầu phục
vụ cho công tác chọn tạo ra các giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt,
chống chịu sâu bệnh đáp ưng nhu cầu an ninh lương thực trong nước và quốc
tế ngày càng cao.
Kết quả nghiên cứu cung cấp thêm thông tin khoa học cho các nghiên
cứu chuyển gen kháng sâu bệnh vào một số giống lúa nhờ Agrobacterium
tumefaciens.
4
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA
1.1. Nguồn gốc, vị trí và phân loại cây lúa
Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khảo cổ học, nguồn gốc của cây
lúa là vùng Đông Nam Á và Đông Dương, những nơi mà có nhiều di tích của
cây lúa phát triển khoảng 10.000 năm trước Công nguyên. Sau đó nghề trồng
lúa được phát triển vào các nước Châu Á như hiện nay [6],[7],[43].
Cây lúa thuộc họ Graminae (hòa thảo), chi Oryza, loài Oryza sativa L.
Chi Oryza có 23 loài trong đó có 2 loài lúa trồng là O. sativa phổ biến ở
Châu Á và O. glaberrima phổ biến ở Tây Phi. O. sativa có 2n = 24 nhiễm sắc
thể và được chia thành 3 loài phụ là Indica, Japonica và Javanica (hay
Japonica nhiệt đới) [6], [35], [43], [44].
Lúa Indica thường trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, có
thân cao, dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá xanh nhạt cong và kháng được nhiều
sâu bệnh. Hạt gạo dài và trung bình, có nhiều tinh bột. Năng suất kém hơn
lúa Japonica.

Lúa Japonica thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc nơi có độ
cao trên 1000m (so với mặt nước biển), có thân ngắn, chống đổ, lá xanh đậm,
thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thường tròn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì
hàm lượng tinh bột ít. Lúa Japonica thường có năng suất cao hơn Indica.
Lúa Japonica nhiệt đới được trồng phổ biến ở Indonesia, mang đặc
điểm của 2 loại lúa Japonica và Indica. Hình thức gần giống như lúa
Japonica, có lá rộng với nhiều lông và ít chồi, thân cứng, chắc và ít cảm
quang, hạt lúa thường có đuôi.
Lúa Oryra glaberrima được trồng ở tây Châu Phi cách đây 3500 năm.
Nguồn gốc của chúng có thể ở lưu vực sông Niger ở Mali, có thân cao như
Indica, gié lúa thẳng, có ít hoặc không có nhánh phụ. Hạt lúa không có lông
5
trên vỏ trấu, gạo đỏ, có thể kháng nhiều sâu bệnh và chịu được hạn, nhưng
năng suất kém hơn những loại lúa nói trên [43].
Nghiên cứu bằng isozyme, người ta có thể phân biệt O. sativa làm 6
nhóm rõ ràng hơn: Nhóm I (Indica), II, III, IV, V, và VI (Japonica). Trong đề
tài này chúng tôi sử dụng callus của loài O. sativa L. với hai thứ là: O. sativa
var. utitissima A. Camus (lúa tẻ) và O. sativa var. glutinosa Tanka (lúa nếp)
để tiến hành nghiên cứu [20].
1.2. Đặc điểm sinh học của lúa
Các giống lúa có nhiều đặc điểm khác nhau về chiều cao, thời gian
sinh trưởng, khả năng chịu thâm canh, chịu chua mặn, chống chịu sâu bệnh…
tuy nhiên, chúng đều có những đặc điểm chung về hình thái, giải phẫu và
sinh lý hóa sinh [10],[11],[19].
Trước hết về mặt hình thái, cơ quan sinh dưỡng của lúa bao gồm các
bộ phận như thân, lá, rễ, hoa và hạt, mỗi bộ phận đều có đặc điểm riêng phù
hợp với chức năng nhất định:
Rễ: rễ lúa là loại rễ chùm. Nó được chia làm hai loại: loại thứ nhất là
rễ mầm mọc từ phôi hạt, có tác dụng hút nước và chất dinh dưỡng đến lúc
cây có 3 lá, loại thứ 2 là rễ đốt mọc ra từ các đốt thân nằm dưới mặt đất, có

tác dụng hút chất dinh dưỡng nuôi cây, trao đổi không khí, giữ cho cây lúa
đứng vững.
Thân: thân lúa là loại thân thảo. Ở thời kì mạ và lúc lúa còn non
thân lúa do các bẹ lá tạo thành. Sau khi làm đốt, thân lúa do các lóng và
đốt tạo thành.
Lá lúa: bao gồm lá mầm và lá thật. Lá mầm mọc ra trong quá trình
ngâm ủ và thời gian đầu sau khi gieo mạ. Lá thật là lá mọc trong quá trình
sinh trưởng sinh dưỡng của cây lúa và tồn tại trong suốt quá trình sinh trưởng
của cây lúa.
Hoa lúa: do có nhiều hoa trên 1 bông lúa quá trình trổ lại không đồng
thời nên hoa lúa nở theo quy luật từ trên xuống dưới, từ ngoài vào trong.
6
Thời gian nở của hoa phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thời tiết: nếu thuận
lợi, nhiệt độ thích hợp, đủ nắng, trời quang mây, gió nhẹ hoa nở rộ vào 8 – 9
giờ sáng; nếu trời nắng nóng hoa lúa sẽ nở sớm vào lúc 7 – 8 giờ sáng; nếu
trời âm u thiếu ánh sáng hoặc gặp rét hoa lúa sẽ nở muộn từ 12 – 14 giờ trưa.
Thời gian phơi màu, thụ tinh của hoa lúa từ khi mở vỏ trấu đến lúc khép lại
khoảng 50 – 60 phút.
Hạt lúa: mỗi hạt lúa được hình thành từ hoa lúa. Các hạt lúa xếp sít và
gối lên nhau tạo thành bông lúa. [6],[7].
1.3. Yêu cầu sinh thái
1. Yêu cầu lượng mưa: lúa được yêu cầu nhiều nước hơn các cây trồng
khác. Lượng mưa cần thiết cho cây lúa trung bình từ 6 – 7 mm/ngày trong
mùa mưa, 8 – 9 mm/ngày trong mùa khô. Một tháng cây lúa cần khoảng
200mm nước. Sự thiếu hụt hay thừa nước đều ảnh hưởng đến sinh trưởng,
phát triển của cây lúa.
2. Yêu cầu ánh sáng: ánh sáng ảnh hưởng đến cây lúa trên 2 mặt.
Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quang hợp, số giờ chiếu sáng trong ngày
ảnh hưởng đến sự phát triển, ra hoa, kết quả của lúa sớm hay muộn. Cường
độ ánh sáng thích hợp cho lúa từ 250 - 400 calo/cm

2
/ngày.
3. Yêu cầu về nhiệt độ: nhiệt độ làm lúa sinh trưởng nhanh hay chậm,
phát dục tốt hay xấu. Lúa sinh trưởng bình thường ở nhiệt độ 25 - 28
0
C. Nếu
nhiệt độ thấp hơn 17
0
C sinh trưởng của cây lúa chậm lại, thấp hơn 13
0
C thì
lúa ngừng sinh trưởng, nếu nhiệt độ thấp kéo dài nhiều ngày lúa có thể chết.
Nhiệt độ cao, trong phạm vi từ 28 - 35
0
C thì lúa sinh trưởng nhanh nhưng
chất lượng kém. Nhiệt độ lớn hơn 40
0
C cây lúa sinh trưởng nhanh nhưng tình
trạng sinh trưởng xấu, nếu kéo theo gió lào, ẩm độ thấp thì cây chết. Mức độ
ảnh hưởng nhiệt độ cao hay thấp, mạnh hay yếu là tùy thuộc vào giống lúa và
giai đoạn sinh trưởng, phát triển của lúa. Nhiệt độ thích hợp cho lúa nảy mầm
là 28 - 32
0
C, trổ bông, phơi màu yêu cầu nhiệt độ 20 - 38
0
C. Nhiệt độ ảnh
hưởng đến ra hoa kết quả sớm hay muộn của lúa. Một số giống lúa mẫn cảm
7
với nhiệt độ, khi tích lũy đủ một số nhiệt nhất định (tổng tích ôn) trong đời
sống của mình thì sẽ ra hoa kết quả. Tổng tích ôn của giống ngắn ngày là

2000 - 2500
0
C, giống dài ngày là 3000 - 3500
0
C.
4. Yêu cầu thổ nhưỡng: đối với lúa nước được gieo cấy ở hầu hết các
nhóm và các loại đất, nhưng muốn lúa có năng suất cao thì đất trồng phải đáp
ứng một số yêu cầu sau: thứ nhất là địa hình bằng phẳng, thành phần cơ giới
từ thịt trung bình đến thịt nặng; thứ hai về hàm lượng N,P,K tổng số đạt mức
khá; thứ ba là độ pH từ 4,5 - 7,0; thứ tư là độ mặn phải thấp hơn 0,5% tổng
số muối tan [7]
1.4. Giá trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế của cây lúa
1.4.1. Giá trị dinh dưỡng của cây lúa
Lúa là một loại cây lương thực có giá trị dinh dưỡng cao. Bộ phận
được sử dụng chủ yếu của cây lúa là hạt lúa.
Ở hạt lúa hàm lượng tinh bột là 62,4%, đây là nguồn cung cấp năng
lượng chủ yếu cho con người.
Về hàm lượng protein, các giống lúa Việt Nam có hàm lượng protein
chủ yếu trong khoảng 7 – 8 %, các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao
hơn giống lúa tẻ.
Hàm lượng lipit chủ yếu ở lớp vỏ cám, nếu ở gạo xay là 2,02% thì ở
gạo đã xát chỉ còn 0,52%.
Hàm lượng vitamin nhóm B như B1, B2, B6, PP… lượng vitamin B1
là 0,45 mg/100 hạt (trong đó phôi 47%, vỏ cám 34,5%, hạt gạo 3,8%).
1.4.2. Ý nghĩa kinh tế của cây lúa
Theo số liệu của FAO, 2005: Trên thế giới, cây lúa được 250 triệu
nông dân trồng. Cây lúa vừa là lương thực chính của 1,3 tỉ người nghèo trên
thế giới, vừa là sinh kế chủ yếu của nông dân và là nguồn cung cấp năng
lượng lớn nhất cho con người, bình quân 180-200 kg gạo/người/năm tại các
nước Châu Á, khoảng 10 kg gạo/người/năm tại các nước Châu Mỹ [41], [43],

8
[44]. Việt Nam có tổng dân số trên 80 triệu người và 100% dân số sử dụng
gạo làm lương thực chính.
Hạt lúa là bộ phận chính được dùng làm lương thực, tất cả các bộ phận
khác của cây lúa đều được con người sử dụng phục vụ cho nhu cầu cần thiết,
thậm chí bộ phận rễ lúa còn nằm trong đất sau khi thu hoạch cũng được cày
bừa vùi lấp để tăng chất mùn cho đất [7]. Do đó cây lúa có vai trò quan trọng
trong đời sống của con người. Những nghiên cứu của cây lúa không chỉ có ý
nghĩa về khoa học mà còn có ý nghĩa thực tế rất lớn [45],[48].
II. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LÚA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
2.1. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới
Theo thống kê của FAO, năm 2005 cây lúa được trồng ở 114 nước và
có mặt trên khấp các châu lục. Trong đó, Châu Phi có 41 nước, Châu Á có 30
nước, Bắc Trung Mỹ có 14 nước, Nam Mỹ có 13 nước, Châu Âu có 11 nước
và Châu Đại Dương có 5 nước. Diện tích lúa biến động và đạt khoảng
152000 triệu ha, năng suất lúa bình quân xấp xỉ 4,0 tấn/ha. Ấn Độ là nước có
diện tích trồng lúa lớn nhất 44790 triệu ha, ngược lại Jamaica là nước có diện
tích trồng lúa thấp nhất 24 ha. Năng suất lúa cao nhất đạt 9,45 tấn/ha tại
Australia và thấp nhất là 0,9 tấn/ha tại Iraq [43], [44].
Giai đoạn 2001- 2005, sản lượng lúa trên thế giới đều tăng, năm 2005
đạt 618441 triệu tấn. Trong đó, sản lượng lúa Châu Á đạt 559349 triệu tấn
chiếm 90,45%; tương tự ở Nam Mỹ là 24020 triệu tấn (3,88%); ở Châu Phi là
18851 triệu tấn chiếm (3,04%); ở Bắc Trung Mỹ là 12537 triệu tấn (2,03%);
ở Châu Âu và Châu Đại Dương là 3684 triệu tấn (0,6%). Như vậy trong giai
đoạn này, Châu Á có sản lượng lúa lớn nhất thế giới.
2.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam
Nghề trồng lúa ở Việt Nam có lịch sử lâu đời nhất so với nghề trồng
lúa ở các nước Châu Á. Theo các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt
Nam…cây lúa đã có mặt từ 3000-2000 năm trước công nguyên. Tổ tiên
9

chúng ta đã thuần hóa cây lúa dại thành cây lúa trồng và đã phát triển nghề
trồng lúa đạt được những tiến bộ như ngày nay [4]
Từ khi thực hiện đổi mới (năm 1986) đến nay, Việt Nam đã có những
tiến bộ vượt bậc trong sản xuất lúa; đưa nước ta từ nước thiếu ăn triền miên
đã không những đảm bảo đủ lương thực cho nhu cầu trong nước mà còn xuất
khẩu từ 3 - 4 triệu tấn gạo/năm, đứng hàng thứ 2 trên thế giới về các nước
xuất khẩu gạo.
Tính đến ngày 06/10/2008 (theo số liệu của VFA), tình hình xuất khẩu
gạo trong tháng 09/2008 đạt 342170 tấn, trị giá 211,222 triệu USD. Từ ngày
01/01/2008 đến ngày 30/9/2008 thì xuất khẩu gạo đạt 3554303 tấn, trị giá
FOB 2153 tỷ USD [45].
III. BỆNH HẠI LÚA (DISEASES)
Chúng ta có thể chia các bệnh lúa ra làm 5 nhóm tùy theo tác nhân gây
bệnh: bệnh do vi khuẩn, bệnh do siêu vi khuẩn, bệnh do tuyến trùng, bệnh do
sinh lý và bệnh do nấm như: bệnh đốm nâu, bệnh khô vằn, bệnh thối bẹ,
bệnh đạo ôn…
3.1. Bệnh đạo ôn (Rice blast):
Bệnh đạo ôn là một trong những bệnh làm thiệt hại nghiêm trọng năng
suất ở lúa. Bệnh có ở khắp các vùng trồng lúa trên thế giới. Những thiệt hại do
bệnh đạo ôn gây ra đối với lúa đã được thông báo thường xuyên trên thế giới
cũng như ở Việt Nam. Theo báo cáo thì năng suất có thể giảm tới 80% ở vùng
dịch và thiệt hại do bệnh gây ra hàng năm vào khoảng 10 - 25%, (1992) [22].
Bệnh đạo ôn có thể xuât hiện lúc lúa non, đặc biệt gây tác hại mạnh
nhất lúc lúa trổ. Do vậy, gây nên bông bạc hoặc hạt thóc bị đen, lep lửng, làm
giảm sản lượng và chất lượng của lúa khá nhiều.
Bệnh có thể gây hại rất sớm từ nương mạ nhưng thường bị nặng nhất
là giai đoạn làm đòng đến sau trổ một thời gian. Nấm có thể tấn công ở
mọi bộ phận của cây lúa nhưng nhiều nhất là ở phiến lá. Bệnh cũng xuất
hiện trên các đốt thân làm gãy ngang thân lúa hoặc trên cổ bông (bệnh khô
10

cổ bông) làm tắt nghẽn mạch dẫn nhựa nuôi hạt, bông lúa bị gãy, hạt bị lép
và lững (hình1.1)
Tác nhân gây bệnh là một loại nấm ký sinh có tên khoa học là:
Pyricularia grisea hay P. Oryzae Cav. (1988) [14] thuộc lớp nấm bất toàn
Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Monilaceae. Loại nấm bệnh này xâm
nhập và ký sinh ở lá, cổ bông và thân lúa để hút chất dinh dưỡng của cây chủ.
Khi xâm nhập vào lúa, sợi nấm hình thành một đĩa bám, bám chặt vào bề mặt
cây chủ, đồng thời hình thành một sợi xuyên đục thủng lớp biểu bì của tế bào
để hút chất dinh dưỡng. Sợi nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong tế bào
qua khí khổng. Trên lá, vết bệnh nhỏ màu nâu, sau phát triển thành vết bệnh
điển hình có dạng hình mắt én hoặc hình thoi, thuôn nhọn hai đầu, ở trung
tâm có màu xám, xung quanh có viềng nâu, ngoài viền nâu thường có một
quầng vàng. Nhiều vết bệnh liên kết lại làm cả lá lúa bị cháy khô. Sau đó, sợi
nấm mọc ra cuống bào tử, cuống đâm qua các lỗ khí hay các lỗ thoát nước
của cây lúa và lộ ra ngoài. Trên cuống có nhiều bào tử hình quả lê có một đến
hai vách ngang. Sợi nấm, cuống bào tử và bào tử nấm rất bé, qua kính hiển vi
mới nhìn thấy được. Khi trời râm mát, ẩm ướt ta thường thấy trên vết bệnh có
phủ một lớp mốc màu xám xanh, đó chính là cuống và bào tử của nấm.
Việc lây nhiễm và phá hoại lúa của bệnh đạo ôn theo trình tự như sau:
sợi nấm nằm trong thóc giống hay rơm rạ bị bệnh cũ, đến vụ sau lúc gieo cấy
gặp thời tiết thích hợp, sợi nấm sinh bào tử, bào tử bay rơi bám vào cây lúa,
mọc mầm sinh sợi nấm, kết bám vào cây, tiếp tục sinh bào tử, phát triển và
lan truyền ra gây hại cho đến lúc thu hoạch thì nấm lại nằm trong thóc và
rơm rạ (1988) [14].
Tốc độ xâm nhập vào tế bào cây chủ tuỳ thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm,
nhiệt độ thuận lợi nhất cho sự xâm nhập này là ở 24 - 28
0
C, độ ẩm khoảng 85
- 100% và ít ánh sáng mặt trời. Do vậy, những lúc trời mát, có sương mù hay
mưa phùn ruộng thiếu nước và bón nhiều phân đạm, sạ cấy quá dày thì khả

năng phát bệnh tăng lên.
11
Để phòng trừ bệnh đạo ôn có hiệu quả, nhiều phương pháp đã được sử
dụng như: diệt sạch cỏ dại, rơm rạ có chứa mầm bệnh trước khi canh tác,
gieo sạ với mật độ vừa phải, bón phân cân đối N, P và K; đặc biệt là phân
kali để tăng cường tính kháng của tế bào cây đối với sự xâm nhập của nấm
bệnh. Dùng thuốc hoá học, cấy xen kẽ nhiều giống lúa trên môt vùng, điều
khiển thời vụ, gieo trồng các giống kháng. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy
triển khai gieo trồng giống kháng là một hướng mang lại hiệu quả kinh tế và
không gây hại cho môi trường trong công tác phòng trừ bệnh đạo ôn
(bonman và cs, 1988; Trần Duy Quý, 1997 [13] [16]).
Hình 1.1. Bệnh đạo ôn
Ngoài ra lúa còn mắc các bệnh do vi khuẩn như bệnh bạc lá, bệnh vàng
lùn và lùn xoắn lá, bệnh tungro, bệnh bướu rễ và các bệnh do tuyến trùng
gây ra
IV. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG
CÔNG TÁC GIỐNG CÂY TRỒNG
4.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Mỗi tế bào sống tách ra từ một cơ thể, khi ở điều kiện thích hợp đều có
khả năng phân chia và phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh, tính chất này gọi là
tính toàn năng (totipotence) của tế bào, lần đầu tiên được Habelandt sử dụng.
12
Tính toàn năng là cơ sở của nuôi cấy tế bào in vitro, từ tế bào thực vật riêng
rẽ có thể tái sinh thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh. [2]
Tính toàn năng của tế bào nói lên khả năng tái sinh cơ thể thực vật
hoàn chỉnh từ tế bào soma nào đó tách ra từ cơ thể. Các tế bào lấy từ bất kì
một mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm,
đoạn thân, rễ…) nếu được nuôi cấy trong môi trường thích hợp đều có khả
năng phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, ra hoa và kết quả
bình thường. Các loại mô phân tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh

trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc có thể phát triển thành callus. Callus là
loại tế bào chưa phân hóa, phân chia liên tục và có khả năng phát triển thành
phôi, chồi và cây hoàn chỉnh.
Tính toàn năng là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật, trong đó kỹ
thuật nuôi cấy mô và tế bào đang ngày càng phát triển và hoàn thiện.Nuôi
cấy mô và tế bào đã nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh
vực công tác cải tạo giống cây trồng, đưa ngành trồng trọt vào thế kỷ công
nghệ hiện đại [15].
4.2. Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô
Quy trình vi nhân giống thông thường gồm 5 giai đoạn chính, mỗi giai
đoạn có những yêu cầu riêng:
* Giai đoan 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu.
* Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng.
* Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
* Giai đoạn 4: Tạo rễ
* Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng.
4.3. Ứng dụng nuôi cấy mô trong công tác giống cây trồng
Ngày nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực
đang phát triển mạnh mẽ theo những hướng ứng dụng chính sau đây:
Nhân nhanh các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc khó nhân
giống bằng các phương pháp nhân giống thông thường khác.
13
Duy trì và nhân nhanh những kiểu gen quý đặc biệt là những kiểu gen
có nguy cơ bị tyuệt chủng nhằm mục đích làm nguyên liệu khởi đầu cho việc
nhângiống cây trồng.
Duy trì và nhân nhanh những dòng bố mẹ đồng hợp tử để phục vụ cho
công tác sản xuất hạt lai.
Bảo quản nguồn gen thực vật
- Làm sạch virut
- Sản xuất và chuyển hoá sinh học các hợp chất tự nhiên.

- Làm công cụ để các phương pháp cải tiến giống bằng công nghệ hiện
đại như lai tế bào soma, chuyển ghép gen ở thực vật có thể ứng dụng được.
[3]
Ở Việt Nam, từ năm 1975 nhiều phòng nuôi cấy mô đã được thành lập
và thu được nhiều kết quả. Viện di truyền nông nghiệp và Viện CNSH đã
hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô và đưa vào sản xuất nhiều giống cây trồng
như hoa hồng, lan, cúc, đồng tiền …Trường Đại học Nông nghiệp I đã hoàn
thiện quy trình và đưa vào sản xuất giống khoai tây sạch virus.
Sự mở rộng của công nghiệp vi nhân giống không chỉ làm tăng tiềm
năng sản xuất cây trồng mà còn thúc đẩy việc đồn điền hoá, trang trại hoá,
công nghệ hóa các mặt hàng nông nghiệp.
V. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN
Kỹ thuật chuyển gen đã và đang trở thành nhân tố quan trọng trong
chương trình chọn tạo giống cây trồng. Có thể chia nguyên lý chuyển gen lam 2
cách: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.
5.1. Chuyển gen trưc tiếp
5.1.1. Chuyển gen bằng xung điện
Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực
mạnh. Khi đặt các tế bào trần (protoplast) trong điện trường, sự dẫn điện và
tính thấm của màng nguyên sinh bị thay đổI, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ
và tạm thời của màng dẫn tới sự hình thành lỗ hổng trên màng tế bào. Một
14
loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình thành tuỳ thuộc vào điện trường,
làm cho DNA bên ngoài môi trường được truyền qua lỗ hổng vào tế bào.
Môt số tế bào thực vật có thể tiếp thụ DNA nhờ xung điện mà không
cần xử lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. Zang và cs,(1988)
đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần sử dụng phương pháp xung điện [6].
Sau một năm shimamoto và cs, (1989) đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu
tiên ở giống lúa japonica sử dụng phương pháp xung điện [6].
5.1.2. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)

Người ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏ
DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn. Phương pháp
này có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí vào tận
nhân và có thể quan sát được. Phương pháp này cần có thiết bị có độ chính
xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật và kỹ năng của người thực hiện phải
chính xác.
5.1.3. Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube)
Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nẩy
mầm và hình thành ống phấn. Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn
mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang
gen chuyển vào. Phương pháp này khá thành công, Đặc biệt trên cây lúa và
cây bông.
5.1.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile
bombardment biolistics)
Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou
và cs, (1991) và kỹ thuật này đươc cải tiến bởi Cao va cs, (1992); Li và cs,
(1993) [5]. Ngay lập tức, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí
nghiệm chuyển gen lúa japonica. Gần đây kỹ thuật chuyển gen bằng súng
bắn gen cũng đã được áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều
giống japonica (Christou và cs, 1998; Datta và cs, 1999 [6]. Cheng và cs
15
(1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào
lúa Japonica sử dụng súng bắn gen [6].
Đây là kỹ thuât tương đối hiện đại và có hiệu quả. Khi sử dụng thiết bị
(súng bắn gen) tạo được áp lực sẽ đẩy viên đạn được làm bằng kim loại trơ
(vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích
thước vào khoảng 1μm, với vận tôc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu
bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ
gen của tế bào chủ.
Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phương pháp dùng súng bắn gen

không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao. Ở một vài
trường hợp, tần suất chuyển gen bằng phương pháp này ngang bằng với tần
suất chuyển gen với cây hai lá mầm [6]
5.2 Chuyển gen gián tiếp
5.2.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus
Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng được coi
như là một vectơ. Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau:
- Bộ gen có cấu trúc DNA
- Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại
- Phổ ký chủ rộng
- Có khả năng tải
- Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào
Có hai loại virus đảm nhận được vai trò làm vectơ chuyển gen là:
* Cauliflower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải đặc biệt là
suplơ. DNA ngoại lai được đưa vào tế bào thực vật nhờ sự lây nhiễm lá bởi
virus. Các CaMV có thể nhân lên trong bào tương một cách độc lập, không
gây trở ngại cho tế bào vật chủ [1]. Song vectơ CaMV có một số hạn chế:
- Phổ ký chủ không rộng (chỉ ở các cây họ cải)
- Lượng DNA ngoại lai gắn vào ít, chỉ khoảng 250bp
16
* Genini virus:
- Có phổ ký chủ rộng: cây một lá mầm, hai lá mầm
- Có nhược điểm lớn là hầu như không truyền được qua hạt. Do đó
muốn nhân các cây chuyển gen trong trường hợp này phải nhân vô tính.
5.2.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens được
xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa
vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium.
VI. VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ QUÁ TRÌNH
CHUYỂN GEN TỰ NHIÊN VÀO THỰC VẬT

6.1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Vào những năm đầu thế kỷ XIX, người ta đã nhận thấy ở một số cây
hai lá mầm xuất hiện những nốt sần hay khối u và đã phân lập được một loài
vi khuẩn và đặt tên cho chúng là Agrobacterium tumefaciens (sau đó người ta
tìm thấy một loại vi khuẩn Agrobacterium gây bệnh rễ tơ ở thực vật, đó là vi
khuẩn A. rhizogenes, chúng làm mất khả năng điều khiển sự phát triển của rễ
dẫn đến sự tăng sinh khối và phân nhánh cao tạo ra rất nhiều rễ tơ (còn gọi là
bệnh rễ tóc) gọi là vi khuẩn A. rhizogenes [3].
Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, là vi khuẩn yếm khí
gram âm. Chi này có ba loài sau: A. Radiobacter, A. rhizogenes, A.
tumefaciens [1] [7] [25].
Qua nhiều công trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định, ở
những tế bào của cây bị tổn thương, A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm
và kích thích tạo khối u tại vị trí đó. Các khối u là nơi cư trú và cung cấp các
chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của A. tumefaciens trong
tế bào thực vật.
Khi phân tích khối u, người ta thấy trong nó có các chất lạ chưa hề có
trong đó như các acid amin lạ: octopin, nopalin. khối u không ngừng phát
triển kể cả khi diệt hết vi khuẩn. Như vậy, chứng tỏ vi khuẩn đã chuyển vào
17
trong cây một tác nhân gây khối u và sản sinh ra vật chất lạ, tác nhân có bản
chất là vật chất di truyền. Khi nghiên cứu vi khuẩn này, người ta thấy trong
vi khuẩn có chứa một plasmid có kích thước lớn mà nếu xử lí vết thương
cho cây bằng vi khuẩn không chứa plasmid thì không gây khối u, còn nếu
chữa vết thương bằng vi khuẩn có chứa plasmid thì gây ra khối u. Như vậy
có thể nói plasmid chính là tác nhân gây khối u và sản sinh ra vật chất lạ do
vi khuẩn chuyển vào, plasmid này được gọi tên là Ti-plasmid (tumor
inducing plasmid)
Sự hình thành khối u xảy ra ở nhiệt độ từ 28
0

C - 30
0
C, trùng với nhiệt
độ chuyển plasmid trong quá trình tiếp hợp của vi khuẩn. Khả năng tạo khối
u bị mất đi khi vi khuẩn sinh trưởng ở 36
0
C. Người ta cũng phát hiện thấy
khả năng gây độc của vi khuẩn mất đi cùng với sự biến mất của một plasmid
cỡ lớn, plasmid gây tạo khối u hay Ti-phlasmid (Walden R, 1988) [25].
6.2 Ti-plasmid và quá trình gây tạo khối u bởi Agrobacterium
tumefaciens
Ti-plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, kích thước khoảng 200kb,
phân tử lượng của nó sấp xỉ 1,2.10
8
tức bằng 3 - 5% NST vi khuẩn. Trong tế
bào thực vật chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Ti-plasmid ở các
chủng Agrobacterium khác nhau đều có bốn vùng tương đồng (Swapan K.
Datta et.al, 1997; (Walden R, 1988) [24] [25].
- Vùng có liên quan đến sự tái bản
- Vùng liên quan đến sự tiếp hợp.
- Vùng gây độc hay còn gọi là vùng vir (Virulen region).
- Vùng T-DNA.
Qúa trình gây tạo khối u có liên quan trực tiếp đến hai vùng T-DNA và
vùng gây độc (vùng vir).
6.2.1 Vùng T-DNA
Vùng T-DNA là vùng được chuyển vào tế bào thực vật và gây nên các
khối u thực vật. Có hai hệ gen tồn tại trên T-DNA là:
18
- Hệ gen thứ nhất quy định quá trình sinh tổng hợp các chất kích thích
sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Khi các gen này được dịch mã sẽ

dẫn đến sự phân chia các tế bào một cách liên tục do nồng độ auxin và
cytokinin tăng lên, gây ra khối u.
- Hệ gen thứ hai quy định quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây la
các acid amin lạ có nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong
tế bào bình thường. Cac opine này được phân giải nhờ các enzym do gen
nằm trên Ti-plasmid quy định và được sử dụng làm nguồn dinh dưỡng nitơ
và cacbon cho vi khuẩn. Dựa vào các opine ta có các chủng A.tumefaciens
khác nhau [25]:
- Chủng tạo octopine.
- Chủng tạo nopaline.
- Chủng tạo succinamopine hoặc L-succinamopine.
T-DNA được giới hạn bởi hai bờ phải (Right border) và bờ trái (left
border). Hai bờ có cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ. Chỉ những đoạn
DNA nằm giữa hai bờ mới được chuyển vào tế bào thực vật, còn hai bờ phải
và bờ trái là những yếu tố cần thiết cho sự chuyển DNA. Tuy nhiên, quá trình
chuyển T-DNA lại do vùng gây độc quy định [25].
6.2.2 Vùng gen vir
Vùng vir dài 35kb mang các gen gây độc. Vùng này bao gồm gen vir
A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir G (một số chủng còn có vir F). Trong đó gen
vir A, vir B, vir D, vir G cần thiết cho tạo độc tính [25]. Hoạt động của gen
vir giúp T-DNA này ra khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào thực vật.
Sự biểu hiện của các gen vùng vir là một quá trình sinh hoá phức tạp ma
các tác nhân đầu tiên tác động đến nó là hợp chất phenolic. Với những đặc tính
này A.tumafaciens được sử dụng như một vectơ để chuyển gen vào cây [24].
6.3 Các vectơ chuyển gen và quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật
Cấu trúc của vectơ chuyển gen vào thực vật là đặt các gen mong muốn
vào môi trường di truyền và vi khuẩn thích hợp để chuyển gen mong muốn
19
nào vào cây và hợp nhất với bộ gen của cây chủ. Một vectơ chuyển gen cần
chứa các thành phần sau:

- Gen khởi động (thường có nguồn gốc từ thực vật hoăc liên quan trực
tiếp với thực vật như CaMV)
- Một đoạn gen kết thúc (như NOS-terminater).
- Đoạn chịu trách nhiệm cho quá trình tái bản như EColR1.
- Đoạn nhận biết enzym gới hạn (Multicloning Site).
- Các gen chỉ cho phép chọn lọc tế bào vi khuẩn và các mô tái sinh
thực vật.
Các vectơ chuyển gen ở vi khuẩn A.tumefaciens được tạo ra nhờ gắn
trực tiếp một gen quan tâm vào giữa hai bờ của T-DNA, là những đoạn cần
thiết để định hướng cho quá trình chuyển gen [25].
Một cơ sở quan trọng giúp cho kỹ thuật này phát triển là nhờ cấu trúc 2
bờ phải và trái của Ti-plasmid, là yếu tố cần thiết cho quá trình xâm nhập của
T-DNA vào tế bào chủ. Điều này có nghĩa rằng nếu thay thế các gen nằm
trên T-DNA bằng những gen mong muốn thì chúng cũng có thể chuyển vào
tế bào thực vật. Hơn nữa, khi những gen tổng hợp các chất kích thích sinh
trưởng trên T-DNA bị loại bỏ, tế bào được biến nạp sẽ không sinh sản quá
nhanh và khối u không hình thành. Tuy nhiên, những tế bào này có khả năng
tái sinh và phát triển bình thường.
Bên cạnh đó, dãy vật chất của Agrobacterium có phổ rất rộng, nó có
khả năng xâm nhập vào hầu hết các loại cây hai lá mầm. Hơn nữa các gen
trên T-DNA được di truyền theo quy luật Mendel và mỗi gen có promoter
riêng nên các gen ngoại lai đưa vào có thể kết hợp và được biểu hiện [3].
Các hệ thống vectơ dựa trên Ti-plasmid đã được nhiều phòng thí
nghiệm trên thế giới nghiên cứu và phát triển theo cách riêng, hiện nay chúng
vẫn đang được cải tiến nhằm mang lại hiệu quả tối ưu. Tuy nhiên có thể chia
chúng thành hai nhóm chính.
20
6.3.1. Vectơ liên hợp (co-integrate vector)
Vectơ hợp nhất hay còn được gọi là cis vectơ, được thiết kế dựa trên
Ti-plasmid nhưng phần lớn vùng T-DNA bị loại bỏ (thường là vùng gen gây

ung thư) và thay thế vào đó là một đoạn DNA mới. Vectơ này không có khả
năng gây tạo khối u do không còn vùng gen quy định sinh tổng hợp auxin và
cytokinin nhưng vẫn còn chức năng chuyển gen do còn giữ lại hai bờ cần
thiết cho quá trình chuyển.
Để đưa DNA ngoại lại vào giữa hai bờ của T-DNA cần sử dụng một
vectơ trung gian. Vectơ này có khả năng hoat động trong E.coli và có một
vùng tương đồng với vùng nằm giữa hai bờ của T-DNA. Nó được chuyển từ
E.coli sang Agrobacterium thông qua sự tiếp hợp. Trong Agrobacterium các
plasmid không có điểm khởi đầu sao chép phù hợp sẽ bị đào thải. Nếu giữa
vectơ trung gian và vectơ liên hợp xảy ra sự tái tổ hợp, chúng sẽ được giữ lại
trong Agrobacterium và bằng cách sử dụng các dấu chuẩn di truyền thích hợp
như kháng sinh để xác định tái tổ hợp [3].
6.3.2 Vectơ nhị phân (binary vector)
Điểm khác biệt của hai vectơ chuyển gen là hai vùng T-DNA và vùng
gen vir tồn tại trên hai vùng ptasmid khác nhau, sao chép một cách độc lập
với nhau. Ưu điểm của vectơ này là không cần đến tái tổ hợp in vivo nên quá
trình biến nạp có hiệu quả hơn và nhanh hơn.
* Hệ thống này gồm hai plasmid [25]:
- Một plasmid có khả năng sao chép ở cả E.coli và Agrobacterum vì
mang điểm khởi đầu sao chép có dãy vật chủ phổ rộng. Phần mang gen gây
khối u đã bị loai bỏ và không chứa các gen vir. Sau khi sản xuất trong E.coli,
các vectơ này được chuyển vào Agrobacterium thông qua quá trình tiếp hợp.
- Một plasmid khác nằm trong Agrobacterum là Ti-plasmid bị loại bỏ
hoàn toàn vùng T-DNA và hai bờ ranh giới, chỉ giữ lại vùng vir cần thiết
đóng vai trò như một plasmid trợ giúp cung cấp các sản phẩm gen vir cho
quá trình chuyển gen từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật. Một vài vectơ
21
nhị phân không bền vững trong Agrobacterium và để duy trì vi khuẩn phải
được nuôi trong điều kiện chọn lọc.
Hệ thống vectơ được phát triển đầu tiên là pGV3850, môt loai vectơ

liên hợp. pGV3850 là 1 Ti-plasmid nopaline C58, vẫn mang các gen vir và
vùng trình tự hai bờ của T-DNA, nhưng phần lớn các gen nằm trên vùng T-
DNA đã bị loại bỏ và thay vào đó là trình tự của pBR 322. Như vậy, các gen
ta mong muốn khi bị tách dòng trong pBR 322 và được đưa vào
Agrobacterium sẽ có thể hợp nhất với từng vùng T-DNA của pGV3850 [25].
Ngoài ra còn có pGV1103 [25], pGV2260, pGV181[3].
Một hệ thống vectơ liên hợp khác là SEV (split-end vector) được thết
kế dựa trên pTi B653 cũng hay được sử dụng [3].
Vectơ nhị phân như pBin 19 có nguồn gốc từ pRK252 có thể sao chép
trong cả E.coli và Agrobacterium. Vectơ này mang hai gen kháng kanamicin,
một gen hoạt động trong vi khuẩn, gen kia biểu hiện trong tế bào thực vật.
Khi DNA ngoại lai được đưa vào vị trí nằm trong đoạn gen lac Z, gen lac Z
không tổng hợp được B-galactosidase, nhờ đó phát hiện được dòng tái tổ hợp
khi nuôi vi khuẩn trên môi trường có X-Gal và IPTG [25]. Ngoài ra còn có
pBSG1, pBSG2, pVSG2 [21].
6.3.3. Quá trình chuyển T- DNA vào tế bào thực vật
Khi các tế bào thực vật bị thương, chúng sẽ tiết ra các hợp chất
phenolic như acetosyringone, α-acetosyringone. Các hợp chất phenolic là
chất dẫn dụ hoá học với vi khuẩn, kích thích vi khuẩn kết bám lên bề mặt tế
bào thực vật. Vi khuẩn sẽ được gắn vào các vị trí đặc trưng trên bề mặt tế
bào, quá trình này còn được sự trợ giúp của các gen vir nằm trên nhiễm sắc
thể gọi là gen ChV (chrromosome virulence) [3].
Quá trình chuyển T-DNA là do các sản phẩm của gen vir quy định.
Đầu tiên, acetosyringone hoạt hoá gen vir A để tổng hợp nên protein vir A.
Protein vir A hoạt động như một chất thụ cảm hoá học, truyền tín hiệu cho
protein vir G nhờ sự photphoryl hoá. Protein vir G điều khiển quá trình dịch
22
mã của các gen vir B, vir C, vir D, vir E. pH môi trường có ảnh hưởng mạnh
mẽ đến cảm ứng gen vir. Sự cảm ứng đó tối ưu ở pH 5,0 – 5,4 và không xảy
ra ở pH ≥ 6,3 [25]. Các phân tử đường cũng tham gia hỗ trợ cho các phức

hợp phenolic làm tăng cường biểu hiện của các gen vir [3].
Tiếp theo đó, T-DNA sợi đơn kể cả hai bờ ranh giới được hình thành
nhờ sự cắt giới hạn của endonuclease vir D2 tại vị trí thứ ba và thứ tư tính từ
trái sang ở bờ phải, đoạn T-DNA luôn được tách ra khỏi Ti-plasmid và
chuyển từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Đoạn DNA còn lại trên Ti-plasmid sẽ
làm khuôn để tổng hợp nên mạch DNA bổ trợ mới theo chiều 5
’-
3
’
.
Protein vir D2 còn có thêm chức năng nhận biết nhân của tế bào thực
vật. Hệ gen vir B mã hoá cho 11 protein có tác dụng kết hợp với màng tế bào
thực vật và định vị tại đó để hình thành cầu nối vận chuyển phức hợp protein-
T-DNA. Như vậy, cấu trúc màng tế bào thực vật bị thay đổi trong suốt quá
trình phức hợp protein-T-DNA đi qua [3].
Sau khi đã qua màng tế bào, T-DNA sẽ được chuyển đến nhân và kết
hợp với DNA trong nhân của tế bào vật chủ ở những vị trí ngẫu nhiên và
được biểu hiện nhờ sự điều khiển của hệ gen vật chủ [25]. Ngoài ra, người ta
còn xác định được rằng các gen nằm trên T-DNA di truyền qua các thế hệ
tuân theo qui luật Menden và cho rằng quá trình chuyển T-DNA là sự cải
biên của cơ chế tiếp hợp vi khuẩn [3].
6.4. Một số yêu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen và tái sinh cây
chuyển gen
Quá trình chuyển gen nhờ Agrobacterium có tần số biến nạp khá cao,
các cây chuyển gen thu được tương đối dễ. Tuy nhiên hiệu quả nay phụ thuộc
vào nhiều yếu tố. Các cây hai lá mầm phù hợp với quá trình này hơn các cây
một lá mầm [24]. Hiệu quả biến nạp ở các mô khác nhau biểu hiện sự tiếp
nhận gen ngoại lai cũng khác nhau (các mô phân sinh dễ biến nạp hơn). Ở
cây cà chua (giống seeda) các mô lá mầm cho hiệu quả biến nạp cao hơn gấp
6 lần mô lá.

23
Thời gian tái sinh cây trên mô lá mầm là từ 2 - 3 tuần, từ mô lá là 4 - 6
tuần. Số lượng cây tái sinh từ mô lá mầm là 1 - 10 cây/mô, trên mô lá là 1-5
cây/mô trong cùng một điểu kiện nuôi cấy (Lã Tuấn Nghĩa và cs, 1995) [11].
Các mô dùng trong biến nạp cần phải vô trùng, vì vậy nó thường được
thu từ cây con nảy mầm trong điểu kiện vô trùng hoặc nhận từ các chồi nhân
giống vô trùng. Do đó, ta không cần khử trùng bề mặt mô, tránh được ảnh
hưởng không tốt cho quá trình tái sinh. Các mô sử dụng trong quá trình biến
nạp phải đáp ứng hai điều kiện là hiệu quả biến nạp và sự tái sinh phải cao.
Quá trình xử lý mô trước khi ngâm vào huyền phù vi khuẩn cũng rất quan
trọng. Mô lá ở cây thuốc lá có thể đáp ứng biến nạp và tái sinh cao ngay sau
khi tạo vết thương. Các mô lá mầm cây cà chua được nuôi trên môi trường
kích thích sự phân bào và giảm tạo phenol sẽ có lợi hơn [6].
Công thức môi trường Anders (1975) cải tiến có chứa 30g/l đường,
4g/l agar, 15-20μM BAP, 8-10μM IAA, 15% nước dừa và các hợp chất Myo-
inositol, PVP đã được nghiên cứu có khả năng tạo cụm chồi nhiều chất cho
hai giống bắp cải CB26 và CB1 chuyển gen GUS và gen Bt kháng sâu [8].
Sự lây nhiễm Agrobacterium có thể được cải tiến, bằng cách thêm các
chất cảm ứng như Acetosyringone, đường vào môi trường nuôi cấy. Khi
nghiên cứu sự ảnh hưởng của Acetosyringone đến hiệu quả chuyển gen ở
giống lúa DT10 ở các nồng độ 100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM.
Trần Bích Lan và cộng sự đã nhận thấy ở nồng độ 400μM thì hiệu quả biến
nạp cao nhất (45,1%) còn ở nồng độ 500μM chỉ đạt 16%, thấp nhất (Trần
Bích Lan và cs 1998) [7].
Sau khi biến nạp cần ức chế sự biến nạp của Agrobacterium bằng các
kháng sinh như cefotaxime 300mg/l, carbenicilin 500mg/l, claforan
350mg/l để ức chế sự phát triển của vi khuẩn vì sự phát triển của vi khuẩn
có thể gây chết các mô biến nạp. Những cây biến nạp sẽ được chọn lọc trên
môi trường có chứa kháng sinh [7].
24

6.5. Chuyển gen vào lúa nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm. Ban
đầu, những cố gắng trong việc tái sinh callus lúa chuyển gen thông qua
Agrobacterium không thành công (Raineri và cs, 1990) [6], ngay sau đó
vấn để này được khắc phục với những callus lây nhiễm với Agrobacterium
được sinh ra từ mô rễ (Chan và cs, 1992) và phôi chưa trưởng thành (Chan
và cs, 1993) [6].
Gần đây, bước ngoặt trong nghiên cứu chuyển gen lúa thông qua
Agrobacterium được đánh dấu bởi công trình nghiên cứu của Smith và Hood
(1995); Komari và cs, (1996); Hiei và cs (1997) [6]. Trong công trình nghiên
cứu của Hiei và cs, tác giả đã thiết kế thành công vectơ đặc hiệu có tên gọi:
Vectơ Super-binary. Đặc điểm của vectơ này là đã được bổ sung gen vir.
Chính sự thay đổi này làm tăng hiệu quả chuyển gen vào lúa japonica. Các
callus từ vỏ phôi và dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 là
thích hợp nhất cho chuyển gen lúa thông qua Agrobacterium. Ngoài ra việc
sử dụng acetosyringone và điều kiện nhiệt độ từ 22 - 28
o
C sau quá trình lây
nhiễm (Cocultivation) cũng được xem là nhân tố quan trọng trong việc nâng
cao hiệu suất chuyển gen. Các phân tích di truyền và phân tử trên số lượng
lớn các cây chuyển gen ở thế hệ thứ 3 đã được chứng minh [6].
Bước ngoặc thứ hai trong nghiên cứu chuyển gen lúa thông qua
Agrobacterium được đánh dấu bởi công trình của Komari và cs, (1996). Ở
công trình này, một plasmid đặc hiệu mang hai đoạn T-DNA riêng biệt một
gen đánh dấu không chọn lọc (Gus), một mang gen đánh dấu chọn lọc (hpt)
đã được tạo ra. Các plasmid này đã được sử dụng cho việc tạo ra các thế hệ
thực vật chuyển gen mang các gen đánh dấu tự do. Hiệu suất chuyển của
đoạn T-DNA là 47% chứng tỏ sự ưu việt của loại vectơ đặc hiệu này. Sự gắn
và sự phân bố riêng biệt của các đoạn T-DNA trong hệ gen thực vật đã được

khẳng định bằng các phân tích phân tử. Hiệu quả của việc chuyển các đặc
25