Nghiên cứu mô bệnh học của cá trắm cỏ (ctenopharyngodon idella) bị nhiễm khuẩn

MỤC LỤC
PHẦN I MỞ ĐẦU 3
1.1 Đặt vấn đề 3
1.2 Mục đích nghiên cứu 4
1.3 Nội dung nghiên cứu 4
PHẦN II TỔNG QUAN KHOA HỌC 5
2.1 – Tình hình nghiên cứu bệnh đốm đỏ 5
2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5
2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7
2.1.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 8
2.2. Cấu tạo một số cơ quan trong cơ thể cá 10
2.2.1. Mang 10
2.2.2. Gan 11
2.2.3. Thận 13
2.2.4. Lách 15
2.2.5. Mạch và tế bào máu 16
PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.1. Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 18
3.1.1. Thời gian 18
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu 18
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu 18
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18
3.2.1. Vật liệu 18
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu 19
3.2.2.1 Thu mẫu 20
3.2.2.2 Cố định và bảo quản mẫu 20
3.2.2.3 Xử lý mẫu 20
3.2.2.4 Đúc Parafin 21
3.2.2.5 Cắt mẫu 22
3.2.2.6 Nhuộm màu 22
3.2.2.7 Đọc kết quả 23

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Kết quả kiểm tra mẫu 24
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn 27
4.3. Kết quả kiểm tra mô học 28
4.3.1. Mô mang 30
4.3.2. Mô gan 33
4.3.3. Mô thận 35
4.3.4. Mô lách 37
4.3.5. Mô máu 39
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41
5.1. Kết luận 41
5.2. Đề nghị 41
PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) là một trong những loài cá truyền
thống đang được nuôi rộng rãi và mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt là đối
với các mô hình nuôi cá nước ngọt ở miền Bắc nước ta. Nhiều năm qua, nghề
nuôi cá trắm cỏ đang bị đe dọa bởi dịch bệnh đốm đỏ và xuất huyết liên tục xảy
ra mà chưa có biện pháp khống chế hiệu quả. Các kết quả nghiên cứu bước đầu
về bệnh cá trắm cỏ ở Việt Nam cho thấy hầu hết các trường hợp bị bệnh đều do
nhiễm khuẩn là chủ yếu (tỷ lệ nhiễm lên đến 80 – 100%) đặc biệt là với bệnh
đốm đỏ, trong khi rất hiếm trường hợp phân lập được virus. Tỷ lệ chết ở bệnh
đốm đỏ khoảng 30 – 50% nhưng bệnh rất dễ bùng phát do môi trường nuôi
không đảm bảo [3]. Các nhà khoa học cũng đã phân biệt được bệnh xuất huyết là
do virus (Reovius) còn bệnh đốm đỏ là do vi khuẩn (chủ yếu là Aeromonas
hydrophia, A. sorbia, Pseudomonas spp) và đưa ra nhiều biện pháp phòng trị [8].
Tuy nhiên dịch bệnh vẫn xuất hiện với mật độ ngày càng cao và tỷ lệ thiệt hại
giảm không đáng kể. Điều bất cập là các triệu chứng lâm sàng lại tương tự ở
bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus cũng như giữa các chủng vi khuẩn khác nhau

dẫn đến những khó khăn khi nghiên cứu bệnh. Ngoài việc thiếu phương tiện kỹ
thuật thì phương pháp chẩn đoán bệnh chưa hoàn thiện cũng là nguyên nhân
quan trọng dẫn đến tình trạng trên.
Phương pháp mô bệnh học (Histopathological method) có vai trò quan
trọng trong việc tìm hiểu những biến đổi mô học đặc trưng dưới ảnh hưởng của
các tác nhân gây bệnh, từ đó xác định được nguyên nhân gây bệnh (vi khuẩn,
virus, nấm, kí sinh trùng…). Vì vậy tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu mô bệnh
học của cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) bị nhiễm khuẩn” nhằm mô tả
các biến đổi tổ chức mô ở một số cơ quan trên cá bị nhiễm khuẩn, từ đó phân
biệt với những biến đổi do tác nhân khác, góp phần chẩn đoán chính xác triệu
chứng, bệnh tích, nguyên nhân và hoàn thiện quy trình phòng trị bệnh trên cá
trắm cỏ.
1.2 Mục đích nghiên cứu
- Tìm hiểu cấu tạo tổ chức mô một số cơ quan (mang, cơ, gan, thận, lách) của
cá bình thường
- Tìm hiểu sự biến đổi tổ chức mô của các cơ quan trên ở cá trắm cỏ bị nhiễm
khuẩn
- Kết quả thu được góp phần làm tài liệu tham khảo cho những nghiên cứu
sau này
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Làm tiêu bản mô cá trắm cỏ bình thường (có kết quả âm tính khi xét
nghiệm vi khuẩn gây bệnh) và cá trắm cỏ bị nhiễm khuẩn (kết quả dương tính
khi xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh)
- Quan sát và mô tả những biến đổi tìm thấy
- Tập hợp kết quả nghiên cứu thành bộ sưu tập mẫu mô của cá trắm cỏ làm
tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu khác

PHẦN II
TỔNG QUAN KHOA HỌC
2.1 – Tình hình nghiên cứu bệnh đốm đỏ
2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Từ lâu trên thế giới đã có những báo cáo về bệnh ở cá trắm cỏ và mức độ
thiệt hại gây ra. Năm 1970, bệnh bắt đầu được phát hiện và gọi chung là bệnh
đốm đỏ. Năm 1971, bệnh xuất hiện ở Indonesia trên cá trắm cỏ sau đó lây sang
hầu hết các loài cá nước ngọt khác và lan rộng ra 11 tỉnh trong cả nước (1996)
gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi thủy sản ở nước này. Tháng 3/1972
bệnh xuất hiện ở miền Trung Queensland (Úc) trên cá sông với các vết loét rộng
trên thân và gọi là bệnh “Bundabery”, sau đó phát triển rộng sang Papua New
Guinea và Tây Úc. Nhiều loài cá nước ngọt khác cũng bị nhiễm (Rodger và
Burker, 1981). Trong những năm 1982 – 1983 bệnh gây thiệt hại khoảng 200
triệu bạt ở Thái Lan (Tonguthai, 1985). Ảnh hưởng của dịch bệnh đã khiến hơn
250 triệu gia đình trong khu vực châu Á sống bằng nghề trồng lúa và nuôi cá
ruộng có nguy cỏ bỏ nghề [2]. Đến năm 1986, hội thảo của các chuyên gia về
dịch bệnh của cá đã chính thức gọi bệnh này là “hội chứng dịch bệnh lở loét”.
Dịch bệnh còn lan sang các nước châu Á khác như Myanma, Lào, Campuchia,
Bangladesh, Nhật Bản, Srilanca… thiệt hại ước tính lên đến hàng triệu đô la [2].
Trước tình hình đó, các nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm và có những
nghiên cứu về dịch bệnh. Do đặc tính lan nhanh và phạm vi tác hại rộng nên các
nhà nghiên cứu đã đi đến kết luận rằng nguyên nhân cơ bản của bệnh là tác nhân
truyền nhiễm sinh học. Vì thế trong quá trình nghiên cứu, các tác nhân vi khuẩn,
virus, nấm, kí sinh trùng đều được đề cập đến.
Những nghiên cứu về môi trường cho thấy bệnh có tính đặc trưng theo

mùa (Rodger và Burke, 1981), và liên quan chặt chẽ tới sự nở hoa của thực vật
phù du [2]. Nhiệt độ nước cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sức đề kháng
và khả năng nhiễm bệnh của cá; đồng thời liên quan trực tiếp đến sự tăng trưởng
và phát triển của A. hydrophila – vi khuẩn được coi là tác nhân chính gây bệnh
đốm đỏ lở loét ở cá. Ngoài ra, pH, hàm lượng chất thải hóa học, thuốc trừ sâu,
nồng độ ion Cl
-
, độ cứng… đều có liên quan đến sự xuất hiện bệnh [2].
Khi nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, Reung Prach và cộng tác viên đã kết
luận rằng không có mối quan hệ trực tiếp nào giữa ký sinh trùng và cá bệnh [2].
Tại các vết loét, Mc Kenzie và Hall (1976) đã phân lập được dạng nấm sợi
không màu, phân đốt. Hai loại nấm Saprolegnia và Achlya sp cũng liên quan đến
hội chứng lở loét ở cá nhưng không phải là tác nhân gây bệnh ban đầu [2].
Người ta còn tìm thấy nấm Alphanomyces piscisida trên cá bị đốm đỏ ở Úc. Đây
cũng chính là tác nhân chính gây ra hội chứng lở loét trên nhiều loài cá ở Thái
Lan, vì thế mà đôi khi bệnh đốm đỏ trên cá trắm cỏ bị nhầm với hội chứng lở
loét EUS, nhưng cá trắm cỏ lại ít nhạy cảm với tác nhân này (Supranee, 1999).
Sau nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học Trung Quốc đã phát hiện ra
rằng trên cá nước ngọt có hai loại bệnh: bệnh xuất huyết do virus và bệnh đốm
đỏ do vi khuẩn. Tác nhân gây bệnh xuất huyết là Reovirus dạng hạt nhỏ, nhân là
ADN (Zonglin và ctv, 1991) còn ở Thái Lan và Myanma lại phân lập được
Rhapdovirus, thế nhưng các đợt dịch bệnh gần đây không tìm thấy tác nhân này
[2]. Sự có mặt của virus có thể là hoàn toàn ngẫu nhiên và nó không tham gia
vào dịch bệnh [2].
Nguyên nhân gây bệnh đốm đỏ được cho là do vi khuẩn đã được đưa ra từ
đầu thế kỷ XX (Plehn, 1904). Người có nhiều đóng góp và phát triển quan điểm
này là Schaperclaus (1954, 1958, 1964, 1966, 1979); ông đã cho rằng nguyên
nhân gây bệnh đốm đỏ là Pseudomonas spp, A. punctata và có thể có vai trò của
virus trong dịch bệnh này. Trong các trường hợp nhiễm khuẩn, phần lớn cá chết
do một loại vi khuẩn đơn độc gây ra, liên quan đến các vết loét hoại tử và đó là

nguyên nhân cuối cùng gây chết cá [2]. Năm 1981, Rodger và Burke đã phát
hiện ra vi khuẩn gây bệnh đốm đỏ trên cá sông ở miền Trung Queensland là
Vibrio anguillarum. Hai ông cũng chỉ ra rằng các vi khuẩn A. hydrophila, A.
sobria, Pseudomonas spp, Flavobacterium sp và Vibrio spp là những nguyên
nhân gây nhiễm trùng thứ cấp nặng. Còn ở Trung Quốc các chuyên gia về bệnh
đã phân lập được Pseudomonas spp ở cá trắm cỏ, trắm đen bị bệnh [9]. Năm
1989, Roberts đã phân lập được A. hydrophila ở cá bệnh thuộc khu vực Ấn Độ -
Thái Bình Dương. Ông cho rằng đó là vi khuẩn gây bệnh đơn độc quan trọng
nhất nhưng không có vai trò gây nhiễm ở giai đoạn đầu của bệnh [2]. Trên cá
trắm cỏ và trắm đen bị bệnh, Hồ Bắc [15] đã phân lập được A. punctata. Như
vậy mặc dù không phải là tác nhân gây bệnh ban đầu nhưng vi khuẩn được coi là
nguyên nhân gây chết ở cá bị đốm đỏ nặng [2].
2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh đốm đỏ bắt đầu được phát hiện lần đầu vào năm 1962
trên cá trắm cỏ và một số loài khác trong họ cá chép (Hà Ký, 1995). Theo báo
cáo của Bùi Quang Tề, trong những năm 1973 – 1976 dịch bệnh xuất hiện ở
đồng bằng sông Cửu Long gây thiệt hại nghiêm trọng. Đến năm 1981, bệnh xuất
hiện ở miền trung Nghệ Tĩnh sau đó lan rộng sang các vùng khác. Từ tháng
11/1987 – 4/1988, trên sông Đà có 80/100 lồng bị nhiễm bệnh. Tháng 2/1992 ở
Hòa Bình có 42/43 lồng nuôi bị bệnh. Từ năm 1994 đến nay dịch bệnh đã xuất
hiện ở hầu hết các đàn cá bố mẹ của các trại sản xuất giống từ Đồng Nai trở ra
Bắc (Hà Ký, 1995). Như vậy dịch bệnh đã lan rộng và xuất hiện với mật độ ngày
càng cao mà chưa có biện pháp khống chế hiệu quả.
Do những biểu hiện bên ngoài tương tự nhau ở bệnh do virus và bệnh do
vi khuẩn mà đã có nhiều ý kiến khác nhau về nguyên nhân gây bệnh đốm đỏ ở cá
trắm cỏ. Năm 1973 – 1974 Nguyễn Văn Thành cho rằng nguyên nhân gây bệnh
là vi khuẩn A. punctata. Năm 1992, Bùi Quang Tề và các cộng sự đã phân lập
được hai nhóm vi khuẩn trên cá bệnh: nhóm 1 có đặc điểm tương tự A. punctata
và nhóm 2 có đặc điểm tương tự A. hydrophila. Mặt khác ông cũng cho rằng tác
nhân gây bệnh đốm đỏ có thể là virus nhưng chưa có kết luận chính xác. Theo

kết quả thu mẫu trên sông Hồng, sông Đuống ngoài A. hydrophila còn gặp
Pseudomonas spp và nấm thủy mi Saprolegnia sp ký sinh trên các vết loét của cá
bệnh. Kết quả thu mẫu tại Cổ Loa, Toàn Thắng, Gia Lâm cũng tương tự như vậy.
Tiếp tục nghiên cứu sâu về vấn đề này, các nhà nghiên cứu ở Viện NCNTTS I đã
kết luận rằng bệnh xuất huyết là do Reovirus còn bệnh đốm đỏ lở loét là do vi
khuẩn, chủ yếu là A. hydrophila, chỉ có một mẫu phân lập được nấm Saprolegnia
diclina và không tìm thấy mẫu mô cơ cá có nấm Alphanomyces piscisida – tác
nhân chính gây hội chứng lở loét EUS (Phan Thị Vân và ctv, 2006). Như vậy A.
hydrophila là tác nhân gây bệnh đốm đỏ lở loét ở cá trắm cỏ, mặt khác bệnh đốm
đỏ ở cá trắm cỏ không phải là hội chứng lở loét EUS.
2.1.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Ngành Bacteria
Lớp Schizomycetes
Họ Vibrionaceae
Giống Aeromonas
Loài Aeromonas hydrophila
A. hydrophila là vi khuẩn Gram (-), dạng que ngắn, hai đầu hơi tròn, kích
thước 0.5 x 1.0 – 1.5 µm. Vi khuẩn vận động nhờ có một tiêm mao, sống yếm
khí tùy tiện [16].

Hình 1,2. Vi khuẩn A.hydrophila [22]
A. hydrophila sống tự do và có mặt thường xuyên trong nước, đặc biệt có
nhiều trong các thủy vực có mật độ tảo cao (Geldreich, 1974). Giống như một
tác nhân cơ hội, vi khuẩn này gây bệnh cho nhiều loài cá nước ngọt và nước lợ.
A. hydrophila được phân lập trên cá hồi nước ngọt và ếch và là nguyên nhân gây
ra bệnh “chân đỏ” (Reed và Toner, 1942). Khi mức độ stress của môi trường quá
cao (nhiệt độ cao, mật độ quá dày, nước nghèo oxy hòa tan và lượng chất thải
hữu cơ nhiều) làm cho sức đề kháng của cá yếu đi, vi khuẩn sẽ xâm nhập và gây
ra hiện tượng nhiễm trùng máu, chướng bụng, xuất huyết. Vi khuẩn này có thể
kết hợp với các tác nhân khác, thậm chí là với loài Aeromonas khác. Chúng tiết

protein ngoại bào có khả năng dung giải rất mạnh và đây là nguyên nhân chính
tạo nên khả năng gây bệnh đốm đỏ trên cá trắm cỏ (Vũ Dũng Tiến và ctv, 2003).
Triệu chứng bệnh thường thấy là xuất hiện các vết loét trên thân, vùng cơ quanh
chỗ loét bị tấy đỏ, tuột vảy. Cơ bị hoại tử sau đó vết loét lan rộng và có thể ăn
sâu vào xương. Vi khuẩn tồn tại trong máu gây ra hiện tượng nhiễm trùng máu
thứ cấp. Các lát cắt mô học cho thấy mô bị hoại tử và có nhiều khuẩn lạc vi
khuẩn cùng với các tế bào bị viêm. Kiểm tra hóa mô còn tìm thấy sự có mặt của
các men Protease, Hemolysin, Leucocidin do vi khuẩn tạo ra. Protease và
Hemolysin tiêu hóa mô và phá hủy hồng cầu, còn Leucocidin là một dạng ngoại
độc tố mà vi khuẩn tiết ra để tiêu diệt bạch cầu bị viêm [22].
Khi gây nhiễm trên cá trắm cỏ, có khoảng 36.4 – 100% số cá bị nhiễm, tỷ lệ
chết 40% và chủ yếu xảy ra ở cá trên một năm tuổi. Kết quả cảm nhiễm 100% cá
nhiễm A. hydrophila. Chúng được coi là tác nhân chính gây bệnh đốm đỏ lở loét
trên cá trắm cỏ ở Việt Nam [8].
2.2. Cấu tạo một số cơ quan trong cơ thể cá
Khi nghiên cứu mô bệnh học của cá, trước hết cần phải hiểu cấu tạo các cơ
quan trong cơ thể cá bình thường, nhờ đó mới có thể phát hiện ra những biến đổi
khác thường khi kiểm tra các lát cắt mô bệnh dưới kính hiển vi. Trong phạm vi
nghiên cứu, đề tài chỉ đề cập đến cấu tạo sơ lược của mô mang, gan, thận, lách,
mạch và tế bào máu – là những cơ quan có biến đổi đặc trưng khi nhiễm khuẩn.
2.2.1. Mang
Mang là cơ quan hô hấp của cá. Bên ngoài mang là xương nắp mang có
nhiệm vụ bảo vệ mang và điều chỉnh sự chuyển động của dòng nước qua tia
mang. Cấu tạo của mang gồm 4 đôi lược mang trải dài từ mép khoang bụng đến
vòm khoang bụng, mỗi lược mang lại gồm hai hàng tia mang, trên mỗi tia mang
là hai dãy tơ mang đối diện với nhau. Các tia mang được bao phủ bởi lớp biểu
mô mỏng, có trụ sụn ở trung tâm và động mạch ly tâm. Các tơ mang được bao
phủ bởi lớp biểu mô mỏng nằm trên lớp màng cơ bản được nâng đỡ bằng các tế
bào trụ. Khoảng không giữa các tế bào trụ gọi là kẽ, nối liền động mạch hướng
tâm với động mạch ly tâm, máu chảy trực tiếp từ động mạch hướng tâm sang động

mạch ly tâm và ngược với hướng dòng nước chảy qua tia mang. Tế bào trụ có khả
năng co lại, thu hẹp đường kính để điều chỉnh lượng máu chảy qua. Thành tơ mang
mỏng với nhiều khe nhỏ giúp cho máu dễ tiếp xúc với môi trường [9].

Hình 3. Tia mang (Formalin, H&E, Bar = 16.7 µm) [9].
1. tia mang; 2. tơ mang; 3. tế bào biểu mô; 4. tế bào tiết nhầy; 5. tế bào trụ; 6. kẽ
(khoang mao mạch); 7. tế bào hồng cầu trong khoang mao mạch; 8. tế bào gốc
chưa biệt hóa; 9. khoang tĩnh mạch trung tâm.
Các loại tế bào tìm thấy trên tia mang và tơ mang bao gồm tế bào sắc tố, tế
bào bạch huyết, tế bào màng trong, tế bào chloride, đại thực bào, tế bào hình gậy,
tế bào tiết nhầy. Tế bào tiết nhầy nằm trên tơ mang, tạo nên lớp phủ ngoài làm
giảm ma sát, ngăn cản sự nhiễm khuẩn, làm tăng tính thẩm thấu thụ động và gia
tăng lưu lượng nước qua mang. Sự thải nhiều urine loãng do việc đào thải nước
qua mức làm gia tăng khả năng mất ion. Tế bào chloride cung cấp vật liệu để
duy trì trạng thái cân bằng ion nội bào tự nhiên. Chức năng của mang là trao đổi
khí, cân bằng acid – base, điều chỉnh ion, thải hợp chất nitro thông qua lớp biểu
mô mang [9].
2.2.2. Gan
Gan là nội quan lớn nhất, bắt nguồn từ các tế bào ruột trong giai đoạn
phôi; nằm ở bụng trước, kéo dài từ phía sau và tạo thành các thùy nhờ những
vòng ruột và bao quanh các nội quan tạo nên hệ thống gan tụy. Màu sắc thay đổi
từ nâu tối đến màu kem, thậm chí là màu vàng tùy vào lượng lipit trong gan và
trạng thái cơ thể. Chức năng của gan bao gồm tiêu hóa dinh dưỡng, sản xuất mật,
giải độc, tạo máu và phá hủy tế bào máu già yếu [9].
Các thùy con hay nhu mô bao gồm các nút tế bào gan bao quanh bởi 3
mạch nối động mạch, tĩnh mạch và ống mật. Khi thu nhỏ bớt mạch máu, chúng
tạo thành các sinusoids – tế bào gan dạng đa diện có nhân ở trung tâm –và các
ống mật tạo thành trung tâm thùy con. Các loại tế bào khác tìm thấy trong nhu
mô gan là mô tạo máu, trung tâm đại thực bào, tế bào biểu mô, tế bào mỡ, tế bào
Kupffer và nguyên bào sợi. Tế bào máu có mặt trong mạch máu và một số bạch

cầu bao quanh mạch. Tế bào gan chứa lipid, glycogen. Sự tạo không bào – có
nguyên nhân từ việc dự trữ glycogen hay chất béo – có thể tạo nên những biến
đổi mô học đáng chú ý. Đại thực bào sắc tố có thể bắt gặp trong nhu mô gan ở
các trung tâm đại thực bào sắc tố (MMC).
Máu tĩnh mạch đi vào phía sau gan từ ruột qua tĩnh mạch rốn gan và mở
rộng các nhánh thành các mao mạch gọi là sinusoids. Sau khi qua sinusoids và
nhập vào tĩnh mạch trung tâm, máu thoát ra khỏi gan nhờ các mạch máu gan và
có thể quay lại tim qua xoang tĩnh mạch. Sinusoids nối với tế bào lưới nội mô có
nhiều lỗ nhỏ với nhân lồi. Các sinusoids kề nhau được tách ra từ một sinusoid
khác nhờ ít nhất là hai tế bào gan. Trong trường hợp tạo không bào glycogen,
nhân và nguyên sinh chất của tế bào gan bị nén lệch tâm với không gian
sinusoid.
Ống mật tồn tại trong nhu mô gan. Được tạo thành từ hai tế bào gan kề
nhau, các ống mật nhỏ hợp lại với nhau để tạo mật làm gia tăng đường kính và
cuối cùng hòa vào ống mật lớn. Các ống mật nhỏ trong gan nối với các tế bào
biểu mô hình khối đơn. Mật được tạo thành từ các tế bào gan với mục đích tiêu
hóa và được dự trữ trong túi mật [9].

Hình 4. Sinusoids và ống mật (Formalin, H&E, Bar = 22.8 µm) [9].
1. tế bào gan với không bào glycogen và nhân lệch tâm; 2. cắt ngang ống mật; 3. cắt
ngang sinusoids gồm 6 tế bào gan xung quanh mao quản; 4. cắt dọc mao quản sinusoid;
5. mô liên kết; 6. đại thực bào mô; 7. tĩnh mạch trung tâm.
2.2.3. Thận
Thận cá nằm giữa cột sống và bóng hơi, chạy dọc từ não đến hậu môn. Cơ
quan này được chia thành hai phần: thận trước bao gồm mô tạo máu, mô bạch
huyết và mô nội tiết; thận sau gồm các nguyên thận được bao quanh bởi mô bạch
huyết kẽ và chứa mô bài tiết. Mặt phải và mặt trái của thận được nối và định
dạng bởi khớp thịt lưng – chiếm khoảng không giữa hai khoang của bóng hơi.
Từ thận sau đến khớp thịt lưng, thận mỏng theo đường cong của bóng hơi. Thận
trước, tách thành hai mặt trái và phải, nằm phía trước khớp thịt lưng đến tận não.

Thận là cơ quan bài tiết nước ở động vật có xương sống, bao gồm các
nguyên thận và ống cung cấp máu. Nước trong cơ thể cá nước ngọt tập trung
nhiều ion hơn nước môi trường xung quanh, điều này dẫn đến sự gia tăng tính
thẩm thấu. Ion bị cô đặc và giữ lại trước khi bài tiết nước đã thanh lọc. Việc này
được thực hiện bằng cách lọc nước qua cầu thận, mỗi cầu thận gồm quản cầu
Malpighi và ống thận. Lớp biểu mô bên trong và ngoài thành cầu thận tạo thành
khoang Bowman’s – cách ly với cầu thận. Thận cũng giữ chức năng thông tin về
các tế bào máu ở động vật gồm cả cá xương.

Hình 5: Cầu thận (Formalin, H&E, Bar = 10.7 µm) [9].
1. khoang Bowman’s; 2. tế bào nội mô; 3. tế bào đảo máu; 4. biểu bì bên trong của
vỏ cầu thận; 5. biểu bì vách của vỏ ống thận; 6. hồng cầu trong mạch máu.


Hình 6. Ống thận, cắt ngang (Formalin, H&E, Bar = 16.7 µm) [9].
1. vùng ống đầu tiên; 2. vùng ống thứ 2; 3. vùng ống giữa; 4. ồng ngoại biên; 5. ống tập
trung; 6. viền chổi; 7. tế bào biểu bì gián phân; 8. đại thực bào sắc tố; 9. tế bào hồng cầu.

Trong khi cầu thận nhỏ và không có mạch thì các ống thận lại có cấu trúc
hoàn chỉnh gồm 6 vùng tế bào có thể nhìn thấy được. Ở lớp biểu mô ống thận
thường thấy tế bào hình gậy và tế bào kẽ (hình 6).
2.2.4. Lách

Hình 7. Lách – tủy trắng (white pulp) và tủy đỏ (red pulp) [9].

Lách là cơ quan có màu đỏ nhạt hoặc màu đen, nằm gần chỗ uốn cong của
dạ dày trong màng treo ruột. Lách giống như hạch bạch huyết của động vật có
xương sống, thường có cấu trúc đơn nhưng ở cá trắm cỏ thì chia làm 2 thùy. Cấu
tạo của lách gồm 3 thành phần chính là tủy trắng, tủy đỏ và mạng lưới các
khoang hình bầu dục (ellipsoids). Tủy trắng chứa mầm gốc để tạo ra bạch cầu và

do đó có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của cá. Tủy đỏ chứa vật chất
ẩn, trong đó có các mạch máu thay đổi kích thước. Phần cuối của mao mạch hay
động mạch nhỏ hơn và được bao quanh bởi các tế bào màng trong dạng lưới gọi
là ellipsoid. Ellipsoids là những mao mạch cơ bản của lách, đóng vai trò lọc
máu; thành của chúng rất mỏng và chứa các sợi lưới để chống đỡ các tế bào
lưới/đại thực bào. Các tế bào thoái hóa thường xuất hiện trong các tế bào lưới –
đóng vai trò chính trong việc loại bỏ hồng cầu già yếu. Bao quanh ellipsoids là tế
bào bạch huyết, chúng có thể gia tăng số lượng khi cơ thể bị bệnh. Khoang
ellipsoids rất hẹp để hồng cầu có thể chui qua nhưng nhờ những chỗ hẹp và rộng
xen kẽ nhau mà máu có thể lưu thông trong mạch khi co bóp. Vỏ bọc lưới của
ellipsoids là bể lọc tác nhân lạ. Tế bào dạng lưới có thể rời khỏi vỏ đến mô bạch
huyết và tới các MMC. Có giả thiết cho rằng, bất cứ kháng thể nào có dạng tế bào
lưới đều có thể cư trú ở mô bạch huyết trước khi kháng thể thực sự bị khóa lại.
MMC là đặc trưng chính của mô tạo máu ở động vật có xương sống và
được tìm thấy ở gan, lách, thận. Màu sắc thay đổi từ vàng nhạt/hồng cho tới dạng
màu đen dày đặc. Các bằng chứng hóa mô cho thấy sắc tố màu vàng (hình thành do
quá trình tạo máu bị hỏng) có nhiều ở lách. MMC hoạt động như những thùng rác
không chỉ chứa tế bào chết mà còn chứa các tác nhân đã bị đại thực bào loại bỏ.
2.2.5. Mạch và tế bào máu
Mạch máu gồm những lớp cơ trơn, sợi mô liên kết và lớp tế bào lót màng
trong. Mô liên kết chứa collagen và những sợi đàn hồi. Động mạch dày hơn tĩnh
mạch trong khi mao mạch rất đơn giản với một lớp màng trong, lớp màng cơ bản
và màng ngoài.
Ở động vật có xương sống bậc cao, tế bào máu được tạo ra ở tủy xương,
lách và hạch bạch huyết. Còn ở cá cơ quan tạo máu gồm thận, lách và tuyến ức
Tế bào máu của các loài cá đều có nhân – đây là điểm khác biệt với động vật có
xương sống bậc cao hơn. Các tế bào máu tồn tại ở dạng dịch huyền phù – được
gọi là huyết tương – chứa nước và nhiều protein, carbohydrate, lipid và ion.
Hồng cầu có chức năng vận chuyển O
2

và CO
2
gắn với sắc tố hemoglobin. Còn
bạch cầu (chiếm khoảng 2 – 4% tổng số tế bào máu) là những tế bào bảo vệ, bao
gồm 4 loại chính: bạch cầu hạt (Granulocytes), tế bào bạch huyết
(Lymphocytes), bạch cầu đơn nhân to (Monocytes) và tiểu cầu (Thrombocytes).
Bạch cầu hạt gồm bạch cầu trung tính – là tế bào phòng vệ nhanh chóng di
chuyển tới những vết thương cấp tính, bạch cầu ái toan – tiêu hóa vi khuẩn và
vật chất của tế bào chết đồng thời cũng tiêu hóa sắc tố chứa lipid như melanin,
lipofuscin, ceroid và một dạng ít gặp hơn là bạch cầu ưa bazơ. Bạch cầu hạt liên
quan đến cơ chế miễn dịch không đặc hiệu, chúng phản ứng với sự có mặt của vật
chất lạ trong cơ thể nhưng không phải là kháng nguyên đặc hiệu. Chúng di chuyển
đến những vùng bị xâm nhập và tiêu diệt chất lạ bằng cách thực bào hoặc trực tiếp
giết chết tế bào nhiễm độc tố đã biết. Bạch cầu hạt chiếm khoảng 4 – 60% tổng số
bạch cầu ở cá, và không có sự khác biệt đáng kể về số lượng giữa các loài.
Bạch cầu đơn nhân to là tiền thân của đại thực bào. Đại thực bào là tế bào
có khả năng ăn vi khuẩn, các tác nhân bên ngoài và những tế bào khác; bao gồm
hai loại: tiểu thực bào (bạch cầu trung tính) linh động và đại thực bào không linh
động (tế bào màng trong, bạch cầu đơn nhân to và tế bào lưới nội mô). Đại thực
bào thường xuất hiện ở những nơi có vết thương mãn tính và trong mô các cơ
quan như gan, thận, lách. Chúng thường kết hợp với sắc tố để tạo thành MMC.
Tế bào bạch huyết là những tế bào có chức năng quan trọng trong những
phản ứng miễn dịch. Trong điều kiện bệnh lý, tế bào bạch huyết giảm số lượng khi
bị tổn thương cấp tính và gia tăng trong trường hợp tổn thương mãn tính [21].

Hình 8. Mô máu; Bạch cầu trung tính (phải), 2. bạch cầu ái toan (trái) [22]
PHẦN III
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Thời gian

Từ 15/01/2008 đến 30/07/2008
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Thu mẫu tại các tỉnh Thái Nguyên, Bắc Ninh, Lạng Sơn, Hà Nội, Hải
Dương, Nghệ An, Hà Tĩnh, Huế.
- Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Mô học – Trung tâm Nghiên cứu
quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thuỷ sản khu vực Miền
Bắc – Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I – Đình Bảng – Từ Sơn – Bắc Ninh.
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu
Cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella)
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu
* Tổ chức mô nghiên cứu: mang, gan, lách, thận, tim
* Dung dịch cố định (Buffered formalin 10%):
Formalin 100% 100ml
Nước cất 900ml
NaH
2
PO
4
.H
2
O 4.0g
Na
2
HPO
4
6.5g
* Dung dịch làm mềm mô (Decalcification)
AlCl
3

7.0g
HCl 8.5ml
Acid formic 5.0ml
Nước cất 87ml
* Dung dịch nhuộm màu Haematoxylin
Haematoxylin crystals C
16
H
14
O
6
.6H
2
O 4.0g
Sodium iodinate NaIO
3
0.8g
Postassium aluminum sulfate KAl(SO
4
)
2
100g
Ctric acid C
6
H
8
O
7
4.0g
Chloralhydrate C

2
H
3
O
2
200g
Nước cất 2000ml
* Dung dịch nhuộm màu EOSIN
EOSIN.Y.Cl.45380 C
20
H
6
Br
4
Na
2
O
5
10g
Acid acetic CH
3
COOH 5ml
Nước cất 1000ml
* Dung dịch cồn etanol các nồng độ
* Dung dịch xylen, parafin
* Máy xử lý mô tự động, máy đúc parafin, máy cắt mô, tủ sấy, keo dán
Bom canada, kính hiển vi, bộ đồ giải phẫu, bộ nhuộm mô, chai lọ thủy tinh, lam
kính, la men…
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp mô bệnh học. Quá trình làm tiêu bản mô được tóm

tắt bằng sơ đồ sau:

Cắt mẫu
Đúc mẫu
Nhuộm màu
Đọc mẫu
Thu mẫu
Cố định
Xử lý
3.2.2.1 Thu mẫu
- Các cá thể được chọn để thu mẫu mô phải còn sống
- Thu mẫu bệnh: chọn mẫu có triệu chứng bệnh tích điển hình và có kết
quả dương tính khi xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh.
- Thu mẫu đối chứng: chọn mẫu mô của cá thể khỏe mạnh bình thường và
kết quả xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh âm tính.
-Tất cả các mẫu phải còn sống trước khi đưa vào cố định.
- Đưa hóa chất và dụng cụ đến tại bờ ao để cố định, nếu không địa điểm thu
mẫu xa phải nhanh chóng đưa cá còn sống đến nơi thuận tiện để cố định mẫu.
3.2.2.2 Cố định và bảo quản mẫu
- Dùng dao mổ sạch cắt các mô cần nghiên cứu (mang, cơ, thận, gan, lách)
thành những miếng nhỏ, thể tích miếng mô nhỏ hơn 1cm
3
.
- Cho miếng mô vào dung dịch cố định Buffered formalin 10% trong 24h.
Thể tích dung dịch cố định gấp 10 lần thể tích miếng mô.
- Với mẫu cá nhỏ, đặt nguyên cả con vào dung dịch cố định nhưng phải
mổ bụng để hở nội tạng đảm bảo dung dịch cố định ngấm đều.
- Nếu lấy mẫu vết thương hở, chỉ lấy miếng mô ở gần chỗ bị thương tổn.
- Các thao tác phải nhanh, tránh để mẫu quá lâu trong không khí. Ghi đầy
đủ lý lịch và dán nhãn cho từng mẫu.

3.2.2.3 Xử lý mẫu
* Chuẩn bị mẫu
- Sau khi cố định, mẫu mô sẽ cứng lại. Dùng dao sạch cắt miếng mô thành
những miếng nhỏ hơn, từ 0.2 – 0.5cm chiều rộng, 0.2 – 0.5cm bề dày và không
quá 2cm chiều dài.
- Cho mẫu vào các cassettes đã ghi nhãn và đậy nắp casssttes lại.
- Các mẫu có xương (cơ) được ngâm trong dung dịch Decalcification 1 –
3h để làm mềm mô. Sau đó mẫu được rửa qua vòi nước chảy nhẹ 20 – 30 phút,
rồi cho vào Na
2
SO
4
5% trong 4 – 5h để trung hòa acid. Cuối cùng rửa lại mẫu
dưới dòng nước chảy nhẹ 15 phút.
* Xử lý mẫu
- Xử lý mẫu mô bằng máy xử lý mẫu tự động
- Khử nước ở mẫu bằng dung dịch cồn có nồng độ tăng dần
- Làm sạch mẫu trong xylen
- Cuối cùng thấm parafin cho mẫu sau khi đã làm sạch
Bảng thời gian khử nước, làm sạch và thấm parafin
Thứ tự
Dung dịch
Thời gian
1
Cồn 70%
30- 60′
2
Cồn 85%
30- 60′
3

Cồn 95% lần I
30- 60′
4
Cồn 95% lần II
30- 60′
5
Cồn 95% lần III
30- 60′
6
Cồn 100% lần I
30- 60′
7
Cồn 100% lần II
30- 60′
8
Cồn 100% lần III
30- 60′
9
Xylen 100% lần I
60- 90′
10
Xylen 100% lần II
60- 90′
11
Parafin lần I
90′
12
Parafin lần II
120′

3.2.2.4 Đúc Parafin
- Sau khi đã thấm parafin vào mẫu, đặt mẫu vào khuôn đúc, rót parafin
nóng chảy vào khuôn. Chỉnh sửa mẫu theo hướng cần cắt và đậy cassettes lên.
- Đặt khuôn trên dàn lạnh cho đến lúc parafin đông cứng lại.
- Gỡ khối paraffin ra khỏi khuôn và gọt thành khối hình thang cân.
3.2.2.5 Cắt mẫu
- Gắn khối paraffin chứa mẫu lên máy cắt mô Microtom
- Dùng tay quay cắt thành các lát mỏng 0.5µ
- Khi các lát cắt được cắt ra tạo thành dải băng mỏng từ lưỡi dao của máy,
dùng kẹp thả dải mô trên nước ấm 45- 48
0
C để các lát cắt được dãn phẳng ra.
- Dùng kẹp nhẹ nhàng tách các lát cắt từ dải mỏng với độ dài thích hợp.
Lấy một lam kính sạch luồn xuống dưới lát cắt để vớt chúng từ nước ấm lên. Các
lam kính được ghi nhãn bằng đầu bút kim cương. Sấy khô các lam kính 3 – 4h
trong tủ sấy 40
0
C.
3.2.2.6 Nhuộm màu
- Lấy các lam kính đã sấy khô và xếp vào khay rồi tiến hành nhuộm màu
Haematoxylin và EOSIN. Trình tự và thời gian nhuộm màu như bảng sau đây:

Số thứ tự
thùng nhuộm
Dung dịch
Thời gian
1
Xylen 100% lần I
2- 3´
2

Xylen 100% lần II
2- 3´
3
Cồn 100% lần I
2- 3´
4
Cồn 100% lần II
2- 3´
5
Cồn 95%
2- 3´
6
Cồn 70%
2- 3´
7
Rửa qua vòi nước chảy nhẹ
4- 6'
8
Hematoxylin
4- 8´
9
Rửa qua nước chảy nhẹ
4- 6´
10
EOSIN
5- 10´
11
Cồn 75%
2- 3´
12

Cồn 95%
2- 3´
13
Cồn 100% lần I
2- 3´
14
Cồn 100% lần II
2- 3´
15
Xylen lần I
2- 3´
16
Xylen lần II
2- 3´

- Dán lamen lên lam kính bằng keo Bom Canada sao cho khi xylen bay
hơi không tạo ra các vùng không có keo hay có bọt khí để tăng độ bền của mẫu.
3.2.2.7 Đọc kết quả
Kết quả nhuộm màu:
- Nhân bắt màu xanh đậm
- Nguyên sinh chất bắt màu hồng hoặc đỏ
- Các bó cơ bắt màu hồng, sợi cơ màu hồng sẫm

PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả kiểm tra mẫu
Các mẫu được thu đều là những mẫu có triệu chứng bệnh tích điển hình
của bệnh đốm đỏ. Cá thường bỏ ăn, tách đàn và bơi lờ đờ trên mặt nước. Biểu
hiện bên ngoài là da sẫm màu, vảy mất ánh bạc do mất nhớt, tuột vảy; đôi khi da
có màu hồng đỏ, toàn thân phù nề. Vây đuôi mòn cụt, một số mẫu có biểu hiện
loét vây đuôi; vây lưng và vây bụng có thể có biểu hiện xuất huyết. Ở những mẫu cá
lớn (trên 1 năm tuổi), thường thấy những vết loét lan rộng trên bề mặt da với viền đen
và mép màu trắng bao quanh. Phần lớn cá chết rải rác nhưng nếu kết hợp với stress
môi trường thì có thể chết nhiều và chết nhanh trong vài ngày (Hình 9, 10).
Mang cá thường bị mòn, tia mang xơ cụt phần đầu. Đa số có biểu hiện
thối mang, loét mang hoặc bám nhiều cặn bẩn làm cản trở quá trình hô hấp
(Hình 11, 12).
Với những mẫu có hiện tượng phù nề, khi giải phẫu nội quan cho thấy gan
sưng to, nhạt màu, đôi khi xuất huyết. Lách cũng sưng to, màu đen và xuất
huyết. Đặc biệt ruột không có thức ăn và chứa rất nhiều dịch. Thận nát vỡ, gia
tăng kích thước so với bình thường. Còn những mẫu loét da, cơ thể không phù nề
thì điểm nổi bật là ruột không có thức ăn và nhiều dịch tiết, thận cùng các nội
quan khác nát nhũn (Hình 13).

Hình 9. Cá trắm cỏ có biểu hiện: 1. tách đàn; 2. nổi lờ đờ trên mặt nước
(Mẫu thu ở Thái Nguyên)

Hình 10. Cá trắm cỏ bị đốm đỏ biểu hiện vết loét rộng trên da
(Mẫu thu ở Thái Nguyên)