ĐỀ TÀI: Enzyme protease

Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
1


Mở đầu

Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme đượac sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh
vực như: chế biến thực phẩm,nông nghiệp,chăn nuôi,y tế…Hàng năm luợng
enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên 500 triệu
USD,được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn
cấu tử,xúc tác cho phản ứng phân hủy.Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân
được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Protease la enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành
sản xuất như: chế biến thưc phẩm ( đông tụ sữa làm cho phomát,lsmf mềm thịt,bổ
sung để tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia.xử lý phế phụ phẩm trong chế
biến thực phẩm…(sản xuất chất tẩy rửa,thuộc da,y tế,nông nghiệp…)
Qua nhiều năm ,việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều
hơn.Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao,do đó cũng hạn chế việc
sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất.Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi
cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ
chiếm 20-30%. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế
enzyme nhằm thu đượ chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết.
Để tách và tinh chế enzyme nói chung và protease nói riêng thì có một số
phương pháp hóa – lý khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm chính sau:
- Phương pháp kết tủa
- Phương pháp sắc ký
- Phương pháp phân tách hệ hai pha nước

Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
2

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn enzyme
phong phú nhất là nguồn từ vi sinh vật, có hầu hết ở các vi sinh vật như vi khuẩn,
nấm mốc và xạ khuẩn,… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất
để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống.

Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
3


Phần I – Tổng quan về enzyme protease

1.Giới thiệu chung
Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid
( -CO-NH)
n
trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các
acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và
vận chuyển acid amin.

H
2
N–CH–CO–NH–CH–CO -… NH–CH-COOH
+H2O


R
1
R
2
R
X

H
2
N-CH-COOH + H
2
N-CH-CO…NH-CH-COOH

R
1
R
2
R
X



Mô hình enzyme protease










Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
4

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa, ) và động vật (gan, dạ
dày bê, ). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.



Cấu trúc không gian enzyme protease






Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
5

1.1 Phân loại Protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).

Peptidase (protease)
(E.C.3.4)


Sơ đồ phân loại protease

Protease được phân chia thành 2 loại : endopeptidase và exopeptidase.
• Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide, exopeptidase được phân
chia thành 2 loại :
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin,một dipeptide hoặc tri peptide.
+ Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác ,endopeptidase được chia thành 4 nhóm:
Metallo proteinase
Exopeptdase
(E.C.3.4.11-17)
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Carboxypeptidase
Aminopeptidase
Endopeptidase
(E.C.3.4.21-99)
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
6

+ Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của

enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.Nhóm
chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin.trypsin,elastase.Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn
như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động
mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng.Các cystein proteinase
thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và
thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11

1.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có
thể khác nhau vê nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
7

thích hợp,…các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4
nhóm sau:
P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid
Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào hoạt động pH của
chúng bao gồm: protease acid, protease trung tính, protease kiềm.
Trong 4 protease kể trên, các protease – xerin và protease – thiol có khả năng
phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin.
Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính
esterase của các dẫn xuất của acid amin. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh
vật đã được nghiên cứa tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý
và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các
enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin.
Các P-xerin có trọng lượng phân tư thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 dalton.
Tuy nhiên, cũng có một số p-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các
enzyme Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp (52.000),… Trọng lượng phân
tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin ( vào khoảng 33.800 –
48.400).
Protease thiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào
khoảng 30.000 – 40.000 dalton.

1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động ( TTHĐ) của protease.
Trong TTHĐ của protease vi sinh vật (VSV) ngoài gốc aa đặc trưng cho
từng nhóm còn có một số gốc aa khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của
một số protease VSV cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau:
-TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số
trường hợp còn có cả các cofactơ kim loại.
+ Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 A
0
, có thể phân
biệt thành 6 phần dưới TTHĐ ( subsite), mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương

ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất.
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
8

+ Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các
tinh thể protease acid của Phizopus chinenis và endothia đã cho thấy phân tử các
phân tử protease này có 2 hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20 A
0
. Khe hở này
là phần xúc tác của các enzyme, các gốc asp-35 và asp-215 xếp đối diện nhau trong
khe ấy.
- Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm
dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu
disulphide.
Mặc dù TTHĐ của các protease VSV có khác nhau nhưng các enzyme này
đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid theo cùng một cơ chế chung
như sau:

E+S enzyme – S Enzyme-S + P1 enzyme + P2

Trong đó: E: Enzyme, S: cơ chất, Enzyme-S: phức chất enzyme-cơ chất, P1,
P2: là sản phẩm đầu tiên và thứ 2 cưa phản ửng.

Phần II – Nguồn thu nhận
Enzyme protease là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất
tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi vi sinh vật đều được
xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là 3 nguồn chính:
động vật, thực vật, vi sinh vật.

2.1 Nguồn động vật
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có nhiều enzyme
nhất.
Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này từ lâu đã được dùng phổ biến trong công
nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
9

trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca
2+
. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển
hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩn
renin bị nhiễm pepxin ( trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi
đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông
tụ sữa kém đi.
Gần đây có nhiều nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính
renin như ở các loài Edothia Parasitica và Mucor Purullus.
Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu thu nhận enzyme từ ruột cá basa. Dịch
trích ly enzyme thu được từ ruột cá basa có tổng hoạt tính cao nhất là 15.78
UI/gCKNT trong điều kiện trích ly : tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/1 (w/w), pH 9.5:
nhiệt đọ 35
0
C: thời gian trich ly 10 phút.

2.2 Nguồn thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được
từ nhựa củ lá, thân, quả đu đủ ( Carica papaya) còn Bromelain thu được từ quả
chồi dứa, vỏ dứa ( pineapple pant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại

hiện tượng tủa trắng của Bia khi làm lạnh ( chilling proofing) do kết tủa protein.
Những ứng dụng khác của proease thực vật này là trong công nghệ làm mềm
thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica).
Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên.








Nguồn protease thu từ thực vật
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
10

Thu nhận từ hạt cốc nảy mầm: Malt là loại hạt hòa thảo nảy mầm trong
những điều kiện nhân tạo( nhiệt độ, độ ẩm, thời gian) xác định gọi là qui tắc ủ
malt.
Quá trình sản xuất malt bao gồm các khâu sau:
+ Thu nhận, xử lí, làm sạch, phân loaị và bảo quản hạt.
+ Rửa, sát trùng và ngâm hạt.
+ Uơm mầm ta sẽ thu được malt tươi.
+ Sấy malt tươi.
+ Xử lí và bảo quản malt khô.
Hoạt tính protease trong hạt ban đầu không đáng kể nhưng khi nảy mầm đã
tăng lên 4-8 lần, tăng nhanh hơn hoạt tính amylase và đạt cực đại vào khoảng
ngày nảy mầm thứ 5. Sự thủy phân protein bắt đầu bằng tác dụng của protienaza
để tạo thành albumoza, polypeptit, pepton và sau đó dưới tác dụng của

peptidaza tạo thành các acidamin. Tuy nhiên sự biến đổi này thường không hoàn
toàn vì các điều kiện nảy mầm thường không phải là điều kiện tối thích cho hoạt
động của hệ enzyme proteaza của hạt.
Tuy nhiên, vì nhiệt độ nảy mầm tương đối thấp và thời gian nảy mầm tương
đối dài sẽ có sự thủy phân protein tương đối sâu sắc để tạo thành một lượng
đáng kể các polypeptit và các acidamin. Tác động này chỉ diễn ra với nội nhũ,
trong khi protein ở lớp ngăn cách nội nhũ với vỏ và cả phần vỏ malt thì không bị
biến đổi cả trong cả quá trình chế biến về sau.

2.3 Nguồn vi sinh vật
Vi sinh vật là nguồn thu nhận enzyme khổng lồ, enzyme protease phân bố
chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,…gồm các loài thuộc Aspergillus,
Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men.

2.3.1 Vi khuẩn
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
11

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% sản lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật và thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra hai loại trên, do đó protease
của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80%
các liên kêt peptide trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số chi Clotridium. Trong đó,
B,subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp
ác protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động trong khoảng pH hẹp ( pH 5-

8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng.
Các protease trung tính có khả năng ái lực cao với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và
một số giống thuộc chi Clotridium.







Bacillus
2.3.2 Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus, A.terricola,
A.saitoi,… Các nấm mốc này có khả năng cả ba loại protease: acid, kiềm và trung
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
12

tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid, có khả năng thủy phân
protein ở pH 2.5-3.
Một số nấm mốc nhưA.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti…cũng có khả
năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat.

Nấm
mốc


2.3.3 Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm ra được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.Terimosus,…

Xạ khuẩn







Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được
chiết tách từ S.grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
13

90% liên kết peptide của nhiều protein thành amina acid. Ở Liên Xô (cũ) người ta
cũng tách được chế phẩm tương tự từ S,grieus có tên là protelin.


Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân keratin. Ở Mỹ,
chế phẩm được sản xuất có tên là M-zim dùng trong sản xuất Da. Protease từ

S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong nghiệp chê
biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptide đinh trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,
phản ứng trong hệ hai pha lỏng.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật
có những lợi ích chính như sau:
• Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy và giống vi sinh vật.
• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch
nhiều lần quanh năm.
• Có thể điều khiển sinh tông hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi.
• Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức
sản xuất.
Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố ( gây độc, gây
bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý.
Để sản xuất chế phẩm enzyme , người ta có thể phân lập giống vi sinh vật có
trong tự nhiên hoặc giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng
hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.

Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
14

Phần III – Thu nhận và làm sạch enzyme protease từ vi simh vật và
thực vật

3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.

Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn.
Quá trình sản xuất cá chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu:











Tuyển chọn và cải tạo giống vi
sinh vật
Phương pháp bảo quản giống
vi sinh vật
Môi trường nuôi cấy vi sinh
tổng hợp enzyme
Tách và làm sạch chế phẩm
enzyme
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
15

Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme

3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.
Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta

có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến
tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các
biến chủng có khả năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao
hơn hẳn chủng gốc ban đầu.

3.1.1.1 Phương pháp gây đột biến.
Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:
-Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có
thể giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược.
Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì
có thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme.
Gây đột biến đoạn gene hoạt hoá promotor để làm tăng áp lực của nó đối với
ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã… Dùng biện pháp này có thể
làm tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần.
Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lỗi”
một bazo khi tái tạo phân tử AND.
Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ)
hay hoá học (các hoá chất) tác dụng lên tế bào sinh vật.

3.1.1.2 Phương pháp biến nạp.
Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi sinh vật dưới ảnh hưởng của
AND trong dịch chiết nhận được từ tế bào của sinh vật khác. Ở đây yếu tố biến nạp
là AND. Sự chuyển vật liệu di truyền (AND) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể
xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế
bào cho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào.
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
16

Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại AND nào chứ không đòi hỏi phải là AND

từ các giống họ hàng. Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn AND nhất
định, thường không quá 10 đoạn. Các đoạn AND được di truỳền trong biến nạp có
M=106-107 và phải có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều
loại vi khuẩn như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium,
Rhizobium, Bacillus, Xantomonas.

3.1.1.3 Phương pháp tiếp hợp gene.
Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được từ tế bào cho đến tế bào
nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp
thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá trình tiếp hợp
gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, Salmonella,
Pseudomonas aeruginosa.

3.1.1.4. Phương pháp tải nạp
Vật liệu di truyền (AND) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ
vai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn
AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do
đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận.

3.1.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã
được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưư
ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời
gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy
chuyển và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu.
• Phương pháp cấy chuyển.
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi
trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh

17

điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần
bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-40
0
C và sau mỗi tuần phải cấy chuyển lại. Khi cấy
chuyển chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng
để đảm bảo không chuyển các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể
gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo
quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng.
Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1
lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó.
Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chin sinh lý.
Phương pháp cấy chuyển rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi
khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến
có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc.

3.2. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
• Phương pháp làm khô
Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều
được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục
của giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm
mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khẩn thời gian giữ giống có thể được một
nă. Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền.
Tuiy nhiên giống như phương pháp cấy chuyển thời gian bảo quản tương đối ngắn.
• Phương pháp đông khô
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng
thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và
đượclàm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối
cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường

chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo
quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
18

số virut. Tuy nhiên phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật
nguyên sinh và tế bào động vật.
• Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi
trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt
độ lạnh sâu (-196
o
C -> -80
o
C).

Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan
mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải
trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục
nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm
tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương
pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt đọ khác nhau như -20
o
C, -30
o
C,
-40
o
C,-70

o
C, -140
o
C và -196
o
C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30
o
C cho hiệu
quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương
pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm sinh vật khác nhau như nấm sợi,
nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp
vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác
nhau như, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và các dòng tế bào động vật. Tuy
nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho
thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro nhue cháy nổ… Đặc biệt phương pháp này
không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung
phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính
quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.

3.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease.
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng cso ảnh
hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. trong thành
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
19

phần môi trường phải có đủ các chất bảo quản được sự sinh trưởng bình thường của
vi sinh vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng

cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó
hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất
kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho khồng bị cản trở.


Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất
tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P,
S, Fe, K và các chất vi lượng khác.

3.3.1. Nguồn cacbon.
Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tuỳ thuộc vào đặc
tính của enzyme và nòi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp.
Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối
với nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác
dụng đến sinh tổng hợp proteinase cảu nấm mốc có thể theo thứ tự:
Đối với Asp.flavus 74: fructoza → glucoza → sacaroza → ramnoza →
manoza → galactoza → arabinora → lactoza.
Đối với Asp. Awamori 200: fructoza → manit → sacaroza → arabinora → manoza
→ galactoza → lactoza.
Đối với Asp. Oryzae 79: fructoza → sacaroza → maltoza → glucoza → manit →
arabinora → galactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme
Protease. Ví dụ: VI khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi
trường tinh bột >8%.
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
20

Nhiều xạ khuẩn ưu nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và

sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng đọ tinh bột từ 0,25
– 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme. Nếu tăng
nồng độ tinh bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính. Tỷ số giữa cacbon
và nitơ cần phải là 4:1. trên môi trường có maltoza (0,5 – 2%) vi sinh vật phát triển
bình thường, nhưng tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế. Xạ khuẩn không phát
triển được ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza
hoặc arabinoza. Glucoza, manoza,fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2 – 5%)
làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme.

Ngoài ra, một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi
sinh vật. Chẳng hạn chủng Ps. Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả
năng sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n-parafin với 12, 14 và
16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol. Chúng khôgn chỉ đồng hoá
đươch cả hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm.

3.3.2. Nguồn nitơ.
Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.
Đối với một số laòi nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus)
trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao. Tren môi
trường kzapek NaNO
3
đwocj thay bằng cả cazein và bổ sung pepton hoạt lực
enzyme tăng 6lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được
nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ.
Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn
nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22 – 74%. Còn trường hợp dùng các
nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp
protease nói chung.
Trong quá trình nuôi cáy vi khuẩn, trong đó có B. subtilis và B.
mesentericus, các h

ợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
21

trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease. Trong số các nguồn
nitơ vô cơ thì NH
4
, H
2
PO
4
là tốt hơn cả. Những muối khác NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
,
NH
4
NO
3
, NaNO
3
, KNO
3
. Ca(NO

3
)
2
làm giảm hoạt lực protease tới 30-50%, còn
amylaza giảm 7-10 lần. Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực
protease và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH
4
)
2
HPO
4
và
nước chiết đậu tương.
Đối với xạ khuẩn ưu nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì peptin là chất cảm
ứng sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất.
Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh
vật. Glỹin, alanin, metionin và lơxin cso tác dụng làm tăng hoạt lực protease cảu
chủng đột biến A. oryzae 251-90 đến 6-9% và nguyên chủng A. oryzae 132-63 tới
7-24%. Nhiều axit amin có tcs dụgn ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin, Axit
glutamic, izolỡin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium 60%. Còn đối
với B. subtilis các axít amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metinonin, axit
glutamic, alamin, lơxin,… Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và
các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đang kể
sinh tổng hợp proteinza vi sinh vật.
3.3.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng.
Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật.
Ion Mg2+ cso tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme cso hoạt tính ở nhiệt
độ cao.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy
thông thường từ 25-30

o
C. Trị số pH ban đầu cảu môi trường (chủ yếu ở môi trường
nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó
cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật.
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
22

Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy môi
trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề
sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này
cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt),
phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt.
Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định
lượng sao chi quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất. Muốn vậy
người ta có thể sử dụng một số phương pháp:

Phương pháp tối ưu hoá quy hoạch thực hiện toàn phần.
Phương pháp toán học môhình hoá thực nghiệm.
3.4. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme.
Có thể chia làm 2 loại: môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên.
Môi trường tổng hợp: là môi trường bao gồm các chất với liều lượng xác
định (qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột,
xenluloza, đường, axit, rượu, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Loại môi trường này
được sử dụng chomục đích nghiên cứu.
Môi trường tự nhiên: thường dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa các
nguồn cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng. Mặt khác, các
nguyên liệu này có sẵn, rẻ tiền nên được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp sản
xuất các phế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Các nguyên liệu để chuẩn bị làm môi
trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau,

khô dầu, bã rượu, rĩ đường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa
chọn sử dụng môi truờng cần chú ý đến các chất cso tác dụng điều hoà sinh tổng
hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
23

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy
thông thường từ 25-30
o
C. Trị số pH ban đầu cảu môi trường (chủ yếu ở môi trường
nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó
cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật.
3.5. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật.
• Nuôi cấy bề mặt:
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát
triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề
mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi
trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi
vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương
lên men-misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men
dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… cso chất phụ gia là trấu.
Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những
chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải
bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn
20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH
4
)
2

SO
4
, (NH
4
)
2
CO), photpho, nitơ
hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc rượu.
 Quy trình công nghệ:
Làm nguội, tơi. Thanh trùng bằng nhiệt độ. Làm ẩm. trộn nguyên liệu. Nuôi cấy,
theo dõi, xử lý. Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy. Gieo trồng vsv lý.
 Ưu nhược điểm:
Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi
đã tách tế bào vi sinh vật. Trong công nghiệp rượu muốn đường hoá 100kg tinh bột
chỉ cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng phải cần đến 100lít nấm mốc chìm
để lọc bã và tế bào vi sinh vật.
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
24

Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế
phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp mà không
cần khâu tách và làm sạch enzyme.
Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui
mô gia đình, trang trại cũng như qui mô đến 20T/ngày.
Nuôi cấy trong điều kiện vô cùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy đều có
nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó.
Tuy nhiên phương pháp bề mặt cso năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá,
cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.
• Nuôi cấy chìm

Vi sinh vật được nuoi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong đa số
trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vsv dùng nguồn cơ chất cacbon là
đường glucoza, saccharoza. Thực tế, trong một số trường hợp đường hoá sơ bộ tinh
bột trước khi thanh trùng. Khi đó đường maltoza được tạo thành là chất cảm ứng
tốt, môi trường thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục
khí.
Phương pháp nuôi cấy bề sâu đồi hỏi phải được vô trùng tuỵet đối ở các khâu vệ
sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí
cung cấp cho quá trình nuôi cấy.
Các giai đoạn chính cảu quá trình nuôi cấy chìm 1 bước gồm: chuẩn bị môi trường
nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất.
 Ưu nhược điểm
Phương pháp nuôi cấy hiện đậi dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ
chức sản xuất.
Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến cso khả năng sinh tổng hợp
enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy,
enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh, vô trùng.
Enzyme protease
Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh
25

Tuy nhiên do thu được canh trường và nông độ enzyme thấp nên khi tách thu
hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm
vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn.

3.6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme.
Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào vi sinh vật
gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhuwnh nó cũng có thể được các vi

sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular).
Enzyme vi sinh vật thương chiết là enzyme ngoại bào.
Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các
cấu tử của tế bào. Do đó có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải
phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.
Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền
với bột thủy tinh hoặc cat thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa
(homogenzizator).
Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải
dùng các yếu tố vật lí và hóa học khác nhau như sóng siêu âm. Dùng các dung môi
hữu cơ như buthanol, aceton, glycerin, ethyl acetate… và chất detergent. Các hóa
chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này
thường chứa mỡ.
Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất,
bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc bằng các dung dịch muối trung tính.
Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó
là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần thiết rút và tiến hành
kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5
o
C). Các thao tác phải nhanh. Một số
chất điện li làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl
2
, CaCl
2
. Tác dụng
của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút.