phân loại và quan hệ di truyền nhóm ếch cây xanh rhacophorus (amphibia rhacophoridae) ở việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT





NGUYỄN THIÊN TẠO


PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY
XANH RHACOPHORUS (AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE)
Ở VIỆT NAM





LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT




NGUYỄN THIÊN TẠO


PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY
XANH RHACOPHORUS (AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE)
Ở VIỆT NAM


Chuyên nghành: Động vật học
Mã số: 60 42 10

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐẶNG TẤT THẾ

HÀ NỘI - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đặng Tất Thế (Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật) đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,
Phòng Sinh học, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ trong quá trình
hoàn thiện luận văn này.
Xin cảm ơn sự giúp đỡ và hợp tác hiệu quả của các đồng nghiệp ở Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật; Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội; Viện Động vật St. Petersburg, Liên bang Nga; Bảo
tàng Leiden, Hà Lan; Vườn thú Cologne, Cộng hòa Liên bang Đức.
Xin cảm ơn gia đình đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.
Đề tài nghiên cứu này nhận được sự hỗ trợ kinh phí của Quỹ Học bổng
Nagao – Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên Môi trường (CRES); Quỹ Bảo tồn
Việt Nam (VCF); Chương trình Hỗ trợ dự án nhỏ (NEF) của Quỹ Nagao, Nhật
Bản; Quỹ Hỗ trợ trang thiết bị nghiên cứu IdeaWild và Hội Địa lý Quốc gia Hoa
Kỳ (National Geographic Society).
Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2010
Học viên
Nguyễn Thiên Tạo


Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn này là do tôi
thu thập và phân tích. Đồng thời, luận văn này chưa từng được bảo vệ trước bất
cứ một hội đồng nào khác trước đây.
Hà Nội, ngày tháng năm 2010.


Nguyễn Thiên Tạo

NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

1
THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
BMNH
Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Anh, Luân Đôn.
IEBR
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội.
KBTTN
Khu Bảo tồn thiên nhiên.
MNHN
Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Quốc gia Pháp, Paris.
MSNG
Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Genoa, I-ta-li-a.
VNMN
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Hà Nội.
VNUH
Bảo tàng Động vật, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội.

VQG
Vƣờn Quốc gia.
ZISP
Viện Động vật Xanh Pê-tec-bua, Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang
Nga.
ZMH
Viện nghiên cứu và Bảo tàng Động vật, Đại học Ham-buốc, Cộng
hòa Liên bang Đức.
ZRC
Bảo tàng Nghiên cứu Đa dạng sinh học Raffles, Đại học Quốc gia
Sing-ga-po.

NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

2
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng II.1. Danh sách và thông tin về mẫu vật nghiên cứu.
Bảng II.2. Thành phần hỗn hợp PCR.
Bảng II.3. Chu trình nhiệt PCR.
Bảng III.1. Số đo mẫu vật loài Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis.
Bảng III.2. Số đo mẫu vật loài Ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi.
Bảng III.3. Số đo mẫu vật loài Ếch cây phê Rhacophorus feae.
Bảng III.4. Số đo các mẫu vật loài Ếch cây ki-ô Rhacophorus kio.
Bảng III.5. Số đo mẫu vật loài Ếch cây lớn Rhacophorus maximus.
Bảng III.6. So sánh các đặc điểm hình thái chính 5 loài ếch cây xanh giống
Rhacophorus ở Việt Nam.
Bảng III.7. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu trên đoạn gen 16S
rRNA.

Bảng III.8. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu vật nghiên cứu trên đoạn gen
Cytochromeb.
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

3
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Bản đồ điểm nóng đa dạng sinh học Đông dƣơng – Mi-an-ma.
Hình II.1. Bản đồ các địa điểm khảo sát thực địa.
Hình III.1. Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis thu tại Chƣ Yang
Sin, Đắk Lắk.
Hình III.2. Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis thu tại Hòn Bà,
Khánh Hoà.
Hình III.3. Bản đồ phân bố loài Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus
chuyangsinensis.
Hình III.4. Ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi thu tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc.
Hình III.5. Bản đồ phân bố loài Ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi ở Việt
Nam.
Hình III.6. Ếch cây phê Rhacophorus feae.
Hình III.7. Bản đồ phân bố loài Ếch cây phê Rhacophorus feae ở Việt Nam.
Hình III.8. Ếch cây ki-ô Rhacophorus kio thu tại Nguyên Bình, Cao Bằng và tại
Kon Plông, Kon Tum.
Hình III.9. Bản đồ phân bố loài Ếch cây ki-ô Rhacophorus kio ở Việt Nam.
Hình III.10. Ếch cây lớn Rhacophorus maximus thu tại Sơn Động, Bắc Giang.
Hình III.11. Bản đồ phân bố loài Ếch cây lớn Rhacophorus maximus ở Việt Nam.
Hình III.12. Đối chiếu trình tự nucleotide và axit amin từ các mẫu nghiên cứu trên
gen 16S rRNA.
Hình III.13. Cây phát sinh chủng loại NJ (Neighbor Joining).
Hình III.14. Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony).

Hình III.15. Đối chiếu trình tự nucleotide và axit amin từ các mẫu nghiên cứu trên
gen Cytochromeb.
Hình III.16. Cây phát sinh chủng loại NJ (Neighbor Joining).
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Hình III.17. Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony),
Hình III.18. Sinh cảnh loài Ếch cây chƣ yang sin ở Hòn Bà, Khánh Hoà.
Hình III.19. Sinh cảnh loài Ếch cây xanh đốm ở Nguyên Bình, Cao Bằng.
Hình III.20. Sinh cảnh loài Ếch cây phê ở Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk.
Hình III.21. Sinh cảnh loài Ếch cây ki-ô ở Kon Plông, Kon Tum.
Hình III.22. Sinh cảnh loài Ếch cây lớn ở Sơn Động, Bắc Giang.

NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

5
MỤC LỤC
THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 1
DANH MỤC CÁC BẢNG 2
DANH MỤC CÁC HÌNH 3
MỤC LỤC 5
MỞ ĐẦU 7
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 10
I.1. Các nghiên cứu về phân loại nhóm ếch cây xanh 10
I.2. Các nghiên cứu về quan hệ di truyền của nhóm ếch cây xanh 13
I.3. Các nghiên cứu về sinh thái học của nhóm ếch cây xanh 14

CHƢƠNG II. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 15
II.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu 15
II.2. Thu thập và xử lý mẫu vật 15
II.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
II.3.1. Phân tích mối quan hệ di truyền 17
II.3.1.1. Gen nghiên cứu 17
II.3.1.2. Thiết kế mồi PCR 18
II.3.1.3. Tách chiết DNA tổng số 18
II.3.1.4. Nhân bản đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR 18
II.3.1.5. Giải mã và phân tích trình tự DNA 20
II.3.1.6. Phân tích số liệu 20
II.3.2. Đặc điểm hình thái 21
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
III.1. Phân loại nhóm ếch cây xanh giống Rhacophorus 23
III.1.1. Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis Orlov,
Nguyen & Ho, 2008 23
III.1.2. Ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi Blanford, 1881 29
III.1.3. Ếch cây phê Rhacophorus feae Boulenger, 1893 34
III.1.4. Ếch cây ki-ô Rhacophorus kio Ohler & Delorme, 2006 39
III.1.5. Ếch cây lớn Rhacophorus maximus Günther, 1858 44
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

6
III.1.6. Khóa định loại 5 loài ếch cây xanh giống Rhacophorus ở Việt
Nam 49
III.2. Quan hệ di truyền giữa các loài ếch cây xanh ở Việt Nam 50
III.2.1. Kết quả giải trình tự nucleotide trên gen 16S rRNA 50

III.2.1.1. Sai khác về mặt di truyền giữa các mẫu cùng loài 58
III.2.1.2. Khoảng cách di truyền giữa các loài 59
III.2.1.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại 59
III.2.2. Kết quả giải trình tự nucleotide trên gen Cytochromeb 61
III.2.2.1. Sai khác về mặt di truyền giữa các mẫu cùng loài 67
II.2.2.2. Khoảng cách di truyền giữa các loài 68
II.2.2.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại 68
III.3. Một số đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài ếch cây xanh giống
Rhacophorus ở Việt Nam 70
III.3.1. Loài Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis 71
III.3.2. Loài ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi 71
III.3.3. Loài ếch cây phê Rhacophorus feae 73
III.3.4. Loài ếch cây ki ô Rhacophorus kio 73
III.3.5. Loài ếch cây lớn Rhacophorus maximus 75
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76
1. Kết luận 76
1.1. Về phân loại nhóm ếch cây xanh giống Rhacophorus ở Việt Nam 76
1.3. Về đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài ếch cây xanh giống
Rhacophorus ở Việt Nam 77
2. Kiến nghị 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

7
MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng địa lý động vật Đông dƣơng–Mi-an-ma (Indo-

Burma), một trong những điểm nóng đa dạng sinh học của thế giới (Hình 1,
Conservation International 2010)[9]. Việt Nam cũng là một trong những nƣớc
có thành phần loài bò sát và ếch nhái đa dạng nhất trên thế giới với tổng số
568 loài đã đƣợc ghi nhân và khu hệ bò sát và ếch nhái có tính đặc hữu cao
(Nguyen et al. 2009; Ziegler & Nguyen 2010) [23,35].

Hình 1. Bản đồ điểm nóng đa dạng sinh học Đông dƣơng – Mi-an-ma (CI 2010).
Trong vài thập kỷ gần đây, nghiên cứu về sự đa dạng của các loài ếch
nhái và bò sát đƣợc tiến hành ở nhiều khu vực khác nhau trên toàn quốc. Các
chƣơng trình nghiên cứu đã khám phá nhiều loài mới cho khoa học, đồng
thời, sự đa dạng về số loài bò sát và ếch nhái ở Việt Nam cũng tăng lên rõ rệt:
từ 340 loài (năm 1996) lên 458 loài (năm 2005) và 545 loài (năm 2009).
Riêng số loài ếch nhái đã tăng lên gấp đôi: từ 82 loài (năm 1996) lên 162 loài
(năm 2005) và 177 loài (năm 2009) (Nguyễn Văn Sáng & Hồ Thu Cúc 1996;
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Nguyễn Văn Sáng và cs. 2005; Nguyen et al. 2009) [21,22,23]. Sau khi cuốn
danh lục của Nguyen et al. (2009) đƣợc xuất bản, có bốn loài mới và một ghi
nhận mới đƣợc công bố, nâng tổng số loài ếch nhái hiện biết của Việt Nam
lên 182 loài (Bain et al. 2009a,b,c; Rowley & Cao 2009; Rowley et al. 2010;
Ziegler & Nguyen 2010)[2,3,4,29,30,35]
Theo Nguyen et al. (2009), trong số các nhóm ếch nhái ở Việt Nam, họ
Ếch cây (Rhacophoridae) có sự đa dạng về thành phần loài cao nhất (51 loài
thuộc 9 giống) với 12 loài mới đƣợc mô tả kể từ năm 2000 trở lại đây. Trong
họ này thì giống Ếch cây Rhacophorus có số loài đa dạng nhất với 17 loài đã
đƣợc ghi nhận và chiếm ƣu thế là nhóm ếch cây xanh với 5 loài[23].
Hiện nay, nhóm ếch cây xanh ở Việt Nam gồm có các loài sau: Ếch cây

chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis, Ếch cây xanh đốm R. dennysi,
Ếch cây phê R. feae, Ếch cây ki-ô R. kio, và Ếch cây lớn R. maximus. Đây là
nhóm ếch cây có kích cỡ tƣơng đối lớn với hai loài mới đƣợc mô tả gần đây:
R. kio (Ohler & Delorme 2006)[24], R. chuyangsinensis (Orlov et al.
2008)[27]; loài R. maximus mới đƣợc ghi nhận ở Việt Nam (Nguyen et al.
2008)[20]; và hai loài đƣợc ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (2007)[7]: R. feae
và R. kio. Nghiên cứu về quan hệ di truyền của nhóm ếch này còn rất hạn chế,
chỉ có một số công trình công bố với mẫu vật nghiên cứu thu ở Trung Quốc,
Lào và Thái Lan (Wilkinson et al. 2002; Ohler & Delorme 2006; Yu et al.
2008; Li et al. 2009)[32,24,18].
Mặt khác, các loài thuộc nhóm ếch cây này có màu sắc rất đẹp, lƣng
màu xanh lá cây với những đốm trắng hoặc sọc sáng màu ven sƣờn hay giữa
lƣng, bụng màu xám hoặc trắng đục, màng bơi màu tím nhạt hay đen xen lẫn
với màu cam. Do vậy, chúng đƣợc coi là nhóm sinh vật cảnh đƣợc ƣa chuộng
và là đối tƣợng bị khai thác mạnh ngoài tự nhiên phục vụ mục đích buôn bán.
Gần đây, một số loài thuộc nhóm ếch cây này đã đƣợc nhân nuôi sinh sản
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

9
thành công tại Trạm nhân nuôi sinh sản các loài bò sát và ếch nhái của Viện
Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (Nguyen et al. 2009)[19].
Để góp phần cung cấp dẫn liệu đầy đủ hơn về hệ thống phân loại và phát
sinh chủng loại của các loài thuộc giống ếch cây Rhacophorus cũng nhƣ làm
cơ sở khoa học cho các chƣơng trình bảo tồn, nhân nuôi các loài ếch nhái quý
hiếm, đề tài này tiến hành nghiên cứu về quan hệ di truyền, hình thái, phân
loại cũng nhƣ tìm hiểu một số đặc điểm sinh học và sinh thái của nhóm ếch
cây xanh ở Việt Nam.
Mục tiêu của đề tài là:

1. Nghiên cứu phân loại 5 loài nhóm ếch cây xanh giống Rhacophorus
dựa trên các đặc điểm hình thái.
2. Phân tích mối quan hệ di truyền và tiến hoá ở mức độ phân tử dựa
trên kết quả giải mã trình tự DNA.
3. Bƣớc đầu tìm hiểu một số đặc điểm sinh học và sinh thái của các loài
ếch cây xanh trên.
Căn cứ vào mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
1. Mô tả đặc điểm hình thái, bổ sung địa điểm phân bố và xây dựng
khoá định loại cho 5 loài ếch cây xanh thuộc giống Rhacophorus ở
Việt Nam.
2. Đánh giá mối quan hệ di truyền, xây dựng cây phát sinh chủng loại
và xác định sự sai khác về mặt di truyền của 5 loài ếch cây xanh,
đồng thời xem xét sự sai khác giữa các mẫu vật cùng loài nhƣng thu
thập ở các địa điểm khác nhau ở Việt Nam dựa trên kết quả giải trình
tự DNA của gen 16S rRNA và gen Cytochromeb.
3. Cung cấp thông tin về một số đặc điểm sinh học, sinh thái của các
loài ếch cây xanh thông qua quan sát trực tiếp trong tự nhiên và trong
điều kiện nuôi nhốt.
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

10
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
I.1. Các nghiên cứu về phân loại nhóm ếch cây xanh
Trên thế giới, họ Ếch cây Rhacophoridae hiện biết có 320 loài thuộc 13
giống, phân bố ở Châu Á gồm Trung Quốc (bao gồm cả Đài Loan), các nƣớc
Đông Nam Á, Nhật Bản, Philippin, Ấn Độ và Châu Phi (Frost 2010)[11]. Ở
Việt Nam họ này có 51 loài thuộc 9 giống bao gồm Aquixalus, Chiromantis,
Feihyla, Kurixalus, Nyctixalus, Philautus, Polypedates, Rhacophorus và

Theloderma; trong đó giống Rhacophorus có 17 loài (Nguyen et al. 2009;
Ziegler & Nguyen 2010) bao gồm: Rhacophorus annamensis Smith, 1924;
R.appendiculatus (Günther, 1859 “1858”); R.baliogaster Inger, Orlov et
Darevsky, 1999; R.calcaneus Smith, 1924; R.chuyangsinensis Orlov, Nguyen
và Ho, 2008; R. dennysii Blanford, 1881; R. dorsoviridis (Bourret, 1937);
R.duboisi Ohler, Marquis, Swan et Grosjean, 2000; R.dugritei (David, 1872);
R.exechopygus Inger, Orlov et Darevsky, 1999; R.feae Boulenger, 1893;
R.hoanglienensis Orlov, Lathrop, Murphy et Ho, 2001; R.kio Ohler et
Delorme, 2006; R.hungfuensis (Liu et Hu, 1961); R.maximus Günther, 1859
“1858”; R.orlovi Ziegler et Köhler, 2001 và R.rhodopus Liu et Hu, 1960.
Dubois (1986) coi họ ếch cây chỉ là một phân họ (Rhacophorinae) của họ
Ếch nhái Ranidae. Tuy nhiên, theo quan điểm phân loại của đa số các nhà
nghiên cứu hiện nay thì giống Ếch cây Rhacophorus thuộc họ Ếch cây
Rhacophoridae, Bộ Không đuôi Anura, Lớp Ếch nhái Amphibia (Orlov et al.
2008; Li et al. 2009; Nguyen et al. 2009; Yu et al. 2009; Frost
2010)[10,27,23,34,11].
Theo phân loại của Dubois (1986) thì các loài ếch cây xanh ghi nhận ở
Việt Nam nằm trong hai nhóm dƣới đây: Nhóm 1) Nhóm Rhacophorus
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

11
reinwardtii (Schlegel, 1840) gồm: Rhacophorus bipunctatus Ahl, 1927;
Rhacophorus dulitensis Boulenger, 1892; Rhacophorus georgii Roux, 1904;
Rhacophorus maximus Gunther, 1859; Rhacophorus nigropalmatus
Boulenger, 1895; Rhacophorus prominanus Smith, 1924; Rhacophorus
reinwardtii (Schlegel, 1840); và Rhacophorus rhodopus Liu & Hu, 1959.
Nhóm 2) Nhóm Rhacophorus dennysi Blanford, 1881 gồm: Rhacophorus
dennysi Blanford, 1881 và Rhacophorus feae Boulenger, 1893[10].

Trong tài liệu của Bourret (1942) mô tả một loài ếch cây xanh là
Rhacophorus nigropalmatus với 4 phân loài: R. nigropalmatus maximus, R.
nigropalmatus nigropalmatus, R. nigropalmatus feae và R. nigropalmatus
dennysi. Trong số đó, chỉ có phân loài R. nigropalmatus feae ghi nhận ở Sa
Pa, Lào Cai, Việt Nam[6].
Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc (1996) ghi nhận tổng số 19 loài ếch
cây, trong đó có duy nhất một loài ếch cây xanh là Rhacophorus
nigropalmatus (hiện nay đƣợc định loại lại gồm 2 loài là R. feae và R.
kio)[21].
Orlov et al. (2001) ghi nhận 20 loài ếch cây ở vùng núi Hoàng Liên,
tỉnh Lào Cai, trong đó có 8 loài ghi nhận mới cho khu hệ ếch nhái Việt Nam
và mô tả thêm một loài mới Rhacophorus hoanglienensis. Các tác giả cũng
tổng hợp danh sách 40 loài ếch cây có ở Việt Nam thuộc 5 giống, trong đó hai
loài P.dennysi và P.feae đƣợc xếp thuộc giống Polypedates[25].
Đến năm 2002, Orlov et al. ghi nhận 42 loài trong họ Rhacophoridae ở
Việt Nam, trong đó có 3 loài ếch cây xanh thuộc hai giống là Polypedates và
Rhacophorus là Polypedates dennysi, P. feae và Rhacophorus
reinwardtii[26].
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

12
Tài liệu của Nguyễn Văn Sáng và cs. (2005) ghi nhận tổng số 45 loài
ếch cây, trong đó cũng ghi nhận 3 loài ếch cây xanh thuộc hai giống là
Polypedates dennysi, P. feae và Rhacophorus reinwardtii[22].
Ohler & Delorme (2006) mô tả loài ếch cây xanh Rhacophorus kio ở
khu vực Đông dƣơng, dựa trên các mẫu vật thu đƣợc ở Việt Nam, Lào và
Thái Lan trƣớc đây đƣợc định loại là Rhacophorus reinwardtii[24].
Năm 2007, Bordoloi et al. đã nghiên cứu về phân loại các loài ếch cây

màng chân đỏ thuộc giống Rhacophorus và mô tả một loài ếch cây mới R.
suffry ở Ấn Độ. Các tác giả so sánh đặc hình thái và xây dựng khóa định loại
của 8 loài các loài ếch cây có màng chân đỏ bao gồm Rhacophorus
bipunctatus, R. kio, R. malabaricus, R. pseudomalabaricus, R. reinwardtii, R.
rhodopus, R. suffry, và R. yaoshanenis. Loài R. kio đƣợc xếp chung cùng
nhóm với loài R. reinwardtii[5].
Chou et al. (2007) sắp xếp các loài sau thuộc nhóm Rhacophorus
maximus: R. dennysi, R. feae, R. maximus, và R. tuberculatus. Nhóm này có
chung các đặc điểm hình thái sau: tay có màng bơi hoàn toàn hoặc ít nhất các
ngón phía ngoài có màng bơi hoàn toàn, không có nếp da phía trên hậu môn
hay gót chân, mút mõm tròn hay hơi nhọn, không có gờ da bên lƣng, không
có riềm da ở mép ngoài cổ chân[8].
Orlov et al. (2008) mô tả loài ếch cây xanh mới với mẫu chuẩn thu tại
VQG Chƣ Yang Sin, tỉnh Đắc Lắc và đặt tên loài mới là Rhacophorus
chuyangsinensis. Các tác giả cũng cập nhật danh sách 49 loài thuộc 11 giống
trong họ Ếch cây ở Việt Nam và chuyển hai loài R.dennysi và R.feae thuộc
giống Rhacophorus[27].
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

13
Cũng trong năm 2008, Nguyen et al. lần đầu tiên ghi nhận loài
Rhacophorus maximus ở Việt Nam dựa trên bộ mẫu thu ở Yên Tử, Bắc
Giang[20].
I.2. Các nghiên cứu về quan hệ di truyền của nhóm ếch cây xanh
Wilkinson et al. (2002) đã tiến hành đánh giá mối quan hệ di truyền của
họ ếch cây ở Châu Á và Châu Phi. Các tác giả giải trình tự DNA của gen 12S
và 16S rRNA để so sánh và xây dựng cây chủng loại phát sinh dạng MP
(Maximum Parsimony) và ML (Maximum Likelihood) cho đại diện của 12

giống thuộc họ ếch cây Rhacophoridae. Kết quả cho thấy loài Polypedates
dennysi nằm trong nhóm các loài thuộc Rhacophorus và các tác giả này đề
nghị chuyển loài P. dennysi sang giống Rhacophorus[32].
Ohler & Delorme (2006) đã so sánh các đặc điểm hình thái kết hợp với
phân tích di truyền phân tử giữa các mẫu vật ếch cây xanh đƣợc định tên là
Rhacophorus nigropalmatus và R. reinwardtii. Kết quả cho thấy các mẫu vật
thu đƣợc ở Lào, Việt Nam, và Thái Lan (trƣớc đây đƣợc định tên là R.
reinwardtii) có đặc điểm khác biệt và nằm ở nhánh tiến hoá khác hẳn so với 2
loài R. nigropalmatus và R. reinwardtii nói trên. Do đó, các tác giả đã mô tả
loài mới đặt tên là Rhacophorus kio với vùng phân bố kéo dài từ Nam Trung
Quốc qua Việt Nam và Lào đến Thái Lan và kết luận loài R. reinwardtii
không phân bố ở Việt Nam[24].
Yu et al. (2008) nghiên cứu quan hệ di truyền các loài thuộc họ ếch cây
Rhacophoridae, tập trung vào các loài phân bố ở Trung Quốc. Nhóm nghiên
cứu này đã giải trình tự một đoạn gen ty thể 12S và 16S rRNA của 23 loài ếch
cây đại diện 4 trong 8 giống trong họ ếch cây của Trung Quốc. Kết quả cho
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

14
thấy loài R. reinwardtii thuộc nhánh tiến hoá cùng với loài R. rhodopus, khác
biệt hẳn so với hai loài Rhacophorus feae và R. dennysi[33].
Yu et al. (2009) đã kiểm tra lại sự phát sinh chủng loại và tiến hoá của
các loài thuộc họ ếch cây Rhacophoridae dựa trên nghiên cứu DNA của các
gen 12S rRNA, 16S rRNA và Cytochromeb và ba đoạn DNA trong nhân mã
hóa protein (Rag-1, Rhodopsin 1, và exon tyrosinase 1). Số liệu nghiên cứu
cho thấy loài R. dennysi thuộc một nhánh tiến hoá riêng có quan hệ gần gũi
với các loài R. feae, R. maximus, R. chenfui, và R. nigropunctatus[39].
Li et al. (2008, 2009) đánh giá quan hệ di truyền trong họ Ếch cây

Rhacophoridae dựa trên 5 gen nhân (brain-derived neurotrophic factor,
proopiomelanocortin, recombination activating gene 1, tyrosinase, rhodopsin
và 3 gen ty thể (12S, 16S rRNA, và t-RNA) với những bình luận về sự tiến hóa
về hình thức sinh sản. Kết quả nghiên cứu cũng xác nhận lại loài R. dennysi có
mối quan hệ gần gũi với các loài R. feae và R. nigropunctatus[17,18].
I.3. Các nghiên cứu về sinh thái học của nhóm ếch cây xanh
Năm 2008, Hà Thị Tuyết Nga nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái
và kỹ thuật nhân nuôi loài chang xanh đốm (Polypedates dennysi) trong điều
kiện nuôi nhốt. Kết quả nghiên cứu cung cấp các thông tin về sinh học, sinh
thái, tập tính, sinh sản và bệnh dịch cũng nhƣ kỹ thuật nuôi nhốt loài chàng
xanh đốm trong điều kiện nuôi nhốt tại trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế -
Từ Liêm, Hà Nội[13].
Năm 2009, Lê Vũ Khôi và cộng sự đã công bố những dẫn liệu về sinh
trƣởng và phát triển của chàng xanh đốm Polypedates dennysi (Blanford,
1881) trong điều kiện nuôi nhốt[16].
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

15
CHƢƠNG II. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Các chuyến khảo sát thực địa đƣợc tiến hành vào tháng VI năm 2008,
tháng V và VI năm 2009 tại KBTTN Tây Yên Tử (tỉnh Bắc Giang); tháng IV
năm 2009 tại VQG Chƣ Yang Sin (tỉnh Đắk Lắk); tháng V năm 2010 tại Bắc
Quang (tỉnh Hà Giang); tháng IX năm 2010 tại khu vực Nguyên Bình, huyện
Trùng Khánh (tỉnh Cao Bằng); tháng VI năm 2010 tại Hƣơng Sơn (tỉnh Hà
Tĩnh) và VQG Phong Nha - Kẻ Bàng (tỉnh Quảng Bình); tháng X năm
2010 tại KBTTN Xuân Liên (tỉnh Thanh Hóa). Đề tài cũng sử dụng mẫu

vật thu thập từ các chuyến khảo sát tại khu vực rừng Kon Plông và núi
Ngọc Linh (tỉnh Kon Tum) vào tháng V và VI năm 2006, núi Hoàng Liên
thuộc huyện Phong Thổ và Tam Đƣờng (tỉnh Lai Châu) vào tháng XI và
XII năm 2006, Kim Hỷ (tỉnh Bắc Kạn) vào tháng VI năm 2010, Mƣờng
Khƣơng và Sa Pa (tỉnh Lào Cai) vào tháng VI năm 2009, núi Tam Đảo
(tỉnh Vĩnh Phúc) vào tháng VIII năm 2010, Quế Phong (tỉnh Nghệ An) tháng
V năm 2009 (Hình II.1).
II.2. Thu thập và xử lý mẫu vật
Thu thập mẫu vật: Mẫu vật chủ yếu đƣợc thu thập dọc theo ven suối và
một số ao hoặc vũng nƣớc đọng trong rừng thƣờng xanh, nơi sinh sống và địa
điểm đẻ trứng của các loài ếch nhái. Thời gian khảo sát từ 19:00 đến 24:00.
Mẫu vật ếch nhái đƣợc thu thập bằng tay; một số ổ trứng cũng đƣợc thu thập
để theo dõi quá trình biến thái và phát triển trong điều kiện nuôi nhốt.
Xử lý mẫu vật: Sau khi chụp ảnh, mẫu vật thu đƣợc xử lý gây mê bằng
hóa chất ethylacetate hoặc cồn 15% trong vòng 24 giờ sau khi thu. Mẫu DNA
đƣợc lấy trƣớc khi cố định mẫu, là một mẩu cơ đùi hoặc gan, ngâm trong cồn
95%. Mẫu ếch nhái đƣợc cố định bằng cồn 80% trong vòng 24 giờ sau đó
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

16
chuyển sang ngâm trong cồn 70% để bảo quản lâu dài, các mẫu đều đƣợc
đánh số hiệu e - ti - két và ghi chép thông tin cụ thể các mẫu trong sổ thực địa.
Mẫu vật ngâm hiện đang đƣợc lƣu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật (IEBR); Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (VNMN); Bảo tàng Động vật,
Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (VNUH); và
Viện Động vật Xanh-pê-tec-bua, Viện Hàn lâm Khoa học Nga (ZISP). Tổng
số có 45 mẫu vật đã đƣợc thu thập trong các chuyến khảo sát để phân tích các
đặc điểm hình thái và 17 mẫu cơ sử dụng để phân tích DNA (Bảng II.1).

Hình II.1. Bản đồ các địa điểm khảo sát thực địa.
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

17
Bảng II.1. Danh sách và thông tin về mẫu vật nghiên cứu
TT
Ký hiệu
Tên khoa học
Địa điểm thu mẫu
Nơi lƣu
giữ mẫu
1.
R. dennysi 1
Rhacophorus dennysi
Tam Đảo, Vĩnh Phúc
VNMN
2.
R. dennysi 2
R. dennysi
Nguyên Bình, Cao Bằng
VNMN
3.
R. dennysi 3
R. dennysi
Bắc Quang, Hà Giang
VNMN
4.

R. dennysi 4
R. dennysi
Phong Nha - Kẻ Bàng,
Quảng Bình
IEBR
5.
R. feae 1
R. feae
Mƣờng Khƣơng, Lào Cai
VNMN
6.
R. feae 2
R. feae
Sa Pa, Lào Cai
IEBR
7.
R .feae 3
R. feae
Tam Đƣờng, Lai Châu
VNMN
8.
R. feae 4
R. feae
Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk
ZISP
9.
R. kio 1
R. kio
Bắc Quang, Hà Giang
VNMN

10.
R. kio 2
R. kio
Kim Hỷ, Bắc Kạn
VNUH
11.
R. kio 3
R. kio
Hƣơng Sơn, Hà Tĩnh
VNMN
12.
R.kio 4
R. kio
Ngọc Linh, Kon Tum
IEBR
13.
R. maximus 1
R. maximus
Sơn Động, Bắc Giang
VNMN
14.
R. maximus 2
R. maximus
Lục Nam, Bắc Giang
IEBR
15.
R. maximus 3
R. maximus
Quế Phong, Nghệ An
VNMN

16.
R. maximus 4
R. maximus
Nghệ An
VNUH
17.
R. chuyangnensis
R. chuyangnensis
Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk
VNMN
II.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
II.3.1. Phân tích mối quan hệ di truyền
II.3.1.1. Gen nghiên cứu
Tiến hành phân tích trình tự DNA của gen ty thể (mitochondrial) do các
gen này di truyền theo dòng mẹ, có tốc độ đột biến cao hơn nhiều lần so với
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

18
gen trong nhân. Vì vậy, việc sử dụng các gen này thích hợp để giải quyết các
nội dung nghiên cứu của đề tài.
Một đoạn gen 16S rRNA (16S ribosomal RNA gen) và Cytochromeb của
hệ gen ty thể đƣợc chọn để giải mã. Nhiều công trình nghiên cứu trƣớc đây
cũng đã sử dụng gen này do có tỷ lệ tiến hóa thích hợp cho nghiên cứu ở bậc
giống, loài và quần thể (Yu et al. 2008, 2009; Li et al. 2009)[17,18].
II.3.1.2. Thiết kế mồi PCR
Đã tiến hành tìm kiếm, đối chiếu các trình tự gen đích của giống
Rhacophorus và một số giống khác trong họ Rhacophorideae đã đƣợc công
bố trong Ngân hàng Gen (Genbank), để tìm kiếm các trình tự thích hợp dùng

làm mồi (primers) cho nhân bản trình tự DNA đích bằng kỹ thuật PCR. Trên
cơ sở tham khảo phƣơng pháp của Palumbi et al. (1991), mồi đã đƣợc thiết kế
và tổng hợp có trình tự nhƣ sau: mồi xuôi (forward primer: 5’
GCAATACACTACACAGCAGA 3’) và mồi ngƣợc (revert primer: 5’
TGATGTAACTCCTGTTGGGT 3’).
II.3.1.3. Tách chiết DNA tổng số
Sử dụng DNeasy Blood and Tissue Kit của hãng QIAgen để tách chiết
DNA tổng số. Các bƣớc tách chiết theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
II.3.1.4. Nhân bản đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR
Căn cứ vào thông số kỹ thuật của mồi và hƣớng dẫn do nhà sản xuất
cung cấp, chúng tôi đã tiến hành tạo thành phần hỗn hợp PCR theo quy trình 5
bƣớc. Thành phần hỗn hợp PCR đƣợc trình bày ở bảng II.2. Chu trình nhiệt
PCR đƣợc thiết lập nhƣ trình bày ở bảng II.3.
NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

19
Bảng II.2. Thành phần hỗn hợp PCR
TT
Thành phần
Nồng độ
Số lƣợng (µl)
1
Tag PCR Mastermix
2x
12,5
2
Mồi xuôi
20 pmol

1
3
Mồi ngƣợc
20 pmol
1
4
DNA tổng số
10 ng
1
5
Nƣớc cất khử ion
-
9,5
Tổng
25

Bảng II.3. Chu trình nhiệt PCR
Các giai đoạn PCR
Nhiệt độ (
o
C)
Thời gian (giây)
Số chu kì
Biến tính ban đầu
96
180
1
Biến tính
96
45

3
Bắt cặp
58
45
Kéo dài
72
45
Biến tính
96
45

3
Bắt cặp
55
45
Kéo dài
72
45
Biến tính
96
45

3
Bắt cặp
50
45
Kéo dài
72
45

Biến tính
96
45

30
Bắt cặp
45
45
Kéo dài
72
45
Kéo dài chu kỳ cuối
72
180
1
Giữ mẫu
4
Đến khi lấy mẫu

NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

20
Điện di DNA trên gel agarose: Gel agarose đƣợc chuẩn bị với nồng độ
1%. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100V. Gel sau
khi chạy điện di đƣợc lấy ra và ngâm vào dung dịch EtBr có nồng độ 0,05 μg/
ml trong khoảng 15 phút để nhuộm DNA. Băng DNA trong gel có thể nhìn
thấy trên máy soi gel bằng tia tử ngoại có bƣớc sóng 302 nm.
Tinh sạch sản phẩm PCR: Sử dụng bộ kit MinElute của hãng QIAgen để

tinh sạch sản phẩm PCR. Các bƣớc tinh sạch sản phẩm PCR theo hƣớng dẫn
của nhà sản xuất bộ kit.
II.3.1.5. Giải mã và phân tích trình tự DNA
Quy trình tạo hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt để giải trình tự DNA
sử dụng kit thƣơng mại BigDye theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm của phản ứng giải trình tự đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp
cột sephadex theo hƣớng dẫn theo qui trình của nhà sản xuất.
II.3.1.6. Phân tích số liệu
Sử dụng chƣơng trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng đã
đƣợc các tác giả khác công bố trên ngân hàng gen (Genbank). Sử dụng
chƣơng trình BioEdit (Hall 1999) để so sánh trình tự DNA. Phần mềm MEGA
4.0 (Kumar et al. 2006) đƣợc dùng để phân tích tiến hoá phân tử và xây dựng
cây phát sinh chủng loại theo các phƣơng pháp Maximum Parsimony (MP) và
Neighbor Joining (NJ). Khoảng cách di truyền tính theo mô hình 2 tham số
của Kimura (1980) vì thích hợp với biến đổi tiến hóa của các gen ty thể. Giá
trị bootstrap (bootstrap value) dùng để đánh giá độ tin cậy của cây phát sinh
chủng loại đƣợc tính với 1.000 lần lấy mẫu thử (resampling), giá trị ≥70 đƣợc
coi là đáng tin cậy đối với cây MP và NJ.

NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

21
II.3.2. Đặc điểm hình thái
Các chỉ tiêu về kích thƣớc đƣợc đo bằng thƣớc kẹp điện tử Alpha-Tool
với đơn vị đo nhỏ nhất là 0,1 mm. Ngoài giá trị nhỏ nhất (min) và giá trị lớn
nhất (max), giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (TB ± SD) với số cá thể tối
thiểu n > 2 cũng đƣợc thống kê trong bảng các chỉ tiêu hình thái.
Các chỉ tiêu hình thái bao gồm: SVL = Chiều dài mút mõm-hậu môn;

HW = Chiều rộng đầu (đo ở điểm rộng nhất của đầu); HL = Dài đầu (đo từ
mút mõm đến gờ sau của xƣơng hàm); HD = Chiều cao đầu (đo ở điểm cao
nhất của đầu, thƣờng ở phía trƣớc ổ mắt); UEW = Rộng mí mắt (phần rộng
nhất của mí mắt trên); ED = Đƣờng kính ổ mắt (theo chiều ngang); TD =
Đƣờng kính lớn nhất của màng nhĩ; IFE = Khoảng cách giữa góc trƣớc hai ổ
mắt; IBE = Khoảng cách giữa góc sau hai ổ mắt; ESL = Dài mũi (khoảng
cách từ mút mõm tới góc trƣớc ổ mắt); TED = Khoảng cách từ rìa trƣớc màng
nhĩ đến góc sau ổ mắt; IND = Khoảng cách giữa hai lỗ mũi; END = Khoảng
cách từ góc trƣớc ổ mắt tới lỗ mũi; AG = Khoảng cách từ nách đến bẹn; FLL
= Dài chi trƣớc (từ mút ngón tay III đến nách); FFL = Chiều dài ngón tay I,
TFL = Chiều dài ngón tay III; FTD = Đƣờng kính lớn nhất của đĩa bám ngón
tay III; HLL = Dài chi sau (từ mút ngón chân IV đến bẹn); FL = Chiều dài đùi
(từ hậu môn đến đầu gối); TL = Chiều dài ống chân (từ đầu gối đến cổ chân);
FOL = Chiều dài bàn chân (từ cổ chân đến mút ngón chân IV); FTL = Chiều
dài ngón chân I; FFTL = Chiều dài ngón chân IV; HTD = Đƣờng kính lớn
nhất của đĩa bám ngón chân IV.