chuyên đề sàng lọc thuốc hiệu năng cao bằng công nghệ sinh học

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM
Khoa Dược
  
CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ
QUY TRÌNH SÀNG LỌC THUỐC HIỆU NĂNG CAO
BẰNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Nhóm thực hiện: Đồng Quỳnh Như
Nguyễn Thị Ái Thuận
Hoàng Đức Thuận
Lớp : Cao học 2014-2016
Giảng viên hướng dẫn : Nguyễn Tú Anh
TP.HCM - 2014
MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 3
.1 DẪN NHẬP 1
.2 TỔNG QUAN 2
.3 3. NỘI DUNG 8
.4 KẾT LUẬN 24
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ASMS Affinity selection mass spectrometry
CDR
Complementary determining region
EBV
Epstein–Barr virus
HTS High-Throughtput Screening
NMR
Nuclear magnetic resonance
QSAR
Quantitative structure activity
SAR
Structure-activity relationship

UHTS Ultra High-Throughput Screening
.1 DẪN NHẬP
Công nghệ sinh học Dược đã có tuổi đời từ rất lâu, tuy nhiên bước tiến quan
trọng nhất là năm 1982 với sự thông qua của FDA cho thuốc Humulin. Tử đây công
nghệ sinh học đóng một cột mốc quan trọng trong ngành Dược, bao gồm tất cả các kĩ
thuật được ứng dụng trong nghiên cứu phát triển và sản xuất thuốc công nghệ sinh
học. Cho đến nay đã có hơn 150 thuốc và vac xin công nghệ sinh học được cấp phép
như Humulin, Fomivirsen, Công nghệ sinh học đã đóng góp vai trò giúp giảm thời
gian nghiên cứu cũng như chi phí từ nghiên cứu đến sản xuất thuốc, Đáng kể đến
trong đó là sàng lọc thuốc hiệu năng cao bằng công nghệ sinh học. Khác với trước đây,
nhờ sự hiểu biết về sinh học đặc biệt là sinh lý bệnh người ngày càng sâu sắc và việc
hoàn thành bản đồ gen người đã giúp các nhà khoa học xác định đích tác động của một
bệnh ở mức độ AND, protein, từ đó phát hiện các chất có tiềm năng tác động lên đích
để phát triề thành thuốc. Để đấy nhanh quá trình phát hiện ra thuốc, sàng lọc hiệu năng
cao (HTS) là một quá trình trong đó việc thử nghiệm một lượng lớn mẫu trở nên hiệu
quả trong thời gian ngắn. Đây là yếu tố quyết định trong phát hiện thuốc ngày nay. Để
hiểu rõ hơn vai trò của công nghệ sinh học trong phát hiện thuốc và quy trình sàng lọc
thuốc hiệu năng cao bằng công nghệ sinh học là như thế nào, nhóm chúng tôi đã lựa
chọn thực hiện đề tài “Quy trình sàng lọc thuốc hiệu năng cao bằng công ngệ sinh
học” dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Tú Anh.
1
.2 TỔNG QUAN
.2.1. Thực trạng của công nghệ sinh học và những ứng dụng trong công nghệ
dược phẩm.
Cho đến nay hơn 150 thuốc công nghệ sinh học và vaccine đã được cấp phép bán ra thị
trường, và 70% trong số đó được thông qua trong 6 năm trở lại đây. Theo những
nghiên cứu gần đây của cơ quan sản xuất và nghiên cứu dược phẩm Mỹ đã tìm ra 369
loại thuốc phù hợp với các tiêu chí của thuốc công nghệ sinh học và dược phẩm. Đích
của các loại thuốc này là hơn 200 căn bệnh và cung cấp các liệu pháp trị liệu mới cho
các bệnh tự miễn, bệnh hen suyễn, Alzheimer, bệnh đa xơ cứng, ung thư, và gồm cả

những bệnh miễn dịch và truyền nhiễm (như AIDS, Malaria).
Công nghệ sinh học dược phẩm hiện chiếm khoảng 5% thị trường dược phẩm thế giới
và hứa hẹn sẽ đạt 15% vào năm 2020. Đồng thời sự phát triển bùng nổ của kỹ thuật
chẩn đoán gen đã cho phép định gen của mỗi cá nhân trong vòng 1 giờ và chỉ với dưới
100 USD. Không chỉ thuốc mà cả những xét nghiệm chẩn đoán y học mới sẽ được sản
xuất và phân phối bởi các công ty công nghệ sinh học dược. Hàng trăm xét nghiệm đã
sẵn sàng để gia tăng tính an toàn cho các chế phẩm máu. Những chi phí cho phân tích
lâm sàng cũng được giảm xuống. Ví dụ như xét nghiệm LDL (Low Density
Lipoproteins), cholesterol và các thông số khác đã được thiết kế trong một xét nghiệm.
Các xét nghiệm tách biệt các thông số này sẽ tốn một chi phí rất lớn. Trong tương lai,
các xét nghiệm công nghệ sinh học sẽ ngày càng chính xác, nhanh hơn trước và cho
phép chẩn đoán bệnh sớm hơn. Kỹ thuật proteomic gia tăng độ nhạy và có thể phát
hiện bệnh bằng kỹ thuật đánh dấu phân tử trước cả khi triệu chứng bệnh xuất hiện,
giúp ngăn ngừa bệnh và có liệu pháp trị liệu sớm.
Kỹ thuật ghép từ động vật biến đổi gen là một lĩnh vực tương lai của công nghệ dược
phẩm. Thông thường, cấy ghép hiệu quả và có chi phí hợp lý đối với các bệnh nghiêm
trọng đe dọa tính mạng, hầu hết là tim, gan và thận. Ở châu Âu là 35 000 và ở Mỹ là
60 000 người đã nhận các cơ quan nói trên. Trị giá mỗi phẫu thuật ghép cơ quan như
vậy giá từ 60 – 120 000 €, đồng thời phải uống thuốc chống thải ghép cả đời. Những
cơ quan và tế bào biến đổi gen từ các loài khác như lợn - được gọi là ngoại ghép – hứa
hẹn sẽ vượt qua được sự thiếu hụt ở cơ quan người nhờ các nguồn hiến tặng. Nhưng
nguy cơ viêm nhiễm trong cấy ghép cũng như nguy cơ cảm ứng gen ung thư rất cần
2
được chú ý. Kỹ thuật mô liên quan đến ngoại ghép là một lĩnh vực được chú ý khác
trong công nghệ sinh học dược. Kỹ thuật mô kết hợp cả sự tiến bộ trong sinh học tế
bào và khoa học vật liệu sinh học. Mô bao gồm các loại mô liên kết như collagen,
polymer phân hủy sinh học, sẽ bị thoái hóa sau khi thành lập cơ quan hoặc cấy ghép tế
bào. Biểu bì và sụn là các mô đầu tiên thành công trong kỹ thuật này và đã được kiểm
tra trên in vivo, hiện tại, các hệ thống sợi sinh học để duy trì chức năng gan, thận của
bệnh nhân đã được thử nghiệm thành công.

Ngày nay, các tế bào gốc được xem là một hướng đi mới trong điều trị và có thể chữa
hầu hết các bệnh chết người hoặc suy nhược như Parkinson, Alzheimer, bệnh bạch cầu
và các bệnh rối loạn về gen như thiếu ADA (adenosine deaminase ) và xơ nang. Tiềm
năng của tế bào gốc phôi và người đã được tập trung thảo luận nhưng vẫn sẽ chưa có
bước đột phá nào trong vòng 10 năm tới để có thể biến các tế bào và kỹ thuật này
thành ứng dụng công nghiệp. Và rõ ràng là những nghiên cứu về tế bào gốc cũng
mang lại những câu hỏi đạo đức. Những cuộc thảo luận về đạo đức và xã hội rất quan
trọng trong thuyết phục công chúng về lợi ích tiềm năng và để giải thích những rủi ro
khi ứng dụng kỹ thuật. Những trở ngại đáng kể về chẩn đoán và điều trị vẫn đang tồn
tại và một sự quan tâm sâu sắc cần được xem trọng trước khi bất cứ liệu pháp gen nào
như điều trị vào gen soma, tế bào gốc hay nhân bản được chấp nhận.
.2.2. Tác động của công nghệ sinh học và genomic trên qui trình phát triển thuốc:
Xu hướng thường xuyên nhất cho công nghệ sinh học dược là các công nghệ và khám
phá mới, đặc biệt là kỹ thuật gen, và cả những ảnh hưởng điều tiết của chính phủ và
luật chăm sóc sức khỏe tác động trên giá cả, dân số và độ tuổi dân số. Một số ảnh
hưởng ít đến chủ đề này là quyền sáng chế, kinh doanh điện tử, công nghiệp hóa đa
quốc gia, những yêu cầu của một thuốc mới, những thay đổi trong công nghệ thông tin
để giải quyết chúng.
Trong thập niên đầu tiên của thế kỷ này, công nghệ sinh học đã có một sự phát triển
bùng nổ như quá trình phát triển mẫu máy tính hay kỹ thuật phòng thí nghiệm tự động,
và những kiến thức về gen, về protein người sẽ tiếp tục phát triển. Kết quả là, càng
ngày càng có nhiều liệu pháp cứu chữa được đưa đến những người cần họ nhất. Ngày
nay, công nghiệp dược có vẻ như đã có những hình thành tốt để đối mặt với những
3
thách thức, như đưa ra số liệu thống kê thuyết phục để nhấn mạnh sự phát triển công
nghiệp:
- Trong suốt những năm 1980, công nghệ sinh học đã đưa ra 18 loại thuốc và
vaccine mới. Và sau đó là 33 loại thuốc sinh phẩm được cấp phép từ 1998 đến
1999, và hơn 25 thuốc được cấp phép trong nửa đầu năm 2000.
- Hầu hết các thuốc được cấp phép trong năm 1998 – 1999 là các thuốc mới, mặc

dù có một số ít là mở rộng phạm vi điều trị.
- Số bằng sáng chế được cấp cho các công ty công nghệ sinh học đã tăng gấp ba
từ gần 3000 mỗi năm vào đầu những năm 1990 lên 9000 trong năm 1998.
- Sau một thập niên phát triển chậm và ổn định, các giải thưởng bằng sáng chế đã
có bước lên dốc vào năm 1995, gần 4000 bằng sáng chế đã được cấp. Từ đó, số
lượng bằng sáng chế đã có tốc độ tặng vọt với 25% hoặc hơn trong mỗi năm.
- Các công ty dược phẩm trước đây tập trung vào hóa điều trị thì nay đã tăng đầu
tư nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học ngay chính phòng thí nghiệm
của họ hoặc liên kết với các nhà máy công nghệ sinh học khác hoặc mua lại
những công ty này. Việc liên minh trong công nghiệp công nghệ sinh học đã
tăng lên gấp đôi gần 250 từ năm 1998 đến năm 2000.
- Giữa năm 1998 đến 1999, doanh thu ngành công nghiệp đã tăng 13% từ 16.1 tỉ
USD lên 22.3 tỉ USD.
Trong tương lai, công nghệ sinh học và công nghệ gen sẽ được định hướng và hình
thành bởi sự tích hợp của công nghệ hiệu năng cao, kỹ thuật gen và thông tin sinh
học. Làn song công nghệ gen là nguồn dữ liệu đính hướng và được ứng dụng trong
khoa học đời sống mới để định danh gen ở những các nhân mang bệnh và cho phép cá
nhân hóa các loại thuốc dựa trên các đặc tính dược động. Vậy, những tác động của
công nghệ sinh học dược và công nghệ gen trên tính kinh tế của quá trình nghiên cứu
phát triển là:
Giảm chi phí nghiên cứu và phát triển:
Trước khi công nghệ sinh học được mở rộng nghiên cứu trên qui mô công nghiệp, giá
cả phát triển mỗi loại thuốc của mỗi công ty là khoảng 880 triệu USD và sẽ mất 15
năm từ khi bắt đầu đến lúc đưa thuốc râ thị trường. Và khoảng 75% số đó thu lại thất
bại. Bằng việc sử dụng công nghệ gen đã tạo ra một cơ hội thực sự giảm thiểu giá cả
4
công ty chỉ còn 500 triệu USD., đồng thời cũng tăng hiệu quả của thuốc. Và không chỉ
tiết kiệm về tiền bạc mà còn tiết kiệm thời gian nghiên cứu có khi giảm còn 15%.
Tăng năng suất
Từ những thử nghiệm thử - sai và các thử in vitro sinh hóa, công nghệ sinh học cho

phép công nghiệp hóa việc phát hiện và xác nhận mục tiêu. Bằng cách sử dụng các
công nghệ vi chuỗi, và các thông tin sinh học, hàng ngàn gen bệnh và các mô khỏe
mạnh đã được phân tích bằng một chip DNA đơn. Sự khác nhau trong kết quả được
phân tích và liên kết với các cơ sở dữ liệu được tích hợp. Tổng lại, khả năng tiết kiệm
mỗi thuốc bằng hệ thống tìm kiếm thông tin thông minh và phân tích gen là khoảng
140 triệu USD trên mỗi thuốc và chỉ mất hơn một năm để đưa thuốc ra thị trường. Tập
đoàn tư vấn Boston đã tính được là tăng công suất lên 6 lần so với cùng mức độ đầu
tư.
Đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc
Không chỉ có ảnh hưởng đến sự phát triển tiền lâm sàng của thuốc bằng công nghệ
sinh học và công nghệ gen mà còn giúp dự đoán các thuộc tính của thuốc và các thông
số dược động học (ADMA / tox) để đẩy nhanh quá trình phát triển công nghiệp dược.
Tiềm năng tiết kiệm là 20 triệu USD và 0,3 năm cho mỗi loại thuốc.
Duy trì tiêu chuẩn cao trong đảm bảo chất lượng
Thuốc công nghệ sinh học có tiêu chuẩn cao cùng chất lượng và an toàn như các loại
thuốc thông thường. Điều thú vị nhất là câu hỏi về chi phí quản lý thuốc tái tổ hợp.
BCG dự đoán là gia tăng 200 triệu USD và hơn một năm trên mỗi thuốc. Lý do chính
của việc này được giải thích bởi sự thêm thời gian để xác định các tính chất lý hóa
chưa biết của các protein tái tổ hợp và oligonucleotide.
Một phần khác của chi phí và thời gian là dành cho việc phát triển các xét nghiệm
kiểm tra thuốc thích hợp mới để xác nhận thuốc, tiêu chuẩn hóa, xác định hoạt động
(ví dụ như các đơn vị sinh học), độc tính, và phương pháp phân tích sinh học.
5
.2.3. Kĩ thuật sàng lọc hiệu năng cao HTS
Gần đây, kỹ thuật sàng lọc hiêu năng cao (HTS) trong việc tìm kiếm thuốc mới ngày
càng được phát triển rộng rãi trong giới nghiên cứu khoa học cũng như những sinh
viên làm những luận án tốt nghiệp hay dự án nghiên cứu tiến sĩ sau đại học . Nó cơ
bản là một quá trình sàng lọc và thử nghiệm số lượng lớn các bộ điều biến sinh học và
cơ quan kích thích chống lại các mục tiêu cụ thể có chọn lọc. Các nguyên tắc và
phương pháp của HTS đã được ứng dụng để sàng lọc các hợp chất hóa học, gen,

protein và các chuỗi peptide. Mục đích chính hay mục tiêu của kỹ thuật này là để đẩy
nhanh quá trình phát hiện thuốc mới bằng cách sàng lọc các thư viện hợp chất lớn với
một tốc độ mà có thể vượt quá một vài ngàn hợp chất mỗi ngày hoặc mỗi tuần. Đối với
bất kỳ thử nghiệm hoặc sàng lọc bằng HTS đã đạt được một số thành công bước đầu
như xác định mục tiêu, chuẩn bị thuốc thử, quản lý hợp chất, phát triển thử nghiệm và
thư viện sàng lọc hiệu năng cao phải được thực hiện với sự cẩn thận và độ chính xác
tối đa. Phương pháp thường theo sau là: trước tiên chọn mục tiêu. Hiện nay có khoảng
500 mục tiêu đang được dùng thư nghiệm. Trong số này, các thụ thể màng tế bào, chủ
yếu là protein G (chiếm 45%), enzyme (28%), tiếp theo là kích thích tố (11%), chưa rõ
(7%), kênh ion (5%), thụ thể ở nhân (2%), và cuối cùng DNA (2%). Các nhà nghiên
cứu dự đoán rằng trong tương lai gần hệ gen của con người sàng lọc có thể thêm số
lượng đáng kể cho các con số nói trên. Mối quan tâm tiếp theo là thư viện để sàng lọc;
là bản mỏng gồm các giếng nhỏ chứa hoạt chất ở dạng khô hay đông khô.các hợp chất
được trình chiếu. Sàng lọc hiêu năng cao là một lĩnh vực rất rộng lớn của nghiên cứu,
phát triển với phạm vi bao gồm thử nghiệm enzyme, thử nghiệm toàn bộ cơ quan và
thậm chí thử nghiệm toàn bộ động vật. HTS cho phép đánh giá nhanh chóng được
dược lực của số lượng lớn các hoạt chất. Không giống như các kỹ thuật khác để đánh
giá dược lực trên cá thể là cung cấp các mẫu máu lựa chon để đánh giá sự giống nhau.
Lợi thế chính là dược động học của số lượng lớn hợp chất có thể được đánh giá nhanh
chóng và chính xác. Nhưng nhược điểm chính là có thể dẫn đến tương tác thuốc.
HTS là một phương pháp mới để tìm thuốc mới, nhưng nó không phải là phương pháp
duy nhất. HTS không chỉ giúp tìm thuốc mới mà còn giúp phát triển các thuốc hiện tai
bằng cách tối ưu hóa tác dụng của thuốc. Trong những năm qua có nhiều tiến bộ trong
khoa học, công nghệ và kinh tế đã giúp các nhà nghiên cứu để phát triển nhanh chóng
6
và chính xác công nghệ phát triển và sàng lọc thuốc để chống lại sự gia tăng các bệnh
và nhiều tác nhân gây bệnh đề kháng với các thuốc hiện tại. Nghiên cứu cũng được
thực hiện để cắt giảm chi phí phát triển thuốc do đó các ngành công nghiệp theo kịp
với sự cạnh tranh ngày càng tăng. Nó được dự đoán rằng với sự ra đời của hệ gen của
con người như ứng cử viên tiềm năng của thư viện hợp chất sẽ được lớn như 100 triệu

hợp chất đó sẽ cần khoảng 10
12
xét nghiệm để thiết lập mối tương quan giữa cấu trúc
và hoạt lực (SAR). Ban đầu các xét nghiệm được thực hiện trong bản 96 giếng nhưng
với tiến bộ hiện nay cũng có bản 1586 giếng. Chương trình HTS điển hình có khả năng
sàng lọc 10.000 chất mỗi ngày, trong khi một số các phòng thí nghiệm với Ultra High-
Throughput Screening (UHTS) có thể thực hiện 100.000 xét nghiệm mỗi ngày.
Quy trình chung trong phát triển thuốc mới:
7
Phát triển thuốcPhát hiện thuốc
Thị
trườn
g
Xác định đích Xác định
LEAD
Thẩm định
đích
Thử nghiệm
lâm sàng
Tối ưu hóa
LEAD
Đăng kí
thuốc
.3 3. NỘI DUNG
.3.1. Xác định và thẩm định đích tác động
.3.1.1. Khái niệm đích tác động
Xác định đích tác động và thẩm định là những bước quan trọng đầu tiên trong quá
trình phát hiện một thuốc. Một cách dễ hiểu, đích tác động là phần kết hợp đặc biệt của
thuốc ở mức in vivo và qua đó thuốc thể hiện tác động của mình. Một đích tác động
đặc hiệu thường phải có các đặc điểm sau:

a. Đích tác động phải là một phân tử sinh học, thường là một protein có thể tồn tại
tác biệt hay ở dạng kết hợp phức tạp
b. Các phân tử sinh học phải có những phần đặc biệt để tương thích với những phân
tử khác (thường là những phân tử nhỏ với cấu trúc đặc biệt). Những phân tử này
có thể là những chất nội sinh hay ngoại sinh như phân tử hóa học (thuốc).
c. Cấu trúc của phân tử sinh học có thể thay đổi khi kết hợp với phân tử nhỏ khác
và những thay đổi có thể hồi phục.
d. Theo những thay đổi trong cấu trúc phân tử sinh học, nhiều đáp ứng sinh học
khác nhau xuất hiện và giúp ổn định tình trạng của tế bào, cơ quan, mô hay cơ
thể.
e. Đáp ứng sinh học được gây ra bởi những thay đổi trong cấu trúc của phân tử sinh
học đóng vai trò quan trọng trog điều hòa và tác động điều trị trong những tình
trạng bệnh lý.
f. Các biểu hiện, hoạt động, và cấu trúc của các phân tử sinh học có thể thay đổi
theo thời gian tiến triển bệnh.
g. Những phân tử nhỏ kết hợp với phân tử sinh học chính là thuốc
Theo như trên, đích tác động của thuốc là phân tử chìa khóa tham gia vào một quá
trình chuyển hóa cụ thể hay là một đường truyền tín hiệu đặc trưng cho một tình trạng
bệnh lý hay một bệnh cụ thể. Tuy nhiên, đích tác động chính nó đã có những hạn chế
và gây ra nhiều tranh luận trong ngành công nghệp dược phẩm. Trong khía cạnh này,
một vài quan điểm phải được làm rõ
a. Đích tác động là một khái niệm tương đối. Đích tác động thuốc cũng giống như
các phân tử sinh học khác và cũng là một phân tử sinh học tham gia vào con
đường dẩn truyền. Sự khác biệt giữa phân tử sinh học thường và đích tác động là
8
vị trị của nó và vai trò trong dẫn truyền. Ở một khía cạnh khác, đích tác động phụ
thuộc vào bệnh, mỗi đích tác động liên quan đến một phổ đặc biệt của bệnh.
b. Hầu hết các bệnh ở người thường phức tạp và liên quan đến nhiều yếu tố nguy
cơ, vì vậy rõ ràng là đích tác động khác nhau chịu trách nhiệm cho một bệnh.
Nhắm vào đích tác động đặc biệt có thể không điều trị được bệnh. Tuy hiên, liên

quan giữa nhiều đích tác động trong một bệnh không có nghĩa là mỗi đích tác
động có vai trò ngang nhau trong một bệnh và do đó thuốc nhắm đến những đích
này có thể cũng sẽ không hiệu quả như nhau trong quá trình điều trị.
c. Đích tác động có thể thay đổi, nghĩa là sự phát triển về hiểu biết sâu bên trong
phân tử sinh học và vai trò trong sinh lý bệnh, đích tác động có thể không quan
trọng bằng hay quan trọng hơn những quan niệm hiện hành.
d. Có nhiều thuốc tác động cùng một đích và một thuốc có thể ác động đến nhiều
đích. Mối quan hệ giữa thuốc và đích tác động không phải là một một mà là một-
nhiều hay nhiều-một.
e. Khi một đích tác động mới được phát hiện và thẩm định, các nhà nghiên cứu
thường hi vọng đạt được nhiều loại thuốc đặc trị nhắm đến đích đó. Tuy nhiên,
một điều quan trọng mà chúng ta phải biết là một cơ quan không rõ ràng và một
thuốc có thể phá vỡ cân bằng nội môi của cơ thể. So với aspirin, rofecoxib là một
thuốc ức chế COX-2. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng rofecoxib tăng
nguy cơ tim mạch, kết quả là đã bị rút khỏi thị trường.
f. Một đích tác động thường chỉ cho một phân tử sinh học. Ý nghĩa này nên được
xem xét lại. Những nhà khoa học hiện nay chú ý rằng một phân tử phức tạp như
HDL hay là một loại tế bào như tế bào nội mô, có thể cũng là một đích tác động
tiềm năng. Tuy nhiên, thẩm định đích tác động dựa trên khái niệm này rất khó vì
các yêu cầu về độ tin cậy, độ chính xác và chỉ số bom tấn để đánh giá tác dụng
của thuốc nhắm đến những mục tiêu đó.
.3.1.2. Phân loại đích tác động
Theo những thuốc sẵn có, một đích tác động có thể được phân thành hai nhóm: nhóm
được thiết lập và nhóm tiềm năng. Nhóm được thiết lập là nhóm được hiểu rõ, được
công bố từ lâu chức năng gì trong cơ thể bình thường và những liên quan đến sinh lý
bệnh con người. Hơn nữa, có nhiều thuốc đã nhắm đến những đích này. Nhóm tiềm
năng là những phân tử sinh học có chức năng chưa được hiểu hết và thiếu những loại
9
thuốc nhắm đến những đích này. Đích tác động tiềm năng đưa ra những hướng nghiên
cứu thuốc hoàn toàn mới.

.3.1.3. Những kĩ thuật mới trong sàng lọc đích tác động
a. Dùng các ngân hàng dữ liệu sẵn có
Các ngân hàng dữ liệu về thông tin sinh học như NCBI, bản đồ gen người (HGP) và
các chương trình hỗ trợ tìm kiếm, săp xếp chuỗi DNA như BLAST, công cụ phân tích
như Wisconsin Package (và ngày nay là Accelrys GCG).
Xác định đích tác động bằng kĩ thuật in silico bao gồm 4 khía cạnh: chọn mô hình phù
hợp, biểu hiện chức năng, đa dạng hóa và biểu hiện gen. Thẩm định dích tac động bao
gồm text mining, con đường, tương tác phân tử, subcellular localization, cấu trúc
protein.
b. Kĩ thuật RNA interference trong sàng lọc đích tác động hiệu năng cao
Đây là kĩ thuật mới nhất trong việc điều hòa biểu hiện gen, tăng cao hiệu quả nghiên
cứu sinh học phân tử nói chung và tiếp theo là nghiên cứu thuốc tác động đích.
RNAi là một quá trình trong đó mạch kép RNA (dsRNA) định hướng cho sự suy thoái
của mRNA mục tiêu. Các chất trung gian của quá trình này là cac chuỗi kép dsRNA
nhỏ, khoảng 21 câp base và được gọi là RNAs can thiệp ngắn (siRNA). Hiện tượng
RNAi được báo cáo đầu tiên vào năm 1998 bời Fire và cộng sự. Ông đã quan sát thấy
các ds RNA có thể ức chất biểu hiện gen ở Caenorhabditis elegans. Mặc dù cơ chế cơ
bản của hiện tượng vẫn chưa được rõ ràng tại thời điểm đó, nhưng nói chung, điều này
đã mang lại lợi ích cho phòng thí nghiệm như là một phương pháp mới làm bất hoạt
gen phiên mã. Quá trình mà dsRNA được cắt thành siRNA được mô tả ban đầ ở thực
vật và sau đó là ở Ruồi giấm (Drosophila). Các yếu tố protein trong tế bào có liên quan
đến chuyển đổi này đã được xác định ngay sau đó.
Sự phát triển nhanh chóng và phổ biến của RNAi như một đề tài nghiên cứu và cũng là
công cụ hữu ích trong phòng thí nghiệm đuôc chứng minh bằng sự gia tăng rất lớn các
bài báo về chủ đề này hằng năm. Đây là phản ứng với việc phát minh ra minh kĩ thuật
mới có tầm quan trọng và ảnh hưởng rộng như phát minh ra phản ứng chuỗi (PCR) đã
đóng góp cho nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học đương đại. Nhiều hướng
nghiên cứu thuốc dã mở ra bằng kĩ thuật RNAi.
c. Kĩ thuật in silico, sàng lọc ảo trên máy tính
Đây là kĩ thuật sàng lọc phổ biến và áp dụng dối với những đích đã biết cấu trúc trong

những năm gần đây. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã đi theo hướng dự đoán subtractes
10
mới cho enzyme của những chức năng chưa biết, dùng docking là một hướng hoàn
toàn mới
Bảng 3.1. Các loại phân tích HTS
Phân tích tế bào Phân tích sinh hóa
Tế bào mammalian Kết hợp receptor-ligand
Vi khuẩn/ nấm Phân tích enzyme (protease, khác)
Kênh calci Kinase và phosphatase
Phân tích tế bào với phát hiện SPA Tương tác protein-protein
Bảng 3.2. Các kĩ thuật phát hiện sử dụng trong sàng lọc hiệu năng cao
Hóa phóng xạ Phát hiện huỳnh quang Đo màu hoặc đọc phổ
Scintillation proximity
assay (SPA)
Time resolved fluorescence
(TRF)
ELISA
FlashPlate
radioimmunoassay (RIA)
Fluorescence polarization Luminescence
Fluorescence resonance
energy transfer (FRET)
Turbidity
.3.1.4. Thẩm định đích tác động
Thẩm định đích tác động mới là yêu cầu cơ bản để phát hiện một thuốc mới và là bước
đầu tiên của trong phát triển thuốc. Thẩm định một đích tác động mới rất hữu ích
không chỉ cho nghiên cứu và phát triển thuốc mới mà còn cung cấp những hiểu biết
sâu hơn về gen gây bệnh. Về cơ bản, thẩm định đích tác động bao gồm 6 bước sau:
1. Phát hiện phân tử sinh học cần quan tâm
2. Đánh giá tiềm năng của phân tử đích

3. Thiết kế quy trình phân tích sinh học để đánh giá tác động sinh học
4. Thiết lập một sàng lọc hiệu năng cao
5. Thiết kế chương trình sàng lọc để tìm ra các hit
6. Đánh giá các hit
11
Quá trình phát hiện thuốc bắt đầu với việc xác định hay đưa ra các bằng chứng của
đích sinh học được cho là có liên quan đến một tình trạng hay một bệnh lý nhất định.
Thông tin hỗ trợ cho vai trò của các đích này trong tiến triển bệnh có thể có được từ
nhiều nguồn khác nhau. Theo các thông thường, các đích tác động được nghiên cứu và
phát hiện trong các phòng thí nghiệm chuyên biệt, và một quy mô nhỏ hơn trog phòng
thí nghiệm của các công ty dược phẩm hay công nghệ sinh học. nghiên cứu cơ bản cho
những hiểu biết về những quá trình tín hiệu cơ bản và thiết yếu trong và giữa các tế
bào và các nhiễu loạn trong một số điều kiện là những bước tiến đầu tiên trong việc
tìm ra đích tác động tiềm năng thích hợp cho phát minh thuốc.
Sau khi nhận diện đích tác động sinh học cần quan tâm, thử thách tiếp theo là đưa đích
tác động vào một xét nghiệm sinh học để đọc được các hoạt động sinh học. Vùng của
các đích tiềm năng là rất lớn, từ enzyme và receptor đến hệ thống tế bào đại diện cho
toàn bộ con đường sinh hóa hay quá trình bệnh lý. Cuối cùng, phạm vi các kĩ thuật
thiết kế phân tích và loại phân tích có ý nghĩa là hoàn toàn tương ứng. Một khi các
phân tích đo lường được các hoạt động sinh học của đích một cách trực tiếp hay gián
tiếp được thiết lập, các hợp chất được kiểm tra bằng các phân tích sinh học để chứng
minh chúng hạn chế hay tăng cường hay không có tác động gì trong hoạt động này.
Sau khi một phân tích sinh học để đo lường hoạt động sinh học được thiết kế, bước
quan trọng tiếp the là thiết lập một sàng lọc hiệu năng cao (HTS). Yêu cầu cơ bản cho
phân tích HTS là độ nhạy, độ ổn định, độ lặp lại cao, hiệu năng tốt và tương thích với
hàng ngàn sàng lọc hay hàng triệu mẫu.
Với đủ may mắn, một vài hợp chất hit sẽ được phát hiện trong lần sàng lọc đầu tiên.
Hợp chất hit phải được sàng lọc để loại trừ các trường hợp dương tính giả. Bước tiếp
theo là nhận diện các hit, có thể bao gồm các đặc tính hóa học, chủ yếu là độ ổn định,
độc tính in vivo và in vitro, và đánh giá dược lý cũng như tác động chuyên biệt trên

mô hình tế bào và động vật.
Tóm lại, thẩm định đích tác động nên được đánh giá ở 3 cấp độ: cấp độ phân tử, cấp
độ tế bào và cấp độ cơ thể (mô hình động vật). Hợp chất nhỏ thường đạt được từ HTS
cho ta một công cụ hữu ích để thẩm định đích tác động mới. Hầu hết các mô hình HTS
là ở cấp độ phân tử, không gắn liền với hệ thống tế bào. Chẳng hạn, sàng lọc một
12
enzyme ức chế đặc biệt thường liên quan đến việc trộn lẫn các enzyme và mẫu chung
với nhau để phát hiện sự giảm in the substrate hay chứng minh sự tăng sản phẩm trong
quá trình xúc tác của emzym này. Kết quả đạt được từ cấp độ này không hoàn toàn tin
cậy vì có nhiều yếu tố có thể tiên đoán trước hay không tiên đoán trước được. Tuy
nhiên, kết quả thật sự từ cấp độ này chuyển đến điếm mà các hit thực sự hoạt động với
đích. Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa tế bào và hệ thống không tế bào. Thẩm định ở
mức tế bào cung cấp thông tin chính xác và xác định cho kết quả không tế bào. Ở cấp
độ này, tầm quan trọng về bệnh học của đích có thể được đưa ra rõ ràng hơn bằng cách
sử dụng các chất hóa học nhỏ. Tác động của chất hóa học nhỏ trên hệ thống tế bào sẽ
cung cấp một phác thảo cho các chất này. Mô hình động vật được sử dụng để thẩm
định đích tác động ở mức cơ thể. Tại mức này, những quan tâm đầu tiên về tác động
của hit được đưa ra. Nếu hit đạt được từ HTS thể hiện tác động trị liệu trong mô hình
động vật, điều này sẽ rất hứa hẹn. Tuy nhiên, thường các hit không thể hiện tác động
trên mô hình động vật và kết quả phải được giải thích cẩn thận. Những thiếu hụt hay
những sai lầm thường thấy bao gồm:
− Sử dụng sai mô hình động vật
− Sử dung sai đường dùng
− Sử dụng sai phương tiên và vật liệu thử nghiệm
− Sử dụng sai liều dùng. Trong nghiên cứu, nhiều liều được thử nghiệm, và kết quả
tê nhất là liều thấp nhất cũng có tác động ( không xác định được liều an toàn trên
động vật). Tệ hơn là liều cao nhất không có tác động (độc tính không được xác
định)
− Nhầm lẫn tài liệu. Một ví dụ là sử dụng liều dựa trên dữ liệu của một tử nghiệm
khác và dùng cho tất cả các thú thử nghiệm. Cuối cùng, tất cả các thú vật tại tất

cả các liều chết, thử nghiệm kết thúc và vấn đề vẫn không được giải quyết.
− Sử dụng sai nồng độ của vật liệu thử nghiệm trong sàng lọc. Nhiều tác động khá
phụ thuộc vào nồng độ
.3.1.5. Thẩm định LOX-1 với vai trò là đích tác động mới của thuốc chống xơ vữa
động mạch.
LOX-1 là một loại mới của ox-LDL receptor được phát hiện từ tế bào nội mô động
mạch (BAEC) bởi Sawamura năm 1997. Các nghiên cứu cho thấy LOX-1 là receptor
chính cho ox-LDL trong các tế bào nội mô động mạch lớn mặc dù những receptoe của
ox-LDL khác cũa đã được tìm thấy. Các nghiên cứu đã ch othay61 một số ligand cho
13
LOX-1 biểu hiện trong nhiều loại tế bào khác nhau và có thể điều hóa ở mức phiên
mã. Biểu hiện thay đổi của LOX-1 tại mức mRNA và protein đã được chứng minh
trong một số quá trình tim mạch như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, thiếu máu cục
bộ cơ tim, bệnh tiểu đường. xác định, quy định và hiểu về con đường truyền tín hiệu
có thể cải thiện những hiểu biết về bệnh học của một số bệnh tim mạch và cung cấp
một lựa chọn điều trị cho bác sĩ. LOX-1 có thể là đích tiềm năng và hứa hẹn cho việc
nghiên cứu các thuốc tim mạch. Mối quan hệ giữa LOX-1 và bệnh xo8 vữa có thể
được tóm tắt như sau: endocytosis cua ox-LDL, biểu hiện cùng vị trí với xơ vữa động
mạch, được tăng cường bời các yếu tố nguy cơ liên quan, nâng LOX-1 protein lên
trong cac1benh65 xơ vữa, ảnh hưởng có liên quan đến sinh bệnh học của xơ vửa, và
được loại bỏ bằng thuốc chống xơ vữa. Hơn nữa, LOX-1 có liên quan đến sự ổn định
của mảng xơ vữa. Nhìn lại các nghiên cứu về LOX-1 trong 10 năm qua cho thấy trong
LOX-1 chứa những đặc điểm của một đích tác động. LOX-1 là một loại protein màng
loại 2 50kDa cấu trúc thuộc về C-type lectin family kết thúc với gốc N thân nước
trong tế bào và C-terminal dài ngoài tế bào được chia cắt bởi chuổi 26 acid amin kị
nước. Vùng lectin là vùng nhận diện ligand dựa trên tương tác điện tích dương với các
ligand tích điện âm. Dựa trên sự sắp xếp quan trọng tron cơ cấu của LOX-1 và so sánh
kích thước của bề mặt mờ của LOX-1 với đường kính của ox-LDL, người ta đề xuất
cách nhận diện ox-LDL, 3 phân tử LOX-1 cần thiết để được gắn kết với một ox-LDL.
Hơn nữa, hai mản của vùng kết hợp lingand-binding của LOX-1 người đã dược tinh

thể hóa và phân tích bằng tia X. Kết hợp của LOX-1 với ox-LDL giản phản ứng
oxihoa1 (ROS), p38-mitogen kích hoạt protein kinase (p38 MMAPK) và tác nhân
phân tử kappa B (NF-kB) kích hoạt, biểu hiện của phân tử gian bào 1(ICAM-1), phân
tử có mạch kết dính tế bào (VCAM-1) và monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-
1). Sự thay đổi của LOX-1 trong các bệnh tim mạch chứng minh nó là một đích đầy
hứa hẹn.
Để thẩm định LOX-1 có khả năng là một đích tác động, HTS dựa trên huỳnh quang
phân cực mạnh là bước đầu tiên để sàng lọc ligand LOX-1 trong vi bản chứa 384
giếng dùng protein người tái tổ hợp. Gen LOX-1 người có được bằng phương pháp
RT-PCR từ tế bào THPbao2bi5 kích thích bởi histamine. Gen LOX-1 tinh khiết được
nhân bản vô tính thành vector pMD 18-T, có khả năng khuếch đại trong chủng E.Coli
14
DH5 alpha. hLOX-1 cDNA được chuyển vào pPIC9K để cung cấp các plasmid tái tổ
hợp pPIC(K His-hLOX-1. Plasmid này được chuyển vào Pichia pastoris GS115.
Protein hLOX-1 tinh sạch bằng HiTrap Chelating HP và được gắn với fluorescein
isothiocyanate (FITC). Phân tích dựa trên tương tác receptor – ligand: LOX-1 người
được gắn với FITC và kết hợp với ligand đặc biệt của nó, ox-LDL và những chất khác
từ ngân hàng mẫu được dùng để cạnh tranh với ox-LDL. Một lượng 12,700 hợp chất
được sàng lọc với một bộ lọc kích thích bước sóng 485 nm và lọc 530 nm. Điều này
mang lại một yếu tố Z của 0,75, và 3 chất của ligand bắt chước với một EC 50 dưới 40
mcM được xác định.
Để tiếp tục đánh giá các hoạt động gắn kết của các chất này, một trong ba hợp chất,
6306, được nghiên cứu sâu hơn bằng mô hình tế bào. Ox-LDL được gắn bởi Dil và tạo
ra Dil-oxLDL được nghiên cứu với tế bào hLOX-1-CHO-K1 ( tế bào CHO-K1được
chuyển gen LOX-1 người). Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang các tế bào hLOX-
1CHO-K1 nhận Dil-ox-LDL cho thấy tế bào hLOX-1-CHO-K1 tiếp thu một lượng
đáng kể Dil-ox-LDL mặc dù việc kiểm soát không có, sự tiếp thu này cũng bị khóa bởi
một lượng thừa của ox-LDL không gắn (200mcg/mL). Lượng 6306 làm giảm đáng kể
LOX-1 thông qua Dil-ox-LDL endocytosis. Điều này đề nghị rằng 6306 có ái lực cao
với hLOX-1 protein trong các điều kiện sinh lý. Các nghiên cứu trước cho thấy rằng

kết hợp ox-LDL với LOX-1 gây ra phản ứng oxy hóa tể bào (ROS). Ox-LDL có lẽ làm
giảm lượng NO nội bào do tăng O
2
nội bào. Dùng tế bào hLOX-1-CHO-K1, những
ảnh hưởng của sàng lọc LOX-1 ligand 6306 trên ROS và sản xuất O
2
trong tế bào đã
được chứng minh. Kết quả cho thấy 6306 làm giảm đáng kể mức NO
2
trong dịch nổi
của môi trường nuôi cấy tế bào. Những kết quả này gợi ý rằng 6306 có ảnh hưởng
tương tự ox-LDL trên ROS và sản xuất O
2
trong tế bào hLOX—CHO-K1. 6306 là
giảm đáng kể mức NO
2
trong dịch nuôi cấy tế bào. Như vậy 6306 có kích hoạt LOX-1
và kết quà là tác động tương tự ox-LDL. Do vai trò quan trọng ox-LDL đóng vai trò
trong xơ vữa, 6306 đã không được dùng trong các nghiên cứu động vật.
Một ligand khác, 6302 có thể ức chế ox-LDL gây ra ROS và tạo O
2
và giảm NO
2
trong
tế bào hLOX-1-CHO-K1. Trong mô hình thử nghiệm chuột bị xơ vữa gây ra bởi chế
độ ăn nhiều chất béo được thiết lập để khám phá vai trò của LOX-1 trong cơ chế bệnh
sinh của bện xơ vữa và để kiểm tra xem LOX-1 ligand có thể là một hợp chất chống
15
xơ vữa hay không, và tác động của ligand LOX-1 6302 được nghiên cứu trong mô
hình này. Kết quả cho thấy LOX-1 ligand 6302 giảm độ chấn thương động mạch chủ

gây ra bằng chế độ ăn giàu chất béo và ức chế hình thành mảng xơ vữa. Mức
cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL-C huyết tương giảm trong khi HDL-C tăng
ở chuột bị xơ vữa dùng 6302. MDA huyết tương cũng giảm. Kết quả này cho thấy ức
chế LOX-1 có thể có tác dụng tốt trên xơ vữa động mạch.
.3.2. Xác định các LEAD
Bảng 1,3-3 tóm tắt các kỹ thuật chủ yếu phổ biến nhất hiện nay trong việc xác định
lead của các tiểu phân tử và các đại phân tử. Bảng trên sẽ thay đổi và xuất hiện các kỹ
thuật mới liên tục. Các protein kết hợp ở dạng liên kết ( thụ thể đặc hiệu) chưa được
xem xét trong bảng này.
Bảng 3.3. Các kỹ thuật xác định LEAD
Tiểu phân tử Đại phân tử (kháng thể)
Kỹ thuật Mô tả Kỹ thuật Mô tả
Sàng lọc hiệu
năng cao
Cách tiếp cận nhanh
chóng khối lượng lớn
các hợp chất đơn hoặc
hỗn hợp các chất đối với
mục tiêu sinh hóa
Nhân bản kháng thể
Kỹ thuật in vitro:
CDR ghép có hoặc
không có đột biến.
Sàng lọc ái lực
bằng khối phổ
Thử nghiệm sang lọc
hiệu năng cao dựa trên ái
lực protein dựa trên tín
hiệu khối phổ
Tái tạo bề mặt kháng

thể chuột
Sự thay thế có chon
lọc bề mặt phần còn
lại của kháng thể
chuột
Thư viện tổ hợp
trực tiếp
Thư viện tổ hợp thiết kế
và tổng hợp xung quanh
các cấu trúc liên quan
đến mục tiêu
Phage display
De novo: chọn lọc
kháng thể từ thư viện
thể trực khuẩn lớn và
đa dạng
EBV transformed
human B cells
Kỹ thuật in vivo: hữu
ích đối với kháng thể
tự nhiên hay kháng
16
Tiểu phân tử Đại phân tử (kháng thể)
thể kháng mầm bệnh,
có thể được kết hơp
với Phage display
Sàng lọc dựa trên
mảnh cấu trúc. Ví
dụ: sàng lọc NMR
Kỹ thuật dùng để xác

định phân tử nhỏ, phân
tử có ái lực yếu với mục
tiêu được tối ưu hóa quá
trình tổng hợp làm tăng
ái lực
Trioma technology
Sự chọn lọc các
kháng thể với mục
tiêu chông s lại bênh
hoặc ung thư bằng
các bạch cầu
lymphocytes
Sàng lọc ảo
Sử dụng kiến thức chọn
lựa bằng vi tính và
phương pháp đánh giá để
xác định phân tử có khả
năng tương tác cao với
mục tiêu sinh hóa
Chuyển gen trên
chuột
Tiêm vào chuột gen
chuyển để tạo thụ thể
Ig được theo dõi bởi
kỹ thuật hybridoma
Mô hình
pharmacophore
Chọn lựa ảo hay thiết kế
ảo dựa trên sự hiểu biết
về SAR của hợp chất đặc

trưng
QSAR
Sự gắn kết thuật toán
và cấu trúc hóa học,
hoạt tính dược lý để
định lượng chuỗi các
chất. Phương pháp mà
có thể được sử dụng
trong QSAR bao gồm
nhiều hồi quy và kỹ
thuật nhận dạng mẫu
EBV transformed
human B cells
Kỹ thuật in vivo: hữu
ích đối với kháng thể
tự nhiên hay kháng
thể gây bệnh, có thể
được kết hơp với
Phage display
.3.2.1. Tiểu phân tử
3.2.1.1. Thu thập và sàng lọc.
Thông thường, việc xác định đích tác động trong việc tìm tiểu phân tư thuốc xác định
lead phân tử khởi đầu bằng việc sàng lọc số lượng lớn các hợp chất liên quan đối với
mục tiêu sinh hóa, có liên quan đến tình trạng bệnh. Trung bình mỗi quy trình sẽ sàng
lọc từ 750.000 – 2.000.000 mẫu hóa học trong việc tìm kiếm một HIT. Tuy nhiên, quá
trình thu thập có thể vượt quá 2.000.000 mẫu thử,, điều này là một bài toán kinh tế cần
phải giảm chi phí cũng như quản lý dữ liệu để tiến trình hiệu quả và đạt kết quả. Một
17
loạt các thử nghiệm sáng tạo trong sàng lọc hiệu năng cao đã được phát triển để làm
cho quá trình đạt hiệu quả với số lượng mẫu từ 500.000- 1.500.000 mẫu thử bao gồm

các đơn chất hoặc hỗn hợp.Để đẩy nhanh quá trình xác định và tối ưu hóa các phân tử,
quá trình này đã được cung cấp các LEAD xác định thay thế cũng như cộng hưởng từ
hạt nhân (NMR), sàng lọc dựa trên các mảnh cấu trúc. Ngoài các thử nghiệm sinh hóa
truyền thống, khối phổ chọn lọc dựa trên ái lực (ASMS) đã trở thành một mô hình
sàng lọc sơ cấp trong nhiều năm qua. Đo quang phổ dựa trên sự tương tác của các
phân tử nhỏ với protein có kết quả đối với các mục tiêu thay đổi . Phương pháp nhanh,
hiệu quả kinh tế trong việc sàng lọc nhiều hợp chất với các HIT sử dụng kỹ thuật sinh
hóa trên các giếng đối với các tập hợp nhỏ. Nhiều kỹ thuật lựa chọn các HIT ảo đã
được phát triển bổ sung để làm giảm số lượng mẫu thử được thử nghiệm cũng như tối
ưu hóa các khả năng để xác định các vùng hoạt động của hợp chất trong bộ sưu tập lớn
các chất. Kỹ thuật phổ biến nhất bao gồm quá trình sang lọc ảo dựa trên mục tiêu đối
với các hợp chất với cấu trúc giống nhau, những phân tử nhỏ có hoạt tính được dự
đoán có khả năng mục tiêu sinh học cũng như ước đoán docking và các điểm chức
năng. Các kỹ thuật lựa chọn có thể được bổ sung thông qua việc sử dụng các mô hình
pharmacophore và sàng lọc QSAR. Cách tiếp cận này sẽ giới hạn kết quả vì không liên
quan trực triệp các thử nghiệm ban đầu của các hợp chất đa dạng nhưng sự lựa chọn
dựa trên nền tảng sự hiểu biết này có xác xuất cao trong việc sàng lọc các hợp chất. Kỹ
thuật này vẫn cho kết quả thành công cao. Tập hợp các hợp chất đa dạng như phân tử
“hit-like” và “lead-like” được chọn lọc dựa trên sự tính toán tính chất hóa lý. Những
hợp chất này được mong đợi sẽ cung cấp điểm bắt đầu dự kiến cho chương trình tối ưu
hóa dược vì chúng được lựa chọn trước để có khả năng hòa tan, khả năng thấm và
những đặ tính khác như trọng lượng phân tử, những tính chất được xem xét tỉ mỉ và
được tối ưu hóa.
Để nâng cao hơn nữa các cơ hội thành công trong lĩnh vực sàng lọc, hầu hết nhà
nghiên cứu đã mở rộng trong việc xem xét các phân tử có tính chất hit-like và lead-like
để cải thiện chất lượng của các mẫu thu thập. Bên cạnh chuỗi phân tử đa dạng, nhiều
nghiên cứu đã tập chung vào thư viện gen hoăc đích tác động và cũng chú ý đến các
sản phẩm tự nhiên và thư viện chế phẩm tự nhiên.
3.2.1.2. Hit to lead
18

Xác suất tổng thể của một sàng lọc hiệu năng cao (HTS) với các lead được chia ra để
tìm ra hoạt chất là 1/1.000.000, tập trung trọng tâm vào các nghiên cứu post-HTS ban
đầu để xác định và quy định đặc tính cho chất lượng lead tốt. Sự phân biệt giữa HIT
(hợp chất đáp ứng sàng lọc tiêu chuẩn ban đầu) và LEAD (đáp ứng hoạt động mục tiêu
và chọn lọc với thăm dò ban đầu của SAR) là rất quan trọng. Một HIT nghiêm ngặt
chặt chẽ đển quá trình lựa chọn LEAD sẽ nâng cao xác suất thành công . Các số liệu
đánh giá đặc trưng cho một loạt hợp chất phải đáp ứng, để tiến tới trạng thái LEAD,
được liệt kê trong bảng sau.
Bảng 3.4. Bảng thông số đánh giá đặc trưng để bắt đầu quá trình tối ưu hóa
LEAD của tiểu phân tử
Thuộc tính Đánh giá thông số của hit-to-lead
Hóa học
Hoạt động tái sản xuất giữa thử nghiệm HTS và thư nghiệm trong
phòng thí nghiệm.
Liệu đáp ứng hoạt tính
Xác định cấu trúc
Xác định độ tinh khiết
Sự ổn định của hợp chất
Thành lập quá trình tổng hợp
Tính chất của hợp chất và đánh giá khả năng cạnh tranh của các hợp
chất
Chứng minh SAR
Sinh hóa
Hỗ trợ tương tác với mục tiêu phân tử (SAR theo thiết kế mong muốn)
Thành lập dữ liệu chọn lọc
Dược lý
Đánh giá hoạt tính và các thuộc tính tiềm năng cần tối ưu hóa.
Thành lập thử nghiệm mô (thử nghệm tế bào, cơ chế thử nghiệm, )
.3.2.2. Đại phân tử
Các quá trình xác định LEAD của các đại phân tử, và đặc biệt là LEAD kháng thể trị

liệu, cách tiếp cận khác biệt đối với in vivo và in vitro. Trong trường hợp của các
phương pháp tiếp cận in vivo, sàng lọc LEAD tiềm năng thường thông qua một thử
19
nghiệm miễn dịch liên kết enzyme hoặc thông qua các thử nghiệm chức năng được
tiến hành song song với các phương pháp tiếp cận HTS thảo luận ở trên. Tuy nhiên, số
lượng các kháng thể sàng lọc thì thấp hơn vì các kháng thể đặc hiệu được làm giàu
bằng cách tiêm vào những con chuột biến đổi gen hoặc có ở bệnh nhân. Đối với các
phương pháp tiếp cận in vitro, việc lựa chọn là dựa trên khuôn mẫu. Ví dụ, các kháng
thể từ thư viện thể thực khuẩn hoặc nấm men được phân lập bởi một quá trình tương
tự như sắc ký giống nhau.
.3.3. Tối ưu hóa LEAD
Sự khác biệt lớn nhất giữa các thuốc tiểu phân tử và các kháng thể trị liệu nằm ở phần
tối ưu hóa các hoạt chất lead, tuy nhiên, qui trình tổng thể thì lại hoàn toàn tương tự
nhau. Các hoạt chất lead ban đầu được tối ưu hóa trong các chu kỳ lặp lại để thu được
các cấu trúc tiềm năng phù hợp với mục đích đưa ra trước đó. Cấu trúc và kích thước
các thuốc tạo ra tính đa chiều của quá trình tối ưu hóa tiểu phân tử (nghĩa là sự thay
đổi một tham số này sẽ làm ảnh hưởng đến tham số khác), vì vậy vùng đặc hiệu trên
kháng thể cho phép quá trình tối ưu hóa hợp chất lead diễn ra nhanh và chủ yếu là một
chiều, nghĩa là sự tối ưu hóa vùng này sẽ không hoặc ít ảnh hưởng đến vùng khác.
Mặc dù, trước đây, cơ hội để tối ưu hóa các đại phân tử bị giới hạn, các công nghệ
kháng thể hiện nay cho phép tiến hành nhiều hay ít các mối tương tác, tính tiềm năng
và tính đặc hiệu trực tiếp qua đặc tính của sản phẩm đích.
.3.3.1. Tiểu phân tử
Theo qui trình phát hiện thuốc tiểu phân tử truyền thống, sự lựa chọn hit-to-lead được
theo dõi bằng sự khảo sát một cách hệ thống và cẩn thận của SAR và các đặc tính hợp
chất in vivo. Chu kỳ lặp lại của các thiết kế và thu thập dữ liệu được sử dụng kết hợp
với việc giả thuyết tìm ra gắn kết với tiểu phân tử đích thông qua nguồn dữ liệu máy
tính. Đối với tiểu phân tử, điều này thể hiện trong các nghiên cứu mà hàng loạt các
hoạt chất có ái lực với thụ thể, enzyme hoặc protein đích được tối ưu để có những đặc
tính như thuốc. Chính xác hơn, tối ưu hóa hợp chất lead là sự thay đổi hợp chất có hoạt

tính sinh học để thực hiện đầy đủ với các thiết bị điện tử, hóa lý, dược động học và độc
tính cần thiết trong lâm sàng.
Đây là một quá trình tối ưu hóa tiềm năng, hiệu quả và giá trị xây dựng trên dữ liệu
(chu trình thiết kế/ phân tích) rút ra trong suốt pha ưu tiên hit-to-lead và được kiểm
20
soát qua các thông số sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ, độc tính và các đặc
tính hóa lý càng thiết thực càng tốt.
Các thế hệ thư viện đích thu được từ các kỹ thuật tổng hợp kết hợp hoặc song song
được dùng để tìm hiểu và phát triển các đặc tính hóa học và trí tuệ. Nếu tuân thủ đúng,
các thiết kế đặc hiệu tương tự tiến hành bằng QSAR hoặc giả thuyết mô hình tương
đồng sẽ liên quan chặt chẽ. Có một lợi thế là có thể thu thập được nhiều các thông tin
cấu trúc riêng rẽ từ cả phổ NMR protein và chiếu xa tia X trên tinh thể đích hoặc phối
tử nếu đích dễ kiểm soát. Trong nỗ lực lựa chọn và thúc đẩy chương trình đã mang lại
cơ hội tốt nhất có thể để phát triển; việc đánh giá giá trị và rủi ro ngay từ khi bắt đầu
tối ưu hóa hợp chất lead xảy ra cùng với việc ưu tiên nguồn lực và kế hoạch.
Bảng 3.5. Thông số đánh giá chuẩn sự khởi đầu của tối ưu hóa LEAD
STT Tiêu chí đánh giá tối ưu hóa lead Tiểu phân tử Đại phân tử
1
Tiềm năng điều trị + +
Tiềm năng thương mại và phạm vi chỉ
định
+ +
Môi trường cạnh tranh + +
Thế mạnh sở hữu trí tuệ + +
Sự phù hợp với đích tác động của bệnh + +
Tính khả thi của các tiên đoán sinh học
tiền lâm sàng
+ +
Chất lượng của các ứng viên lead (một vài
thông số xem trong tiêu chuẩn hit-to-lead)

Đặc trưng Đặc trưng
2
Khả năng dung nạp liên quan đích + +
Sự phù hợp với tiêu chuẩn điều trị + +
Tính khả thi trong thiết kế thử lâm sàng + +
Tính tuân thủ tỉ lệ hoặc cấu trúc trong thiết
kế thuốc
+ -
21
Chiến lược hóa học liên quan đến việc mô tả vùng đặc trưng của phân tử có thể được
xác định qua tương tác với các acid amin trên đích trong các mẫu ba chiều, vì vậy rất
có tiềm năng và chọn lọc.
Những vùng phân tử trung lập về SAR được tìm ra sẽ dùng như những vị trí để thay
đổi các tính chất hóa lý. Những thay đổi nhỏ thường ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học,
sự chuyển hóa, hấp thu của phân tử. Tối ưu hóa của một hợp chất hóa học vì vậy luôn
có tính đa chiều, và cần có sự cân nhắc trước khi lựa chọn các ứng viên thử tiền lâm
sàng. Bất cứ sự cải tiến nào trong tính đặc hiệu cũng có thể tăng lên đi kèm với sự
giảm độ hấp thu hoặc thời gian bán thải, và sự điều chỉnh đó một lần nữa sẽ có tác
động đặc hiệu.
Do lặp lại các thay đổi và tái kiểm tra đã làm cho dự án phát hiện các thuốc truyền
thống kéo dài và rất tốn kém. Các độc tính không liên quan cấu trúc được theo dõi sau
đó trong quá trình phát triển và không dự đoán được trên các xét nghiệm tiền lâm
sàng. Để giải quyết một số biến chứng, các phương pháp dự đoán thời gian bán thải và
độc tính mới đã được phát triển. Các thử nghiệm kiểm tra ADME được công nhận với
những cải tiến đáng kể trong khả năng tối ưu hóa hợp chất lead thành công và bây giờ
là được sử dụng rộng rãi trong thực tế. Cho đến nay, thành phần quan trọng để khám
phá tiểu phân tử là khả năng đánh giá sớm nhất có thể các nguy cơ trong ADMET.
Điều then chốt là “fast fail” để giảm thiểu thấp nhất các nghiên cứu tổng quát và chi
phí, đầu tư phát triển phát sinh trong quá tìm những khuyết điểm của các ứng viên
trong quá trình thử lâm sàng.

.3.3.2. Đại phân tử
Những đại phân tử như kháng thể có miền cấu trúc xác định (được phân biệt với vùng
đặc trưng và ái lực từ những vùng hằng định ) quyết định thời gian bán thải ( Fc
receptor [FcRn] vùng liên kết) và chức năng thụ thể ( độc tính tế bào phụ thuộc vào
kháng thể - [ADCC]) và độc tính phụ thuộc bổ thể.
Sự phân tách này rất quan trọng vì quá trình tối ưu hóa có thể xong trong lúc đầu của
giai đoạn 1 chiều. Sự khác nhau bao quát của các vùng quyết định bổ thể 3 (CDR3)
của chuỗi nặng hay nhẹ làm gia tăng ái lực sẽ ở hầu hết hoặc tất cả các trường hợp
không có ảnh hưởng trên thời gian bán thải hoặc chức năng thụ thể của kháng thể.
22